JPWO2019138957A1 - アミノ基を有するリガンドの固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本発明はリガンドを強固に固定化しつつ、余剰ホルミル基の不活化に優れた固定化方法を提供することにある。本発明に係るホルミル基含有不溶性基材に標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドを固定化する方法は、前記リガンドと前記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、２種類以上の還元剤を使用することによりイミンを還元する工程を含むことを特徴とする。

Description

本発明は、ホルミル基含有不溶性基材にアミノ基を有するリガンドを効率的に固定化する方法に関する。
特定の化合物への特異的親和性を有するペプチドや、酵素の基質などの生物活性物質は、不溶性の基材に固定化することにより、固定化された生物活性物質と相互作用する物質を回収したり、検出したりできることからその利用性が高まる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーでは、標的化合物と特異的に結合する生物活性物質をリガンドとして不溶性多孔性粒子に固定化することで、混合液の中から標的化合物のみを効率良く回収することが可能になる。アフィニティークロマトグラフィーの産業利用例としては、固定化されたタンパク質を用いた免疫グロブリンの分離や固定化された抗体を用いた抗原の分離が挙げられる。
リガンドを不溶性基材に固定化する形態としては、固定化されたリガンドの漏出を低減するために、強固な共有結合で固定化されていることが産業利用上極めて重要である。また同時に、固定化されているリガンドの状態も重要であり、リガンドが活性を維持したまま固定化されていることが好ましい。
不溶性基材にリガンドを固定化する方法としては、例えば、不溶性基材にホルミル基を導入し、当該ホルミル基とアミノ基を有するリガンドとを反応させてイミンとし、イミノ基を還元することで安定なアミンとする還元的アミノ化反応により固定化する方法が開発されている（特許文献１）。
さらに同様の反応において、特許文献２に示される様な特定の還元剤を使用することでリガンドの漏出量を顕著に抑制可能な方法が開示されている。
特開２０１５−１１０２２４号公報 国際公開第ＷＯ２０１７／０３４０２４号パンフレット
しかしながら、本発明者らは特許文献１の方法では、リガンド漏出量に改善の余地があり、さらに、特許文献２の方法では余剰ホルミル基の不活化において改善の余地があることを見出した。
本発明は前記改善点について解決し、リガンド漏出量を抑制しつつ、余剰ホルミル基の不活化に優れた固定化方法を提供することにある。
本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、２種類以上の還元剤を使用することにより、リガンドがより確実に不溶性基材へ固定化されるとともに、余剰ホルミル基の低減化も可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、下記［１］〜［９］に関する。
［１］ ホルミル基含有不溶性基材に、アミノ基を有するリガンドを固定化する方法であって、
前記リガンドと前記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
２種類以上の還元剤を使用することにより前記イミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］ 前記２種類以上の還元剤を別々に添加することにより前記イミンを還元する前記［１］に記載の方法。
［３］ 前記還元剤としてｐＫａが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を使用した後に別の還元剤を使用することにより前記イミンを還元する前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 前記ｐＫａが６．５以下のルイス塩基が、窒素含有複素環式芳香族化合物である前記［３］に記載の方法。
［５］ 前記リガンドとしてペプチドを用いる前記［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］ 前記ペプチドが抗体特異的に結合可能である前記［５］に記載の方法。
［７］ 前記ホルミル基含有不溶性基材が、多糖類、合成ポリマー、およびガラスからなる群より選択される少なくとも１種により構成されているものである前記［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］ 前記ホルミル基不溶性基材の形状が、多孔性粒子、モノリス、および多孔性膜からなる群より選択される少なくとも１種である前記［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ 標的化合物を精製する方法であって、
前記［１］から［８］のいずれかに記載の方法により前記ホルミル基含有不溶性基材に前記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、
前記標的化合物を含む混合液と前記吸着体とを接触させることにより、前記標的化合物を前記吸着体に吸着させる工程、および、
前記吸着体に吸着した前記標的化合物を前記吸着体から分離する工程を含むことを特徴とする方法。
本発明によれば、リガンドの漏出量を顕著に抑制するとともに、余剰ホルミル基の十分な不活性化も同時に達成できる。よって、本発明方法は不純物混入量が低減された高純度の標的化合物が得られる特異的吸着体を製造可能なものとして、産業上非常に優れている。
以下に、本発明の実施の一形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．不溶性基材へのホルミル基の導入工程
ホルミル基含有不溶性基材が市販されているなどして入手可能である場合は本工程の実施は必要ないが、入手できない場合は、公知方法に従って不溶性基材へホルミル基を導入する。
