JPH0354959B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明に従えば、平均粒径約３〜約70ミクロン
及び平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単
位を有する微粒シリカゲル又は平均粒径約37〜約
177ミクロン及び平均孔寸法約40〜約1000オング
ストローム単位を有する微粒状の孔の制御された
ガラスと、約400〜約1800の平均分子量を有する
ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシラン
との共有結合非架橋ポリエチレンイミン反応生成
物のカルボキシル化された形態が、生物流体から
実質的に精製された免疫グロブリンＧを得るため
にクロマトグラフイ又は抽出方法に於て固相とし
て利用される。 （従来の技術） エム．フラツシヤーによる、名称「精製された
モノクロ−ナル抗体」の米国特許4469630（特願昭
59−242584号、特開昭60−173000号に対応）に於
て、上記の共有結合非架橋ポリエチレンイミン反
応生成物のカルボキシル化されていない形態を用
いるモノクロ−ナル抗体型IgGの精製が記載され
ている。 （発明が解決しようとする点） 本発明においては、驚くべきことに、上記反応
生成物のカルボキシル化された形態は陽イオン交
換マトリツクスを形成し、生物流体中に存在する
IgG抗体と効果的かつ選択的に結合することが見
出された。更に米国特許4469630に記載されるカ
ルボキシル化されていない陰イオン交換マトリツ
クスは腹水流体蛋白質のほとんどと結合し、次に
IgG抗体を選択的に分離するが、本明細書で用い
るカルボキシル化された陽イオン交換マトリツク
スは主としてIgG抗体を結合し、生物流体中の他
の蛋白質性の物質の殆どを結合させないままにし
ておく。蛋白質が陰イオンマトリツクス（正の電
荷を有する）及び陽イオンマトリツクス（負の電
荷を有する）の両方に本質的に同じPH範囲で結合
するということは非常にめずらしいこと、予測で
きないことである。 （問題を解決する手段） 本発明は好ましい具体例において免疫グロブリ
ンＧを含有している生物流体から免疫グロブリン
Ｇ（IgG）抗体を分離し精製する方法に関するが、
これは、非架橋性の共有結合されたポリエチレン
イミン（PEI）官能基を有するシリカゲル又は孔
の制御されたガラス（CPG）のカルボキシル化
された形態の微粒状の静的な多孔性の相上で液体
クロマトグラフイを用いて、約PH5.5〜PH8.3の水
性緩衝液で、カルボキシル化されたポリエチレン
イミン結合シリカゲル又はCPGカラムからIgG抗
体の勾配溶離することによつて分離精製するもの
である。 又固相マトリツクスとして上記カルボキシル化
された物質での固体相抽出手段を用いて生物流体
から上記IgG抗体を分離精製する方法に関する。 便宜上、非架橋、共有結合ポリエチレンイミン
官能基を有するシリカゲルの微粒状のカルボキシ
ル化された形態は、以後「カルボキシル化−PEI
−PrSi−シリカゲル」、非架橋、共有結合ポリエ
チレンイミン官能基を有する微粒状の孔の制御さ
れたガラスのカルボキシル化された形態を、以後
「カルボキシル化−PEI−PrSi−CPG」とよぶこ
ともある。これらは本発明で使用され、「ポリエ
チレンイミン結合クロマトグラフ充填剤」という
名称の特開昭60−135761号の（1983年11月25日米
国出願の米国出願番号555368）中においてフグ
ラムスデンによつて記載され、その内容はここで
参照する。この出願の関連する文章をここに再現
する。 ［ラムスデンの特開昭60‐135761の抜粋］ 該発明の非架橋共有結合 PEIシリカゲル及び
ガラス生成物は次の段階によつて都合よく生成さ
れる。 Ａ 平均粒径３〜約70ミクロン及び平均孔寸法約
50〜約1000オングストローム単位を有する微粒
シリカゲル又は平均粒径約37〜約177ミクロン
及び平均孔寸法約40〜約1000オングストローム
単位を有する微粒状の孔の制御されたガラスの
いずれかを、不活性有機溶媒スラリー中で、約
400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレ
ンイミノプロピルトリメトキシシランの低級ア
ルカノール性溶液と約２〜約50時間環境温度〜
還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクシヨンを反応混合から回収
し、 Ｃ 上記固体フラクシヨンを乾燥し且つシランを
それぞれシリカゲル又は孔の制御されたガラス
に完全に結合するのに十分な温度及び時間で加
熱する。 本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結
