ES2896897T3

ES2896897T3 - Agentes de clarificación para el bioprocesamiento de adsorbentes y métodos para producir y usar los mismos

Info

Publication number: ES2896897T3
Application number: ES16804510T
Authority: ES
Inventors: Surya Kiran Chodavarapu; Feng Gu
Original assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2022-02-28
Anticipated expiration: 2036-06-03
Also published as: CN107921407B; SG10201911134QA; JP2018517559A; EP3302784A4; KR102566292B1; EP3302784B1; US10695744B2; PL3302784T3; CN107921407A; BR112017026193B1; EP3302784A1; KR20180015239A; US20180169610A1; HK1253897A1; WO2016196906A1; BR112017026193A2

Abstract

Adsorbentes que comprenden: partículas de sílice que tienen una amplia distribución de tamaño de poro según se mide mediante una amplitud 90 de distribución de tamaño de poro, cuyo valor de la amplitud 90 de distribución de tamaño de poro se calcula como [(PD90 - PD10)/PD50], mientras que PD10 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 10 %, PD50 es diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 50 %, y PD90 es diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 90 %, todos basados en datos de intrusión de mercurio, de al menos 2,8; y material polimérico unido covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice.

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes de clarificación para el bioprocesamiento de adsorbentes y métodos para producir y usar los mismos

Campo de la invención

La presente invención está orientada a agentes de clarificación adsorbentes adecuados para su uso en procedimientos de bioprocesamiento. La presente invención está además orientada a métodos para producir y usar agentes de clarificación adsorbentes para la retirada o separación de sustancias biológicas no deseadas durante procedimientos de bioprocesamiento.

Antecedentes

En los últimos años, la fabricación de productos biofarmacéuticos ha demostrado mejoras importantes en la producción de MAb (AcM), que presentan títulos de producto de hasta 25 g/l asociados frecuentemente con densidades celulares muy altas. Los cultivos celulares de alta densidad con >150 millones de células/ml plantean un gran desafío en el procesamiento posterior debido a la necesidad de retirar una gran cantidad de biomasa y niveles aumentados de contaminantes de los restos celulares generados durante el cultivo y la recogida celulares. La producción de sustancias biológicas (Mab, en particular) implica habitualmente procesar un caldo de cultivo celular complejo del cual deben aislarse y purificarse las sustancias biológicas deseadas mientras se mantiene una alta recuperación y calidad globales del producto. Tradicionalmente, la centrifugación y una combinación de técnicas de filtración (filtración de flujo tangencial y filtración en profundidad) se han aceptado ampliamente como estaciones de trabajo para clarificar estos caldos de cultivo celular complejos. Sin embargo, la mejora de los procesos de cultivo de células de mamífero está proporcionando densidades celulares totales mucho más allá de los niveles tradicionales de 20 x 106 células/ml para células CHO a >150 x 106 células/ml para células PER.C6. Por tanto, las limitaciones de las técnicas za sea de centrifugación como de filtración son evidentes por el alto contenido de sólidos (<40 %) de tales recogidas.

La centrifugación puede aplicarse a corrientes de alimentación del proceso con altos niveles de sólidos, por ejemplo. Sin embargo, la recuperación del producto puede ser baja debido a los volúmenes de sedimento aumentados y a la necesidad de eliminación de lodos con frecuencia (especialmente en la centrifugación continua a gran escala). Además, la rotura celular por las fuerzas de cizallamiento generadas durante la centrifugación puede disminuir adicionalmente la eficiencia de la clarificación de la recogida y provocar potencialmente daño y/o atrapamiento del producto.

Los filtros de profundidad son ventajosos porque retiran contaminantes y muchos vienen en formato de un solo uso, lo que reduce la necesidad de limpieza y validación. Sin embargo, los filtros de profundidad actualmente no pueden manejar corrientes de alimentación con alto contenido de sólidos y se usan frecuentemente en serie con centrifugación. La TFF (FFT) puede manejar una alta carga de sólidos, pero esta técnica puede presentar un rendimiento deficiente debido a la polarización de sólidos en la superficie de la membrana cuando se procesan corrientes de alimentación altamente densas. La dilución excesiva del producto y la lisis celular provocadas por las fuerzas de cizallamiento también pueden limitar la utilidad de la TFF.

Además, se ha usado ampliamente la floculación de las recogidas de cultivo celular para potenciar operaciones de productividad de clarificación y de filtración posterior. Las técnicas actuales incluyen el uso de polímeros poliiónicos solubles (tales como DEAE-dextrano, polímeros de base acrílica y polietilenamina) y materiales inorgánicos tales como tierra de diatomeas y perlitas, que retiran células y residuos celulares. Sin embargo, los polímeros deben retirarse posteriormente de las corrientes de proceso, lo que requiere monitorización y cuantificación mediante ensayos en proceso y de liberación de producto. Si la cromatografía IEX se incluye como etapa de purificación en el proceso posterior, las capacidades de unión se verán afectadas en gran medida por la naturaleza cargada de los floculantes. La alta viscosidad de las disoluciones madre de policationes presenta un desafío de proceso adicional.

En los últimos años, se han desarrollado varias nuevas técnicas de clarificación. Por ejemplo, se ha introducido la tecnología de recogida de un solo uso (http://www.selectscience.net/product-news/sartorius-stedim-biotech) para cultivos de alta densidad celular usando tierra de diatomeas (TD) como adyuvante de filtración. (Minow B., y col, BioProcess Int., 1 de abril de 2014). Sin embargo, dada su baja área superficial (BET~ 1 m2/g) y su naturaleza no porosa, la TD no funciona en la adsorción de proteínas y/u otros tipos de materiales biológicos, sino solamente como adyuvante de filtración.

En otros procesos, se han usado materiales particulados funcionalizados como adsorbentes para la clarificación de caldos celulares. Por ejemplo, los métodos de W02010043700 y WO2010043703 de clarificación o retirada de proteínas de células huésped mediante la utilización de material de intercambio aniónico en el proceso. Las propiedades o condiciones óptimas para los materiales de intercambio iónico no se describen en las solicitudes de patente. US-2014/367338, US-4576927 y W02011/012302 mencionan el uso de partículas de sílice con material polimérico unido covalentemente a sus superficies como agentes de clarificación para bioprocesamiento.

Se continúa realizando esfuerzos para desarrollar adicionalmente materiales de clarificación y procedimientos que tienen agentes mejorados en forma de materiales particulados funcionalizados para mejorar la capacidad de unión (es decir, la cantidad y la variedad de biomateriales que pueden unirse a los agentes de clarificación adsorbentes) y/o selectividad de unión de los materiales particulados funcionalizados.

