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Die
Erfindung betrifft die Verwendung eines zusammengesetzten Sorbens,
das einen Träger
umfasst, der wenigstens partiell mit einem polymeren Film bedeckt
ist, der auf primären
aromatischen Aminen beruht [D. Sindhimeshram et al. "Transport Properties
of Substituted Derivatives of Polyaniline", Electron Manuf. and Test", 260-267 (1995)].
Die innere Oberfläche
der porösen
Träger
ist ebenfalls bedeckt. Das zusammengesetzte Sorbens der Erfindung
wird unter Bedingungen hergestellt, die ebenfalls offenbart werden.
Eine chromatographische Säule
oder Kartusche wird ebenfalls offenbart.
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Für die Trennung
verschiedener Substanzen sind viele verschiedene chromatographische
Materialien bekannt. Diese chromatographischen Träger können allein
oder in Kombinationen verwendet werden, so dass fast alle spezifischen
Bedürfnisse
abgedeckt werden. Es ist jedoch noch notwendig, neue Sorbentien
für die
Trennung von Biomolekülen,
wie Nucleinsäuren,
mit anderen charakteristischen Merkmalen zu gewinnen.
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US-A-5,225,495
offenbart ein Verfahren zur Bildung von Polyanilinfilmen auf einem
Substrat sowie durch dieses Verfahren gebildete zusammengesetzte
Artikel. Diese Materialien werden für Filme verwendet, die elektrisch
leitend sind.
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JP 02004446 offenbart ein
Gasadorbens, das ein elektrisch leitendes Polymer mit konjugierten Doppelbindungen
umfasst. Das leitfähige
Polymer wird auf der Oberfläche
eines Pulverträgers
abgeschieden. Die Oberfläche
umfasst Mikroporenwände. Als
elektrisch leitendes Polymer wird Polyanilin verwendet.
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Das
technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt,
besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem Proteine und andere Substanzen
von Nucleinsäuren
abgetrennt werden können
und das daher besonders gut für
die schnelle einstufige Probenvorbereitung von DNA, z.B. für PCR, geeignet
ist. Ein Sorbens mit den erwähnten
Eigenschaften ist Gegenstand von
EP
99 100 416 . Aber dieses Sorbens hat einen Nachteil: Die
polymere Oberfläche
ist hydrophob. Man möchte,
dass die oben angesprochene Trennung in wässriger Umgebung durchgeführt werden
kann.
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WO-A-89/07265
offenbart ein chromatographisches Material für die stationäre Phase,
bei dem ein mechanisch stabiles und chemisch inertes Substrat mit
einem elektrisch leitenden Polymer, bei dem es sich um ein Polyanilin
handeln kann, beschichtet wird. Die chromatographische Trennung
wird durchgeführt,
indem man ein elektrisches Potential an das Material der stationären Phase
anlegt, so dass die Elution mittels Veränderungen in den chemischen
Eigenschaften des Polymers, die von dem angelegten Potential abhängen, gesteuert
wird.
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Das
technische Problem wird gelöst
durch die Verwendung eines zusammengesetzten Sorbens, das eine wenigstens
partielle Beschichtung auf einem Träger aufweist, wobei die Beschichtung
im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst,
zur Isolierung oder Reinigung von DNA aus einer Lösung, die
DNA und Proteine umfasst, im analytischen oder präparativen
Maßstab, wobei
die DNA im Durchfluss enthalten und das Protein an das Sorbens gebunden
ist.
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Vorzugsweise
ist der Träger
ein anorganisches Material, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die
anorganischen Metalloxide umfasst, vorzugsweise mit einer porösen Struktur,
wie Oxide von Aluminium, Titan, Zirconium, Silicium und/oder Eisen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung ist der Träger
ein organisches Material, vorzugsweise mit einer porösen Struktur,
wie Teilchen oder Oberflächen
aus linearem oder vernetztem Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylat.