合された」という用語は、PEI部分がシリカゲル
又は孔の制御されたガラスに化学的相互作用によ
つて共有的に結合されていて、プロピルーシリル
（Pr‐Si）の結合を生じていることを意味し、
「非架橋」という用語は隣接する共有結合した
PEI部分上のイミノ及びアミノ基が架橋していな
い又は架橋剤と反応し、重合層を形成していない
ことを意味する。 以下に限るわけではないが、反応は次のように
２段階で完了すると考えられる。 段階１ シラン上のシリカヒドロキシル及びメト
キシ基が反応してSi−Ｏ−Si結合及び遊離メタ
ノールを形成し、幾らかの残留メトキシ基が未
反応のままでいる。 段階２ 残留メトキシ基との反応の完結がａ）及
びｂ）による熱硬化の間に行なわれる。 無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則
及び球状（好ましい）の微粒形で市販されてお
り、また幾つかの商品等級で得られ、メツシユ寸
法が３−325（ASTM）の範囲である。数字的な
メツシユ寸法の表示に頼るよりも、本発明の為の
より正確な指標はシリカゲルの微粒の平均粒径及
び平均孔寸法が夫々約３〜70ミクロン及び約50〜
約1000、好ましくは約250〜500オングストローム
単位のものである。HPLCクロマトグラフカラム
充填に使用する最終製品のためには、約３〜約10
ミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、低圧
クロマトグラフイーカラム充填用には約40〜約70
ミクロンがこのましい。 液体クロマトグラフイーに使用する為に化学的
にシリカに似ているシリケート含有支持物質であ
るところの孔の制御されたガラス（CPG）は市
販されており、例えばピア−スケミカルカンカン
パニー、ロツクフオード、イリノイから得ること
が出来、平均粒径が30〜177ミクロンそして平均
孔寸法が40〜1000オングストローム、好ましくは
40〜500オングストロームである。 シリカゲル又はCPGスラリーを調製するのに
適した不活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例
えば、ヘキサン、ヘブタンなど、芳香族炭化水素
例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど、低
級アルカノール類例えば、エタノール、イソプロ
パノール、ブタノールなど、塩素化ノタン、例え
ば塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、な
ど（注意そのようなクロロ溶媒は高温で反応する
かもしれない）、及びテトラヒドロフラン、グラ
イム（グリコールジメチルエーテル）、ジグライ
ム（ジエチレングリコールジメチルエーテル）な
どの他の不活性溶媒が適している。一般に溶媒ml
に対してシリカゲル又はCPGのグラム１：５の
比が適当なスラリーを与える。シリカゲル及び
CPG微粒が細かく不溶性であるの性質の為に真
の溶液でなくスラリーが得られる。 （Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエ
チレンイミンとしても知られているポリエチレン
イミノプロピルトリメトキシシランはポリエチレ
ンイミンとアミノプロピルトリメトキシシランと
の反応生成物で次の式によつて記載される。 ここで本発明の目的にはｎは約４〜37の整数又
は平均分子量で表現すると約400〜1800である。 シラン(1)は反応中でシリカゲルまたはCPGと
の反応中に於いてシランを可溶化させる為の十分
なアルカノールを使用して低級C₁〜C₆アルカノ
ール溶液の形で使用される。50％（ｗ／ｗ）のイ
ソプロパノール溶液が好ましい。一般に約25〜
100ｇのシラン又はこれに代つて約50〜200mlの50
％（ｗ／ｗ）シランのアルカノール溶液が各100
ｇのシリカゲル又はCPGと反応するのに使用さ
れる。反応は環境温度で実施できるが反応溶媒系
の還流までの高温を反応速度を強めるために使用
することが出来る。反応は実質的な完了（段階
１）迄に容易に２〜50時間内に進行する。反応対
の混合中に撹はんをするのが有利であるが、その
後の反応は更に撹はんすることなしに続き得る。
無水の条件は臨界的でなく、小量の水即ち約0.1
〜1.0ml／スラリー溶媒50mlの存在が反応に悪影
響を与えないことが見いだされている。 生じる固体フラクシヨンは反応混合物から慣用
の物理的手段例えばろ過、遠心分離などによつて
回収される。一般にろ過手段は粒径５ミクロンを
保持するのに十分なものであるのに対し、遠心は
３ミクロンの粒子寸法に適している。 回収された固体フラクシヨンは次に、乾燥、そ
