PT950067E - Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína a. - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína A"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do Invento O presente invento refere-se genericamente à purificação de proteínas. Em particular, o presente invento refere-se a um método para purificação de proteínas contendo uma região Ch2/Ch3, tais como anticorpos e imunoadesinas, através de cromatografia de afinidade em Proteína A.

Descrição da Arte Relacionada A purificação rentável em larga escala de proteínas é um problema de crescente importância para a indústria biotecnológica. Geralmente, as proteínas são produzidas através de cultura celular, utilizando linhas celulares de mamífero ou bacterianas modificadas para produzirem a proteína de interesse através de inserção de um plasmideo recombinante contendo o gene para essa proteína. Uma vez que as linhas celulares utilizadas são organismos vivos, têm de ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo açúcares, aminoácidos e factores de crescimento, habitualmente fornecidos a partir de preparações de soro animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos com que se alimentam as células e de subprodutos das próprias células até uma pureza suficiente para utilizar como terapêutico humano coloca um formidável desafio.

Os procedimentos para purificação de proteínas a partir de detritos celulares dependem inicialmente do local de expressão da proteína. Algumas proteínas podem ser levadas a ser segregadas directamente da célula para o meio de crescimento envolvente; outras são produzidas intracelularmente. Para estas últimas proteínas, o primeiro passo de um processo de purificação envolve a lise da célula, que pode ser feita através de uma variedade de métodos, incluindo ruptura mecânica, choque osmótico ou tratamentos 2 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ enzimáticos. Esta ruptura liberta todo o conteúdo da célula no homogenato e produz adicionalmente fragmentos subcelulares que são difíceis de remover devido ao seu pequeno tamanho. Estes são geralmente removidos através de centrifugação diferencial ou através de filtração. O mesmo problema surge, embora numa escala menor, com proteínas segregadas directamente devido à morte natural das células e à libertação de proteínas intracelulares das células hospedeiras no decurso do processo de produção proteica.

Uma vez obtida uma solução clarificada contendo a proteína de interesse, a sua separação das outras proteínas produzidas pela célula é habitualmente tentada utilizando uma combinação de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separam misturas de proteínas com base na sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho. Várias resinas cromatográficas diferentes estão disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo uma adaptação precisa do esquema de purificação à proteína particular envolvida. A essência de cada um destes métodos de separação é que as proteínas possam ser levadas a mover-se a diferentes velocidades ao longo de uma longa coluna, alcançando uma separação física que aumenta à medida que passam mais para baixo na coluna ou a aderir selectivamente ao meio de separação, sendo então diferencialmente eluídos através de solventes diferentes. Nalguns casos, a proteína desejada é separada de impurezas quando as impurezas aderem especificamente à coluna, e a proteína de interesse não, isto é, a proteína de interesse está presente no "fluido eluente" ("flow-through"). A cromatográfia de afinidade, que explora uma interacção específica entre a proteína a purificar e um agente de captura imobilizado, pode também ser uma opção para algumas proteínas. A Proteína A é um adsorvente útil para cromatográfia de afinidade de proteínas, tais como anticorpos, que contêm uma região Fc. A Proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kDa de Staphylococcus áureos que se liga com uma elevada afinidade (cerca de 10“8 M para a IgG humana) à região Fc dos anticorpos. 3 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ

SUMÁRIO DO INVENTO

Foi aqui identificado um problema associado à cromatografia em Proteína A de preparações proteicas contaminadas. Em particular, observou-se que na cromatografia em Proteína A utilizando uma superfície de vidro ou de sílica para adsorção da Proteína A (p.ex., quando a Proteína A é imobilizada numa coluna de vidro de poro controlado ou numa coluna de ácido silícico), os contaminantes na preparação proteica (tais como as proteínas de ovário de hamster chinês (CHOP), quando a preparação proteica é derivada de uma célula de CHO) aderem à superfície de vidro ou de sílica da fase sólida. Verificou-se que isto ocorre mesmo quando a fase sólida é revestida com um reagente (tal como glicerol) numa tentativa de prevenir aderência não específica. Foi aqui considerado um passo de lavagem intermédio que aborda este problema. Este passo de lavagem serve para remover os contaminantes, mas não a Proteína A imobilizada ou a proteína de interesse ligada à Proteína A, da fase sólida. Em particular, verificou-se que os electrólitos hidrófobos, p.ex., cloreto de tetrametilamónio (TMAC) e cloreto de tetraetilamónio (TEAC), podem ser utilizados neste passo de lavagem intermédio.