不溶性基材は、水など、標的化合物を含む混合液の溶媒に対して不溶性を示し、且つ、標的化合物を吸着すべきものであれば特に制限されない。例えば、クロマトグラフィー用充填剤に用いられる多孔性粒子、標的化合物を検出するための分析機器のバイオセンサ、標的化合物の分離回収や分析などに用いられるモノリス、標的化合物の分離回収や夾雑物の除去などに用いられる多孔性膜、プロテインマイクロアレイなどのチップなどを挙げることができる。分析機器のバイオセンサとしては、表面プラズモン共鳴やバイオレイヤー干渉法を利用した分析機器のセンサーチップを挙げることができる。
不溶性基材を構成する材料としては、水など、標的化合物を含む混合液の溶媒に対して不溶性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、デンプン、プルラン、キトサン、キチンなどの多糖類；ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成ポリマー；シリカガラス、ホウケイ酸ガラス、光学ガラス、ソーダガラスなどのガラスを挙げることができる。また、ポリスチレンやスチレン−ジビニルベンゼン共重合体など官能基を有さない合成ポリマーからなる基材の表面を、水酸基などの反応性官能基を有する高分子材料でコーティングしてもよい。かかるコーティング用高分子材料としては、ヒドロキシエチルメタクリレートや、ポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と、反応性官能基を有する他の重合性単量体との共重合体のようなグラフト共重合体などを挙げることができる。前記材料の中では多糖類やポリビニルアルコール等が、基材表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いられる。
不溶性基材の形状としては、多孔性粒子、モノリス、多孔性膜を挙げることができる。
不溶性基材としての多孔性粒子の大きさは適宜調整すればよいが、例えば、体積平均粒径で２０μｍ以上１０００μｍ以下とすることが好ましい。当該体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、カラムに充填した際における背圧を低く抑えることが可能になる。一方、当該体積平均粒径が１０００μｍ以下であれば、表面積が大きくなって標的化合物の吸着量が大きくなる。当該体積平均粒径としては、３０μｍ以上がより好ましく、４０μｍ以上がさらに好ましく、５０μｍ以上がよりさらに好ましく、また、２５０μｍ以下がより好ましく、１２５μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以下がよりさらに好ましく、８５μｍ以下がよりさらに好ましい。多孔性粒子の体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔性粒子の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔性粒子の粒径は、個々の多孔性粒子の顕微鏡写真を撮影して電子データとして保存し、粒径測定ソフトウェア（例えば、メディアサイバーネティックス社製「イメージプロプラス」）を用いて測定することができる。多孔性粒子は、強度向上などのため、常法に従って、多官能化合物により架橋することが好ましい。
モノリスは、多孔質連続構造体の一種であり、構造を支える骨格と空孔とが一体となったスポンジ状の構造体である。モノリスは優れた物質移動性や圧流速特性を示し、その空孔サイズおよび骨格サイズを制御することで、標的化合物の吸着効率や分離効率の向上、通液性の向上、或いは検出感度の向上が可能である。構造体が連続的に多孔質であることは、走査型電子顕微鏡観察などを用いて、異なる断面において構造が同様の空孔を有していることを確認することで判断できる。
多孔性膜としては、平膜、ホロファイバー、デプスフィルター構造などの形態を有するものを挙げることができる。
モノリスや多孔性膜など空孔を有する不溶性基材において、空孔径は捕捉対象である標的化合物や通液速度などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、１ｎｍ以上、１０μｍ以下程度とすることができる。例えば、標的化合物が抗体または抗体断片である場合、空孔径は１０ｎｍ以上、３００ｎｍ以下程度とすることが特に好ましい。
原材料を不溶性基材にする方法としては、公知方法を用いればよい。例えば多孔性粒子の場合、原料高分子の溶液または分散液を、油脂などに分散させることにより液滴化した上で、アルコールやアルコール水など前記溶液または分散液の溶媒と混和可能な溶媒と接触させることにより、多孔性粒子化すればよい。
不溶性基材にホルミル基を導入するためには、不溶性基材を構成する原材料やコーティング材料の官能基を利用すればよい。例えば、原材料として多糖類を用いた場合には、多数の水酸基が存在する。当該水酸基にエピクロロヒドリンなどのハロヒドリンを反応させることにより、エポキシ基を導入することができる。或いは、架橋剤としてポリエポキシド化合物を用いた場合には、未反応のエポキシ基が残ると考えられる。エポキシ基は酸性水溶液または塩基性水溶液により容易に開環する。開環したエポキシ基は１，２−ジオール基となり、当該１，２−ジオール基は酸化剤で酸化することによりホルミル基とすることができる。
水酸基をホルミル基に酸化するための酸化剤としては、例えば、過ヨウ素酸や過ヨウ素酸塩を用いることができる。過ヨウ素酸塩としては、過ヨウ素酸ナトリウムや過ヨウ素酸カリウムを挙げることができる。