Sumario

La presente invención aborda la necesidad en la técnica de bioprocesos mejorados mediante el descubrimiento de que el uso de determinados materiales de sílice porosos funcionalizados proporciona un rendimiento mejorado como adsorbentes de clarificación. Los adsorbentes de la presente invención proporcionan inesperadamente una capacidad de unión excepcional, así como selectividad de unión en bioprocesos (p. ej., biopurificación, bioseparación, etc.) en comparación con materiales particulados funcionalizados conocidos.

En particular, la presente invención proporciona bioprocesos mejorados que usan materiales de sílice funcionalizados poliméricos que se componen de partículas de sílice porosas que tienen una distribución de tamaño de poro suficientemente amplia como para permitir que las partículas puedan unirse selectivamente a una amplia variedad de biomoléculas incluyendo, pero sin limitarse a, células, proteínas de células huésped, ácidos nucleicos, restos celulares, cromatinas, etc., para retirar estos materiales durante una o más etapas de bioprocesamiento. Las partículas de sílice porosas tienen una distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud (span) 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 2,8. En otras realizaciones, en donde las partículas porosas tienen una distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de hasta aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0.

Por consiguiente, la presente invención está orientada a partículas de sílice porosas funcionalizadas con polímero que tienen una distribución de tamaño de poro especificada (también denominadas en el presente documento “ adsorbentes” ) que son útiles como agentes de clarificación en una variedad de bioprocesos. La presente invención está orientada a adsorbentes que comprenden material polimérico unido covalentemente a la superficie de partículas de sílice porosas, en donde dichas partículas tienen una distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 2,8. En algunas realizaciones deseadas, la invención comprende los adsorbentes útiles como un agente de clarificación para bioprocesamiento, en donde los adsorbentes comprenden un material de polielectrolito unido covalentemente a la superficie de las partículas de sílice porosas, en donde las partículas porosas tienen una distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de hasta aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0. En realizaciones preferidas de la invención, el material polimérico comprende un polielectrolito, p. ej., polietilenimina.

La presente invención se refiere incluso adicionalmente a métodos para producir adsorbentes en forma de material particulado funcionalizado. En una realización ilustrativa, el método para producir adsorbentes de la presente invención comprende: poner en contacto partículas de sílice porosas con uno o más reactantes en condiciones de reacción que resultan en al menos un material polimérico unido covalentemente a al menos una superficie de las partículas de sílice, en donde las partículas de sílice tienen una amplia distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 2,8.

La presente invención se refiere además a un método para clarificar una mezcla de bioproceso durante un procedimiento de bioprocesamiento. El método proporciona la retirada o separación de las sustancias biológicas no deseadas, p. ej. restos celulares, de una mezcla de bioprocesamiento usando los absorbentes de la invención.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de las realizaciones dadas a conocer y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La FIGURA muestra gráficamente la comparación en las distribuciones de tamaño de poro (a partir de porosimetría de mercurio) para dos sílices diferentes.

Descripción detallada

Para fomentar una comprensión de los principios de la presente invención, se presentan a continuación descripciones de realizaciones específicas de la invención y se usa un lenguaje específico para describir las realizaciones específicas. No obstante, se comprenderá que no se pretende ninguna limitación del alcance de la invención mediante el uso de lenguaje específico. Se contemplan alteraciones, modificaciones adicionales, y tales aplicaciones adicionales de los principios de la presente invención analizadas tal como se le ocurrirían normalmente a un experto en la técnica a la que pertenece la invención.

Cabe señalar que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un(o)” , “una” , “el” y “ la” incluyen referentes en plural, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “un óxido” incluye una pluralidad de tales óxidos y la referencia a “óxido” incluye la referencia a uno o más óxidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.

“Aproximadamente” que modifica, por ejemplo, la cantidad de un componente en una composición, las concentraciones, los volúmenes, las temperaturas de proceso, los tiempos de proceso, las recuperaciones o los rendimientos, las velocidades de flujo y valores similares, e intervalos de los mismos, empleados en la descripción de las realizaciones de la divulgación, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manipulación; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en los componentes usados para llevar a cabo los métodos; y otras consideraciones similares. El término “aproximadamente” también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular, y cantidades que difieren debido al mezclado o el procesamiento de una formulación con una concentración o mezcla inicial particular. Tanto si están modificados o no por el término “aproximadamente” , las reivindicaciones adjuntas incluyen equivalentes de estas cantidades.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “ bioproceso” o “ bioprocesamiento” se refieren a un proceso discontinuo que forma, altera y/o utiliza una o más biomoléculas. El término “ bioproceso” incluye, pero no se limita a, procesos de bioseparación, procesos de biopurificación, procesos para formar productos biofarmacéuticos y procesos para purificar productos biofarmacéuticos. Tal como se usa en el presente documento, el término “bioproceso” o “bioprocesamiento” se refiere al procesamiento que puede realizarse antes de un proceso cromatográfico (p. ej., que retira restos celulares de un lote de material), no abarca procesos cromatográficos (p. ej., cromatografía de líquidos).

Tal como se usa en el presente documento, el término “ biomolécula” significa cualquier molécula que produce un organismo vivo, incluyendo moléculas grandes tales como proteínas, polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos; y pequeñas moléculas tales como metabolitos primarios, metabolitos secundarios y productos naturales. Los ejemplos de biomoléculas incluyen células y residuos celulares; anticuerpos, proteínas y péptidos; ácidos nucleicos, tales como ADN y a RN; endotoxinas; virus; vacunas y similares. Otros ejemplos de biomoléculas incluyen aquellos citados en los documentos WO 2002/074791 y en US-5.451.660.

Tal como se usa en el presente documento, el término “funcionalizado” en lo referido a la superficie de las partículas de sílice significa partículas de sílice porosas que se han modificado en superficie mediante reacción con al menos un compuesto funcional para alterar la selectividad de al menos una parte de la superficie de la partícula, incluida el área de superficie en la parte externa de las partículas, y/o en el área de superficie de los poros internos. La superficie funcionalizada puede usarse para formar una fase unida (de manera covalente o iónica), una superficie recubierta (p. ej, unida a C18 de fase inversa), una superficie polimerizada (p. ej., intercambio iónico), una superficie inherente (p. ej., material híbrido inorgánico/orgánico) o similar. Por ejemplo, la reacción de partículas de óxido inorgánico porosas con octadeciltriclorosilano forma una “fase inversa” mediante la unión covalente del silano a la superficie inorgánica (p. ej., C4, C8, C18, etc.). En otro ejemplo, la reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la cuaternización del grupo amino forma una “fase de intercambio aniónico” . En un tercer ejemplo, puede formarse una fase unida mediante reacción de las partículas inorgánicas con aminopropiltrimetoxisilano seguida de la formación de una amida con un cloruro de ácido. Otras fases unidas incluyen diol, ciano, catión, afinidad, quiral, amino, C18, hydrophilic interaction (interacción hidrófila - HILIC), hydrophilic interaction (interacción hidrófila - HILIC), modo mixto, exclusión por tamaño, etc. Como parte de la fase unida o superficie funcionalizada, puede usarse un ligando para mostrar una interacción específica con la molécula o biomolécula objetivo (p. ej., ligato), tal como aquellos expuestos en US-4.895.806.

