JPS61249996A - 免疫グロブリンｇの精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明に従えば、平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平
均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位を有
する微粒シリカゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミク
ロン及び平均孔寸法約４０〜約１０００オングストロー
ム単位を有する微粒状の孔の制御されたガラスと、約４
００〜約１８００の平均分子量を有するポリエチレンイ
ミノプロピルトリメトキシシランとの共有結合非架橋ポ
リエチレンイミン反応生成物のカルボキシル化された形
態が、生物流体から実質的に精製された免疫グロブリン
Ｇを得るためにクロマトグラフィ又は抽出方法に於て固
相として利用される。

（従来の技術） エム、フラッシャ−による、名称「精製されたモノクロ
ーナル抗体」の米国特許４　、４６９　、６３０に於て
、上記の共有結合非架橋ポリエチレンイミン反応生成物
のカルボキシル化されていない形態を用いるモノクロー
ナル抗体型１３Ｇの精製が記載されて一マる。

（発明が解決しようとする点） 本発明においては、驚くべきことに、上記反応生成物の
カルボキシル化された形態は陽イオン交換マトリックス
を形成し、生物流体中に存在するＩｇＧ抗体と効果的か
つ選択的に結合することが見出された。更に米国特許４
　、４６９　、６３０に記載されるカルボキシル化され
ていない陰イオン交換マトリックスは腹水流体蛋白質の
ほとんどと結合し、次にＩｇＧ抗体を選択的に分離する
が、本明細書で用いるカルボキシル化された陽イオン交
換マトリックスは主としてＩｇＧ抗体を結合し、生物流
体中の他の蛋白質性の物質の殆どを結合させないままに
−しておく。蛋白質が陰イオンマトリックス（正の電荷
を有する）及び陽イオンマトリックス（負の電荷を有す
る）の両方に本質的に同じｐＨ範囲で結合するというこ
とは非常にめずらしいこと、予測できないことである。

（問題を解決する手段） 本発明は好ましい具体例において免疫グロブリンＧを含
有している生物流体から免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗
体を分離し精製する方法に関するが、これは、非架橋性
の共有結合されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）官能基
を有するシリカゲル又は孔の制御されたガラス（ＣＰＧ
）のカルボキシル化された形態の微粒状の静的な多孔性
の指上で液１体クロマトグラフィを用いて、約ｐＨ５，
５〜ｐＨ８，３の水性緩衝液で・カルボキシル化された
ポリエチレンイミン結合シリカゲル又はＣＰＧカラムか
らＩｇＧ抗体の勾配溶離をすることによって分離精製す
るものである。

又固相マトリックスとして上記カルボキシル化された物
質での固体相抽出手段を用いて生物流体から上記ＩｇＧ
抗体を分離精製する方法に間する。

便宜上、非架橋、共有結合ポリエチレンイミン官能基を
有するシリカゲルの微粒状のカルボキシル化された形態
は、以後　ｒカルボキシル化−ＰＥＩ−ＰｒＳｉ−シリ
カゲル」、非架橋、共有結合ポリエチレンイミン官能基
を有する微粒状の孔の制御されたガラスのカルボキシル
化された形態を、以後「カルボキシル化−ＰＥＩ−Ｐｒ
Ｓｉ−ＣＰＧＪとよぶこともある。これらは本発明で使
用され、「ポリエチレンイミン結合クロマトグラフ充填
剤」という名称の特開昭６０−１３５７６１号の（１９
８３年１１月２５日米国出願の米国出願番号５５５，３
６８）中においてフグラムスデンによって記載され、そ
の内容はここで参照する。この出願の関連する文章をこ
こに再現する。

［ラムスデンの特開昭６０−１３５７６１の抜粋］該発
明の非架橋共有結合ＰＥＩシリカゲル及びガラス生成物
は次の段階によって都合よく生成される。

Ａ　平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
カゲル又は平均粒径約３７〜約１７７ミクロン及び平均
孔寸法約４０〜約１０００オングストローム単位を有す
る微粒状の孔の制御されたガラスのいずれかを、不活性
有機溶媒スラリー中で、約４００〜約ｔｓｏｏの平均分
子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキシ
シランの低級アルカノール性溶液と約２〜約５０時間環
境温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ　生じる固体フラクションを反応混合物から回収し、 Ｃ上記固体フラクションを乾燥し且つシランをそれぞれ
シリカゲル又は孔の制御されたガラスに完全に結合する
のに十分な温度及び時間で加熱する。

本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結合された
」という用語は、ＰＥ１部分がシリカゲル又は孔の制御
されたガラスに化学的相互作用によって共有的に結合さ
れていて、プロピル−シリル（Ｐｒ−５ｔ）の結合を生
じていることを意味し、「非架橋」という用語は隣接す
る共有結合したＰＥ１部分上のイミノ及びアミノ基が架
橋していない又は架橋剤と反応し、重合層を形成してい
ないことを意味する。

以下に限るわけではないが、反応は次のように２段階で
完了すると考えられる。

段階ｌ　シラン上のシリカヒドロキシル及びメトキシ基
が反応して５ｉ−０−５ｉ結合及び遊離メタノールを形
成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のままでいる。