ホルミル基含有不溶性基材におけるホルミル基含量は、特に限定されないが、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であることが好ましい。ホルミル基含量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．５μｍｏｌ以上であれば、リガンドを効率良く固定化でき、吸着体として用いた場合に、目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、ホルミル基含量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１００μｍｏｌ以下であれば、目的物の吸着量が大きくなりやすい。また、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩を作用させてホルミル基を導入する方法を用いる場合、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたりのホルミル基含量が１００μｍｏｌ以下であれば、ホルミル基含有不溶性基材の強度が大きくなりやすいため好ましい。前記ホルミル基含量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上がより好ましく、１．５μｍｏｌ以上がさらに好ましく、２μｍｏｌ以上がよりさらに好ましく、また、７５μｍｏｌ以下がより好ましく、５０μｍｏｌ以下がさらに好ましく、４０μｍｏｌ以下がよりさらに好ましい。ホルミル基含量は、例えば、ホルミル基導入反応の、時間、温度、過ヨウ素酸および／または過ヨウ素酸塩などのホルミル化剤の濃度などによって調整することができる。なお、本発明において、前記ホルミル基含量などの基準となるホルミル基含有不溶性基材の容積は、モノリスや多孔性膜などに関しては空孔および骨格を含んだ構造体全体の体積であり、多孔性粒子などに関しては、特に記載が無い限りタッピング体積をいうものとする。タッピング体積は、多孔性粒子などと水などの分散媒とを含むスラリーを計量容器に投入し、振動を与えながらそれ以上体積が減少しなくなるまで沈降させた状態の体積をいう。
ホルミル基含量は、ホルミル基含有不溶性基材にフェニルヒドラジン溶液を加え、４０℃で１時間撹拌し、反応後の上澄みの吸収スペクトルを紫外可視光分光光度計で測定し、フェニルヒドラジンの検量線からフェニルヒドラジン減少量を測定することによって評価することができる。
２．リガンドへのアミノ基の導入工程
リガンドがアミノ基を有する場合は本工程の実施は必要ないが、アミノ基を有さない場合には、アミノ基を導入する。
本発明において不溶性基材に結合させるリガンドとは、例えば標的化合物に特異的な分子間の親和性に基づいて、ある分子の集合から標的化合物に選択的に結合できる物質をいう。リガンドは、標的化合物に対する親和性を有するものであり、例えば、ペプチド、糖鎖、酵素の基質化合物、ＤＮＡなどを挙げることができる。本発明においてペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合している化合物であって、標的化合物に特異的な親和性を有するものをいい、例えば、基質化合物に結合する受容体タンパク質、抗原に対する抗体、糖鎖に結合できるレクチンなど、標的化合物に特異的な親和性を有するタンパク質、また、標的化合物への特異的親和性が維持されているタンパク質のサブユニットやドメイン、Ｆａｂ領域などの抗体断片などを挙げることができる。
リガンドとして用い得るペプチドとしては、例えば、抗体アフィニティーリガンドを挙げることができる。抗体アフィニティーリガンドとしては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成リガンド、およびそれらの類縁体が挙げられる。なお、本発明においてこれら抗体アフィニティーリガンドの類縁体とは、前記プロテインＡなどを構成する１以上のアミノ酸を欠失、置換および／または付加したものであって、標的抗体またはその断片に対する親和性が天然型に対して維持または改善された改変体や、標的抗体またはその断片に対する親和性が維持されたそのサブユニットやドメインをいう。前記改変体における欠失などの変異の数の上限は、元となるペプチドを構成するアミノ酸などにもよるが、例えば２０以下とすることができ、１０以下または５以下がより好ましい。当該変異数としては、１以上が好ましい。
酵素の基質化合物や糖鎖でアミノ基が存在しない場合には、アミノ基を導入する。なお、当業者であれば、基質化合物や糖鎖に存在する官能基をアミノ基に変換したり、官能基を利用してアミノ基を導入することは容易である。リガンドにすべきペプチドにはＮ末端にしかアミノ基が存在しない場合や側鎖アミノ基が十分に存在しない場合には、遺伝子組み換え技術や合成技術などにより任意の部位にリジン等の塩基性アミノ酸やその誘導体を導入したり置換することもできる。また、ＤＮＡや糖に利用可能なアミノ基が存在しなかったり不十分である場合には、同様の技術によりアミノ基を導入可能である。
本発明においてリガンドが標的とする化合物は、精製や検出の対象であり、リガンドが特異的に結合可能であればよく、特に限定されない。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成リガンドと結合する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＧ誘導体；レクチンと結合する糖タンパク質；リシンと結合するプラスノミノーゲン；アビジンと結合するビオチン；プロテアーゼ阻害剤と結合するプロテアーゼ；トリアジンと結合するヌクレオチド結合タンパク質；ガゼインあるいはチロシンと結合するｓｒｃキナーゼなどが挙げられる。免疫グロブリンＧ誘導体には、Ｆａｂなどの抗体断片が含まれる。
３．リガンドと不溶性基材の反応工程
本工程では、標的化合物に対する特異的親和性を有し且つアミノ基を有するリガンドとホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する。より具体的には、不溶性基材のホルミル基とリガンドのアミノ基を反応させることにより、イミノ基を形成する。
リガンドと不溶性基材とのイミノ化反応の反応液のｐＨとしては、アミノ基含有リガンドの固定化量および／または固定化率がより大きくなるため、７．０以上、１３．０未満の範囲が好ましい。
前記イミノ化反応の溶媒としては、ｐＨの安定性の観点から緩衝液が好ましい。本発明で用いることができる緩衝液については特に限定はなく、従来公知の緩衝液を好適に用いることができる。
前記イミノ化反応の温度は適宜調製すればよいが、−１０℃以上、５０℃以下が好ましい。反応温度が−１０℃以上であれば、反応液の流動性の観点から好ましく、５０℃以下であれば、リガンドや不溶性基材のホルミル基が失活し難いため好ましい。当該反応温度としては−５℃以上がより好ましく、０℃以上がさらに好ましく、また、４５℃以下がより好ましく、４０℃以下がさらに好ましい。
反応時間は、リガンドと不溶性基材が十分に反応するまでとすればよく、具体的には予備実験などで決定すればよいが、例えば、１時間以上、５０時間以下程度とすればよい。