Tal como se usa en el presente documento, el término “polielectrolito” se define como un polímero que comprende unidades de repetición tales como (i) un catión, (ii) un anión, o (iii) un grupo funcional de electrolito que se asocia o disocia con un protón en disoluciones acuosas para formar una carga positiva o negativa. Por ejemplo, los polielectrolitos catiónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polietilenimina (PEI), polialilamina, polivinilpiridina, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (pDADMAC) y copolímeros que contienen grupos funcionales similares. Los polielectrolitos aniónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), poli(ácidos estirenosulfónicos), ácidos nucleicos y copolímeros que contienen grupos funcionales similares (p. ej., poli(estireno-co-ácido maleico), poli(estireno-ácido sulfónico-co-ácido maleico)).

Tal como se usa en el presente documento, el término “polietilenimina” se define como un polímero que comprende unidades de repetición de una amina unida a un espaciador -CH2CH2-, en donde el polímero puede ser lineal o ramificado y puede contener grupos amino primarios, secundarios y/o terciarios.

Tal como se usa en el presente documento, el término “área de superficie de partícula BET” se define como que significa un área de superficie de partícula según se mide mediante el método de adsorción de nitrógeno de Brunauer-Emmet-Teller.

Tal como se usa en el presente documento, el término distribuciones de mediana de diámetro (tamaño) de poro se midió mediante intrusión de mercurio usando un instrumento Autopore® IV 9520, disponible de Micromeritics Instrument Corporation (Norcross, GA).

Tal como se usa en el presente documento, el término “distribución de tamaño de poro” significa la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas.

Tal como se usa en el presente documento, “ mediana de diámetro de poro” es la mediana de diámetro de poro (PD50), se define como el punto medio en el cual al 50 % del volumen de poro contribuyen poros más pequeños y al 50 % contribuyen poros más grandes.

Tal como se usa en el presente documento, el término “volúmenes de poro” al que se hace referencia en el presente documento representa volúmenes acumulativos a partir de intrusión de mercurio en poros de 50-10.000 Á de tamaño.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ peso molecular” se define que significa la masa molar de una única molécula de un compuesto o polímero particular.

Tal como se usa en el presente documento, se calcula el “valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro” como [(PD90 - PD10)/PD50], mientras que PD10 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 10 %, PD50 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 50 %, y PD90 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 90 %, todos basados en datos de intrusión de mercurio.

Partículas porosas

Tal como se describió anteriormente, las partículas de sílice porosas usadas para preparar los adsorbentes de la presente invención presentan una amplia distribución de tamaño de poro, según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 2,8, o al menos aproximadamente 3,0, o al menos aproximadamente 4,0, o al menos aproximadamente 5,0, o al menos aproximadamente 6,0, o al menos aproximadamente 7,5, de manera deseable, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0, de manera más deseable, de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, y en algunas realizaciones, aproximadamente 7,8). La amplia distribución de tamaño de poro permite la formación de agentes de clarificación adsorbentes que proporcionan una capacidad de unión, selectividad de unión, así como unión de una amplia variedad de biomoléculas.

Generalmente, las partículas de sílice porosas tienen una distribución de tamaño de poro de aproximadamente 30 a aproximadamente 5000 Á.

Ventajosamente, la amplia distribución de tamaño de poro de las partículas de sílice porosas usadas para formar los adsorbentes de la presente invención permite una capacidad de unión controlada, selectividad de unión, y la unión de una amplia variedad de biomoléculas mediante la elección de (1) material polimérico específico unido a superficies de las partículas de sílice, (2) la cantidad de material polimérico unido a superficies de las partículas de sílice y/o (3) el peso molecular del material polimérico unido a superficies de las partículas de sílice. Tal como se muestra y describe en la sección de ejemplos a continuación, la amplia distribución de tamaño de poro de las partículas de sílice usadas para formar los adsorbentes de la presente invención proporciona más flexibilidad y capacidad de unión en comparación con adsorbentes conocidos disponibles comercialmente.

De forma típica, las partículas de sílice porosas útiles para preparar los adsorbentes de la invención presentan una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 100 Á. En otra realización, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de tamaño de poro de al menos aproximadamente 150 Á (o al menos aproximadamente 200 Á; o al menos aproximadamente 250 Á, o al menos aproximadamente 300 Á; o al menos aproximadamente 350 Á; o al menos aproximadamente 400 Á, o al menos aproximadamente 500 Á; o al menos aproximadamente 600 Á; o al menos aproximadamente 800 Á. En algunas realizaciones, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de tamaño de poro de aproximadamente 100 Á a aproximadamente 800 Á. En algunas realizaciones, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de tamaño de poro de aproximadamente 150 Á a aproximadamente 250 Á. En otras realizaciones, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de tamaño de poro menor de 2000 Á. En otras realizaciones, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de tamaño de poro menor de 1000 Á.

Las partículas de sílice tienen típicamente un tamaño de partícula, según se mide mediante una mediana de dimensión de partícula, menor de 150 pm. Las partículas de sílice porosas tienen típicamente una mediana de dimensión de partícula de aproximadamente 1 pm, más típicamente, menor de aproximadamente 100 pm. En algunas realizaciones, las partículas de sílice porosas tienen una mediana de dimensión de partícula de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 pm, de manera más deseable, aproximadamente 30 pm.

Las partículas de sílice tienen típicamente una forma irregular, pero pueden tener cualquier forma (p. ej., esférica, elíptica, etc.). Independientemente de la forma, las partículas de sílice porosas tienen típicamente una mediana de dimensión de partícula tal como se analizó anteriormente en el presente documento.

En realizaciones adicionales, las partículas de sílice porosas pueden tener una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,0 según se mide, por ejemplo, usando técnicas de Transmission Electron Microscopy (microscopía electrónica de transmisión - TEM). Tal como se usa en el presente documento, la expresión “ relación de aspecto” se usa para describir la relación entre (i) la mediana de dimensión de partícula de las partículas de sílice porosas y (ii) la mediana de dimensión de partícula de sección transversal de las partículas de sílice porosas, en donde la dimensión de partícula de sección transversal es sustancialmente perpendicular a la dimensión de partícula más grande de las partículas de sílice porosas. En algunas realizaciones de la presente invención, las partículas de sílice porosas tienen una relación de aspecto de al menos aproximadamente 1,1 (o al menos aproximadamente 1,2, o al menos aproximadamente 1,3, o al menos aproximadamente 1,4). De forma típica, las partículas de sílice porosas tienen una relación de aspecto de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,5.

