DK165925B - Fremgangsmaade til rensning af immunoglobulin g ved hjaelp af immobiliseret carboxyleret polyethyleniminsilan - Google Patents

Description

i

DK 165925B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af i alt væsentligt renset immunoglobulin G fra en prøve af en biologisk væske indeholdende immunoglobulin G, hvorved immunoglobulin G adskilles og genvindes 5 fra prøven ved at anvende væskechromatografi eller fastfase-ekstraktion, hvor henholdsvis den chromatografiske pakning eller fastfasematricen i alt væsentligt består af partikler, hvortil polyethyleniminopropyltrimethoxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på 400 til 1800 D er bundet i covalent 10 bundet, ikke-tværbundet form, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at polyethyleniminopropyltrimethoxysilanet er carboxyleret og er bundet til partikelformig silicagel med en gennemsnitspartikeldiameter på 3 til 70 μιη og en gennemsnitsporestørrelse på 50 til 1000 Å eller til partikel-15 formigt glas med kontrolleret porestørrelse med en gennemsnitspartikeldiameter på 37 til 177 μτη. og en gennemsnitsporestørrelse fra 40 til 1000 Å.

I US-patentskrift nr. 4.469.630 er beskrevet en rensning af monoklonalt antistof af typen IgG under an-20 vendelse af den ikke-carboxylerede form af det ovenfor beskrevne covalent bundne, ikke-tværbundne polyethylen-imin-reaktionsprodukt. Det har nu overraskende vist sig, at den carboxylerede form af det ovenfor anførte reaktionsprodukt, som danner en kationbyttermatrix, effektivt 25 og selektivt binder IgG-antistofferne, der er til stede i biologiske væsker. Medens den ikke-carboxylerede an-ionbyttermatrix, der er beskrevet i US-patentskrift nr.

4.469.630, yderligere binder størsteparten af ascites-væskeproteinerne og derpå selektivt udskiller IgG-anti-30 stoffet, binder den her anvendte carboxylerede kationbyttermatrix primært IgG.-antistoffet og efterlader størsteparten af det øvrige proteinmateriale ubundet i den biologiske væske. Det er meget usædvanligt og ikke til at forudsige, at et protein vil binde både til en an-35 ionisk (positivt ladet) og en kationisk (negativt ladet) matrix inden for praktisk taget samme pH-område.

DK 165925B

2

Den specielle carboxylerede form af silicagel, som bærer ikke-tværbundne, covalent bundne polyethylenimin--funktioner, i det følgende undertiden omtalt som "carb-oxyleret-PEI-PrSi-silicagel", og den specielle carboxy- 5 lerede form af glas med kontrolleret porestørrelse, son bærer ikke-tværbundne, covalent bundne polyethylenimin--funktioner, i det følgende undertiden omtalt som "carboxyl eret-PEI-Pr Si-CPG" , for nemheds skyld, som anvendes ifølge opfindelsen, er beskrevet i den sideløbende US-pa-10 tentansøgning serie nr. 555.368, som har ført til US patentskrift nr. 4.540.486 (udstedt 10. september 1985). Relevante dele fra denne ansøgning er gengivet i det følgende.

Uddrag fra US-patentansøgning serie nr. 355.368: "Den ikke-tværbundne, covalent bundne PEI-silica-15 gel og glasprodukter ifølge opfindelsen fremstilles hensigtsmæssigt under anvendelse af de følgende trin: A. Omsætning af enten partikelformig silicagel med en gennemsnitspartikeldiameter på ca. 3 til ca. 70^,um og en gennemsnitsporestørrelse på ca. 50 til ca.

20 1000 Å eller partikelformig glas med kontrolleret porestørrelse med en gennemsnitspartikeldiameter på ca. 37 til 177^um og en gennemsnitsporestørrelse på ca. 40 til ca. 1000 Å i en indifferent organisk opløsningsmiddelopslæmning med en lavere al-25 kanolopløsning af polyethyleniminopropyltrimeth- oxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på ca.

400 til ca. 1800, hvilken omsætning gennemføres ved omgivelsestemperatur til tilbagesvalingstemperatur i ca. 2 til ca. 50 timer, 30 B. genvinding af den resulterende faste fraktion fra reaktionsblandingen og C. opvarmning af den faste fraktion ved en sådan temperatur og i tilstrækkelig lang tid til at tørre cg binde silanen helt til henholdsvis silicagel eller 35 glas med kontrolleret porestørrelse.

O

3

DK 165925 B

Som anvendt her betyder udtrykket "covalent bundet", at PEI-delene er knyttet covalent til silicagelen eller glasset med kontrolleret porestørrelse ved kemisk vekselvirkning, som resulterer i en propyl-silyl (Pr-Si) bin-5 ding, og udtrykket "ikke-tværbundet" betyder, at imino-og aminogrupperne på de tilstødende covalent bundne PEI-dele ikke er tværbundet eller har reageret med et tværbindingsmiddel til dannelse af et polymert lag.