反応後、常法に従って後処理をしてもよいが、イミノ基は比較的不安定であることから、そのまま次工程に進むことが好ましい。
４．イミノ基の還元工程
本工程では、前工程においてリガンドのアミノ基と不溶性基材のホルミル基との間で形成されたイミノ基を還元する。本工程にて２種類以上の還元剤を作用させることにより、不溶性基材のホルミル基とリガンドのアミノ基とで形成されたイミノ基、並びに未反応の余剰ホルミル基を十分に還元することができ、リガンドがより確実に不溶性基材へ固定化されるとともに、余剰ホルミル基の低減化も可能となり、リガンドの漏出が顕著に抑制されるとともに、余剰ホルミル基による非特異吸着のリスクを低減できるものと推測される。また、少ない還元剤量で効果を発揮できるため、コストと環境負荷を抑制可能なものとして、産業上優れている。
前記の通り２種類以上の還元剤を使用することでリガンド漏出量を顕著に低減できる。より具体的には、後記の実施例の条件において、リガンドの漏出量を２００ｎｇ／ｍＬ以下にすることができる。当該漏出量としては、１５０ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。
また、リガンド固定化後の不溶性基材にホルミル基が残存していると、標的化合物以外の化合物が当該ホルミル基へ非特異的に反応または吸着し、標的化合物のみを選択的に吸着できなくなるおそれがあり得る。余剰ホルミル量としては、不溶性基材１ｍＬあたり８μｍｏｌ以下が好ましく、５μｍｏｌ以下がより好ましく、３μｍｏｌ以下がさらにより好ましい。
本発明者らは、イミノ基の還元工程にて２種類以上の還元剤を使用することでリガンド漏出量を低減しつつ、余剰ホルミル基をより低減化可能であることを実験的に見出した。驚くべきことに、前記２種類以上の還元剤を組み合わせて同時に使用するよりも、各還元剤を別々に逐次的に添加することで、前記効果がさらに高くなることを実験的に見出した。
本発明に使用できる前記還元剤としては特に限定は無く使用することができるが、例えばボラン錯体を使用できる。より具体的な例としては、４−(ジメチルアミノ)ピリジンボラン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン、Ｎ−エチルモルホリンボラン、Ｎ−メチルモルホリンボラン、Ｎ−フェニルモルホリンボラン、ルチジンボラン、トリエチルアミンボラン、またはトリメチルアミンボラン、４−(ジメチルアミン)ピリジンボラン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミンボラン、Ｎ−エチルモルホリンボラン、Ｎ−メチルモルホリンボラン、Ｎ−フェニルモルホリンボラン、ルチジンボラン、アンモニアボラン、ジメチルアミンボラン、ピリジンボラン、２−メチルピリジンボラン（α−ピコリンボラン）、３−メチルピリジンボラン（β−ピコリンボラン）、４−メチルピリジンボラン（γ−ピコリンボラン）、Ｎ’Ｎ−ジエチルアニリンボラン、Ｎ’Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンボラン、２，６−ルチジンボラン、ボランアミン、トリスジメチルアミノボラン、トリスメチルアミノボラン、ボラジン、１，３，５−トリメチルボラジン、２，４，６−トリメチルボラジン、ヘキサメチルボラジン、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム等を挙げることができる。
また、ボラン錯体還元剤の中でも、ｐＫａが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体還元剤を使用することでリガンド漏出量を効率的に低下させることができる。ルイス塩基を配位子とするボラン錯体のルイス塩基のｐＫａとしては６．４以下が好ましく、６．３以下がより好ましく、６．２以下がさらに好ましい。一方、当該ｐＫａの下限は特に制限されず、ｐＫａが低いルイス塩基を有するボラン錯体を用いるほど吸着体のリガンド漏出量は低減される傾向があると考えられるが、ｐＫａが過剰に低いとボランと錯体を形成し難くなるおそれがあり得るため、０．２以上が好ましく、０．５以上または１．０以上がより好ましく、２．０以上、３．０以上、４．０以上がよりさらに好ましく、５．０以上がよりさらに好ましい。
本発明で用いるｐＫａが６．５以下のルイス塩基は、電子対をボランに供与して錯体を形成可能な化合物であり、還元作用を発揮する化合物をいう。例えば、アミン、ホスフィン、フェノール、アミド、ウレア、オキシムを挙げることができる。
ｐＫａは、窒素原子の非共有電子対が芳香環と共役している場合には低下する傾向がある。よって、本発明で用いるｐＫａが６．５以下のルイス塩基としては、窒素含有複素環式芳香族化合物、および／または、置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物を挙げることができる。
本発明における「窒素含有複素環式芳香族化合物」は、芳香環内に少なくとも１個の窒素原子を含有する芳香族化合物であってｐＫａ値が６．５以下である化合物を意味し、例えば、ピロール等の５員窒素含有複素環式芳香族化合物；ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン等の６員窒素含有複素環式芳香族化合物；キノリン、イソキノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン等の縮合窒素含有複素環式芳香族化合物を挙げることができる。
「置換基としてアミノ基を有する芳香族炭化水素化合物」は、１以上のアミノ基が置換基として芳香環に直接結合している芳香族炭化水素化合物であってｐＫａ値が６．５以下である化合物をいう。アミノ基としては、−ＮＨ2、モノ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ基を挙げることができる。置換基としてのアミノ基の数は、置換数が増えるほどｐＫａ値が大きくなる傾向にあるので、１個または２個が好ましい。芳香族炭化水素化合物としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニルなどのＣ6-12芳香族炭化水素化合物を挙げることができる。