段階２　残留メトキシ基との反応の完結がａ）及びｂ）
による熱硬化の間に行なわれる。

ｌ　・ 無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則及び球状
（好ましい）の微粒形で市販されており、また幾つかの
商品等級で得られ、メツシュ寸法が３−３−３２５（Ａ
ＳＴの範囲である。数字的なメツシュ寸法の表示に頼る
よりも、本発明の為のより正確な指標はシリカゲルの微
粒の平均粒径及び平均孔寸法が夫々約３〜７０ミクロン
及び約５０〜約１０００、好ましくは約２５０〜５００
オングストローム単位のものである。　ＨＰＬＣクロマ
トグラフカラム充填に使用する最終製品のためには、約
３〜約ｌθミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、
低圧クロマトグラフィーカラム充填用には約４０〜約７
０ミクロンがこのましい。

液体クロマトグラフィーに使用する為に化学的にシリカ
に似ているシリケート含有支持物質であるところの孔の
制御されたガラス（ＣＰＧ）は市販されており、例えば
ピアースケミカルカンパニー、ロックフォード、イリノ
イから得ることが出来、平均粒径が３０〜１７７ミクロ
ンそして平均孔寸法が４０〜１０００オングストローム
、好ましくは４０〜５００オングストロームである。

シリカゲル又はＣＰＧスラリーを調製するのに適した不
活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例えば、ヘキサン
、ヘスタンなど、芳香族炭化水素例えば、ベンゼン、ト
ルエン、キシレンなど、低級アルカノール類例えば、エ
タノール、イソプロパツール、ブタノールなど、塩素化
メタン、例えば塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭
素、など（注意そのようなりクロ溶媒は高温で反応する
かもしれない）、及びテトラヒドロフラン、グライム（
グリコールジメチルエーテル）、ジグライム（ジエチレ
ングリコールジメチルエーテル）などの他の不活性溶媒
が適している。一般に溶媒層１に対しシリカゲル又はＣ
ＰＧのグラム　ｌ：５の比が適当なスラリーを与える。

シリカゲル及びＣＰＧ微粒が細かく不溶性であるの性質
の為に真の溶液でなくスラリーが得られる。

（Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエチレンイ
ミンとしても知られているポリエチレンイミノプロピル
トリメトキシシランはポリエチレンイミンとアミノプロ
ピルトリメトキシシランとの反応生成物で次の式によっ
て記載される。

Ｍｅ ＭｅＯ−５ｉ−ＣＨ２ＣＨｚＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２Ｃ
Ｈ２ＮＨ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２Ｍｅ ここで本発明の目的にはｎは約４〜３７の整数又は平均
弁子量で表現すると約４００〜１８００である。

シラン（１）は反応中でシリカゲルまたはＣＰＧとの反
応中に於いてシランを可溶化させる為の十分なアルカノ
ールを使用して低級ＣＩ−ＣＢアルカノール溶液の形で
使用される。５０χ（Ｗ／Ｗ）のイソプロパツール溶液
が好ましい。一般に約２５〜１００ｇのシラン又はこれ
に代わって約５０〜２００１の５ｏχ（ν／Ｗ）シラン
のアルカノール溶液が各１００　ｇのシリカゲル又はＣ
ＰＧと反応するのに使用される。反応は環境温度で実施
できるが反応溶媒系の還流までの高温を反応速度を強め
るために使用することが出来る０反応は実質的な完了（
段階１）迄に容易に２〜５０時間内に進行する０反応体
の混合中に攪はんをするのが有利であるが、その後の反
応は更に攪はんすることなしに続き得る。無水の条件は
臨界的でなく、小量の水即ち約０．１〜１．０　ｍｌ　
／スラリー溶媒５０■１の存在が反応に悪影響を与えな
いことが見いだされている。

生じる固体フラクションは反応混合物から慣用の物理的
手段例えばろ過、遠心分離などによって回収される。一
般にろ過手段は粒径５ミクロンを保持するのに十分なも
のであるのに対し、遠心は３ミクロンの粒子寸法に適し
ている・ 回収された固体フラクションは次に、乾燥、モしてシラ
ンとシリカゲル又はＣＰＧの完全な共有結合に十分な温
度及び時間で熱硬化される・一般に約４０〜１２０℃に
於ける　１４時間が十分であることが分かった。このよ
うにして得られた共有結合し・非架橋の最終生成物は好
ましくは約０．５〜約３．８％の窒素を含有している。

このようにして得た弱塩基性のＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリ
カゲル又はＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ生成物は不活性有
機溶媒中の適当な二塩基酸無水物での慣用の処理（例え
ばＳ、ガブタ等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
２８，１９６−２０１（１９８３）を参照）によって弱
酸性カルボキシル化形に変換出来る。典型的なそのよう
な無水物は、例えば無水こはく酸、無水グルタル酸、無
水ジグリコール酸などを含んでいる。十分な無水物をＰ
Ｅ１部分上の実質的に全てのイミノ及びアミノ官能基と
反応させるために使用する。生じるサクシノイル化され
た生成物中のカルボキシル基の数は例えば適当なアルカ
リに対する標準の滴定によって決定できる０本発明の目
的には、最終生成物グラム当たりのカルボキシルミリ当
量的０．３〜約１．２が好ましい。