El volumen de poro de las partículas de óxido metálico de sílice porosas se mide mediante intrusión de mercurio en poros de 50-10.000 Á de tamaño. En otra realización, las partículas de sílice medidas mediante intrusión de mercurio en poros de 50-10.000 Á de tamaño es al menos aproximadamente 0,25 cc/g 0,50 cc/g. En una realización ilustrativa de la presente invención, las partículas de sílice porosas tienen un volumen de poro medido mediante intrusión de mercurio en poros de 50-10.000 Á de tamaño, de al menos aproximadamente 1,0 cc/g; al menos aproximadamente 1,50 o al menos aproximadamente 1,77 cc/g. En otra realización ilustrativa de la presente invención, las partículas de sílice porosas tienen un volumen de poro según se mide mediante intrusión de mercurio en poros de 50-10.000 Á de tamaño, de aproximadamente 1,0 cc/g a aproximadamente 3,0 cc/g.

El área de superficie de las partículas de sílice porosas también tienen un área de superficie según se mide mediante el método de adsorción de nitrógeno BET (es decir, el método de Brunauer-Emmet-Teller) de al menos aproximadamente 100 m2/g, o al menos aproximadamente 300 m2/g, o al menos aproximadamente 500 m2/g. En una realización ilustrativa de la presente invención, las partículas de sílice porosas tienen un área de superficie BET de aproximadamente 100 m2/g a aproximadamente 1000 m2/g o de aproximadamente 600 m2/g a aproximadamente 800 m2/g. En otra realización ilustrativa de la presente invención, las partículas de sílice porosas tienen un área de superficie BET de aproximadamente 700 m2/g.

Las partículas comprenden de manera deseable sílice que tiene una pureza de al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente el 93 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 94 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 95 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 96 % en peso de SiÜ2, al menos aproximadamente el 97 % en peso de SiÜ2, o al menos aproximadamente el 98 % en peso de SiÜ2 hasta el 100 % en peso de SiÜ2 basándose en el peso total de la partícula.

Adsorbentes

Según la presente invención, el absorbente comprende partículas de sílice porosas tal como se describió anteriormente en el presente documento y un material polimérico unido covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice. En una realización, los adsorbentes comprenden al menos un resto bifuncional que se extiende desde dichas superficies de dichas partículas de sílice, comprendiendo cada uno de dicho al menos un resto bifuncional (i) uno o más grupos funcionales que pueden unirse a dichas superficies y, o bien (iia) dicho material polimérico, o bien (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse a dicho material polimérico.

En otra realización, los adsorbentes comprenden al menos un resto bifuncional que se extiende desde las superficies de dichas partículas de sílice, comprendiendo cada uno de dicho al menos un resto bifuncional (i) uno o más grupos funcionales que pueden unirse a dichas superficies, y (iia) dicho material polimérico.

En otra realización adicional, los adsorbentes comprende al menos un resto bifuncional que se extiende desde dichas superficies de dichas partículas de sílice, comprendiendo cada uno de dicho al menos un resto bifuncional (i) uno o más grupos funcionales que pueden unirse a dichas superficies y (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse a dicho material polimérico.

El resto bifuncional adecuado que se extiende desde la superficie de dicha partícula de sílice comprende anillos de epoxi que pueden reaccionar con grupos de amina de las cadenas poliméricas de los polielectrolitos. En una realización, el al menos un resto bifuncional que comprende el adsorbente comprende producto de la reacción de la superficie de sílice con un epoxi-silano. En una realización preferida, el epoxi-silano comprende (3-glicidoxipropil)-trimetoxisilano.

En una realización de la invención, el material polimérico se une covalentemente a la superficie de las partículas de sílice mediante un enlace covalente que consiste en uno o más átomos seleccionados del grupo que consiste en C, O, Si y N.

De forma típica, el material polimérico comprende un polielectrolito. El polielectrolito puede ser catiónico o aniónico. Los materiales de polielectrolito catiónicos adecuados comprenden polietilenimina, polialilamina, polivinilpiridina, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (pDADMAC), un copolímero que contiene uno o más grupos funcionales catiónicos o formadores de cationes, o combinaciones de los mismos. El polielectrolito catiónico puede comprender además un producto de reacción de dichas partículas de óxido metálico y una disolución acuosa de trimetoxisilil-polietilenimina. En una realización preferida, el material polimérico comprende polietilenimina. En una realización incluso más preferida, la polietilenimina tiene (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, cada uno de los cuales es menor de aproximadamente 5000. Todavía en una realización más preferida, la polietilenimina tiene (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, cada uno de los cuales oscila de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500; o. (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, en el intervalo de aproximadamente 800 a aproximadamente 2000, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, en el intervalo de aproximadamente 600 a aproximadamente 1800.

En una realización, el material polimérico comprende una polietilenimina que tiene una estructura:

antes de unirse covalentemente a dichas superficies, y n es un número mayor de o igual a 1.

Los materiales de polielectrolito aniónicos adecuados comprenden poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), poli(ácido estirenosulfónico), ácido nucleico, un copolímero que contiene uno o más grupos funcionales aniónicos o formadores de aniones o combinaciones de los mismos. En una realización preferida, el material de polielectrolito aniónico comprende poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico) o una combinación de los mismos. En una realización más preferida, el material de polielectrolito aniónico comprende un poli(ácido acrílico) o un poli(ácido metacrílico) que tiene un peso molecular promedio en peso, Pm, mayor de aproximadamente 50.000. En una realización incluso más preferida, el poli(ácido acrílico) o poli(ácido metacrílico) tiene un peso molecular promedio en peso, Pm, de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 250.000.

La cantidad del material polimérico presente en el absorbente es cualquier cantidad adecuada para proporcionar interacciones de carga con materiales biológicos y, por tanto, unirse selectivamente a estos materiales biológicos de carga opuesta. En una realización, los materiales poliméricos comprenden una cantidad tal que menos del 100 % de dichas superficies de las partículas de sílice se unen a dicho material polimérico. En otra realización, dicho material polimérico está presente en el adsorbente en una cantidad que representa hasta aproximadamente el 20,0 % en peso de dichos adsorbentes basado en un peso total de dichos adsorbentes. En otras realizaciones, el material polimérico está presente en una cantidad que representa de aproximadamente el 1,0 a aproximadamente el 15,0 % en peso de dichos adsorbentes basado en un peso total de dichos adsorbentes.

Métodos para producir adsorbentes

El absorbente de la invención se preparan, generalmente, poniendo en contacto las partículas de sílice con uno o más reactantes en condiciones de reacción que dan como resultado la unión covalente del material polimérico a las superficies de las partículas de sílice. La etapa de puesta en contacto puede utilizar un disolvente. En una realización, la etapa de puesta en contacto utiliza una mezcla de reacción libre de disolvente orgánico.