Uden at være bundet heraf, antages det, at reaktionen 10 løber fuldstændig til ende i to trin som følger:

Trin 1: Silica-hydroxylgrupper og methoxygrupperne på silanen reagerer til dannelse af Si-O-Si--bindinger og fri methanol, idet nogle meth-oxygrupper forbliver tilbage, som ikke rea-15 gerer:

li—OH MeQ^ Pr-PEI !!i-0^ ^Pr-PEI

20 + si -2 MeOH^ Si / \ —* I. /\ !5i—OH MeO OMe Si—O OMe 25 30 35

O

4

DK 165925 B

Trin 2; Reaktionen med de resterende methoxygrupper bringes til ende under varmebehandling, jfr. a) og b): 5 a) i.

bi—O ^Pr-PEI i! i—O.

s* ^Si-Pr-PEI

10 / \ Si—O

Si-O OMe -MeOMe ^ varme 0 S ι-o OMe \ / si—O^

Si N.

/ \ J^Si-Pr-PEI

15 $i—O Pr-PEI si—O—

b) I

$i-0^ ^Pr-PEI fi-0\ 20 Si -MeOH ^ \

I. / \ varme ' $i—O-Si-Pr-PEI

S l-O OMe /

Si—OH Si—O

25 30 35

O

DK 165925B

5

Silicagel, der består af amorft siliciumdioxid, er kommerciel tilgængelig i uregelmæssige og kuglefor-mige (foretrukket) partikler og i flere kommercielle kvaliteter med mesh-størrelser i området fra 3 til 5 325 (ASTM). Fremfor at stole på en numerisk angivelse af mesh-størrelse, er til opfindelsens formål mere nøjagtige kendetegn imidlertid silicagelpartiklernes gennemsnitsdiameter og gennemsnitsporestørrelse, henholdsvis fra ca. 3 til ca. 70yUm og fra ca. 50 til 1000, for-10 trinsvis 250 til 500 Å. Når produkter skal anvendes til pakning af HPLC-chromatograf isøj ler,, foretrækkes der som udgangsmateriale en silicagel med ca. 3 til ca. lO^um, og til pakning af lavtrykschromatografisøj ler foretrækkes der en silicagel med ca. 40 til ca. 70yUm.

15 Glas med kontrolleret porestørrelse (CPG), som er et silicat, som indeholder et støttemateriale, der kemisk er lig med det siliciumdioxid, der anvendes i væskechro-matografi, er kommercielt tilgængeligt f.eks. fra Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, og har en gennemsnits-20 partikeldiameter på 37 til 177^um og en gennemsnitspore størrelse på 40 til 1000 Å, fortrinsvis 40 til 500 Å.

Eksempler på indifferente organiske opløsningsmidler, der er egnet til fremstilling af silicagel- eller CPG--opslæmningen, er aliphatiske carbonhydrider, såsom hexan, 25 heptan og lignende, aromatiske carbonhydrider, såsom ben zen, toluen, xylen og lignende, lavere alkanoler, såsom ethanol, isopropanol, butanol og lignende, chlorerede me-thaner, såsom methylenchlorid, chloroform, carbontetra-chlorid og lignende (advarsel: sådanne chloropløsningsmid-30 ler kan reagere ved højere temperatureri), og sådanne andre indifferente opløsningsmidler som tetrahydrofuran, glym, diglym og lignende. Almindeligvis giver et forhold på 1:5 af silicagel eller CPG i gram og opløsningsmiddel i ml en passende opslæmning. På grund af den fine, uopløse-35 lige natur af den partikelformige silicagel og CPG, fås der snarere en opslæmning end en ægte opløsning.

O

6

DK 165925 B

Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan, også kendt som (N-trimethoxysilylpropyl)-polyethylenimin, er et reaktionsprodukt mellem polyethylenimin og aminopropyl- trimethoxysilan og kan gengives ved den følgende formel: 5 JMe i -CH 2CH 2CH 2”NH- ( CH 2CH 2NH ) n“CH 2CH 2“NH 2 (I) 0Me 10 hvor til opfindelsens formål n er et helt tal fra ca. 4 til ca. 37 eller udtrykt i gennemsnitsmolekylvægt fra ca.

400 til ca. 1800.

Silanen (I) anvendes i reaktionen med silicagelen eller CPG i form af en lavere C.-C^-alkanolopløsning 15 X o under anvendelse af tilstrækkelig alkanol til at opløseliggøre silanen. Der foretrækkes en 50% w/w isopropanol-opløsning. Almindeligvis anvendes der 25 til 100 g silan eller alternativt ca. 50 til 200 ml af en 50% w/w alkanol-opløsning af silanen til reaktion med hver 100 g silicagel 20 eller CPG. Reaktionen kan gennemføres ved omgivelsestem-peratur, selv om der kan anvendes forhøjede temperaturer op til tilbagesvalingstemperaturen for reaktionsopløsningsmiddelsystemet for at forøge reaktionshastigheden. Reaktionen forløber let til næsten fuldendelse (trin 1) i lø-25 bet af 2-50 timer. Det er fordelagtigt at anvende omrøring under blandingen af reaktanterne, selv om reaktionen derpå kan fortsætte uden yderligere omrøring. Vandfrie betingelser er ikke kritisk, idet det har vist sig, at tilstede- - værelsen af en lille smule vand, f.eks. ca. 0,1 til 1,0 ml 30 prv 50 ml opslæmningsopløsningsmiddel, ikke har en uheldig indvirkning på reaktionen.

Den fremstillede faste fraktion udvindes fra reaktionsblandingen under anvendelse af gængse fysiske midler, f.eks. filtrering, centrifugering etc. Almindeligvis er 35 filtreringsmidler, der er tilstrækkelige til at tilbageholde en partikelstørrelse på 5^um, egnede, medens, centri- o

7 DK 165925 B

fugering er egnet til en partikelstørrelse på 3^um.