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Bei
den Derivaten von Polyanilin handelt es sich vorzugsweise um substituierte
oder unsubstituierte Alkylaniline, aromatische Systeme, Ethylanilin, Propylanilin
und/oder Ethoxyanilin.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine chromatographische Säule, Kapillare
oder Kartusche, die wenigstens teilweise mit einem zusammengesetzten
Sorbens gefüllt
ist, das einen Träger
umfasst, der wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung
bedeckt ist, die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen membranartigen Gegenstand,
der ein zusammengesetztes Sorbens umfasst, das einen Träger umfasst, der
wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung bedeckt ist,
die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst,
wobei das zusammengesetzte Sorbens in eine poröse polymere oder anorganische
Matrix eingebettet ist.
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Gemäß der Erfindung
lässt sich
die Verwendung der Erfindung leicht mit einem Kit durchführen, der
ein zusammengesetztes Sorbens umfasst, das einen Träger umfasst,
der wenigstens partiell mit einer polymeren Beschichtung bedeckt
ist, die im Wesentlichen Polyaniline oder Derivate von Polyanilinen umfasst,
wobei das zusammengesetzte Sorbens in loser Form oder in chromatographische
Säulen
oder Kartuschen gemäß Anspruch
5 verpackt oder als membranartiger Gegenstand gemäß Anspruch
6 vorliegt, gegebenenfalls in Kombination mit Filtermaterialien,
Reagentien und/oder Puffern oder anderen Vorrichtungen oder Chemikalien
zur Durchführung von
Probenvorbereitungen oder chromatographischen Trennungen.
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Durch
die Kombination der hohen Bindungskapazität für Proteine und der porösen Struktur
des zusammengesetzten Sorbens kann DNA in einem Schritt von anderen
Substanzen abgetrennt werden. Daneben ermöglicht die spezielle Eigenschaft
von Polyanilinen, ihre Farbe unter bestimmten Bedingungen zu verändern [Hailin
Hu et al. "Electrically
Conducting Polyaniline – Poly(acrylic acid)
Blends"; Polymer
International, 45, 262-270 (1998); Ya. Kogan et al. "(NH4)2IrCl6 i drugie protoniruutshie
agenty khimitcheskoj polimerizatcii anilina" Izvestiya Akademii Nauk. Ser. khim.,
8, 1500-1502 (1994)], ihre Verwendung zum Nachweis der Wechselwirkung
von getrennten Substanzen auf der Oberfläche des Sorbens.
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Die
Hauptvorteile der Verwendung des zusammengesetzten Sorbens, wie
sie schon früher
vorgeschlagen wurden [A. Syed et al. "Polyaniline: Reaction Stoichiometry
and Use as an Ion-exchange Polymer and Acid/Base Indicator"; Synthetic Metals, 36,
209-215 (1990); US-Patent 5,281,363; 1/1994, Shacklette et al.;
252/500; US-Patent 5,232,631; 8/1993, Yong Cao et al.; 252/500;
J. Nicolau "Characteristic
of Polyaniline filled by Porous n+-type
Silica by the Renthgene Photoelectrical Spectroscopy Method"; Synthetic Metals,
1-3, 2073-2074 (1995)],
sind die leichte Handhabung, die Geschwindigkeit des Trennvorgangs
und die Möglichkeit
einer visuellen Kontrolle der Sorptions- und Trennungsvorgänge. DNA
ist im Durchfluss enthalten (Kartuschenverfahren). Gebundene Proteine
können
bei Bedarf getrennt durch einen Gradienten eluiert und anschließend analysiert
werden.
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Das
gemäß der Erfindung
zu verwendende zusammengesetzte Sorbens, das einen Träger enthält, der
wenigstens partiell mit einem chemisch stabilen polymeren Film mit
hoher Affinität
zur Oberfläche
des Trägers
bedeckt ist, wird durch ein Verfahren erhalten, das die folgenden
Schritte umfasst:
- • Herstellung einer Suspension
durch In-Kontakt-Bringen eines Trägers mit dem Reaktionsgemisch,
das wenigstens ein oder mehrere Monomere und ein oder mehrere Dotierungsmittel
enthält
(wie es in US-A-5,281,363 offenbart ist, auf das hier ausdrücklich Bezug
genommen wird);
- • Zugabe
eines Oxidationsmittels zu der hergestellten Suspension;
- • Polymerisation
von Monomeren auf der Oberfläche
des Trägers.