［以上で特開昭６０−１３５７６１の抜粋終すコ例えば
無水コハク酸（好ましい）、無水グルタル酸、無水ジグ
リコール酸なとの二塩基酸無水物と、ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ
−シリカゲル又はＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧのＰＥ１部
分上のイミノ及びアミノ官能基とのＮ−アシル化された
反応生成物である、上記の弱酸性のカルボキシル化−Ｐ
ＥＩＰｒＳｉ−シリカゲル及びカルボキシル化−ＰＥ１
−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧのラムスデンの製品は本発明の精製
に於けるクロマトグラフィ及び抽出方法に於て使用され
る固相マトリックスである。

ラムスデンの上記カルボキシル化された生成物は、出発
シリカゲルが約３〜約７０ミクロンの平均粒径及び約５
０〜約１０００オングストローム単位の平均孔寸法、好
ましくは約２５０〜５００オングストロームの平均孔寸
法を有し、出発の孔の制御されたガラス（ＣＰＧ）は約
３７〜１７７ミクロンの平均粒径及び平均孔寸法約４０
〜１０００オングストローム単位、好まシくハ約４０〜
５００オングストロームを有し、出発ポリエチレンイミ
ノプロピルトリメトキシシランは後で共有結合された非
架橋形で微粒状のシリカゲル又は微粒状のＣＰＧに結合
されるが、これらは平均分子量約４００〜約ｔｓｏｏ′
ｌｔ冑し、ＰＥ１部分のイミノ及びアミノ官能基に結合
されている二塩基酸セグメントの残留カルボン酸官能基
（上記セグメントのカルボキシルは末端に位置している
）は、好ましくはカルボキシル化ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シ
リカゲル又はＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ生成生成物グラ
ムカリカルボキシルミリ当量約０〜１．２を提供するの
が好ましい。

従って本発明は抗体型１３Ｇとしても知られている本質
的に精製された免疫グロブリンＧを上記を含んでいる生
物流体、例えば、血清、血しよう、ＩｇＧ抗体を製造す
る組織培養細胞の上澄み流体、腹水液等から得る方法を
提供し、これを液体クロマトグラフィ充填又は固相抽出
マトリックスが微粒状のカルボキシル化されたＰＥｌ−
Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はカルボキシル化されたＰＥｌ
−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧからなる液体クロマトグラフィ又は
固相抽出を用いて行う方法が提供される。

本発明に於てそのようなりロマトグラフイ充填剤又は固
相マトリックスがＩｇＧ抗体を優先的（選択的）に結合
し、そしてこれを生物流体中の多くの他の蛋白質から取
り除くのに液体クロマトグラフィ又は面相抽出に於て特
に有用であることが発見された。結合されたＩｇＧ抗体
は次に本質的に純粋な形態に於て固体相マトリックスか
ら溶出されるか又は液体クロマトグラフィ中の他の結合
された蛋白質の少量から更に適当な水性緩衝液を用いる
勾配溶離によって分離及び精製することができる０本明
細書で実質的に精製されたとは定量的に回収されたＩｇ
Ｇ抗体フラクション中に存在する蛋白質の７０％を越え
るものがＩｇＧ抗体であることを意味する。実際本発明
の好ましい方法、即ち、液体クロマトグラフィに於ては
、定量的に回収されたＩｇＧ抗体フラクション中の、９
０％を越える蛋白質、即ち本質的な均−物がＩｇＧ抗体
である。精製％はこの技術で既知の方法、例えばナトリ
ウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって実証できる。ニー、ケー、ラエムリ等、ネ
イチャー２２７．６８０（１９７０）を参照０本発明は
例えば血しよう、血清、組織培養上澄み液、腹水流体（
例えばマウス又はラットの腹水流体）などＩｇＧ抗体を
含有している生物流体で使用するのに適している。免疫
グロブリンＧという用語又はＩｇＧ抗体という用語は、
全てのモノクローナル及びポリクｑ−ナルＩｇＧ抗体及
びＩｇＧ形のサブクラス、例えば１８Ｇ１、ＩｇＧ２ａ
、ＩｇＧｚｂ、　１ｇＧ５．１ｇ６１＋３等を含む。抗
体を含有しているそのような液体又は溶液又は物質を製
造する方法はこの技術で一般的であり、例えば「モノク
ローナル抗体」ノ１イブリドーマ、ア　ニュー　ディメ
ンジョン　イン　バイオロジカル　アナリシーズ、エッ
チ、アール、ケネット等、プレナムプレス発行、１９８
０年、ニューヨーク、及び「メソツズインエンザイモロ
ジー」ジー、ガルフレッド及びシー、ミルスタイン、ジ
エー、ジエー、ランゴーン及びエッチ、ブナキス編・７
３巻、３１〜４６頁、アカデミツクプレス発行、１９８
１年を参照。

高純度形に於けるＩｇＧの単離は明らかに望ましい０例
えばインビトロの治療方法において＋ｇｃ抗体のできる
かぎり純粋で濃縮されたものが、悪影響を及ぼす副作用
を最小限にし、そして目的とする治療効果を最大限にす
るのに要求される。同様にインビトロの治療目的の為に
はそのような精製及び濃縮された抗体は特定の診断試験
の感度及び特異性を最大限にするのに望ましい。