してシランとシリカゲル又はCPGの完全な共有
結合に十分な温度及び時間で熱硬化される。一般
に約40〜120℃に於ける１−４時間が十分である
ことがわかつた。このようにして得られた共有結
合し、非架橋の最終生成物は好ましくは約0.5〜
約3.8％の室素を含有している。 このようにして得た弱塩基性のPEI−PrSi−シ
リカゲル又はPEI−PrSi−CPG生成物は不活性有
機溶媒中の適当な二塩基酸無水物での慣用の処理
（例えばS.ガブタ等，Anal.Biochem.128，196−
201（1983）を参照）によつて弱酸性カルボキシル
化形に変換出来る。典型的なそのような無水物
は、例えば無水こはく酸、無水グルタル酸、無水
ジグリコール酸などを含んでいる。十分な無水物
をPEI部分上の実質的に全てのイミ乃及びアミノ
官能基と反応させるために使用する。生じるサク
シノイル化された生成物中のカルボキシル基の数
は例えば適当なアルカリに対する標準の滴定によ
つて決定できる。本発明の目的には、最終生成物
グラム当たりのカルボキシルミリ当量約0.3〜約
1.2が好ましい。 ［以上で特開昭60−135761の抜粋終り］ 例えば無水コクハ酸（好ましい）、無水グルタ
ル酸、無水ジグリコール酸などの二塩基酸無水物
と、PEI−PrSi−シリカゲル又はPEI−PrSi−
CPGのPEI部分上のイミノ及びアミノ官能基との
Ｎ−アシル化された反応生成物である、上記の弱
酸性のカルボキシル化−PEI−PrSi−シリカゲル
及びカルボキシル化−PEI−PrSi−CPGのラムス
デンの製品は本発明の精製に於けるクロマトグラ
フイ及び抽出方法に於て使用される固相マトリツ
クスである。 ラムスデンの上記カルボキシル化された生成物
は、出発シリカゲルが約３〜約70ミクロンの平均
粒径及び約50〜約1000オングストローム単位の平
均孔寸法、好ましくは約250〜約500オングストロ
ームの平均孔寸法を有し、出発の孔の制御された
ガラス（CPG）は約37〜177ミクロンの平均粒径
及び平均孔寸法約40〜1000オングストローム単
位、好ましくは約40〜500オングストロームを有
し、出発ポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランは後で共有結合された非架橋形で微粒状
のシリカゲル又は微粒状のCPGに結合されるが、
これらは平均分子量約400〜約1800を有し、PEI
部分のイミノ及びアミノ官能基に結合されている
二塩基酸セグメントの残留カルボン酸官能基（上
記セグメントのカルボキシルは末端に位置してい
る）は、好ましくはカルボキシル化PEI−PrSi−
シリカゲル又はPEI−PrSi−CPG生成物グラム当
りカルボキシルミリ当量約0.3〜1.2を提供するの
が好ましい。 従つて本発明は抗体型IgGとしても知られてい
る本質的に精製された免疫グロブリンＧを上記を
含んでいる生物流体、例えば、血清、血しよう、
IgG抗体を製造する組織倍養細胞の上澄み流体、
腹水液等から得る方法を提供し、これを液体クロ
マトグラフイ充填又は固相抽出マトリツクスが微
粒状のカルボキシル化されたPEI−PrSi−シリカ
ゲル又はカルボキシル化されたPEI−PrSi−CPG
からなる液体クロマトグラフイ又は固相抽出を用
いて行う方法が提供される。 本発明に於てそのようなクロマトグラフイ充填
剤又は固相マトリツクスがIgG抗体を優先的（選
択的）に結合し、そしてこれを生物流体中の多く
の他の蛋白質から取り除くのに液体クロマトグラ
フイ又は固相抽出に於て特に有用であることが発
見された。結合されたIgG抗体は次に本質的に純
粋な形態に於て固体相マトリツクスから溶出され
るか又は液体クロマトグラフイ中の他の結合され
た蛋白質の少量から更に適当な水性緩衝液を用い
る勾配溶離によつて分離及び精製することができ
る。本明細書で実質的に精製されたとは定量的に
回収されたIgG抗体フラツクシヨン中に存在する
蛋白質の70％を越えるものがIgG抗体であること
を意味する。実際本発明の好ましい方法、即ち、
液体クロマトグラフイに於ては、定量的に回収さ
れたIgG抗体フラクシヨン中の、90％を越える蛋
白質、即ち本質的な均一物がIgG抗体である。精
製％はこの技術で既知の方法、例えばナトリウム
ドデシルサルフエートポリアクリルアミドゲル電
気泳動によつて実証できる。ユー．ケー．ラエム
リ等、ネイチヤー227680（1970）を参照。 本発明は例えば血しよう、血清、組織倍養上澄
み液、腹水流体（例えばマウス又はラツトの腹水
流体）などIgG抗体を含有している生物流体で使
用するのに適している。免疫グロブリンＧという
用語又はIgG抗体という用語は、全てのモノクロ
ーナル及びボリクローナルIgG抗体及びIgG形の