前記窒素含有複素環式芳香族化合物は、ｐＫａ値が６．５以下である限りアミノ基を含む置換基を有していてもよく、前記芳香族炭化水素化合物は、ｐＫａ値が６．５以下である限りアミノ基以外の置換基を有していてもよい。アミノ基以外の置換基としては、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ1-6アルコキシ基、水酸基、ハロゲノ基、シアノ基およびニトロ基からなる群より選択される１以上を挙げることができる。
実際には、置換基の種類や数によりｐＫａ値は変化するので、ｐＫａ値が記載されている資料や実測などによりｐＫａ値が６．５以下であるルイス塩基を選択すればよい。例えば、前記窒素含有複素環式芳香族化合物および芳香族炭化水素化合物としては、ピリジン；α−ピコリン、β−ピコリン、γ−ピコリンなどのピコリン；ジフェニルアミン；ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−トルイジンなどのトルイジン；ピロールなどを挙げることができるが、これらに制限されるものではない。
その他、脂肪族アミンであっても、置換基の種類や数によってはｐＫａ値が６．５以下になる場合がある。例えば、ｐＫａ値が６．５以下である脂肪族アミンとしては、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミンなどのヒドロキシルアミンまたはアルコキシアミン；シアノメチルジエチルアミン、ジ（シアノメチル）アミン、ジ（シアノエチル）アミンなどのシアノＣ1-6アルキルアミンを挙げることができる。
ｐＫａ値が６．５以下であるホスフィンとしては、例えば、電子吸引性基を有する第三級ホスフィンと、第二級ホスフィンおよび第一級ホスフィンを挙げることができる。電子吸引性基を有する第三級ホスフィンとしては、例えば、２−シアノエチルジ（Ｃ1-6アルキル）ホスフィン、フェニルジ（Ｃ1-6アルキル）ホスフィン、ジ（２−シアノエチル）Ｃ1-6アルキルホスフィン、トリフェニルホスフィンおよびトリ（２−シアノエチル）ホスフィンを挙げることができる。第二級ホスフィンとしては、ジ（Ｃ1-6アルキル）ホスフィン、ジフェニルホスフィンおよびジ（２−シアノエチル）ホスフィンを挙げることができる。第一級ホスフィンとしては、Ｃ1-6アルキルホスフィンを挙げることができる。
ｐＫａ値が６．５以下であるフェノールとしては、ｏ位またはｐ位に電子吸引性の置換基を有するフェノールを挙げることができる。例えば、２，４−ジニトロフェノール、２−クロロフェノール、２−ブロモフェノール、４−ニトロフェノールを用いることができる。
ｐＫａ値が６．５以下であるアミドとしては、例えば、シアナミド、Ｃ1-6アルキルシアナミド、アセトアミドを挙げることができる。
ｐＫａ値が６．５以下であるウレアとしては、例えば、ウレア、ニトロウレアおよびチオウレアを挙げることができる。
ｐＫａ値が６．５以下であるオキシムとしては、例えば、オキサミドオキシム、ベンズアミドオキシム、α−フェニルアセトアミドオキシム、スクシンアミドオキシムおよびトルアミドオキシムを挙げることができる。
前記ボラン錯体は、一般にナトリウムボロハイドライドより製造したジボランと配位子となるルイス塩基を反応させることにより製造可能である。
イミンを含む反応液に２種以上の還元剤を添加する態様は特に制限されず、２種以上の還元剤を同時に添加してもよいが、別々に逐次的に添加することが好ましい。還元剤を別々に逐次的に添加する場合に、添加する順番は特に限定なく使用することができるが、例えば先に使用する還元剤として、ｐＫａが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体還元剤を挙げることができる。ｐＫａが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体還元剤としては、前記で例示したボラン錯体還元剤を使用することができるが、例えば、ピリジンボランや２−メチルピリジンボランを挙げることができる。また、前記別の還元剤としては特に限定は無く使用することができるが、例えば、ジメチルアミンボラン、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを挙げることができる。なお、使用する還元剤の数としては、５以下が好ましく、４以下または３以下が好ましく、２でもよい。
２種以上の還元剤を別々に逐次的に添加する場合、１種の還元剤を添加した直後に別の還元剤を添加してもよいが、１種の還元剤を添加した後、時間的な間隔を空けて別の還元剤を添加することが好ましい。かかる間隔の時間は、例えば、１０分以上、２４時間以下とすることができる。２種以上の還元剤の添加の間には、反応液を静置してもよいが、攪拌することが好ましい。
還元反応の溶媒としては、水系溶媒が好ましい。水系溶媒とは、水；緩衝液などの水溶液；水混和性有機溶媒；または水溶液と水混和性有機溶媒との混合溶媒を挙げることができる。水混和性有機溶媒とは、水と無制限に混和可能な有機溶媒をいい、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒を挙げることができる。
本工程の還元反応において水系溶媒を用いれば、有機溶媒を用いる場合に比べ、固定化するリガンドの変性や変質を抑制できることから好ましい。但し、アミン−ボラン錯体は水に対して不溶性を示すことがあることから、用いるアミン−ボラン錯体の水溶性に応じて適量の水混和性有機溶媒を配合してもよい。水系溶媒における水混和性有機溶媒の濃度としては、例えば７０質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましい。アミン−ボラン錯体の溶解のためには、当該濃度は２質量％以上が好ましく、５質量％以上がより好ましい。
本工程の還元反応の反応液のｐＨとしては、２以上、１２未満の範囲が好ましい。当該ｐＨが２以上であれば、イミノ基の分解や、水との反応によるボラン錯体の失活をより確実に抑制でき得る。一方、当該ｐＨが１２未満であれば、ボラン錯体の反応をより一層促進でき得る。当該ｐＨとしては、３以上がより好ましく、また、１０未満がより好ましく、９未満がさらに好ましい。
その他、反応温度や反応時間などは、十分に還元できる条件であればよく、具体的には予備実験などで決定すればよいが、例えば、１時間以上、５０時間以下程度、並びに０℃以上、５０℃以下程度とすればよい。