好ましくはＩｇＧ抗体を含有する生物流体は予備処理さ
れて干渉する微粒物質を除き、カルボキシル化されたＰ
Ｅｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はカルボキシル化された
ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ固相物質にＩｇＧ抗体を結合
することを達成するのに必要な適当なイオン強度及びｐ
Ｈに平衡化される。干渉する微粒物質は慣ト化するのに
十分な力での遠心によって除去することができる。生物
流体の平衡化はこの技術で一般的である任意の手段、例
えば適当な緩衝液での適当な種類及び孔寸法の分子ふる
い、例えばセフアデックスのブランドのもとに入手可能
な市販のもの上でのクロマトグラフィ脱塩、適当な緩衝
液に対する希釈又はそれによる透析等によって達成でき
、生物流体を特定のＩｇＧ抗体のｐＨ（その環境におけ
る正味のイオン荷電を有しないモノクローナル抗体のｐ
Ｈ）よりも低いｐＨであるがｐＨ５，５より低くないｐ
Ｈに於て、そして生物流体の後の処理における溶離に使
用される低い方のイオン強度の緩衝液のイオン強度に等
しいか又はそれ以下のイオン強度に生物流体を平衡化さ
せる。

液体クロマトグラフィによって本質的に均一に精製する
ためには液体クロマトグラフィで使用するのに適したク
ロマトグラフィカラムは前に記載したカルボキシル化Ｐ
Ｅｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はカルボキシル化ＰＥｌ
−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ多孔性クロマトグラフィマトリック
スで充填される。適当な鉄又はガラスのクロマトグラフ
ィカラムには約５〜１００ｃｍの長さ、そして約１−１
００蒙謁の内部径を壱するものが含まれる。適当なりロ
マトグラフィパラメータ、例えばカラム充填技術、カラ
ム寸法、カラム温度、圧力などの選択はこの技術で通常
の知識を有するものによって容易に決定される。

適当な緩衝液をカラムに通すことによってクロマトグラ
フィにおいて充填されたカラムを平衡化する。この緩衝
平衡化段階ののち、カラムを生物流体の蛋白性の成分の
クロマトグラフィ分離をするために使用するが、生物流
体は上に述べたように予め微粒物質を無くし、そして適
当なイオン強度とｐＨに平衡化させておく。生物流体の
試料を緩衝液で平衡化されたカラムに適用して、ＩｇＧ
抗体及び少量の汚染蛋白質を選択的に夫々のカルボキシ
ル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はカルボキ
シル化されたＰＥ１ＰｒＳｉ−ＣＰＧクロマトグラフィ
充填物質に結合させる。

結合したＩｇＧ抗体を次に慣用の勾配溶離技術によって
選択的に溶離するが、独立したクロマトグラフィパラメ
ータである、時間、流速及び／又は勾配形状を考慮に入
れて増加するイオン強度及び増加するｐＨの勾配を発生
させる。約ｐＨ５，５〜約８．３の陽イオン緩衝液、例
えば燐酸カリウム、トリスアセテート、アンモニウムア
セテート、塩化ナトリウムなどをそのような勾配を発生
させるのに、使用でき、結合したＩｇＧを選択的にカル
ボキシル化された充填物質から溶離させる０例えば勾配
物を約３０分から約４時間、流速的０．１ミリリットル
／分〜約２リットル／分で生成させるのが有利である。

別の方法としては結合した抗体を少量の不純物とともに
十分高いイオン強度の緩衝溶液によって単一段階におい
て溶離させ、実質的に精製した形態において結合した抗
体を開放する。そのような選択結合及びその後の単一段
＃＊ｌＩｌの方法は、固相抽出として記載され、これは
上記のようにカラム中で又はバッチ方法で実施できる。

後者の場合にはカルボキシル化ＰＥｌＰｒ５ｉ−シリカ
ゲル又はカルボキシル化ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧの固
相マトリックスを平衡化させた生物流体と攪拌し、次に
マトリックスと流体を慣用の手段、例えば傾斜又は遠心
によって分離し、次にＩｇＧ抗体を適当なイオン強度の
水性緩衝液とともに攪拌させることによってマトリック
スから溶離し、結合したＩｇＧ抗体を開放させる。

分割された蛋白質はこの技術で一般的な任意の方法によ
って同定できる。例えば、紫外線吸収を２８ｏｎ−でモ
ニターすることによって同定できる。

分離した蛋白質を含有している溶離フラクションを手動
又はフラクションコレクターによって集めることができ
る。均一なＩｇＧ抗体を含有している溶離フラクション
をこの技術でよく確立されている手段によって同定する
ことが出来る０例えば個々の抗体に対し展開されるラジ
オイミュノアッセイによって、他の抗体抗原反応によっ
て又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって同定す
ることができる。

本発明の方法はＩｇＧ抗体を含有している生物流体の全
容量と独立していることが見出され、固体クロマトグラ
フィ充填又は固体相マトリックスとして使用されるカル
ボキシル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル又はカ
ルボキシル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧの量を除
いて限定要因がない。即ちこの方法は固体支持体の能力
を越えないかぎり運転可能である。

本発明の方法にしたがって、抗体型１８Ｇを合音してい
る生物流体は液体クロマトグラフィ又は固相抽出によっ
て分離され、実質的に精製された形態の上記抗体を提供
する。