Den genvundne faste fraktion varmehærdes derpå ved en temperatur og i så lang tid, at der sker en tørring og fuldstændig covalent binding af silanen til si-5 licagelen eller CPG. Generelt har ca. 1 til 4 timer ved ca. 40-120°C vist sig at være tilstrækkelig. Det således fremstillede covalent bundne, ikke-tværbundne slutprodukt indeholder fortrinsvis fra ca. 0,5 til ca. 3,8% nitrogen .

10 De således fremstillede svagt basiske PEI-PrSi- -silicagel- eller PEI-PrSi-CPG-produkter kan omdannes til en svagt sur, carboxyleret form ved gængs behandling, jfr. f.eks. S. Gupta et al., Anal. Biochem. 128, 196-201 (1983), med et passende dibasisk syreanhydrid i et indif-15 ferent organisk opløsningsmiddel. Typiske anhydrider er f.eks. ravsyreanhydrid, glutarsyreanhydrid, diglycolsyre-anhydrid og lignende. Der anvendes så meget anhydrid, at der sker en reaktion med praktisk taget alle imino- og aminofunktionerne på PEI-delen. Antallet af carboxylgrup-20 per i det resulterende succinoylerede produkt, kan f.eks.

bestemmes ved gængs titrering mod passende alkali. Til den foreliggende opfindelses formål foretrækkes der et carboxyl-milliækvivalent pr. gram slutprodukt på ca.

0,3 til ca. 1,2." - Uddrag slut.

25 De ovenfor beskrevne svagt sure carboxyleret-PEI- -PrSi-silicagel- og carboxyleret PEI-PrSi-CPG-produkter omtalt i US patentansøgning serie nr. 355,368, som er de N-acylerede reaktionsprodukter fra et dibasisk syreanhydrid, såsom ravsyreanhydrid (foretrukket), glutarsyre-30 anhydrid, diglycolsyreanhydrid og lignende, og imino- og aminofunktionerne på PEI-delen i PEI-PrSi-silicagelen eller PEI-PrSi-CPG, er de fastfasematerialer, der anvendes i de her omhandlede chromatografiske rensningsmetoder og ekstraktionsrensningsmetoder.

35

DK 165925B

8

De i US patentansøgning serie nr. 355.368 anførte carboxylerede produkter er sådanne, hvor udgangssilicagelen har en gennemsnitspartikeldiameter på 3 til 70 μιη og en gennemsnitsporestørrelse på 50 til 100 Å, fortrinsvis 250 5 til 500 Å, hvor udgangsglasset med kontrolleret porestørrelse (CPG) har en gennemsnitspartikeldiameter fra 37 til 177 μιη og en gennemsnitsporestørrelse fra 40 til 100 Å, fortrinsvis 40 til 500 Å, hvor desuden udgangspolyethyleniminopropyltri-methoxysilanen, som senere bindes til den partikelformige 10 silicagel eller det partikel formige CPG i en covalent bundet, ikke-tværbundet form, har en gennemsnitsmolekylvægt på 400 til 1800, og hvor den resterende carboxylsyrefunktionalitet i det dibasiske syresegment (carboxylgruppen i det anførte segment er placeret terminalt), som er knyttet til imino-15 og aminofunktionerne på PEI-delen, fortrinsvis giver et carboxyl-milliækvivalent pr. gram carboxyleret-PEI-PrSi--silicagel eller carboxyleret-PEI-PrSi-CPG produkt på 0,3 til 1,2.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes 20 der en fremgangsmåde til fremstilling af praktisk taget renset immunoglobulin G, også kendt som antistof type IgG, fra en biologisk væske indeholdende det anførte antistof, ' såsom f .eks. plasma, serum, supernatantvæske fra vævsdyrkningsceller, der producerer IgG-antistof, ascites-25 væske og lignende, ved at anvende enten væskechromatogra-fi eller fastfaseekstraktion, hvor væskechromatografi-pakkematerialet eller fastfaseekstraktionsmatrixen indeholder den ovenfor anførte partikelformige carboxyleret--PEI-PrSi-silicagel eller carboxyleret-PEI-PrSi-CPG.

30 Det har nu vist sig, at en sådan chromatografisk pakning eller fastfasematrix er særlig anvendelig til væskechromatografi og fastfaseekstraktion til preferen-tiel (selektiv) binding af IgG-antistoffer og fjernelse 35

O

DK 165925B

9 deraf fra de fleste andre proteiner i den biologiske væske. Det bundne IgG-antistof kan derpå elueres fra fastfasema-tricen i praktisk taget renset form eller kan adskilles yderligere og renses for små mængder andet bundet protein 5 i væskechromatografi ved gradienteluering under anvendelse af passende vandige puffere. Som anvendt her betyder udtrykket "praktisk taget renset", at mere end 70% af det tilstedeværende protein i den kvantitativt genvundne IgG--antistoffraktion er IgG-antistoffet. Ved den foretrukne 10 fremgangsmåde ifølge opfindelsen, væskechromatografi, er faktisk mere end 90% af proteinet, dvs. væsentlig homogenitet, i den kvantitativt genvundne IgG-antistoffraktion IgG-antistoffet. Renhedsprocenten kan verificeres ved kendte metoder, f.eks. ved natriumdodecylsulfatpolyacryl-15 amidgelelektroforese, jfr. U.K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendelig til brug ved biologiske væsker, som indeholder IgG-antistof, såsom plasma, serum, vævsdyrkningssupernatant, ascites-20 væske (f.eks. ascitesvæske fra mus eller rotter) og lig nende. Udtrykket "immunoglobulin G" eller "IgG-antistof" omfatter alle monoklonale og polyklonale IgG-antistoffer og underklasser af IgG-typen, f.eks. IgG^, I(?G2b'