サブクラス、例えばIgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、
IgG₁₊₃等を含む。抗体を含有しているそのような
液体又は溶液又は物質を製造する方法はこの技術
で一般的であり、例えば「モノクローナル抗体」
ハイブリドーマ、ア ニユー デイメンジヨン
イン バイオロジカル アナリシーズ、エツチ．
アール．ケネツト等、プレナムプレス発行、1980
年、ニユーヨーク、及び「メソツズインエンザイ
モロジー」ジー．ガルフレツド及びシー．ミルス
タイン、ジエー．ジエー．ランゴール及びエツ
チ．ブナキス編、73巻、31〜46頁、アカデミツク
プレス発行、1981年を参照。 高純度形に於けるIgGの単離は明らかに望まし
い。例えばインビトロの治療方法においてIgG抗
体のできるかぎり純粋で濃縮されたものが、悪影
響を及ぼす副作用を最小限にし、そして目的とす
る治療効果を最大限にするのに要求される。同様
にインビトロの治療目的の為にはそのような精製
及び濃縮された抗体は特定の診断試験の感度及び
特異性を最大限にするのに望ましい。 好ましくはIgG抗体を含有する生物流体は予備
処理されて干渉する微粒物質を除き、カルボキシ
ル化されたPEI−PrSi−シリカゲル又はカルボキ
シル化されたPEI−PrSi−CPG固相物質にIgG抗
体を結合することを達成するのに必要な適当なイ
オン強度及びPHに平衡化される。干渉する微粒物
質は慣用の分級手段、例えば濾過又は微粒物質を
ペレツト化するのに十分な力での遠心によつて除
去することができる。生物流体の平衡化はこの技
術で一般的である任意の手段、例えば適当な緩衝
液での適当な種類及び孔寸法の分子ふるい、例え
ばセフアデツクスのブランドのもとに入手可能な
市般のもの上でのクロマトグラフイ脱塩、適当な
緩衝液に対する希釈又はそれによる透析等によつ
て達成でき、生物流体を特定のIgG抗体のPH（そ
の環境における正味のイオン荷電を有しないモノ
クロ−ナル抗体のPH）よりも低いPHであるがPH
5.5より低くないPHに於て、そして生物流体の後
の処理における溶離に使用される低い方のイオン
強度の緩衝液のイオン強度に等しいか又はそれ以
下のイオン強度に生物流体を平衡化させる。 液体クロマトグラフイによつて本質的に均一に
精製するためには液体クロマトグラフイで使用す
るのに適したクロマトグラフイカラムは前に記載
したカルボキシル化PEI−PrSi−シリカゲル又は
カルボキシル化PEI−PrSi−CPG多孔性クロマト
グラフイマトリツクスで充填される。適当な鉄又
はガラスのクロマトグラフイカラムには約５〜
100cmの長さ、そして約１〜100mmの内部径を有す
るものが含まれる。適当なクロマトグラフイパラ
メータ、例えばカラム充填技術、カラム寸法、カ
ラム温度、圧力などの選択はこの技術で通常の知
識を有するものによつて容易に決定される。 適当な緩衝液をカラムに通すことによつてクロ
マトグラフイにおいて充填されたカラムを平衡化
する。この緩衝平衡化段階ののち、カラムを生物
流体の蛋白性の成分のクロマトグラフイ分離をす
るために使用するが、生物流体は上に述べたよう
に予め微粒物質を無くし、そして適当なイオン強
度とPHに平衡化させておく。生物流体の試料を緩
衝液で平衡化されたカラムに適用して、IgG抗体
及び少量の汚染蛋白質を選択的に夫々のカルボキ
シル化されたPEI−PrSi−シリカゲル又はカルボ
キシル化されたPEI−PrSi−CPGクロマトグラフ
イ充填物質に結合させる。 結合したIgG抗体を次に慣用の勾配溶離技術に
よつて選択的に溶離するが、独立したクロマトグ
ラフイパラメータである、時間、流速及び／又は
勾配形状を考虜に入れて増加するイオン強度及び
増加するPHの勾配を発生させる。約PH5.5〜約8.3
の陽イオン緩衝液、例えば隣酸カリウム、トリス
アセテート、アンモニウムアセテート、塩化ナト
リウムなどをそのような勾配を発生させるのに使
用でき、結合したIgGを選択的にカルボキシル化
された充填物質から溶離させる。例えば勾配物を
約30分から約４時間、流速約0.1ミリリツトル／
分〜約２リツトル／分で生成させるのが有利であ
る。 別の方法としては結合した抗体を少量の不純物
とともに十分高いイオン強度の緩衝溶液によつて
単一段階において溶離させ、実質的に精製した形
態において結合した抗体を開放する。そのような
選択結合及びその後の単一段階溶離の方法は、固
相抽出として記載され、これは上記のようにカラ
ム中で又はバツチ方法で実施できる。後者の場合
にはカルボキシル化PEI−PrSi−シリカゲル又は
カルボキシル化PEI−PrSi−CPGの固相マトリツ
クスを平衡化させた生物流体と撹拌し、次にマト
リツクスと流体を慣用の手段、例えば傾斜又は遠
心によつて分離し、次にIgG抗体を適当なイオン