次の実施例は説明の為に提供され、本発明を限定するも
のでない、実施例１〜５はラムスデンの非カルボキシル
化反応生成物を例示し、実施例６〜８はラムスデンのカ
ルボキシル化反応生成物を例示する。実施例９〜１１は
本発明の抽出及び精製方法に於てそのようなカルボキシ
ル化された生成物の使用を例示する。

実施例１ Ａ、ニューシャーシ−Ｈフィリップスパークのジ工−テ
ィーベーカーケミカルカンパニーにより、「シリカゲル
１１７０２４」として不規則形で市販されている平均粒
径４０ミクロン及び平均孔゛寸法６０オングストローム
を有するシリカゲル１０ｇの５０１トルエン中のスラリ
ーに、攪はんしながら平均分子量　４００〜６００（推
定５００）を有しペトラルチシステムインコーボレーテ
ッド、ブリストル、ＰＡ、から”（Ｎ−トリメトキシシ
リルプロピル）−ポリエチレンイミンＰＳＯ７Ｂ”とし
て市販されているポリエチレンイミノプロピルトリメト
キシシランの５０Ｘ　（ｗ／ν）イソプロパツール溶液
１９．７１　ｇを加える。

混合物を室温（２５℃）で約１時間１０分攪はんし次に
一夜（１７時間）攪はんなしに放置する。攪はんを再度
更に５時間４０分室温で開始し、次に再度混合物を一夜
放置する。混合物を次に中程度にフリット化されたガラ
スフィルター上でろ過する。ろ液を５０−１のトルエン
で２度そして５０１１メタノールで２度洗浄しいかなる
過剰のシラン反応体も確実に除去し、次に８０〜８５℃
で約３時間３０分オーブン　　。

乾燥し、約１２　ｇの共有結合したＰＥドシリカゲル製
品約３．９χＮを生成する。

Ｂ、実施例ＩＡの手順を繰り返すが但し１１の水をシリ
カゲル／シラン混合物に加える。　ＰＥＩ結合シリカゲ
ル製品の収量は約１３．３　ｇ；約５．５χＮ。

実施例２ 平均粒径５．２５ミクロン及び平均孔寸法３３０オング
ストロームを有し、カリフォルニア州へスペリアのザセ
ップＡ　Ｒａタイオンズグループから商品名”Ｖｙｄａ
ｃ　Ａ”カタログＮｏ、　１０１７９Ｂ５の商品名で球
状のシリカとして市販されている２０　ｇのシリカゲル
の１００ｍ１）ルエン及び２１の水中のスラリーを調製
しそして１０分間室温で攪はんする。これに攪はんしな
がら３９．４　ｇの平均分子量５００を有するポリオキ
シエチレンイミノプロとルトリメトキシシランの５０％
　（ｗ／ｗ）　　イソプロパツール溶液３９．４　ｇを
加え、混合物をさらに５分間攪はんする。

混合物を次に室温で一夜放置する。混合物を次に１．０
ミクロンフィルターのろうとを使用しろ過する。ろ液を
５０１のトルエンで２回、５０１のメタノールで２回洗
い次にろうと上で空気乾燥し最後に８０〜８５℃で約３
時間３０オーブン乾燥しＰＣＩ結合されたシリカゲル製
品的２．８５Ｘ　Ｎを生成する。

実施例３ 平均粒径４０〜６３ミクロンと平均孔寸法４２０オング
ストロームを有しＥ、メルクリエージエンツ、西ドイツ
から商品名”Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ　５００”の名で市販
されている２３０−４００メツシユ（ＡＳＴＭ）のシリ
カゲル２０　ｇの５０−１のメタノールおよび１　ｍｌ
の水中のスラリーを調製し５分間室温で攪はんする。平
均分子量１８００を有するポリエチレンイミノプロビル
ト、リメトキシシランの５０％（ｗ／ｗ）イソプロパツ
ール溶液１１．２　ｇの１００　ｍｌメタノール中の別
の溶液も調製する。シラン溶液を次にシリカゲルスラリ
ーに５分間かけて攪はんしながら加える。添加が完了し
た後攪はんを止め、混合物を室温で５０時間放置する。

混合物を次に中程度の寸法の焼結ガラス上でろ過する。

ろ液を３　ｘ　５０　ｉｍｌのメタノールで真空で下で
洗浄し次に８０〜８５℃で約４時間オーブン乾燥しＰＥ
ｌ−結合のシリカゲル製品的１．１χＮを生成する。

実施例４ 次の反応混合物が前の実施例の教えに従って製造された
。

成」トーーー−ＪＪ　　　　ル シリカゲル（５ミクロン、　１０ｇ　　１．Ｏｇ　　１
（１ｇ３３０オングストローム） イソプロパツール　　　５０ａ＋１　５０ｍ１　５０ｍ
１水　　　　　　　　　　　　　　　　０．５１　。２
５ｍ１　０．１ａ＋ＩＰＥＩＰｒ−ｔｒｉＭｅＯ−シラ
ン （Ｍ、Ｗ、＝６００）、　５０％（ｗ／ｗ）の１−Ｐｒ
ＯＨ溶液として　　９．９ｇ　　４．９５３　２ｇ各反
応混合物を５分間室温で攪はんし次に攪はんなしで４１
時間３０分放置した。各混合物をろ過し。