IgG^ t og lignende. Metodikken ved fremstilling 25 af sådanne væsker eller opløsninger eller stoffer inde holdende antistof er kendt, jfr. f.eks. "Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses" af R.H. Rennet et al., udgivet af Plenum Press,

New York, 1980 og "Methods in Enzymology" af G. Galfred 30 og C. Milstein, redigeret af J.J. Langone og H. Van

Vunakis, bd. 73, s. 31-46, udgivet af Academic Press, 1981.

Isoleringen af IgG-antistof i stærk renset form er klart ønskelig. F.eks. til in vivo terapeutiske formål er 35 det nødvendigt, at IgG-antistof er så rent og så koncen-

10 DK 165925 B

O

treret som muligt for at formindske uheldige bivirkninger og for at maksimere det tilsigtede terapeutiske formål. Tilsvarende er til in vitro diagnosticeringsformål sådan renset og koncentreret antistof ønskeligt for at 5 maksimere sensitiviteten og specificiteten af den pågældende diagnosticeringstest.

Den biologiske væske, som indeholder IgG-antistof, forbehandles fortrinsvis for at fjerne generende partikel-formigt stof og ligevægtsindstilles til en passende ion-10 styrke og pH-værdi, som er nødvendig for at opnå binding af IgG-antistoffet til carboxyleret-PEI-PrSi-silicagel-eller carboxyleret-PEI-PrSi-CPG-fastfasemateriale. Det generende partikelformige stof kan fjernes me(j q$ngse klaringsmidler, f.eks. ved filtrering eller ved centrifuge-15 ring med en kraft, der er tilstrækkelig til at pelletere det partikelformige materiale. Ligevægtsindstilling af den biologiske væske kan gennemføres mpd vilkårlige midler, son er gængse f.eks. ved chromatografisk afsaltning med en passende puffer på molekylarsigte af passende type og pore-20 størrelse, såsom sådanne, der er kommercielt tilgængelige under navnet "Sephadex", ved fortynding med eller dialyse mod en passende puffer og lignende til ligevægtsindstilling af den biologiske væske til en pH-værdi, der er mindre end den pH-værdi (den pH-værdi, ved hvilken det monoclonale 25 antistof ikke bærer nogen nettoionladning i dets omgivelser), som det bestemte IgG-antistof har, men ikke lavere end en pH-værdi på 5,5, og til en ionstyrke, der er lig med eller mindre end ionstyrken af pufferen med lavere ionstyrke, som anvendes til eluering i den følgende behandling af den bio-30 logiske væske.

35

DK 165925 B

11 o

Til rensning ved væskechromatografi til praktisk taget ensartethed, pakkes chromatografiske søjler, der er anvendelige til brug i væskechromatograf i* med den ovenfor beskrevne porøse chromatografiske matrix af carboxy-5 leret-PEI-PrSi-silicagel eller carboxyleret-PEI-PrSi- -CPG. Egnede stål eller glassøjler til chromatografisk brug er sådanne, som har en længde på 5-100 cm og indvendige diametre på 1 til 100 mm. Valg af passende chromatografiske parametre, såsom søjlepakningsteknik, 10 søjlestørrelse, søjletemperatur, tryk og lignende, be stemmes let af enhver fagmand.

Den pakkede søjle ligevægtsindstilles i en chromatograf ved at passere en passende pufferopløsning gennem søjlen. Efter dette pufferligevægtsindstillingstrin 15 anvendes søjlen til chromatografisk adskillelse af pro teinkomponenterne i den biologiske væske, der som bemærket på forhånd kan være blevet befriet for partikel-formig stof og ligevægtsindstillet til en passende ionstyrke og pH-værdi. En prøve af den biologiske væske over-20 føres til den puffer-ligevægtsindstillede søjle for se lektivt at binde IgG-antistoffet og mindre forurenende proteiner til det chromatografiske pakningsmateriale henholdsvis carboxyleret-PEI-PrSi-silicagel eller carboxy-leret-PEI-PrSi-CPG.

25 Det bundne IgG-antistof kan derpå selektivt elueres ved gængse gradientelueringsteknikker, idet der skal tages hensyn til de indbyrdes afhængige chromatografiske parametre som tid, strømningshastighed og gradientform for at frembringe gradienter med stigende ionstyrke og/eller 30 stigende pH-værdi. Kationiske puffere, f.eks. kalium- phosphat, trisacetat, ammoniumacetat, natriumchlorid og lignende, med pH-værdier på 5,5 til 8,3 kan anvendes til frembringelse af sådanne gradienter til elu- ering af det bundne IgG selektivt fra det carboxylerede 35

DK 165925B

12 pakningsmateriale. Gradienten kan f.eks. med fordel dannes i løbet af 1/2 til 4 timer med en strømningshastighed på 0,1 ml/min. til 2 1/min.