En una realización de la invención, el uno o más reactantes comprenden al menos un compuesto bifuncional que comprende (i) uno o más grupos funcionales que pueden unir el compuesto a las superficies de las partículas de sílice y, o bien (iia) el material polimérico, o bien (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse al material polimérico.

Los reactantes adecuados que comprenden al menos un compuesto bifuncional que comprende (i) uno o más grupos funcionales que pueden unir el compuesto a las superficies de las partículas de sílice, y (iia) el material polimérico incluyen, pero no se limitan a, polietileniminas.

Los reactantes adecuados que comprenden al menos un compuesto bifuncional que comprende (i) uno o más grupos funcionales que pueden unir el compuesto a las superficies de las partículas de sílice, y (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse al material polimérico, incluyen, pero no se limitan a, poli(ácidos acrílicos).

También está dentro del alcance de la invención elegir el uno o más reactantes para producir adsorbentes que tengan un grado de afinidad deseado por uno o más compuestos biológicos particulares a través de la atracción debida a cargas opuestas. Por ejemplo, la afinidad de ADN cargado negativamente hacia la superficie de cargas positivas. La cantidad de cada uno del uno o más reactantes también puede seleccionarse para formar adsorbentes que tengan un grado deseado de cobertura de superficie de partícula por el material polimérico.

Uso de adsorbentes

El adsorbente según la presente invención comprende sílice funcionalizada en superficie con polielectrolitos. Para lograr la adsorción de una mayor cantidad de sustancias biológicas no deseadas, los requisitos de las moléculas porosas son un alto volumen de poro (>1,0 cc/g) y un alto valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro (>1,0). Si estas condiciones se cumplen, con la unión del polielectrolito, ya sea con carga positiva o negativa, los materiales adsorbentes pueden usarse eficazmente para su uso tanto como adsorbentes y como agentes de clarificación. En una realización, los adsorbentes funcionalizados se usan como agente de clarificación para bioprocesamiento, en donde los adsorbentes comprenden: partículas de sílice que tienen una amplia distribución de tamaño de poro según se mide mediante un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 2,8; y material polimérico unido covalentemente a superficies de las partículas de óxido metálico.

El absorbente puede usarse poniendo en contacto el adsorbente poroso funcionalizado en un recipiente de bioprocesamiento que contiene materiales biológicos no deseados obtenidos durante un procedimiento de bioprocesamiento; dejar un tiempo de incubación suficiente para permitir la adsorción de los materiales biológicos no deseados al adsorbente o la formación de sedimento celular y una capa de sobrenadante; separar la mezcla resultante a través de o bien filtración o bien decantación o bien bombeo de la capa de sobrenadante y, después de eso, extraer la sustancia biológica deseada o bien del filtrado o bien del sobrenadante o llevar a cabo etapas de purificación adicionales que incluyen etapas de filtración en profundidad y cromatografía posterior.

En una realización, los adsorbentes según la presente invención se añaden a un recipiente de bioprocesamiento que contiene una o más biomoléculas seleccionadas del grupo que consiste en una proteína, un polisacárido, un lípido, un ácido nucleico, un metabolitos, una célula de mamífero, restos celulares de mamífero, un anticuerpo, un péptido, ADN, ARN, una endotoxina, un virus, una vacuna, una enzima, o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, el recipiente de bioprocesamiento contiene al menos uno de: células huésped, restos celulares, proteínas de células huésped, ácidos nucleicos, cromatinas, anticuerpos, virus o vacunas. Los adsorbentes funcionalizados se unen a una o más biomoléculas que entran en contacto con los adsorbentes. Después de la etapa de unión en la que los adsorbentes se une a una o más biomoléculas que entran en contacto con los adsorbentes, los adsorbentes unidos a la una o más biomoléculas se separa de otros componentes del procedimiento de bioprocesamiento.

Debe entenderse que aunque los adsorbentes y métodos descritos anteriormente se describen como “que comprenden” uno o más componentes o etapas, los adsorbentes y métodos descritos anteriormente pueden “comprender” , “consistir en” o “consistir esencialmente en” cualquiera de los componentes o etapas de los adsorbentes y métodos descritos anteriormente. Por consiguiente, cuando la presente invención, o una parte de la misma, se ha descrito con un término abierto tal como “que comprende” , debe entenderse fácilmente que (a menos que se indique de otro modo) la descripción de la presente invención, o la parte de la misma, debe interpretarse además como que describe la presente invención, o una parte de la misma, mediante el uso de los términos “que consiste esencialmente en” o “que consiste en” o variaciones de los mismos tal como se describe a continuación.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “comprende” , “que comprende” , “ incluye” , “que incluye” , “tiene” , “que tiene” , “contiene” , “que contiene” , “caracterizado por” , o cualquier otra variación de los mismos, pretenden abarcar una inclusión no exclusiva, sujeta a cualquier limitación indicada explícitamente de otro modo, de los componentes mencionados. Por ejemplo, un adsorbente y/o método que “comprende” una lista de elementos (p. ej., componentes o etapas) no se limita necesariamente solo a esos elementos (o componentes o etapas), sino que puede incluir otros elementos (o componentes o etapas) no enumerados expresamente o inherentes al adsorbente y/o método.

Tal como se usa en el presente documento, las frases de transición “consiste en” y “que consiste en” excluyen cualquier elemento, etapa o componente no especificado. Por ejemplo, “consiste en” o “que consiste en” usados en una reivindicación limitarían la reivindicación a los componentes, materiales o etapas mencionados específicamente en la reivindicación, excepto por las impurezas comúnmente asociadas con ellos (es decir, impurezas dentro de un componente dado). Cuando la frase “consiste en” o “que consiste en” aparece en una cláusula del cuerpo de una reivindicación, en lugar de seguir inmediatamente al preámbulo, la frase “consiste en” o “que consiste en” limita solamente los elementos (o componentes o etapas) que se exponen en esa cláusula; otros elementos (o componentes) no se excluyen de la reivindicación en su totalidad.

Tal como se usa en el presente documento, las frases de transición “consiste esencialmente en” y “que consiste esencialmente en” se usan para definir un adsorbente y/o método que incluye materiales, etapas, características, componentes o elementos, además de aquellos descritos literalmente, siempre que estos materiales, etapas, características, componentes o elementos adicionales no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. El término “que consiste esencialmente en” ocupa una posición intermedia entre “que comprende” y “que consiste en” .