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Der
chemisch stabile polymere Film ist ein solcher, wie er offenbart
ist in [V. Kobryanski et al. "Izutchenie
mechanizma reaktcii kondensatcii anilina na primere polutcheniya
vodorastvorimogo polimera" Vysokomolekulyarnye
soedineniya, A, 37, 35-38 (1995)] bzw. [Wu Shuizhu et al. "Diffusion-controlled Deposition
of Polyaniline onto Poly(methylmethacrylate) Substrates"; Polymer International,
47, 335-339 (1998); E. Tassi et al. "A Conductive and Electroactive Elastomer:
A Polyaniline – Nitrilic
Rubber Composite";
J. Chem. Soc., Chem. Commun., 155-156 (1990); B. Vincent et al. "Colloidal Dispersions
of Electrically-conducting, Spherical Polyaniline Particles"; J. Chem. Soc.,
Chem. Commun., 683-684 (1990); US-Patent 5,176,851; 1/1993, Barry
et al.; 252/500; V. Shevchenko et al. "Electron Microscopy and X-Ray Diffraction
Studies of Polyaniline Films"; Synthetic
Metals, 37, 69-71 (1990)].
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Poröse oder
nichtporöse
anorganische Materialien, die aus der Gruppe ausgewählt sind,
die anorganische Metalloxide, wie Oxide von Aluminium, Titan, Zirconium,
Silicium und/oder Eisen, umfasst, sowie poröse oder nichtporöse organische
Materialien, wie Teilchen oder Oberflächen aus linearem oder vernetztem
Polystyrol, Polyethylen und Polyacrylat, können als Träger des in der Erfindung zu
verwendenden zusammengesetzten Sorbens verwendet werden. Besonders
bevorzugt ist poröses
Glas, z.qB. Glas mit kontrollierter Porosität (CPG). Typischerweise wird
CPG mit einer Porengröße im Bereich
von 10 bis 200 nm verwendet.
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Die
Bildung des Polyanilinfilms auf der Trägeroberfläche erfolgt unter Bedingungen,
die die Bildung einer festen [C. Fasomg et al. "Study on the Crystallinity of Polyaniline", Mol. Cryst. Liq.
Cryst., 160, 175-184 (1988)], stabilen Schicht aus unverzweigten
Polymermolekülen
gewährleisten.
Das Trägermaterial
wird in ein Reaktionsgefäß gefüllt und vorzugsweise
unter Vakuum gesetzt. Dann wird ein auf Wasser basierendes oder
organische Lösungsmittel
enthaltendes Reaktionsgemisch sukzessive in das Reaktionsgefäß eingeführt und
mit dem Trägermaterial
in Kontakt gebracht. Das Reaktionsgemisch kann ein oder mehrere
substituierte oder unsubstituierte Anilinmonomere enthalten, die
mit einem oder mehreren Dotierungsmitteln dotiert sind.
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Zur
Durchführung
der Polymerisation wird vorzugsweise eine wässrige Lösung eines Oxidationsmittels,
insbesondere Ammoniumpersulfat, Kaliumpersulfat, Natriumvanadat,
Peroxodisulfat, Dicumylperoxid, Alkylhydroperoxid, hinzugefügt, und
das System wird 1 bis 3 h lang bei –5°C bis 25°C inkubiert. Nach der Inkubation
wird die innere und äußere Oberfläche des
porösen
anorganischen Materials mit Polyanilin oder Derivaten bedeckt. Nicht
umgesetzte Komponenten werden durch Filtration entfernt, das Sorbens
wird gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
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Das
gemäß der Erfindung
zu verwendende zusammengesetzte Sorbens kann zur Abtrennung von
DNA aus einer Lösung,
die DNA und Proteine umfasst, verwendet werden. Daher wird eine
chromatographische Säule
oder Kartusche mit dem zusammengesetzten Sorbens gefüllt. Das
zusammengesetzte Sorbens verhält
sich ähnlich
wie andere feste chromatographische Träger, so dass die Verfahren zum
Befüllen
von chromatographischen Säulen
oder Kartuschen analog verwendet werden können. Das zusammengesetzte
Sorbens kann auch in Form eines membranartigen Gegenstands hergestellt
werden, der den Verbundstoff der Erfindung umfasst, wobei das zusammengesetzte
Sorbens in eine poröse polymere
oder anorganische Matrix eingebettet ist.