強度の水性緩衝液とともに撹拌させることによつ
てマトリツクスから溶離し、結合したIgG抗体を
開放させる。 分割された蛋白質はこの技術で一般的な任意の
方法によつて同定できる。例えば、紫外線吸収を
280nmでモニターすることによつて同定できる。
分離した蛋白質を含有している溶離フラクシヨン
を手動又はフラツクシヨンコレクターによつて集
めることができる。均一なIgG抗体を含有してい
る溶離フラクシヨンをこの技術でよく確立されて
いる手段によつて同定することが出来る。例えば
個々の抗体に対し展開されるラジオイミユノアツ
セイによつて、他の抗体抗原反応によつて又はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によつて同定する
ことができる。 本発明の方法はIgG抗体を含有している生物流
体の全容量と独立していることが見出され、固体
クロマトグラフイ充填又は固体相マトリツクスと
して使用されるカルボキシル化されたPEI−PrSi
−シリカゲル又はカルボキシル化されたPEI−
PrSi−CPGの量を除いて限定要因がない。即ち
この方法は固体支持体の能力を越えないかぎり運
転可能である。 本発明の方法にしたがつて、抗体型IgGを含有
している生物流体は液体クロマトグラフイ又は固
相抽出によつて分離され、実質的に精製された形
態の上記抗体を提供する。 次の実施例は説明の為に提供され、本発明を限
定するものではない。実施例１〜５はラムステン
の非カルボキシル化反応生成物を例示し、実施例
６〜８はラムスデンのカルボキシル化反応生成物
を例示する。実施例９〜11は本発明の抽出及び精
製方法に於てそのようなカルボキシル化された生
成物の使用を例示する。 実施例 １ Ａ ニユージヤージー州フリツプスバークのジエ
ーテイーベーカーケミカルカンパニーにより、
「シリカゲル ＃7024」として不規則形で市般
されている平均粒径40ミクロン及び平均孔寸法
60オングストロームを有するシリカゲル10ｇの
50mlトルエン中のスラリーに、撹はんしながら
平均分子量400〜600（推定500）を有しペトラル
チシステムインコ−ポレ−テツド、ブリスト
ル、PA.から“（Ｎ−トリメトキシシリルプロ
ピル）−ポリエチレンイミンPSO76”として市
販されているポリエチレンイミノプロピルトリ
メトキシシランの50％（ｗ／ｗ）イソプロパノ
ール溶液19.71ｇを加える。混合物を室温（25
℃）で約１時間10分撹はんし次に一夜（17時
間）撹はんなしに放置する。撹はんを再度更に
５時間40分室温で開始し、次に再度混合物を一
夜放置する。混合物を次に中程度にフリツト化
されたガラスフイルター上でろ過する。ろ液を
50mlのトルエンで２度そして50mlメタノールで
２度洗浄しいかなる過剰のシラン反応体も確実
に除去し、次に80〜85℃で約３時間30分オーブ
ン乾燥し、約12ｇの共有結合したPEI−シリカ
ゲル製品約3.9％Ｎを生成する。 Ｂ 実施例1Aの手順を繰り返すが但し１mlの水
をシリカゲル／シラン混合物に加える。PEI結
合シリカゲル製品の収量は約13.3ｇ；約5.5％
Ｎ。 実施例 ２ 平均粒径5.25ミクロン及び平均孔寸法330オン
グストロームを有し、カリフオルニア州ヘスベリ
アのザセツプＡ Raタイオンズグループから商
品名“Vydac Ａ”カタログNo.．101T9B5の商品
名で球状のシリカとして市販されている20ｇのシ
リカゲルの100mlトルエン及び２mlの水中のスラ
リーを調製しそして10分間室温で撹はんする。こ
れに撹はんしながら39.4ｇの平均分子量500を有
するポリオキシエチレンイミノプロピルトリメト
キシシランの50％（ｗ／ｗ）イソプロパノール溶
液39.4ｇを加え、混合物をさらに５分間撹はんす
る。混合物を次に室温で一夜放置する。混合物を
次に1.0ミクロンフイルターのろうとを使用しろ
過する。ろ液を50mlのトルエンで２回、50mlのメ
タノールで２回洗い次にろうと上で空気乾燥し最
後に80〜85℃で約３時間30オーブン乾燥しPEI結
合されたシリカゲル製品約2.85％Ｎを生成する。 実施例 ３ 平均粒径40〜63ミクロンと平均孔寸法420オン
グストロームを有しE.メルクリエージエンツ、西
ドイツから商品名“Fractosil 500”の名で市販
されている230−400メツシユ（ASTM）のシリ
カゲル20ｇの50mlのメタノールおよび１mlの水中
のスラリーを調製し５分間室温で撹はんする。平
均分子量1800を有するポリエチレンイミノプロピ
ルトリメトキシシランの50％（ｗ／ｗ）イソプロ
パノール溶液11.2ｇの100mlメタノール中の別の
溶液も調製する。シラン溶液を次にシリカゲルス
ラリーに５分間かけて撹はんしながら加える。添
加が完了した後撹はんを止め、混合物を室温で50