Alternativt kan det bundne antistof sammen med mindre 5 urenheder elueres i et enkelt trin med en pufferopløsning med tilstrækkelig høj ionstyrke til at frigøre det bundne antistof i praktisk taget renset form. En sådan metode med selektiv binding og efterfølgende enkelttrinseluering kan beskrives som fastfaseekstraktion, som kan gennemføres 10 i en søjle som beskrevet ovenfor eller i en batch-proces.

Ved sidstnævnte omrøres fastfasematricen bestående af carb-oxyleret PEI-PrSi-silicagel eller carboxyleret-PEI-PrSi--CPG med den ligevægtsindstillede biologiske væske, hvorpå matrice og væske adskilles med gængse midler, såsom ved 15 dekantering eller centrifugering, og IgG-antistoffet derpå elueres fra matricen ved omrøring med en vandig puffer med passende ionstyrke til frigørelse af det bundne IgG-anti-stof.

De opløste proteiner kan identificeres med ethvert 20 kendt middel, f.eks. ved måling af ultraviolet absorbering ved 280 nm. De eluentfraktioner, som indeholder de fraskilte proteiner, kan opsamles manuelt eller ved brug af en fraktionssamler. Den eluentfraktion, som indeholder det homogene IgG-antistof, kan identificeres ved kendte midler, så-25 som ved radioimmunanalyse udviklet til det specielle antistof eller andre antistof-antigenreaktioner eller ved poly-acrylamidgelelektroforese.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har vist sig at være uafhængig af det samlede rumfang biologisk væske inde-30 holdende IgG-antistoffet, og der er ikke nogen begrænsende faktor med undtagelse af den mængde carboxyleret-PEI-PrSi--silicagel eller carboxyleret-PEI-PrSi-CPG, der anvendes som fast chromatografisk pakning eller fastfasematrix, dvs. fremgangsmåden er operabel sålænge kapaciteten af det faste 35 støttemateriale ikke overskrides.

13

O

DK 165925 B

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen separeres derfor en biologisk væske, som indeholder antistof af type IgG, ved væskechromatografi eller fastfaseekstrak-tion til tilvejebringelse af antistoffet i praktisk taget 5 renset form.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, men skal dog ikke betragtes som værende begrænsende herfor. Eksemplerne 1-5 viser de ikke-carboxylerede reaktionsprodukter anført i 10 US patentansøgning serienr. 355.368, eksemplerne 6-8 viser de carboxylerede reaktionsprodukter beskrevet i US patentansøgning serienr. 355.368, og eksemplerne 9-11 viser anvendelsen af sådanne carboxylerede produkter i ekstraktions- og rensningsprocesserne ifølge opfindelsen.

15

Eksempel 1 A. Til en opslæmning af 10 g silicagel med en gennemsnitspartikeldiameter på 40^,um og en gennemsnitsporestørrelse på 60 Å, kommerciel tilgængelige fra J. T.

20 Baker Chemical Co., Phillipsburg, N.J., i uregelmæssig form som "Silicagel nr. 7024", i 50 ml toluen sættes under omrøring 19,71 g af en 50% w/w isopropanolopløsning af polyethyleniminopropyltrimethoxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på 400-600 (antagelig 500), kommerciel tilgænge-25 lig fra Petrarch Systems Inc., Bristol, PA, som " (N- -trimethoxysilylpropyl)-polyethylenimin PS076". Blandingen omrøres ved stuetemperatur (ca. 25°C) i ca. 1 time og 10 minutter og får derpå lov at henstå natten over (ca. 17 timer) uden omrøring. Omrøringen gennemføres igen i yder-30 ligere 5 timer og 40 minutter ved stuetemperatur, og blandingen får igen lov at henstå natten over. Derpå filtreres blandingen over et middelfrittet glasfilter. Filtratet vaskes med 50 ml toluen to gange og med 50 ml methanol to gange for at sikre, at eventuelt overskud af si-35 lanreaktant fjernes, hvorpå det ovntørres ved 80-85°C i ca. 3 timer og 30 minutter til dannelse af ca. 12 g cova-

O

14

DK 165925B

lent bundet PEI-silicagelprodukt, nitrogenindhold ca.

3,9%.

B. Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1-A gentages, idet der dog sættes 1 ml vand til silicagel/si-5 lanblandingen. Udbyttet af det PEI-bundne silicagelpro- dukt er ca. 13,3 g, nitrogenindhold ca. 5,5%.

Eksempel 2

Der fremstilles en opløsning af 20 g silicagel med 10 en gennemsnitspartikeldiameter på 5,25^um og en gennemsnitsporestørrelse på 330 Å, kommercielt tilgængelig fra The Sep A Ra Tions Group, Hesperia, CA, som kugleformig silicagel under varebetegnelsen "Vydac A", katalog nr. 101T9B5, i 100 ml toluen og 2 ml vand, og opslæmningen 15 omrøres i 10 minutter ved stuetemperatur. Hertil sættes under omrøring 39,4 g af en 50% w/w isopropanolopløsning af polyethyleniminopropyltrimethoxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på 500, og blandingen omrøres i yderligere 5 minutter. Blandingen får derpå lov at henstå natten over 20 ved stuetemperatur. Derpå filtreres blandingen under an vendelse af en l,0^um filtertragt. Filtratet vaskes med 50 ml toluen to gange og 50 ml methanol to gange, hvorpå det lufttørres på tragten og til slut ovntørres ved 80--85°C i ca. 3 timer og 30 minutter til dannelse af det 25 PEI-bundne silicagelprodukt, nitrogenindhold ca. 2,85%.