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Zur
leichten Verwendung ist es vorteilhaft, den erfundenen Verbundstoff
in loser Form, in eine chromatographische Säule oder Kartusche vorgepackt
oder als membranartigen Gegenstand in Kombination mit Filtermaterialien,
Reagentien und/oder Puffern oder anderen Vorrichtungen oder Chemikalien,
die zur Durchführung
von Probenvorbereitungen und chromatographischen Trennungen benötigt werden,
zum Beispiel in Form eines Kits, bereitzustellen.
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Die
chromatographische Trennung unterliegt keiner Einschränkung in
Bezug auf den Maßstab.
Sie kann bei jedem chromatographischen Arbeitsschritt für die Isolierung
oder Reinigung von DNA aus einer Lösung, die DNA und Proteine
enthält,
im präparativen
oder analytischen Maßstab
verwendet werden.
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Die
Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert, die
nicht einschränkend
gemeint sind.
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Beispiel 1
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Eine
Menge von 2,5 bis 15 g des porösen Trägers (z.B.
Glas mit kontrollierter Porosität)
mit einem mittleren Porendurchmesser von 10 bis 200 nm und einer
mittleren spezifischen Oberfläche
von 30 bis 130 m2/g wird in eine Glasampulle
(Reaktionsgefäß) übergeführt. Die
Ampulle wird mit einer Vakuumquelle und über ein Ventil mit einem Reservoir
verbunden, das 30 ml einer wässrigen
Lösung
der Monomere (1-4 μl/m2 CPG-Oberfläche)
und des Dotierungsmittels (HCl) in einem Stoffmengenverhältnis von
1:3 enthält.
Ein Vakuum von 10 mbar wird an die Ampulle angelegt. Wenn die Trägerteilchen
sich nicht mehr bewegen (nach ungefähr 20 min), wird die monomerhaltige
Lösung
von unten her in die Ampulle gefüllt, während die
Leitung zur Vakuumquelle geschlossen ist. Während dieses Schritts benetzt
die Monomerlösung
den Träger
und dringt in die Poren der Trägerteilchen
ein. Dann wird das Ventil zum Monomerreservoir geschlossen. Der
nächste
Schritt muss so schnell wie möglich
durchgeführt
werden. Unter Atmosphärendruck
werden 20 ml einer Oxidationsmittellösung (0,005 bis 0,008 g/m2 CPG-Oberfläche)
unter Mischen in die Ampulle gegeben. Das Mischen wird 0,5-3 h lang bei 20°C fortgesetzt.
Nach den ersten 10-15 min wird die Farbe der Suspension Dunkelblau.
Am Ende des Vorgangs wechselt die Farbe der Suspension nach Dunkelgrün. Das Produkt
wird aus der Ampulle entnommen und dann mit Wasser (40 ml pro Gramm)
gewaschen und dann 3 h lang in 1 M Ammoniumhydroxid (20 ml pro Gramm)
inkubiert. Die Farbe des zusammengesetzten Sorbens wird Dunkelblau.
Danach wird das Sorbens gründlich
mit 50-Vol.-%igem
Methanol in Wasser (100 ml pro Gramm) gewaschen und 17 h lang in
einem Vakuumofen bei 60°C
getrocknet.
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Beispiel 2
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10
g NPO mit einer spezifischen Oberfläche von 33 m2/g
("GORKOVKIY Khimitcheskiy
Zavod", Nigniy Novgorod,
Russland) werden in eine Ampulle gefüllt und 20 min lang evakuiert.
Dann wird zuerst eine wässrige
Lösung
von Monomeren mit Dotierungsmittel (HCl) (0,924 ml Anilin pro g
Träger)
und dann eine Lösung
von Oxidationsmittel (0,226 g Ammoniumpersulfat pro g MPS-Träger) hinzugefügt. Alle
Schritte werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Reaktion wird 2 h
lang unter Rühren
fortgesetzt.
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Nach
der Reaktion wird das Sorbens in einen Trichter mit einer Glasfilterscheibe übergeführt und mit
0,4 l Wasser gewaschen und 3 h lang in 0,2 l Ammoniumhydroxid inkubiert.
Danach wird das Produkt auf dem Trichter mit der Glasfilterscheibe
mit 0,8 l Wasser gewaschen und 17 h lang in einem Vakuumofen bei
60°C getrocknet.