時間放置する。混合物を次に中程度の寸法の焼結
ガラス上でろ液を３×50mlのメタノールで真空で
下で洗浄し次に80〜85℃で約４時間オーブン乾燥
しPEI−結合のシリカゲル製品約1.1％Ｎを生成す
る。 実施例 ４ 次の反応混合物が前の実施例の教えに従つて製
造された。

【表】 各反応混合物を５分間室温で撹はんし次に撹は
んなしで41時間30分放置した。各混合物をろ過
し、 50mlのイソプロパノールで１度そし50mlのメタ
ノールで２度洗浄した。各ろ液を80〜85℃で約３
時間12分オーブン乾燥しそれぞれのPEI結合した
シリカゲル製品Ａ：1.2％Ｎ，Ｂ：1.0％Ｎ，Ｃ：
0.9％Ｎを生成した。 実施例 ５ Ａ 平均粒径40ミクロン及び平均孔寸法50オング
ストロームを有する50mlヘキサン中の10ｇのシ
リカゲルのスラリーに平均分子量500を有する
PEIPr−triMeO−シランの50％（ｗ／ｗ）
iPrOH溶液19.71ｇを加える。混合物を５分間
室温で撹はんし、次に還流温度に約２時間加熱
した。混合物を室温に放冷し、ろ過し50mlのヘ
キサンで２回そして50mlのメタノールで２回洗
浄した。ろ液を次に80〜85℃で３時間オーブン
乾燥しPEI結合シリカゲル製品を生成した。 Ｂ 実施例5Aの手順を繰り返したが、但し等量
の孔の制御されたガラス125ミクロン、240オン
グストローム）をそこで使用したシリカゲルと
置き換え、対応する共有結合された非架橋PEI
−PrSi−CPG製品を生成した。 実施例 ６ 実施例２の手順を繰り返したが但し125mlのト
ルエンと2.5mlの水中の25ｇのシリカゲル（5.25
ミクロン；330オングストローム）が50ｇの
PEIPr−triMeO−シラン（M.W.500）の50％
（ｗ／ｗ）ｉ−PrOH中溶液と反応され、約29.4
ｇのPEI結合シリカゲル製品を生成した。この生
成物を次に125mlのトルエン及び10ｇの無水コハ
ク酸と混合し、混合物を80℃の水溶中で２時間回
転した。この時間の終わりに20mlのメタノールを
加え混合物をろ過した。回収したコハク酸化PEI
結合したシリカゲル製品は連続して１×50トルエ
ン、２×50mlメタノール及び、１×50mlエチルエ
ーテルで洗浄される。生成物を次に80℃で約48時
間乾燥する。1N水酸化ナトリウムに対する生成
物の滴定はカルボキシルミリ当量、製品グラム当
たり約0.65を示す。 実施例 ７ Ａ 500ｇのシリカゲル（40〜55ミクロン；250オ
ングストローム）を2500mlのトルエン中でスラ
リーにする。このスラリーに247.5ｇのポリエ
チレンイミノプロピルトリメトキシシラン（平
均分子量600）をイソプロパノール中に50％溶
液として加える。混合物を15分間スラリーに
し、次に48.5時間室温で放置する。混合物を次
に濾過して固相を1000ml容量のトルエンで２
回、更に1000ml容量のメタノールで２回洗浄す
る。洗浄した固相を乾燥し、オーブン中で85℃
で５時間硬化させる。PEI−PrSi−シリカゲル
の収量は約570ｇである。 200ｇのこのPEI−PrSi−シリカゲル生成物
を1000mlのトルエンでスラリーにしこれに54ｇ
の無水コハク酸を加える。混合物を40℃水浴中
の回転シエーカー中に３時間40分置き、その後
200mlのメタノールを加えて混合物を濾過する。
このようにして得たサクシノイル化したPEI−
PrSi−シリカゲルを４回500ml容量のメタノー
ルで洗浄し、85℃で３時間オーブン乾燥する。
収量217.1ｇ。カルボキシル滴定0.65ミリ当
量／ｇ。分折10.24％Ｃ、1.88％Ｈ、及び2.75％
Ｎ。 Ｂ 実施例7Aの手順に従うが、そこで使用した
無水コハク酸の代りに個々に等容量の無水グル
タル酸及び無水ジグリコール酸に置き換えて、
対応するグルタノイルPEI−PrSi−シリカゲ
ル、及びジグリコロイル−PEI−PrSi−シリカ
ゲルを夫々の生成物として得た。 実施例 ８ 1750mlのイソプロパノール中でスラリーにした
350ｇのシリカゲル（15〜20ミクロン；300オング
ストローム）にイソプロパノール中の50％（ｗ／
ｗ）ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシ
ランの溶液173mlを加える。混合物を15分間撹拌
し、次に42分間放置する。混合物を次に濾過し、
固体を二度750ml容量のイソプロパノールで洗い、
更に750ml容量のメタノールで洗浄する。洗浄し
た固体相を乾燥し、オーブン中で85℃で3.5時間
硬化させる。PEI−PrSi−シリカゲルの収量は約
376.3ｇ、分析1.20％Ｎである。 200ｇのこのPEI−PrSi−シリカゲル生成物を
1000mlのトルエンでスラリーにし、54ｇの無水コ