Eksempel 3

Der fremstilles en opslæmning af 20 g 230-400 mesh (ASTM) silicagel med en gennemsnitspartikeldiameter på 30 40-63^um og en gennemsnit spor es tørrelse på 420 Å, kommer cielt tilgængelig fra E. Merck Reagents, Tyskland, under varebetegnelsen "Fractosil 500", i 50 ml methanol og 1 ml vand, og der omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur. Der fremstilles ligeledes en separat opløsning af 35

15 DK 165925 B

o 11,2 g af en 50% w/w isopropanolopløsning af polyethylen-iminopropyltrimethoxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på 1800 i 100 ml methanol. Silanopløsningen sættes derpå til silicagelopslæmningen i løbet af 5 minutter under 5 omrøring. Efter endt tilsætning afbrydes omrøringen, og blandingen får lov at henstå ved stuetemperatur i 50 timer. Derpå filtreres blandingen over sintret glas i mellemstørrelse. Filtratet vaskes med 3 x 50 ml methanol under formindsket tryk og ovntørres derpå ved 80-85°C 10 i ca. 4 timer til dannelse af det PEI-bundne silicagel- produkt, nitrogenindhold ca. 1,1%.

Eksempel 4

Der fremstilles følgende reaktionsblandinger i over-15 ensstemmelse med det i de foregående eksempler anførte:

Komponenter ABC

Silicagel (5/Um, 330 Å) 10 g 10 g 10 g 20 Isopropanol 50 ml 50 ml 50 ml

Vand 0,5 ml 0,25 ml 0,1 ml PEIPr-triMeO-silan (molekylv.=600) som 50% w/w i-PrOH opl. 9,9 g 4,95 g 2 g 25

Hver reaktionsblanding omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur og får derpå lov at henstå uden omrøring i 41 timer og 30 minutter. Hver blanding filtreres, vaskes 30 1 gang med 50 ml isopropanol og to gange med 50 ml metha nol. Hvert filtrat ovntørres ved 80-85°C i ca. 3 timer og 12 minutter til dannelse af de respektive PEI-bundne sili-cagelprodukter, A: 1,2% N, B: 1,0% N, C: 0,9% N.

35

16 DK 165925 B

o

Eksempel 5 A. Til en opslæmning af 10 g silicagel med en gennemsnit spar tikeldiameter på 40^um og en gennemsnitsporestørrelse på 50 Å i 50 ml hexan sættes der 19,71 g af 5 en 50% w/w i-PrOH opløsning af PEIPr-triMeO-silan med en gennemsnitsmolekylvægt på 500. Blandingen omrøres i 5 minutter ved stuetemperatur og opvarmes derpå til tilbagesvalingstemperatur i ca. 2 timer. Blandingen får lov at afkøle til stuetemperatur, hvorpå den filtreres og 10 vaskes med 50 ml hexan to gange og 50 ml methanol to gange.

Filtratet ovntørres derpå ved 80-85°C i ca. 3 timer til dannelse af det PEI-bundne silicagelprodukt.

B. Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 5-A gentages, idet der dog i stedet for den der anvendte silicagel an- 15 vendes samme mængde glas med kontrolleret porestørrelse (125^um, 240 Å) til dannelse af det tilsvarende covalent bundne, ikke-tværbundne PEI-PrSi-CPG-produkt.

Eksempel 6 20 Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2 gentages, idet dog 25 g silicagel (5,25^,um, 330 Å) i 125 ml toluen og 2,5 ml vand omsættes med 50 g af en 50% w/w i-PrOH opløsning af PEIPr-triMeO-silan (molekylvægt 500) til dannelse af ca. 29,4 g af det PEI-bundne silicagelprodukt.

25 Dette produkt blandes derpå med 125 ml toluen og 10 g ravsyreanhydrid, og blandingen roteres i et 80°C varmt vandbad i 2 timer. Derpå tilsættes der 20 ml methanol, og blandingen filtreres. Det udvundne succinoylerede PEI--bundne silicagelprodukt vaskes successivt med 1 x · 30 50 ml toluen, 2 x 50 ml methanol og 1 x 50 ml ethylether.

Produktet tørres derpå ved ca. 80°C i ca. 48 minutter. Titrering af produktet mod IN natriumhydroxid viser et carboxyl-milliækvivalent på ca. 0,65 pr. g produkt, 35 o

17 DK 165925 B

Eksempel 7 A. 500 g silicagel (40-55^um, 250 Å) opslæmmes i 2500 ml toluen. Denne opslæmning tilsættes 247,5 g po-lyethyleniminopropyltrimethoxysilan (gennemsnitsmole- 5 kylvægt = 600) som en 50% opløsning i isopropanol. Blandingen omrøres i 15 minutter og får derefter lov at henstå i 48,5 timer ved stuetemperatur. Derpå filtreres blandingen, og den faste fase vaskes to gange med 1000 ml toluen efterfulgt af to yderligere vaskninger med 1000 ml 10 methanol. Den vaskede faste fase tørres og hærdes i en ovn ved 85°C i 5 timer. Udbytte af PEI-PrSi-silicagel-produkt er ca. 570 g.

200 g af dette PEI-PrSi-silicagelprodukt opslæmmes med 1000 ml toluen, hvortil der sættes 54 g ravsyre-15 anhydrid. Blandingen anbringes i et roterende rysteappa rat i et 40°C vandbad i 3 timer og 40 minutter, hvorpå der tilsættes 200 ml methanol, og blandingen filtreres.