反応後においては、吸着体を洗浄することにより、本発明方法により不溶性基材に共有結合で固定化されたリガンド以外の試薬などを除去することが好ましい。洗浄剤や洗浄方法に特に限定は無いが、水、酢酸、アルコール、各種有機溶剤、ｐＨ２〜１３の水溶液、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、緩衝剤、界面活性剤、尿素、グアニジン、グアニジン塩酸塩、その他の再生剤などの、少なくとも１種を含有する溶液などを通液または投入して攪拌することが好ましい。また、同一または異なる溶液を用いて洗浄を複数回行うと、リガンドの漏出量がさらに減少するため好ましい。
本発明に係るリガンド固定化基材のリガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１ｍｇ以上５００ｍｇ以下が好ましい。リガンドの導入量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、標的化合物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、５００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。当該リガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり、２ｍｇ以上がより好ましく、３ｍｇ以上がさらに好ましく、４ｍｇ以上がよりさらに好ましく、また、１２０ｍｇ以下がより好ましく、６０ｍｇ以下がさらに好ましく、３０ｍｇ以下がよりさらに好ましい。
また、本発明に係るリガンド固定化基材のリガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．０１μｍｏｌ以上１５μｍｏｌ以下が好ましい。リガンドの導入量がホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり０．０１μｍｏｌ以上であれば、標的化合物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１５μｍｏｌ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。当該リガンド導入量としては、ホルミル基含有不溶性基材１ｍＬあたり、０．０３μｍｏｌ以上がより好ましく、０．０５μｍｏｌ以上がさらに好ましく、０．１μｍｏｌ以上がよりさらに好ましく、また、５μｍｏｌ以下がより好ましく、２μｍｏｌ以下がさらに好ましく、１μｍｏｌ以下がよりさらに好ましい。
リガンドの導入量は、固定化反応前後の反応液上清中のリガンド由来の吸光度を測定し、測定値の差から未反応のリガンド量を求め、それ以外のリガンドはすべて不溶性基材に結合したと仮定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いても、リガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有リガンドであれば、リガンド固定化基材のＮ含量分析を行うことにより、リガンドの導入量を測定することができる。
５．吸着体の使用例
以上で説明した本発明方法によりリガンドを不溶性基材に強固に固定化して製造された吸着体は、リガンドの漏出が顕著に抑制されていることから、当該吸着体を標的化合物の精製に用いた場合、標的化合物へのリガンドの混入が顕著に抑制されている。また、余剰ホルミル基が十分に不活性化されているため、当該吸着体を標的化合物の精製に用いた場合、非特異吸着が少ないことが期待される。
本発明に係る吸着体を用いて標的化合物を精製するには、標的化合物を含む混合液と吸着体とを接触させることにより、標的化合物を吸着体へ選択的に吸着させる。接触方法は特に制限されず、例えば、単に前記混合液に吸着体を加えて混合してもよいが、カラムに吸着体を充填した上で前記混合液を当該カラムへ導入する方法が効率的で便利である。
例えば、直径０．１ｃｍ以上２０００ｃｍ以下、高さ１ｃｍ以上５０００ｃｍ以下のカラムを用いることが好ましい。直径が０．１ｃｍ以上および高さが１ｃｍ以上であれば、標的化合物の吸着を効率良く行うことができる。また、吸着の精度や効率の観点から、直径としては２０００ｃｍ以下で高さとしては５０００ｃｍ以下が好ましい。
標的化合物を含む混合液と前記吸着体との接触時間（ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ）としては、吸着の精度や装置の耐久性の観点から１分間以上が好ましい。一方、効率の観点からは当該接触時間としては１２分間以下が好ましい。前記接触時間としては２分間以上がより好ましく、３分間以上がさらに好ましく、また、１０分間以下がより好ましく、９分間以下がさらに好ましい。
具体的な吸着条件に関しては、例えば、吸着体１ｍＬあたりの標的化合物の吸着量が１ｍｇ以上となるように調整することが好ましい。当該吸着量が１ｍｇ以上であれば、効率良く精製が行える。一方、当該吸着量が２００ｍｇ以下であれば、吸着した標的化合物を吸着体から溶出し易い。当該吸着量としては、１０ｍｇ以上１５０ｍｇ以下がより好ましく、２０ｍｇ以上１３０ｍｇ以下がさらに好ましく、３０ｍｇ以上１００ｍｇ以下がよりさらに好ましい。
標的化合物の吸着量は、特に限定は無いが、静的吸着量や動的吸着量として求めることができる。例えば静的吸着量を測定する場合は、ｐＨ７．４のリン酸バッファーで十分に洗浄した吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの標的化合物を３５ｍＬのｐＨ７．４の同リン酸バッファーに溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の標的化合物の減少量を測定することにより求めることができる。
本発明に係る吸着体に標的化合物を吸着させた後は、非特異的吸着物を除去するために、吸着体を洗浄することが好ましい。洗浄条件は特に制限されないが、吸着された標的化合物が脱離しないようにｐＨが６．０以上８．０以下程度の緩衝液または、超純水、純水、逆浸透水、蒸留水などで十分に洗浄することが好ましい。