５０１のイソプロパツールで１度そして５０　ｍｌのメ
タノールで２度洗浄した。各ろ液を８０〜ｂ゛　で約３
時閏！２分オーブン乾燥しそれぞれのＰＥＩ結合シタシ
’）　力’７’　ｋ　製品Ａ：　１．２Ｘ　　Ｎ＋　Ｂ
：　１−０％　Ｎ−Ｃ：　０．９ｍ　Ｎを生成した。

実施例５ Ａ、平均粒径４０ミクロン及び平均孔寸法５０オングス
トロームを有する５０１ヘキサン中の１０　ｇのシリカ
ゲルのスラリーに平均分子量５００を有するＰＥｌＰｒ
−４ｒ団ｅＯ−シランの５０％（ｗ／ｗ）　１ＰｒＯＨ
溶液１９．７１ｇを加える。混合物を５分間室温で攪は
んし、次に還流温度に約２時間加熱した。混合物を室温
に放冷し、ろ過し５０１のへキサンで２回そして５０１
のメタノールで２回洗浄した。ろ液を次に８０〜８５℃
で３時間オーブン乾燥しＰＥＩ結合シリカゲル製品を生
成した。

Ｂ、実施例５Ａの手順を繰り返したが、但し等量の孔の
制御されたガラス１２５ミクロン、２４０オングストロ
ーム）をそこで使用したシリカゲルと置き換え、対応す
る共有結合された非架橋ＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧ製品
を生成した。

実施例６ 実施例２０手順を繰り返したが但し　１２５１のトルエ
ンと２．５１の水中の２５８のシリカゲル（５，２５ミ
クロン；３３０オングストローム）が５０８のＰＥＩＰ
ｒ−ｔｒｉＭｅＯ−シラン（Ｍ、Ｗ、　５００）の５０
Ｘ（ｗ／ｗ）ｉＪｒＯＨ中溶液と反応され、約２９．４
　ｇのＰＥＩ結合シリカゲル製品を生成した。この生成
物を次に１２５１のトルエン及び１０　ｇの無水コハク
酸と混合し、混合物を８０℃の水浴中で２時間回転した
。この時閉の終わりに２０１のメタノールを加え混合物
をろ過した。回収したコハク酸化ＰＥＩ結合したシリカ
ゲル製品は連続して　１　ｘ　５０　）ルエン・２ｘ５
０１メタノール及び、１　ｘ　５０　ｍｌエチルエーテ
ルで洗浄される。生成物を次に８０℃で約４８時間乾燥
する。ＩＮ水酸化ナトリウムに対する生成物の滴定はカ
ルボキシルミリ当量、製品グラム当たり約０．６５を示
す。

実施例７ Ａ、５００ｇのシリカゲル（４０〜５５ミクロン；２５
０オングストローム）を２５００ｍ　ｌのトルエン中で
スラリーにする。このスラリーに２４７．５ｇのポリエ
チレンイミノプロピルトリメトキシシラン（平均分子量
６００）をイソプロパツール中の５０χ溶液として加え
る。

混合物を１５分間スラリーにし、次に４８．５時間室温
で放置する。混合物を次に濾過して・固相を１０００＋
＋１容量のトルエンで２回、更に１０００ｍ　ｌ容量の
メタノールで２回洗浄する。洗浄した固相を乾燥し、オ
ーブン中で８５℃で５時間硬化させる。ＰＣＩ−ＰｒＳ
ｉ−シリカゲルの収量は約５７０ｇである。

２００ｇのこのＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル生成物を
１０１００（１のトルエンでスラリーにしこれに５４ｇ
の無水コハク酸を加える。混合物を４０℃水浴中の回転
シェーカー中に３時間４０分置き、その後２００１のメ
タノールを加えて混合物を濾過する。このようにして得
たサクシノイル化したＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルを
４回５００１容量のメタノールで洗浄し、８５℃で３時
間オーブン乾燥する。収量２１７．１ｇ、カルボキシル
Ｗ定０．６５ミ１７当量／ｇ、分析１０．２４ＸＣ１１
，８８ＸＨ１及び２．７５χＮ。

Ｂ、実施例７Ａの手順に従うが、そこで使用した無水コ
ハク酸の代りに個々に等容量の無水グルタル酸及び無水
ジグリコール酸に置き換えて、対応するグルタノイルＰ
Ｅｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル、及びジグリコロイルーＰ
Ｅ１４ｒＳｉ−シリカゲルを夫々の生成物として得た。

実施例８ １７５０ｗ＋１のイソプロパツール中でスラリーにした
３５０ｇのシリカゲル（１５〜２０ミクロン；３００オ
ングストローム）にイソプロパツール中の５０χ（Ｗ／
Ｗ）ボリエチレンイミノブロとルトリメトキシシランの
溶液１７３１を加える。混合物を１５分間攪拌し、次に
４２分間放置する。混合物を次に濾過し、固体を二度７
５０１容量のイソプロパツールで洗い、更に７５０１容
量のメタノールで洗浄する。洗浄した固体相を乾燥し、
オーブン中で８５℃で３．５時間硬化させる＊　ＰＥｌ
−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルの収量は約３７６．３ｇ、分析
１．２０ＸＮである。