Den således fremstillede succinoylerede PEI-PrSi-silica-gel vaskes fire gange med 500 ml methanol og ovntørres 20 ved 85°C i 3 timer. Udbytte: 217,1 g. Carboxyltiter: 0,65 milliækvivalent/g. Analyse: 10,24% C, 1,88% H og 2,75% N.

B. Ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 7A, idet der dog i stedet for ravsyreanhydridet an- 25 vendes en ækvivalent mængde glutarsyreanhydrid og digly- colsyreanhydrid fås den tilsvarende glutaroyl-PEI-PrSi--silicagel og diglycoloyl-PEI-PrSi-silicagel som produkter .

30 Eksempel 8

Til 350 g silicagel (15-20^um, 300 Å) opslæmmet i 1750 ml isopropanol sættes 173 ml af en 50% w/w opløsning af polyethyleniminopropyltrimethoxysilan i isopropanol. Blandingen omrøres i 15 minutter og henstilles 35 derpå i 42 timer. Derpå filtreres blandingen, og de o

18 DK 165925 B

faste stoffer vaskes to gange med 750 ml isopropanol efterfulgt af to yderligere vaskninger med 750 ml methanol. Den vaskede faste fase tørres og hærdes i en ovn ved 85°C i 3,5 timer. Udbytte af PEI-PrSi-silica-5 gelprodukt er ca. 376,3 g. Analyse: 1,20% N.

200 g af dette PEI-PrSi-silicagelprodukt opslæm-mes med 1000 ml toluen, og der tilsættes 54 g ravsyre-anhydrid. Blandingen roteres i et 40°C vandbad i 2 timer og 10 minutter, hvorpå der tilsættes 300 ml methanol.

10 Reaktionsblandingen filtreres derpå, og den faste fase ovntørres ved 85°C i 2 timer, hvorved der fås ca. 207,1 g succinoyl-PEI-PrSi-silicagelprodukt (15-20yum, 300 Å). Carboxyltiter: 0,3 milliækvivalent/g. Analyse: 5,07%C, 0,95% H og 1,05%N.

15

Eksempel 9 A. En 200 mg prøve af den ovenfor i eksempel 7A fremstillede succinoyl-PEI-PrSi-silicagel pakkes mellem to polyethylenfritter med en porestørrelse på 20^,ul i 20 en 1 ml polypropylensprøjtecylinder. 2 ml 0,01M kalium- phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,6 suges gennem søjlen med et vakuum på 50 cm Hg ved hjælp af en vakuummanifold kommerciel tilgængelig under betegnelsen "Baker-10 SPE. System", J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, 25 N.J. En lOO^ul prøve af supernatanten fra et hybridom— vævsdyrkningsmedium indeholdende immunoglobulin G af ukendt specificitet klares ved centrifugering og fortyndes derpå med 400^ul 0,01M kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,6. Hele 500^ul prøven overføres til søjlen 30 af mærket "Baker-10 SPE. . System" ved et vakuumtryk på 50 cm Hg. Eluatet isoleres. Søjlen vaskes med 4 ml 0,01M kaliumphosphat med en pH-værdi på 6,6, og eluatet opsamles. Søjlen vaskes med 2 ml 0,035M kaliumphosphat med en pH-værdi på 6,6 og til slut med 2 ml 0,1M kaliumphos-35 phat med en pH-værdi på 6,6. Ved hver vaskning opsamles o

19 DK 165925 B

eluatet. Alle de opsamlede eluater analyseres ved natrium-dodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese gennemført praktisk taget som beskrevet af U.K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970). Eluatet med 0,010M kaliumphosphat med 5 en pH-værdi på 6,6 indeholder albuminen transferrin og størsteparten af de øvrige proteiner i den oprindelige prøve eksklusive immunoglobulin G. Den kvantitativt udvundne immunoglobulin G sammen med omtrent 10% forurenende protein findes i 0,1M kaliumphosphateluatet med en 10 pH-værdi på 6,6.

B. En lignende udvinding af immunoglobulin G fås ved at følge fremgangsmåden beskrevet i eksempel 9A med en lOO^ul prøve af human serum.

C. En ækvivalent mængde glutaroyl-PEI-PrSi-silica-

15 gel og diglycoloyl-PEI-PrSi-silicagel ifølge eksempel 7B

anvendes hver især i stedet for succinoyl-PEI-PrSi-sili-cagelen ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 9A til opnåelse af en tilsvarende udvinding af immunoglobulin G.

20 Eksempel 10 A. En chromatografisk søjle bestående af rustfrit stål med en længde på 25 cm og en diameter på 0,46 mm pakkes med 3,8 g succinoyl-PEI-PrSi-silicagel fremstillet i eksempel 6 og ligevægtsindstilles med 0,01M ka-25 liumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,0 ved at pumpe pufferen gennem søjlen med en strømningshastighed på 1 ml/min. i 20 minutter. En 0,1 ml prøve af human plasma overføres til den pakkede søjle, og der opnås proteinseparation ved gradienteluering under anvendelse af en 30 120 min. lineær gradient fra 0,01M kaliumphosphat med en pH-værdi på 6,0 til 0,25M kaliumphosphat med en pH--værdi på 6,8 med en strømningshastighed på 1 ml/min. Proteinelueringen påvises under anvendelse af UV absorption ved 280 nm med fuld skalaabsorbering sat til 35 0,32 absorptionsenheder. Der ses en række absorptions-