Die Farbe des Produkts ist Dunkelblau.
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Beispiel 3
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Die
Beschichtung erfolgt analog zu dem Verfahren, das oben in Beispiel
2 beschrieben ist. Die Reaktionszeit beträgt 3 h.
- Träger: 10
g MPS-2000 GC (mittlere Porengröße 200 nm,
mittlere spezifische Oberfläche
33 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod,
Russland).
- Menge des Anilins in Wasser: 0,93 ml/g Träger.
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Beispiel 4
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Das
Verfahren ist wie in Beispiel 3.
- Träger: 10 g MPS-1150 GC (mittlere
Porengröße 100 nm,
mittlere spezifische Oberfläche
39 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod,
Russland).
- Menge des Anilins in Wasser: 1,1 ml/g Träger.
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Beispiel 5
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Das
Verfahren ist wie in Beispiel 3.
- Träger: 10 g MPS-250 GC (mittlere
Porengröße 24 nm,
mittlere spezifische Oberfläche
34 m2/g, NPO ("GORKOVKIY Khimitcheskiy Zavod", Nigniy Novgorod,
Russland).
- Menge des Anilins in Wasser: 0,95 ml/g Träger.
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Beispiel 6
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Das
Verfahren ist wie in Beispiel 3.
- Träger: 10 g CPG-10-240 (Fluka,
mittlere Porengröße 24,2
nm, mittlere spezifische Oberfläche
88,1 m2/g.
- Menge des Anilins in Wasser: 2,47 ml/g Träger.
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Beispiel 7
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Das
Verfahren ist wie in Beispiel 3.
- Träger: 10 g CPG-10-500 (Fluka,
mittlere Porengröße 52 nm,
mittlere spezifische Oberfläche
48,6 m2/g.
- Menge des Anilins in Wasser: 1,36 ml/g Träger.
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Beispiel 8
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Das
Verfahren ist wie in Beispiel 3.
- Träger: 10 g CPG-10-1000 (Fluka,
mittlere Porengröße 97,2
nm, mittlere spezifische Oberfläche
37,9 m2/g.
- Menge des Anilins in Wasser: 1,06 ml/g Träger.
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Beispiel 9
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Eine
Menge von 0,3-0,5 g Sorbens in TE-Puffer (0,02 M Tris-HCl, pH 7,5,
1 mM EDTA) wird 0,5 h lang entgast, und das Gemisch wird in eine
Kartusche übergeführt und
mit wenigstens 20 Vol. TE-Puffer äquilibriert. 200 μl einer Probe,
die das Plasmid pBR322, RNA und Proteine in TE-Puffer enthält, werden
in die Kartusche übergeführt. Die
Kartusche wird mit TE-Puffer eluiert, und 200-μl-Fraktionen des Eluats werden aufgefangen.
Die gereinigte DNA ist in der ersten Fraktion enthalten, wie spektrophotometrisch
und durch Gel-Elektrophorese (0,8% Agarose-Gel) gezeigt werden kann.
RNA und Proteine können
mit 50% Methanol eluiert werden.
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Beispiel 10
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Das
zusammengesetzte Sorbens wird wie in Beispiel 9 hergestellt und
in eine Säule
(Länge
10 cm, Innendurchmesser 4 mm) eingefüllt. Eine Probe von 200 μl, die 2
mg pBR 322, RNA und Proteine enthielt, wird auf die Säule übergeführt und
chromatographisch aufgetrennt (Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min).
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Der
Eluent ist ein A-B-Gradient:
A: 10 mM Tris-HCl pH 7,5
B:
A + Isopropanol
0-5 min: 100% A, 0% B
5-12,5 min: 80%
A, 20% B
12,5-20 min: 0% A, 70% B
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Die
mechanische Stabilität
des Sorbens bietet aufgrund der mechanischen Eigenschaften des anorganischen
Trägers
die Möglichkeit
zur Verwendung als Füllungen
in Kartuschen und Säulen
und für Reinigungen
in einem diskontinuierlichen Format (Teilchensuspension).
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Prüfung der Sorbentien
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A. Quecksilberporometrie
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Die
Porogramme, die durch Testen der auf MPS-2000, MPS-1150 und MPS-250
beruhenden Sorbentien erhalten wurden, zeigen eine gleichmäßige Verteilung
der Poren, die von der Porengröße des Ausgangsmaterials
abhängt.