２００ｇのこのＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル生成物を
１０００層１のトルエンでスラリーにし、５４８の無水
コハク酸を加えた。混合物を４０℃の水浴中で２時間ｌ
Ｏ分回転させ、その後に３００１のメタノールを加えた
。

反応混合物を次に濾過し、固相を８５℃で２時間オーブ
ン乾燥し、約２０７．１ｇのサクシノイル化したＰＥｌ
−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル（１５〜２０ミクロン；３００
オングストローム）を生成した。カルボキシル滴定０．
３ミリ当量／ｇ、分析、５．０７＄Ｃ、０，９５ＸＨ、
及び１．０５ＸＮゆ 実施例９ Ａ、実施例７Ａで得たサクシノイル化したＰＥｌ−Ｐｒ
５ｉ−シリカゲル２００ｇの試料２００ｇを１１のポリ
プロピレンの注射器胴体中の二つのポリエチレン２０μ
ｍ孔寸法フリットの間に充填した。２１００．０１モル
燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，６を２０インチＨｇの真空
に於て商品名ベーカー−１０５Ｐε（登録商標）システ
ムにュージャージー州、フィリップスバーブのジ工−テ
ィーベーカーケミカルカンパニーＩｌ）から市販の真空
マニホルドによって吸引しカラムを通過させた。１００
μｍの特異性が知られていない免疫グロブリンＧを含有
しているハイプリドーマ組−培養培地上澄み液の試料を
遠心分離で透明にし、次に４００μ冨の０．０１Ｍ燐酸
カリウム緩衝液ｐＨ６，６で希釈した。全５００μｍ試
料をバーカー−１０ＳＰＥシステム上のカラムに２０イ
ンチＨｇの真空圧力で適用した。

溶離物を集めた。カラムを４１の０．ＯＩＭ燐酸カリウ
ムｐｔ＋ｅ、ｅで洗浄し、溶離物を集めた。カラムを２
１の０．３５Ｍ燐酸カリウムｐＨ６，６で洗浄し、最後
に２１のＯ，ＩＭ燐酸カリウムｐＨｊ６．６で洗浄した
。各洗浄において溶ｌＩｌ物を集めた。集めた溶離物の
各々をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分析し、本質的にニー、ケー。ラエムリによ
る、ネイチャー２２７　６８０（１９７０）に記載され
るように実施した。０．０１０Ｍ燐酸カリウムｐＨ６，
６溶離物はアルブミン、トランスフェリン及び元の試料
の他の殆との蛋白質を含有していたが、免疫グロブリン
Ｇは除く。定量的に回収された免疫グロブリンＧを凡そ
ＩＯｘの汚染蛋白質とともに０．１Ｍ燐酸カリウムｐＨ
６，６溶離物中で見出した。

Ｂ、免疫グロブリンＧの同様の回収を実施例９Ａの手順
にしたがフて人の血清の１００μｍの試料で得た。

Ｃ０当量のグルタロイルＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル
及びジグクコロイルＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル、（
実施例７Ｂ）を各々実施例９Ａの方法におけるサクシノ
イルＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルの代りに用いて同様
の免疫グロブリンＧの回収を与えた。

実施例１Ｏ ステンレス鋼クロマトグラフカラム　２５ｃｍ　ｘＯ，
４６ｍｍを３．８８の実施例６のサクシノイル化ＰＥｌ
−Ｐｒ５ｉ−シリカゲルで充填し、０．０１Ｍ燐酸カリ
ウム緩衝液ｐＨ６，０で、この緩衝液をカラムに流速１
＋＋Ｉ／分で２０分間通じることによって平衡化させた
番人の血しょうの０．１ｗ＋Ｉ試料を充填カラムに適用
し、蛋白分Ｉｌｌ　ヲ０．ＯＩＭ燐酸力Ｉ７　’７　ム
ｐ８６．６カラ０．２５Ｍ燐酸カリウムｐＨ６，８まで
の１２０分間の線形勾配で、流速１１７分を用いて勾配
溶離することによって達成した。蛋白溶離をＵ■吸収を
２８０ｎｓに於て使用することによって検出し、フルス
ケールの吸光度０．３２吸収単位にセットした。一連の
２８０ｎｍ吸収ピークを約２分〜約５０分の保持時間の
範囲で検出した。イリノイ州ネパービルのミルズラボラ
トリーインコーボレーテッド、カタログ番号６４１４５
１から得られる人の１８６抗体の市販試料を用いて、上
記と同じ勾配プロフィールを用いての共クロマトグラフ
化によって、約２５分間の保持時間に於ける蛋白質ピー
クを、人の血しょうＩｇＧフラクションとして同定した
。２５分間に於て溶離する蛋白質ピークを上記のニー、
ケー、ラエムリにより、ネイチャーに記載されるように
ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって１０％を越えるものと評価し、これ
は５００００ダルトン（ＩｇＧの重い鎖）及び２５００
０ダルトン（ＩｇＧの軽い鎖）の分子量に対応する二つ
の主要なりマシープルーバンド及び全蛋白質の３０％未
溝の幾つかのぼんやりしたクマシーブルーバンドを与え
た。　ＩｇＧ抗体の回収は９０Ｘを越えた。