20 DK 165925 B

o toppe ved 280 nm, som i retentionstid ligger i området fra ca. 2 minutter til ca. 50 minutter. Proteintoppen ved ca. 25 minutters retentionstid er identificeret som humanplasma-IgG-fraktionen ved en cochromatografering 5 med en kommercielt tilgængelig prøve af human IgG-anti- stof fra Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL under katalog nr. 641451 under anvendelse af den samme gradientprofil som skitseret ovenfor. Proteintoppen, der elueres ved ca. 25 minutter, bedømmes til at være mere end 70% 10 ren ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektro- forese som beskrevet af U.K. Laemmli, Nature, ibid., hvilket giver to tydelige "Coomassie blue"-bånd svarende til en molekylvægt på 50.000 dalton (tung kæde af IgG) og 25.000 dalton (let kæde fra IgG) og flere svage 15 "Coomassie blue" bånd, som repræsenterer mindre end 30% af det samlede farvede protein. Genvindingen af IgG-an-tistoffet er større end 90%.

B. Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 10A gentages to gange, idet der dogi stedet for 0,1 ml prøven af human- 20 plasma anvendt der anvendes en 1,0 ml prøve af museascites- væske indeholdende IgG-antistof, især IgG-antistof med specificitet for kvægserumalbumin og IgG-antistof med specificitet for røde blodlegemer fra får. Topretentionstiden for den førstnævnte prøve er 26 minutter og for sidst-25 nævnte 30 minutter. Den analyserede renhedsprocent og gen vinding af det ekstraherede IgG i begge prøver er mere end 90%.

C. Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 10A gentages, idet der dog i stedet for 0,1 ml prøven af humanplasma an- 30 vendesen 1,0 ml prøve af supernatant fra hybridomvævs- dyrkningsvæske indeholdende IgG-antistof af ukendt specificitet. Topretentionstiden er 45 minutter, og både den analyserede renhed og genvinding er hver især større end 90%.

35 21

DK 165925B

Eksempel 11 A. Til 1,0 ml supernatant fra et hybridom-vævsdyrkningssubstrat og 3,0 ml 0,01M kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,0 sættes 30,0 mg af suc- 5 cinoyl-PEI-PrSi-silicagelproduktet fra eksempel 8. Blandingen omrystes i 1 minut. Den bundne fase får lov at bundfælde i 1 time, og den resulterende supernatant (1) dekanteres. Den faste remanens suspenderes igen ved omrystning i 10 ml 0,01M kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 10 6,0 og bundfældes i 1 time. Den anden supernatant (2) dekan teres derefter, og den faste remanens derfra suspenderes igen ved omrystning i 1,0 ml 0,125M kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8 i 1 minut, og denne blanding får igen lov at bundfælde i 1 time. Den resulterende supernatant (3) 15 dekanteres. Hver af de tre supernatantvæsker analyseres ved HPLC-chromatografi og den tidligere anførte natriumdodecyl-sulfatpolyacrylamidgel-elektroforese. Supernatanten (3) viser sig at indeholde mere end 75% af IgG-antistoffet, der er til stede i den oprindelige prøve, i en renhed på mere 20 end 90%. De øvrige to supernatanter (1) og (2) viser sig at indeholde mindre end 5% af IgG-antistoffet. Yderligere IgG kan også genvindes fra fastfastmaterialet ved reekstraktion med 0,125M kaliumphosphatpuffer med en pH-værdi på 6,8.

B. Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 11A gen-25 tages, idet der dog i stedet for den der anvendte suc- cinoyl-PEI-PrSi-silicagel anvendes en ækvivalent mængde succinoyl-PEI-PrSi-CPG fremstillet ifølge eksempel 5B med praktisk taget de samme resultater.

30 35

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af i alt væsentligt renset immunoglobulin G fra en prove af en biologisk væske 5 indeholdende immunoglobulin G, hvorved immunoglobulin G adskilles og genvindes fra proven ved at anvende væskechro-matografi eller fastfaseekstraktion, hvor henholdsvis den chromatografiske pakning eller fastfasematricen i alt væsentligt består af partikler, hvortil polyethyleniminopropyl-10 trimethoxysilan med en gennemsnitsmolekylvægt på 400 til 1800 D er bundet i covalent bundet, ikke-tværbundet form, kendetegnet ved, at polyethyleniminopropyltrimeth-oxysilanet er carboxyleret og er bundet til partikelformig silicagel med en gennemsnitspartikeldiameter på 3 til 70 μιη 15 og en gennemsnitsporestørrelse på 50 til 1000 Å eller til partikelformigt glas med kontrolleret porestørrelse med en gennemsnitspartikeldiameter på 37 til 177 μπι og en gennemsnitsporestørrelse fra 40 til 1000 Å.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendeteg-20 net ved, at det carboxylerede reaktionsprodukt har et carboxylmilliækvivalent pr. gram produkt på ca. 0,3 til ca. 1,2.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den biologiske væske er plasma, serum, 25 vævsdyrkningssupernatant eller ascitesvæske.

4. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at prøven af biologisk væske ligevægtsindstilles til en ionstyrke, der er lig med eller mindre end ionstyrken af pufferen med lavere ionstyrke, som anvendes 30 til gradienteluering i det efterfølgende chromatografiske adskillelses- og genvindingstrin, og til en pH-værdi, der er større end det pågældende immunoglobulin G's pi.