次いで、吸着体に吸着した標的化合物を分離させることにより、精製された標的化合物を得ることができる。標的化合物を吸着体から分離させるには、例えば、ｐＨが３．０以上５．０以下程度の緩衝液で吸着体を洗浄すればよい。
本願は、２０１８年１月１２日に出願された日本国特許出願第２０１８−３１００号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年１月１２日に出願された日本国特許出願第２０１８−３１００号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１： 吸着体の製造
不溶性基材として、架橋セルロース粒子（特開２００９−２４２７７０号公報に記載の方法により得られるゲル）を用いた。当該不溶性基材７０ｍＬを、グラスフィルター上で、ｐＨ３．４の０．０１Ｍクエン酸バッファー（サツマ化工製クエン酸三ナトリウム二水和物、サツマ化工製クエン酸一水和物および逆浸透水を用いて調製）で十分に洗浄した。次いで、洗浄した不溶性基材を遠沈管へ導入し、同クエン酸バッファーを加えて総液量を１０８ｍＬとした。ここへ、過ヨウ素酸ナトリウム０．４５ｇ（キシダ化学製）を逆浸透水１７．６ｍＬに溶解した水溶液を加え、６℃で４０分間撹拌することにより、不溶性基材の１，２−ジオール基をホルミル基へ酸化した。グラスフィルターを用いて濾過し、十分量の逆浸透水で洗浄することにより、ホルミル基含有担体を得た。
得られたホルミル基含有担体１５ｍＬを、グラスフィルター上で、０．９Ｍりん酸二カリウム水溶液（米山化学製りん酸水素二カリウムと逆浸透水を用いて調製）で十分に洗浄した。次いで、洗浄したホルミル基含有担体をセパラブルフラスコに導入し、同りん酸二カリウム水を加えて総液量を１９ｍＬとした。別途、ＷＯ２０１１／１１８６９９を参考にして、同国際公報に記載の配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテインＡを調製した。当該プロテインＡの５８ｇ／Ｌ水溶液２．６ｍＬを前記ホルミル基含有担体に加えた後に、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（要薬品製２４％水酸化ナトリウム水溶液と逆浸透水を用いて調製）でｐＨ１１に調整後、７℃で１５時間撹拌した。その後、上清を抜き取り、総液量を１９ｍＬとした後に、α−ピコリンボラン（純正化学製）４８ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）をエタノール（和光純薬工業製）３．２ｍＬに溶解した溶液とジメチルアミンボラン（白井サイエンス製）０．２４ｇ（４．０５ｍｍｏｌ）を逆浸透水２．２ｍＬに溶解した水溶液を同時に加えた。続いて、２．４Ｍクエン酸水溶液（クエン酸１水和物と逆浸透水で調製）を加えて混合液のｐＨを７．６に調整した後に、２５℃まで昇温し４時間撹拌した。
得られた担体を、グラスフィルター上で、逆浸透水を用いて洗浄し、さらに、０．１Ｍクエン酸水溶液、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ硫酸ナトリウム混合水溶液（石田化学工業製硫酸ナトリウムを使用）、クエン酸緩衝液（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム２水和物＋クエン酸１水和物，ｐＨ＝６）にて順次洗浄した。最終的に、逆浸透水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、リガンド固定化吸着体を得た。
比較例１： 吸着体の製造
ジメチルアミンボランを使用せず、α−ピコリンボラン溶液のみを１０倍量使用したこと以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
比較例２： 吸着体の製造
α−ピコリンボランを使用せず、ジメチルアミンボラン水溶液のみを１．１倍量使用した以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
実施例２： 吸着体の製造
α−ピコリンボランの溶液を添加後、２．４Ｍクエン酸水溶液を加えて混合液のｐＨを７．６に調整した後に２５℃まで昇温し、１時間撹拌後、ジメチルアミンボラン水溶液を加え、３時間撹拌すること以外は実施例１と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
実施例３： 吸着体の製造
最初に添加するα−ピコリンボランをピリジンボラン（０．４５ｍｍｏｌ）に変更した以外は実施例２と同様にして、リガンド固定化吸着体を得た。
実施例４： 吸着体の製造
実施例１において、プロテインＡとホルミル基含有担体との反応液（１９ｍＬ）に、ピリジンボラン（０．４５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（１．４ｍＬ）を添加した。次いで、２．４Ｍクエン酸水溶液を加えて反応液のｐＨを７．６に調整した後に、２５℃まで昇温した。反応液を１時間撹拌した後、ジメチルアミンボラン（３．６ｍｍｏｌ）の水溶液を加えた。３時間撹拌後、更にＮ’Ｎ−ジエチルアニリンボラン（０．４５ｍｍｏｌ）のエタノール溶液を添加し、１時間攪拌した。
得られた担体を、グラスフィルター上で、逆浸透水を用いて洗浄し、さらに、０．１Ｍクエン酸水溶液、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋０．５Ｍ硫酸ナトリウム混合水溶液（石田化学工業製硫酸ナトリウムを使用）、クエン酸緩衝液（０．５Ｍクエン酸三ナトリウム２水和物＋クエン酸１水和物，ｐＨ＝６）にて順次洗浄した。最終的に、逆浸透水を用いて、洗浄濾液の電気伝導度が５μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、リガンド固定化吸着体を得た。
試験例１： 余剰ホルミル基量の測定
余剰ホルミル基とフェニルヒドラジンが反応することを利用し、反応後のフェニルヒドラジン残量から、不溶性基材に残留するホルミル基量を見積もった。具体的には、各吸着体４ｍＬをｐＨ８の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファで洗浄後、総液量６ｍＬに調整し、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ２ｍＬを添加し、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、得られたフェニルヒドラジンの上清中残量より、消費されたフェニルヒドラジン量を余剰ホルミル基量として見積もった。結果を表１に示す。