ハク酸を加えた。混合物を40℃の水浴中で２時間
10分回転させ、その後に300mlのメタノールを加
えた。反応混合物を次に濾過し、固相を85℃で２
時間オーブン乾燥し、約207.1ｇのサクシノイル
化したPEI−PrSi−シリカゲル（15〜20ミクロ
ン；300オングストローム）を生成した。カルボ
キシル滴定0.3ミリ当量／ｇ。分析、5.07％Ｃ、
0.95％Ｈ、及び1.05％Ｎ。 実施例 ９ Ａ 実施例7Aで得たサクシノイル化したPEI−
PrSi−シリカゲル200ｇの試料200ｇを１mlの
ポリプロピレンの注射器胴体中の二つのポリエ
チレン20μ孔寸法フリツトの間に充填した。
２mlの0.01モル燐酸カリウム緩衝液PH6.6を20
インチHgの真空に於て商品名ベーカー−
10SPE（登録商標）システム（ニユージヤージ
ー州、フイリツプスバーグのジエーテイーベー
カーケミカルカンパニー製）から市販の真空マ
ニホルドによつて吸引しカラムを通過させた。
100μの特異性が知られていない免疫グロブ
リンＧを含有しているハイブリドーマ組織倍養
倍地上澄み液の試料を遠心分離で透明にし、次
に400μの0.01M燐酸カリウム緩衝液PH6.6で
希釈した。全500μ試料をベーカー−10SPE
システム上のカラムに20インチHgの真空圧力
で適用した。溶離物を集めた。カラムを４mlの
0.01M燐酸カリウムPH6.6で洗浄し、溶離物を
集めた。カラムを２mlの0.35M燐酸カリウムPH
6.6で洗浄し、最後に２mlの0.1M燐酸カリウム
PH6.6で洗浄した。各洗浄において溶離物を集
めた。集めた溶離物の各々をドデジル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
し、本質的にユー．ケー．ラエムリによる、ネ
イチヤー227 680（1970）に記載されるように実
施した。0.010M燐酸カリウムPH6.6溶離物はア
ルブミン、トランスフエリン及び元の試料の他
の殆どの蛋白質を含有していたが、免疫グロブ
リンＧは除く。定量的に回収された免疫グロブ
リンＧを凡そ10％の汚染蛋白質とともに0.1M
燐酸カリウムPH6.6溶離物中で見出した。 Ｂ 免疫グロブリンＧの同様の回収を実施例9A
の手順にしたがつて人の血清の100μの試料
で得た。 Ｃ 当量のグルタロイルPEI−PrSi−シリカゲル
及びジグリコロイルPEI−PrSi−シリカゲル、
（実施例7B）を各々実施例9Aの方法における
サクシノイルPEI−PrSi−シリカゲルの代りに
用いて同様の免疫グロブリンＧの回収を与え
た。 実施例 10 ステンレス鋼クロマトグラフカラム 25cm×
0.46mmを3.8ｇの実施例６のサクシノイル化PEI−
PrSi−シリカゲルで充填し、0.01M燐酸カリウム
緩衝液PH6.0で、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で20分間通じることによつて平衡化させ
た。人の血しようの0.1ml試料を充填カラムに適
用し、蛋白分離を0.01M燐酸カリウムPH6.6から
0.25M燐酸カリウムPH6.8までの120分間の線形勾
配で、流速１ml／分を用いて勾配溶離することに
よつて達成した。蛋白溶離をUV吸収を280nmに
於て使用することによつて検出し、フルスケール
の吸光度0.32吸収単位にセツトした。一連の
280nm吸収ピークを約２分〜約50分の保持時間の
範囲で検出した。イリノイ州ネパービルのミルズ
ラボラトリ−インコ−ボレ−テツド、カタログ番
号641451から得られる人のIgG抗体の市販試料を
用いて、上記と同じ勾配プロフイールを用いての
共クロマトグラフ化によつて、約25分間の保持時
間に於ける蛋白質ピークを、人の血しようIgGフ
ラクシヨンとして同定した。25分間に於て溶離す
る蛋白質ピークを上記のユー．ケー．ラエムリに
より、ネイチヤーに記載されるようにナトリウム
ドデシルサルフエートポリアクリルアミドゲル電
気泳動によつて70％を越えるものと評価し、これ
は50000ダルトン（IgGの重い鎖）及び25000ダル
トン（IgGの軽い鎖）の分子量に対応する二つの
主要なクマシーブルーバンド及び全蛋白質の30％
未満の幾つかのぼんやりしたクマシーブルーバン
ドを与えた。IgG抗体の回収は90％をえた。 Ｂ 実施例10Aの手順を２回繰り返したが、但し
0.1mlのそこで使用した人の血しようの試料に
代えてIgG抗体、特に牛血清アルブミンに対す
る特異性を有しているIgG抗体及び羊の赤血球
に対する特異性を有するIgG抗体、を含有して
いるマウス腹水液の1.0ml試料を用いた。前者
の試料に対する保持時間ピークは26分で後者に
対しては30分であつた。分析された純度％及び
抽出されたIgGの回収率は両方の試料で90％を