Además, debe entenderse que los adsorbentes y/o métodos descritos en el presente documento pueden comprender, consistir esencialmente en o consistir en cualquiera de los componentes y características descritos en el presente documento, tal como se muestra en las figuras con o sin cualquier característica o características no mostrada en las figuras. Dicho de otro modo, en algunas realizaciones, los adsorbentes y/o métodos de la presente invención no tienen ninguna característica adicional distinta de las mostradas en las figuras, y tales características adicionales, no mostradas en las figuras, se excluyen específicamente de los adsorbentes y/o métodos. En otras realizaciones, los adsorbentes y/o métodos de la presente invención tienen una o más características adicionales que no se muestran en las figuras.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no debe considerarse que impongan en modo alguno limitaciones al alcance de la misma. Por el contrario, debe comprenderse claramente que puede recurrirse a diversas otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que, después de la lectura de la descripción del presente documento, puedan sugerirse a los propios expertos en la técnica sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Se determinaron las medianas de tamaño de partícula indicadas en los ejemplos mediante dispersión de luz láser usando un instrumento Malvern Mastersizer 2000 disponible de Malvern Instruments Ltd. (según la norma ASTM B822-10). El tamaño de partícula se define como la mediana de tamaño de partícula por distribución de volumen. Se obtuvieron las áreas de superficie BET a partir del análisis de sorción de nitrógeno descrito en la documentación. Se calcularon la mediana de tamaño de poro, el volumen de poro y la distribución de tamaño de poro basándose en la intrusión de mercurio en poros de 35-10000 Á de tamaño. El volumen de poro se define como el volumen de poro acumulativo en el mismo rango de tamaño de poro, y se determina la mediana de tamaño de poro con un diámetro (tamaño) de poro en el cual al 50 % del volumen de poro contribuyen poros más pequeños y al 50 % contribuyen poros más grandes. La amplitud 90 se define como una amplitud de tamaño de poro relativa y se calcula como (PD90 - PD10)/PD50, mientras que PD10 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 10 % y PD50 y PD90 son tal como se definen como contribuciones de volumen de poro acumulativo del 50 % y el 90 % basado en los datos de mercurio, respectivamente.

1. Unión de polietilenimina (PEI) para superficie catiónica

En estos ejemplos, se usaron seis grados diferentes de sílice (A, B, C, D, E, F), disponibles de W. R. Grace, y se enumeran sus propiedades (área de superficie BET, volumen de poro, amplitud 90 de distribución de tamaño de poro y mediana de tamaño de poro PD50) en la Tabla I a continuación:

Tabla I

El tamaño de partícula de estas sílices oscila de 5 pm a 70 pm. La sílice B es sílice comercial con un nombre comercial de Syloid® W900, la sílice C es una sílice comercial con un nombre comercial de Davisil® XWP 500, la sílice F es una sílice comercial con un nombre comercial de Trisyl®. Todas ellas están disponibles de W. R. Grace & Co. La sílice G es una muestra de sílice unida con PEI (polietilenimina sobre gel de sílice, polvo, malla de 40 200 de Sigma-Aldrich Corporation) disponible comercialmente. La sílice H en la tabla es una tierra de diatomeas (polvo, adecuada para la mayor parte de filtraciones, de Sigma-Aldrich Corporation) y se intentó la unión con PEHA usando el mismo procedimiento que las otras muestras.

Las sílices A, B tenían las propiedades de volúmenes de poro mayores de 1,0 cc/g y valores de amplitud 90 mayores de 1,0.

En los ejemplos, se usó pentaetilenhexamina (PEHA), una mezcla de poliaminas de molécula pequeña para representar PEI en los presentes ejemplos.

El proceso de unión consistió en dos etapas: 1). Unión en superficie con epoxi-silano (3-glicidoxipropiltrimetoxisilano), y luego 2). La reacción de PEHA con grupos epoxi de superficie (ataque de grupos amino nucleófilos al anillo de epoxi, y esto conduce a la unión de amina con apertura del anillo de epoxi, formando pamino-alcoholes (N. Azizi, M. R. Saidi, Org. Lett., 2005, 7, 3649-3651).

IA. Procedimiento de unión inicial

Se prepararon muestras de sílice modificada tratando las partículas desnudas de gel de sílice (secadas en un horno a 120 0C durante la noche) con epoxi-silano. Se cargó un matraz indentado de fondo redondo de 1 l con partículas de sílice (100 g), y luego se añadieron gota a gota 10 g (al 10 % p/p con respecto a sílice) de epoxisilano en el matraz mientras se hacía rotar. Se permitió que rodase la mezcla en un rotavapor durante la noche (16 h). Se separó una pequeña porción (2 g) de la muestra y se lavó con 10 ml de acetona cinco veces y se secó en un horno a 70 0C durante 20 horas. Se sometió la muestra secada a análisis elemental para determinar la cantidad de contenido de carbono mediante el uso de un instrumento LECO.

I B. Reacción con PEI

Se pesaron 20 g de sílice unida de la muestra obtenida anteriormente en el punto 1A y se colocaron en un matraz Erlenmeyer. Se pesaron 6 g de PEHA en un vaso de precipitados pequeño (al 30 % p/p con respecto a sílice) y se mezcló con 100 g de DIW para disolver PEHA para proporcionar una suspensión ~ al 15 % de sílice para la reacción). Se agitó bien la mezcla y se dejó asentar en un baño de agua (65 °C durante 30 min). Después de la reacción, se diluyó adicionalmente la sílice con agua desionizada, se filtró. Entonces, se empapó la sílice con HCl 0,5 M durante 20-30 minutos y se filtró. Se lavó la sílice resultante con DIW tres veces (3 x 100 ml) y se secó una pequeña muestra a 90 0C durante la noche. Se envió la muestra secada para análisis del % de C. Se secó la parte restante de la muestra dentro de la campana extractora en condiciones ambientales antes del análisis.

IC. Prueba de capacidad de unión por lotes

En estos ejemplos se usaron dos compuestos modelo: 1. Oligonucleótidos de ADN (Ácido desoxirribonucleico de esperma de arenque de Sigma-Aldrich), menos de 50 pares de bases, PM < 15000. 2. Bovine serum albumin (Albúmina sérica bovina - BSA) (polvo liofilizado, cristalizado, >98,0 % de Sigma), PM~ 66000.

Método de ensayo: Se realizaron las capacidades de unión mediante el uso de disolución de BSA (5 mg/ml) a un pH de 8,0 con tampón Tris - HCl 20 mM, o disolución de ADN (2 mg/ml) a pH 3,45 con tampón fosfato de sodio 10 mM. Se pesaron muestras de sílice secada en viales y, luego, las disoluciones de proteína (se determinó la adsorción UV/Vis a 280 nm mediante el uso de un espectrofotómetro Genesys®10S Bio UV-Vis). Después de 2 h, se recogieron los sobrenadantes y se midieron las adsorciones de nuevo en las mismas condiciones. Se calculó el porcentaje de disminución de señal de UV/Vis (cuanto mayor sea la disminución antes y después de la adsorción, mayor es la capacidad de unión). Se llevaron a cabo tres mediciones de adsorción en paralelo para una muestra y se calcularon y notificaron los promedios.