Die mittlere Beschichtungsdicke der polymeren Schicht beträgt 50-75 Å
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• Bestimmung der Hydrolysestabilität
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Proben
des auf polyanilinbeschichtetem MPS beruhenden Sorbens und eine
Probe des unmodifizierten MPS wurden 16 h lang unter basischen Bedingungen
(pH 11) inkubiert und zentrifugiert (3000 U/min, 1 min). Aliquote
des Überstands
wurden entnommen und mit einer Lösung
von Ammoniummolybdat und Schwefelsäure gemischt. Spektren dieser
Gemische wurden aufgenommen. Ein Peak bei λ = 320 nm weist auf die Anwesenheit
von Silicomolybdänsäure hin,
die gebildet wird, wenn Siliciumionen unter basischen Bedingungen
aus den Teilchen herausgelöst
werden. Unmodifizierte Trägerteilchen
zeigten den höchsten
Peak. Die kleinsten Peaks bezogen sich auf diejenigen oberflächenmodifizierten
Teilchen, die 3 h lang beschichtet worden waren. Die Hydrolysestabilität dieser
Sorbentien war auf das 2,5- bis 21fache gestiegen.
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Die
beschriebenen modifizierten Sorbentien (auf der Grundlage von MPS-250
GC, MPS-1150 GC, MPS-2000 GC und CPG-10-500) wurden für die Reinigung
von genomischer DNA aus Lysaten von Escherichia coli verwendet.
- 1. Eine Übernachtkultur
des Stammes E. coli JM 109 (50 μl
Bakterienzellen, 10 ml Medium, 37°C) wurde
durchgeführt.
- 2. Von dieser Kultur wurde 1 ml in Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert.
- 3. Nach der Entfernung des Überstands
wurde das Bakteriensediment in 100 μl Puffer 1 (2 mg/ml Lysozym,
2 mM CaCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,9, 4% Saccharose)
suspendiert.
- 4. Für
die Zelllyse wurde die Suspension 8 min lang bei 60°C inkubiert.
- 5. 100 μl
Puffer 2 wurden hinzugefügt
(1% MIRA Tensid-Mix, 1,5 mM EDTA), und es wurde auf Raumtemperatur
abgekühlt.
- 6. Das Gemisch wurde 10 min lang bei Raumtemperatur geschüttelt und
weitere 5 min lang ohne Schütteln
bei Raumtemperatur inkubiert.
- 7. Das Gemisch wurde 2 min lang mit 13 000 U/min zentrifugiert.
- 8. Der Überstand
wurde auf eine mit Sorbens gepackte Säule gegeben und mit TE-Puffer
eluiert.
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Herstellung
und Verwendung des Sorbens
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Das
Sorbens wird anschließend
in Methanol, 50% Methanol und Wasser benetzt und dann 0,5 h lang
entgast. Der Überstand
wird dekantiert, und das Sorbens wird viermal mit TE-Puffer gewaschen. Während das
Sorbens in TE-Puffer gerührt
wird, wird es im Vakuum in einem Exsikkator entgast. Mit dieser Suspension
des Sorbens (120 mg/ml) werden Kartuschen gepackt.
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Ein
Bakterienlysat (siehe oben, Schritt 8) aus 1 ml Übernachtkultur wird hergestellt
und auf die Kartusche pipettiert und mit TE-Puffer eluiert. Die
Kartusche wird 5-10 min lang ohne Elution inkubiert. Fünf Fraktionen
mit einem Volumen von 200 μl
werden, unmittelbar nachdem die Kartusche zu tropfen beginnt, aufgefangen.
Die Fraktionen werden weiterhin durch Agarose-Gel-Elektrophorese
(0,8% Agarose in 89 mM Tris; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA) bei einer konstanten
Stromstärke
von 100 mA analysiert.
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Die
Gele werden mit Ethidiumbromid angefärbt. In der zweiten Fraktion
findet man genomische DNA, aber keine RNA. Die DNA-haltige Fraktion
wird in einem Spektrophotometer gemessen. Das Verhältnis der
Extinktion A260:A280 dieser
Fraktionen liegt im Bereich von 1,58 bis 1,78.