Ｂ、実施例１０Ａの手順を２回繰り返したが、但し０．
１１のそこで使用した人の血しょうの試料に代えてＩｇ
Ｇ抗体、特に牛血清アルブミンに対する特異性を有して
いるＩｇＧ抗体及び羊の赤血球に対する特異性を有する
ＩｇＧ抗体、を含有しているマウス腹水液の１．０１試
料を用いた。前者の試料に対する保持時間ピークは２６
分で後者に対しては３０分であった６分析された純度％
及び抽出されたＩｇＧの回収率は両方の試料で９０％を
越えた。

Ｃ０実施例１０Ａの手順を繰り返したが、０．１ｍｌの
人の血しようの試料に代えて未知の特異性のＩｇＧ抗体
を含有している１、０１のハイブリドーマ組織培養培地
上澄み液を用いた。ピークの保持時間は４５分で分析純
度及び回収は各々９０％を越えた。

実施例１１ Ａ、　１．０ｍｌのハイブリドーマ組織培養培地上澄み
液及び３．０１の０．０１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６
，０に実施例８からの３０．０ｍｇのサクシノイル化さ
れたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル結合相を加えた。こ
の混合物を１分間攪拌した。結合相を一時間放置して沈
め、生じる上澄みを傾斜させた。固体残留物を１０−１
の０．０１Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，０中で攪拌す
ることによって再懸濁し１時間沈めた。この第二の上澄
み液を次に傾斜させ、それから固体残留物を１分間０．
１２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，８、！、０１中で
振動することによって再懸濁させ、この混合物を再度一
時間沈めた。生じる上澄みを傾斜させた。

三つの上澄み流体の各々を）ＩＰＬｃクロマトグラフィ
によって分析し、ＨＰＬＣクロマトグラフィと前に述べ
たドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析した。流体上澄みは９（Ｈ純度を越える純度
で元の試料内に存在する７５χを越えるＩｇＧ抗体を含
有していたことがわかった。他の二つの上澄みはＩｇＧ
抗体５ｘ未満を含有していることが分かった。追加的な
ＩｇＧも０．１２５Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，８で
再抽出することによって面相材料から回収できる。

Ｂ、実施例１１Ａの手順を繰り返したが、そこで使用し
たサクシノイル化されたＰＥｌ−Ｐｒ５ｉ−シリカゲル
の代りに当量の実施例５Ｂのサクシノイル化されたＰＥ
ｌ−Ｐｒ５ｉ−ＣＰＧを使用し、実質的に同じ結果を得
た。

出願人　ジェイ　ティー　ベーカー　ケミカルカンパニ
ー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫グロブリンＧを含有している生物流体の試料か
   ら実質的に精製された免疫グロブリンＧを得る方法にお
   いて、上記免疫グロブリンを上記試料から液体クロマト
   グラフィ又は固相抽出を用いて分離し回収することから
   なり、ここでクロマトグラフィ充填剤、又は固相マトリ
   ックスが夫々本質的に平均粒径約３〜約７０ミクロン及
   び平均孔寸法約５０〜約１０００オングストローム単位
   を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約３７〜約１７７
   ミクロン及び平均孔寸法約４０〜約１０００オングスト
   ローム単位を有する微粒状の孔の制御されたガラスと、
   約４００〜約１８００の平均分子量を有するポリエチレ
   ンイミノプロピルトリメトキシシランとのカルボキシル
   化された共有結合、非架橋ポリエチレンイミン反応生成
   物からなることを特徴とする方法。 ２、上記カルボキシル化された反応生成物が生成物グラ
   ム当りのカルボキシルミリ当量約０．３〜約１．２を有
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、上記生物流体が血しょう、血清、組織培養上澄み、
   又は腹水流体である特許請求の範囲第２項に記載の方法
   。 ４、免疫グロブリンＧを含有している生物流体の試料か
   ら実質的に精製された免疫グロブリンＧを得る方法にお
   いて、 ａ、上記生物流体の試料を後のクロマトグラフィ分離及
   び回収段階に於て勾配溶離のために使用する低い方のイ
   オン強度の緩衝液のイオン強度に等レいか又は該イオン
   強度よりも小さいイオン強度に、そしてその特定される
   免疫グロブリンＧのｐＨよりも大きなｐＨに平衡化させ
   、 ｂ、上記免疫グロブリンＧを上記試料から液体クロマト
   グラフィを用いて分離回収するが、 クロマトグラフィ充填剤が本質的に平均粒径約３〜約７
   ０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜約１０００オングス
   トローム単位を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約３
   ７〜約１７７ミクロン及び平均孔寸法約４０〜約１００
   ０オングストローム単位を有する微粒状の孔の制御され
   たガラスと、約４００〜約１８００の平均分子量を有す
   るポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシランとの
   カルボキシル化された共有結合、非架橋反応生成物から
   なることを特徴とする方法。 ５、上記カルボキシル化された反応生成物が生成物グラ
   ム当りカルボキシルミリ当量約０．３〜約１．２を有す
   る特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、上記生物流体が血しょう、血清、組織培養上澄み、
   又は腹水流体である特許請求の範囲第５項に記載の方法
   。