La siguiente tabla muestra los resultados de la capacidad de unión de los Ejemplos 1 -10:

Tabla 2

Tal como se mencionó anteriormente, se prepararon los Ejemplos 1-6 mediante el tratamiento de la sílice secada con epoxisilano y, luego seguido por la reacción de los productos intermedios de sílice con PEHA. Los números de % de C, calculados al restar el % de C total del % de C de la sílice unida con epoxi, son indicadores de la cantidad total de aminas que se unen a partir de las reacciones. Para la Muestra 7 (PEI-sílice comercial) (las mediciones de BET y Hg se llevaron a cabo después de que los grupos de superficie de la muestra se quemaron al colocar muestras en un horno de mufla a 460 °C al aire durante la noche) se midieron la unión de ADN y BSA mediante el mismo método de medición. La tierra de diatomeas (sílice H) para el Ejemplo 8 también se unió con PEHA mediante el uso del mismo procedimiento. Tal como se muestra, el Ejemplo 8 tiene un nivel muy bajo de cantidad de PEHA unido (debido a un área de superficie muy baja) y la cantidad de ADN adsorbido.

Los resultados mostrados anteriormente indican que para obtener una alta cantidad de ADN y BSA adsorbidos, se requieren un alto volumen de poro y amplitud 90. Las Muestras 1,2 y 3 tenían tanto volumen de poro como amplitud 90 mayores de 1,0, y estas muestras mostraron mayor unión tanto de ADN como de BSA. Todas las otras muestras mostraron una menor unión. En el Ejemplo 9, debido a su alta área de superficie, la sílice A no unida tuvo cierta capacidad de unión de ADN y BAS, pero la unión fue muy baja en comparación con la Muestra 1 unida con PEHA.

La siguiente Figura muestra la comparación en distribuciones de tamaño de poro (a partir de porosimetría de mercurio) para la Sílice A y Sílice G. Tal como se indicó, la Sílice A tiene la distribución de tamaño de poro más amplia que oscila de 50 Á a más de 5000 Á.

2. Unión de sílice con polímeros aniónicos para la unión de proteínas básicas

2A. Preparación

La preparación de sílice unida con polímero aniónico se logró mezclando la disolución acuosa neutra de polímeros (neutralizada con una base tal como hidróxido de amonio o hidróxido de sodio) con sílice y, luego, calentando en horno la mezcla a 190 °C durante 5 horas para forzar la formación de unión del polímero y los grupos de superficie. Se prepararon disoluciones de poli(ácido acrílico) o poli(ácido metacrílico) comerciales (de Sigma-Aldrich Corporation) disolviendo (o diluyendo si el producto comercial es una disolución acuosa) polímero en agua desionizada y se ajusta el pH de la disolución a 7-8 con hidróxido de amonio (o hidróxido de sodio). La concentración para las disoluciones fue de aproximadamente el 18 %.

Se mezclaron 20 g de sílice (Sílice A) con disolución de polímero que contiene aproximadamente 10 g de polímero neto. Se colocó la mezcla en un recipiente de cerámica y se colocó en un horno en una campana extractora bien ventilada. Se calentó la mezcla a 90 °C hasta que no se observó líquido y después se calentó en horno a 190 °C durante 5 horas. Se volvió a suspender la mezcla resultante con agua desionizada, y se lavó 5 veces con 200 ml de NaCI al 10 % y 1 vez con 200 ml de NaHCÜ3, seguido de 3 veces con 100 ml de agua desionizada.

2B. Evaluación de unión a proteínas

El procedimiento fue similar al procedimiento descrito en 1C, con la excepción de que se usó lisozima (a partir de clara de huevo de gallina, polvo liofilizado, proteína >90 %, >40.000 unidades/mg de proteína de Sigma) en esta prueba, y la concentración de la proteína fue de 25 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0. Se midió la cantidad de proteína adsorbida a través de la cantidad de pérdida de señal después de 2 h de incubación a temperatura ambiente, a partir de UV/Vis a una longitud de onda de 280 nm y se calculó mediante el coeficiente de absorción de lisozima.

La siguiente Tabla 3 muestra los resultados de unión a proteínas para los Ejemplos 11-14 a continuación:

Tabla 3.

La Tabla 3 muestra que una mayor unión de lisozima se asocia con un alto peso molecular del polímero. Las muestras de polímero de bajo peso molecular tuvieron una unión similar a la del control, sílice sin polímero unido (Muestra 14).

Aunque la invención se ha descrito con un número limitado de realizaciones, estas realizaciones específicas no pretenden limitar el alcance de la invención tal como se describe y se reivindica por lo demás en el presente documento. Puede resultar evidente para los expertos en la técnica tras la revisión de las realizaciones ilustrativas del presente documento que son posibles modificaciones, equivalentes y variaciones adicionales. Todas las partes y porcentajes en los ejemplos, así como en el resto de la memoria descriptiva, son en peso a menos que se especifique de otro modo. Además, se pretende que cualquier intervalo de números citados en la memoria descriptiva o las reivindicaciones, tal como el que representa un conjunto particular de propiedades, unidades de medida, condiciones, estados físicos o porcentajes, incorpore literal y expresamente en el presente documento como referencia o de cualquier otra manera, cualquier número que se encuentre dentro de tal intervalo, incluido cualquier subconjunto de números dentro de cualquier intervalo citado de este modo. Por ejemplo, siempre que se describa un intervalo numérico con un límite inferior, Ri, y un límite superior, Rs , se da a conocer específicamente cualquier número R que se encuentre dentro del intervalo. En particular, se dan a conocer específicamente los siguientes números R dentro del intervalo: R = Ri k(Rs -Ri), donde k es una variable que oscila del 1 % al 100 % con un incremento del 1 %, p. ej., k es el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %. ... 50 %, 51 %, 52 %. ... 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Además, también se da a conocer específicamente cualquier intervalo numérico representado por dos valores cualesquiera de R, tal como se calculó anteriormente. Cualquier modificación de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, resultará evidente para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Adsorbentes que comprenden:

partículas de sílice que tienen una amplia distribución de tamaño de poro según se mide mediante una amplitud 90 de distribución de tamaño de poro, cuyo valor de la amplitud 90 de distribución de tamaño de poro se calcula como [(PD90 - PD10)/p D50], mientras que PD10 es el diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 10 %, PD50 es diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 50 %, y PD90 es diámetro de poro a una contribución de volumen de poro acumulativo del 90 %, todos basados en datos de intrusión de mercurio, de al menos 2,8;

y

material polimérico unido covalentemente a superficies de dichas partículas de sílice.