越えた。 Ｃ 実施例10Aの手順を繰り返したが、0.1mlの
人の血しようの試料に代えて未知の特異性の
IgG抗体を含有している1.0mlのハイブリドーマ
組織倍養倍地上澄み液を用いた。ピークの保持
時間は45分で分析純度及び回収は各々90％を越
えた。 実施例 11 Ａ 1.0mlのハイブリドーマ組織倍養倍地上澄み
液及び3.0mlの0.01M燐酸カリウム緩衝液PH6.0
に実施例８からの30.0mgのサクシノイル化され
たPEI−PrSi−シリカゲル結合相を加えた。こ
の混合物を１分間撹拌した。結合相を一時間放
置して沈め、生じる上澄みを傾斜させた。固体
残留物を10mlの0.01M燐酸カリウム緩衝液PH
6.0中で撹拌することによつて再懸濁し１時間
沈めた。この第二の上澄み液を次に傾斜させ、
それから固体残留物を１分間0.125M燐酸カリ
ウム緩衝液PH6.8、1.0ml中で振動することによ
つて再懸濁させ、この混合物を再度一時間沈め
た。生じる上澄みを傾斜させた。三つの上澄み
流体の各々をHPLCクロマトグラフイによつて
分析し、HPLCクロマトグラフイと前に述べた
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析した。流体上澄みは90％純度
を越える純度で元の試料内に存在する75％を越
えるIgG抗体を含有していたことがわかつた。
他の二つの上澄みはIgG抗体５％未満を含有し
ていることが分かつた。追加的なIgGも0.125M
燐酸カリウム緩衝液PH6.8で再抽出することに
よつて固相材料から回収できる。 Ｂ 実施例11Aの手順を繰り返したが、そこで使
用したサクシノイル化されたPEI−PrSi−シリ
カゲルの代りに当量の実施例5Bのサクシノイ
ル化されたPEI−PrSi−CPGを使用し、実質的
に同じ結果を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 免疫グロブリンＧを含有している生物流体の
   試料から精製された免疫グロブリンＧを得る方法
   において、上記免疫グロブリンを、液体クロマト
   グラフイにおける充填剤や固相抽出における固相
   マトリツクスなどの固相へ選択的に吸着させて、
   上記試料から分離し回収することからなり、ここ
   で該固相が、 (a) 平均粒径３〜70ミクロン及び平均孔寸法50〜
   1000オングストローム単位を有する微粒シリカ
   ゲル又は平均粒径37〜177ミクロン及び平均孔
   寸法40〜1000オングストローム単位を有する微
   粒状の孔の制御されたガラスと、 (b) 400〜1800の平均分子量を有するポリエチレ
   ンイミノプロピルトリメトキシシランとを、 反応させて得られる、共有結合、非架橋ポリエチ
   レンイミン反応生成物を、カルボキシル化したも
   のからなることを特徴とする方法。 ２ 上記カルボキシル化された反応生成物が生成
   物グラム当りのカルボキシルミリ当量0.3〜1.2を
   有する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 上記生物流体が血漿、血清、組織培養上澄
   み、又は腹水流体である特許請求の範囲第２項に
   記載の方法。 ４ 免疫グロブリンＧを含有している生物流体の
   試料から精製された免疫グロブリンＧを得る方法
   において、 ａ 上記生物流体の試料を後のクロマトグラフイ
   分離及び回収段階に於て勾配溶離のために使用
   する低い方のイオン強度の緩衝液のイオン強度
   に等しいか又は該イオン強度よりも小さいイオ
   ン強度に、そしてその特定される免疫グロブリ
   ンＧのPHよりも大きなPHに平衡化させ、 ｂ 上記免疫グロブリンＧを上記試料から液体ク
   ロマトグラフイを用いて分離回収するが、 クロマトグラフイ充填剤が、 (a) 平均粒径３〜70ミクロン及び平均孔寸法50
   〜1000オングストローム単位を有する微粒シ
   リカゲル又は平均粒径37〜177ミクロン及び
   平均孔寸法40〜1000オングストローム単位を
   有する微粒状の孔の制御されたガラスと、 (b) 400〜1800の平均分子量を有するポリエチ
   レンイミノプロピルトリメトキシシランとを 反応させて得られる共有結合、非架橋反応生成物
   を、カルボキシル化したものからなることを特徴
   とする方法。 ５ 上記カルボキシル化された反応生成物が生成
   物グラム当りカルボキシルミリ当量0.3〜1.2を有
   する特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６ 上記生物流体が血漿、血清、組織培養上澄
   み、又は腹水流体である特許請求の範囲第５項に
   記載の方法。