試験例２： リガンド漏出量の測定
前記実施例および比較例で作製したリガンド固定化吸着体にヒトＩｇＧを吸着させた場合におけるリガンド漏出量を求めた。
（１）溶液調製
下記Ａ〜Ｅ液と中和液を調製し、使用前に脱泡した。
Ａ液： Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（和光純薬工業製）と逆浸透水を用いて調製したｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液
Ｂ液： ３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液に酢酸でｐＨ３．５に調整した酢酸ナトリウムバッファ（酢酸ナトリウム、並びに酢酸は何れも和光純薬工業製）
Ｃ液： 和光純薬工業製りん酸と逆浸透水を用いて調製した０．１Ｍりん酸水溶液
Ｄ液： ポリクロナール抗体（バクスター社製「ガンマガード」）と前記Ａ液を用いて調製した濃度３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液
Ｅ液： 水酸化ナトリウムおよび逆浸透水で調製した０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
中和液： シグマアルドリッチ製のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと逆浸透水で調製した２Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液
（２）充填と準備
カラムクロマトグラフィー用装置（ＧＥヘルスケア社製「ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００」）に、前記実施例または比較例で作製した吸着体試料を充填した直径０．５ｃｍ×高さ１５ｃｍのカラムを接続した。フラクションコレクターに、予め中和液３ｍＬを入れた１５ｍＬ採取用チューブをセットした。
（３）ＩｇＧ精製
前記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液（ＩｇＧ水溶液）を５０ｍＬ通液した。次いで、Ａ液を２１ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液することによりＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を９ｍＬ、Ａ液を９ｍＬ、Ｅ液を１５ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なおＤ液の流速は０．５ｍＬ／分、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ液の流速は１ｍＬ／分とし、吸着体との接触時間が６分または３分となるようにした。
（４）リガンドの漏出量の測定
リガンドの漏出量を評価するために、ＩｇＧ溶出液に含まれるリガンド量を測定した。具体的には、前記試験例２（３）で得られた溶出液を回収し、溶出液中のＩｇＧ量とリガンドの量を測定し、精製ＩｇＧ中に漏出したリガンド濃度を漏出量として求めた。リガンド濃度はＥＬＩＳＡ法で測定した。還元剤の種類並びに添加方法と、リガンド漏出量並びに余剰ホルミル基量との関係を、表１に示す。
Figure 2019138957
表１に示す結果の通り、１種類の還元剤だけの使用では、リガンド漏出量または余剰ホルミル基量において改善の余地があったが、２つ以上の還元剤を使用することで、余剰ホルミル基量が十分に低減されており、且つリガンド漏出量を抑制可能であることを証明した。また、２種類以上の還元剤を同時ではなく、別々に逐次使用することでその効果が更に高いことも証明した。

Claims (9)

  1. ホルミル基含有不溶性基材に、アミノ基を有するリガンドを固定化する方法であって、
    前記リガンドと前記ホルミル基含有不溶性基材とを混合することによりイミンを形成する工程、および、
    ２種類以上の還元剤を使用することにより前記イミンを還元する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記２種類以上の還元剤を別々に添加することにより前記イミンを還元する請求項１に記載の方法。
  3. 前記還元剤としてｐＫａが６．５以下のルイス塩基を配位子とするボラン錯体を使用した後に別の還元剤を使用することにより前記イミンを還元する請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｐＫａが６．５以下のルイス塩基が、窒素含有複素環式芳香族化合物である請求項３に記載の方法。
  5. 前記リガンドとしてペプチドを用いる請求項１から４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ペプチドが抗体特異的に結合可能である請求項５に記載の方法。
  7. 前記ホルミル基含有不溶性基材が、多糖類、合成ポリマー、およびガラスからなる群より選択される少なくとも１種により構成されているものである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記ホルミル基不溶性基材の形状が、多孔性粒子、モノリス、および多孔性膜からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 標的化合物を精製する方法であって、
    請求項１から８のいずれかに記載の方法により前記ホルミル基含有不溶性基材に前記リガンドを固定化して吸着体を製造する工程、
    前記標的化合物を含む混合液と前記吸着体とを接触させることにより、前記標的化合物を前記吸着体に吸着させる工程、および、
    前記吸着体に吸着した前記標的化合物を前記吸着体から分離する工程を含むことを特徴とする方法。
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