2. Los adsorbentes de la reivindicación 1, en donde dichas partículas de sílice tienen una mediana de tamaño de partícula menor de 150 pm, preferiblemente menor de 100 pm, más preferido de 10 a 50 pm, en particular 30 pm.

3. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dichas partículas de sílice tienen una mediana de tamaño de poro, medido mediante intrusión de mercurio usando un instrumento Autopore® IV 9520, disponible de Micromeritics Instrument Corporation, menor de 200 nm (2000 Á), preferiblemente menor de 100 nm (1000 Á), más preferido de 10 nm a _ 80 nm (de 100 a aproximadamente 800 Á), todavía más preferido de 15 nm a 25 nm (de 150 a 250 Á), en particular 20 nm (200 Á).

4. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dichas partículas de sílice tienen una distribución de tamaño de poro, que es la abundancia relativa de cada tamaño de poro en un volumen representativo de partículas inorgánicas porosas, de 3 a 500 nm (de 30 a 5000 Á), preferiblemente de 5 a 300 nm (de 50 a 3000 Á).

5. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dichas partículas de sílice tienen un área de superficie de partícula BET de al menos 100 m2/g, preferiblemente al menos 300 m2/g, más preferido al menos 500 m2/g, todavía más preferido de 600 a 800 m2/g, en particular 700 m2/g.

6. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas partículas de sílice tienen un volumen de poro, medido mediante intrusión de mercurio, de al menos 0,25 ml/g, preferiblemente al menos 0,50 ml/g, más preferido al menos 1,00 ml/g, todavía más preferido al menos 1,50 ml/g, en particular 1,77 ml/g.

7. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas partículas de sílice tienen un valor de amplitud 90 de distribución de tamaño de poro de al menos 3,0, más preferido de 5,0 a 10,0, todavía más preferido de 7,5 a 8,5, en particular 7,8.

8. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además al menos un resto bifuncional que se extiende desde dichas superficies de dichas partículas de sílice, comprendiendo cada uno de dicho al menos un resto bifuncional (i) uno o más grupos funcionales que pueden unirse a dichas superficies y, o bien (iia) dicho material polimérico, o bien (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse a dicho material polimérico.

9. Los adsorbentes de la reivindicación 8, en donde dicho al menos un resto bifuncional comprende un epoxi-silano.

10. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicho al menos un resto bifuncional comprende (3-glicidoxi-propil)trimetoxisilano.

11. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicho material polimérico se une covalentemente a dichas superficies mediante un enlace covalente que consiste en uno o más átomos seleccionados del grupo que consiste en C, O, Si y N.

12. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho material polimérico comprende un polielectrolito, preferiblemente dicho material polimérico comprende polietilenimina, polialilamina, polivinilpiridina, poli(cloruro de dialildimetilamonio) (pDADMAC), o un copolímero que contiene uno o más grupos funcionales catiónicos o formadores de cationes, en particular polietilenimina.

13. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho material polimérico comprende trimetoxisilil-polietilenimina.

14. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en donde dicha polietilenimina tiene (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, cada uno de los cuales es menor de 5000, preferiblemente (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, cada uno de los cuales oscila de 500 a 2500, más preferido (i) un peso molecular promedio en peso, Pm, que oscila de 800 a 2000, y (ii) un peso molecular promedio en número, Mn, que oscila de 600 a 1800.

15. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde dicha polietilenimina tiene una estructura:

16. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho material polimérico comprende un polielectrolito aniónico.

17. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y 16, en donde el material polimérico comprende poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico), poli(ácido estirenosulfónico), ácido nucleico, o un copolímero que contiene uno o más grupos funcionales aniónicos o formadores de aniones, preferiblemente poli(ácido acrílico), poli(ácido metacrílico) o una combinación de los mismos, en donde dicho poli(ácido acrílico) o dicho poli(ácido metacrílico) tiene preferiblemente un peso molecular promedio en peso, Pm, mayor de 50.000, más preferido de 100.000 a 250.000.

18. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho material polimérico está presente en una cantidad que representa hasta el 20,0 % en peso de dichos adsorbentes basado en un peso total de dichos adsorbentes, preferiblemente del 1,0 al 15,0 % en peso de dichos adsorbentes basado en un peso total de dichos adsorbentes.

19. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde menos del 100 % de dichas superficies se unen a dicho material polimérico.

20. Los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 unidos a uno o más compuestos biológicos particulares, en donde el uno o más compuestos biológicos particulares comprenden preferiblemente una proteína, un polisacárido, un lípido, un ácido nucleico, un metabolitos, una célula de mamífero, restos celulares de mamífero, un anticuerpo, un péptido, ADN, ARN, una endotoxina, un virus, una vacuna, una enzima, o cualquier combinación de los mismos.

21. Un método para producir los adsorbentes de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, comprendiendo dicho método:

poner en contacto las partículas de sílice con uno o más reactantes en condiciones de reacción que dan como resultado el material polimérico unido covalentemente a las superficies de las partículas de sílice.

22. El método de la reivindicación 21, en donde el uno o más reactantes comprenden al menos un compuesto bifuncional que comprende (i) uno o más grupos funcionales que pueden unir el compuesto a las superficies de las partículas de sílice, y (iia) el material polimérico, o (iib) uno o más grupos reactivos que pueden unirse al material polimérico.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21 y 22, en donde dicha etapa de puesta en contacto utiliza una mezcla de reacción libre de disolvente orgánico.

24. Uso de adsorbentes según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, como agente de clarificación para bioprocesamiento.

25. Uso de los adsorbentes según la reivindicación 24, en donde los adsorbentes se añade a un recipiente de bioprocesamiento que contiene una o más biomoléculas, comprendiendo preferiblemente la una o más biomoléculas una proteína, un polisacárido, un lípido, un ácido nucleico, un metabolitos, una célula de mamífero, restos celulares de mamífero, un anticuerpo, un péptido, ADN, ARN, una endotoxina, un virus, una vacuna, una enzima, o cualquier combinación de los mismos.

26. Uso de los adsorbentes según una cualquiera de las reivindicaciones 24 o 25, en donde los adsorbentes se unen a una o más biomoléculas que entran en contacto con los adsorbentes.

27. Uso de los adsorbentes según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en donde los adsorbentes se añaden a un recipiente de bioprocesamiento que contiene al menos uno de: células huésped y residuos celulares; anticuerpos, proteínas y péptidos; ácidos nucleicos, tales como ADN y ARN; endotoxinas; virus; vacunas.

28. Uso de los adsorbentes según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en donde después de una etapa de unión en la que los adsorbentes se une a una o más biomoléculas que entran en contacto con los adsorbentes, separando los adsorbentes unidos a la una o más biomoléculas de otros componentes de un procedimiento de bioprocesamiento.