Assim, o presente invento proporciona um método para purificação de uma proteína, que compreende uma região Ch2/Ch3, a partir de uma sua solução contaminada, através de cromatografia em Proteína A, compreendendo os seguintes passos efectuados sequencialmente: a) adsorção da Proteína A imobilizada numa fase sólida compreendendo sílica ou vidro; b) remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo, em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetrapropilamónio, cloreto de tetrabutilamónio, cloreto de tetrametilamónio (TMAC) ou cloreto de tetraetilamónio (TEAC); e c) recuperação da proteína a partir da fase sólida.

Em concretizações preferidas, a proteína é um anticorpo (p.ex., um anticorpo anti-HER2, anti-IgE ou anti-CD20) ou uma imunoadesina (p.ex., uma imunoadesina receptora de TNF). 4 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições

Quando aqui utilizado, o termo "Proteína A" engloba Proteína A recuperada a partir de uma sua fonte nativa, Proteína A produzida sinteticamente (p.ex., através de síntese peptídica ou através de técnicas recombinantes) e suas variantes que mantenham a capacidade para se ligarem a proteínas possuindo uma região CH2/CH3. A Proteína A pode ser adquirida comercialmente em Repligen, Pharmacia e Fermatech. A Proteína A é imobilizada numa fase sólida. Por "fase sólida" entenda-se uma matriz não aquosa à qual a Proteína A pode aderir. A fase sólida de interesse daqui é uma que compreende uma superfície de vidro ou de sílica. A fase sólida pode ser uma coluna de purificação ou uma fase descontínua de partículas discretas. Em concretizações preferidas, a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em certas concretizações, a fase sólida é revestida com um reagente (tal como glicerol) que se pretende que previna a aderência não específica de contaminantes à fase sólida. A proteína de interesse daqui é uma que compreende uma região CH2/CH3 e é portanto passível de purificação através de cromatografia em Proteína A. O termo "região CH2/CH3" quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos na região Fc de uma molécula de imunoglobulina que interagem com a Proteína A. Em concretizações preferidas, a região Ch2/Ch3 compreende uma região CH2 intacta seguida de uma região Ch3 intacta e compreende de preferência uma região Fc de uma imunoglobulina. Exemplos de proteínas contendo uma região Ch2/Ch3 incluem os anticorpos, as imunoadesinas e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de interesse fundida ou conjugada com uma região CH2/CH3. 0 "passo de lavagem intermédio" é um passo efectuado após a proteína de interesse ser carregada na fase sólida e adsorvida à Proteína A, mas antes da proteína ser recuperada da coluna. O passo de lavagem intermédio serve para remover contaminantes que se ligam não especificamente à fase sólida, 5 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ sem eluir significativamente a proteína de interesse da fase sólida. No passo de lavagem intermédio, a fase sólida é lavada com um solvente electrólito hidrófobo (p.ex., o solvente electrólito hidrófobo é passado através da coluna de Proteina A, onde a fase sólida é uma coluna). O "solvente electrólito hidrófobo" no passo de lavagem intermédio é o que é capaz de eluir os contaminantes ligados à fase sólida, sem eluir significativamente a Proteína A imobilizada nem a proteína de interesse a ela adsorvida. De preferência, o solvente electrólito hidrófobo é um transportador aquoso (p.ex., um tampão) compreendendo um ou mais electrólitos hidrófobos. Os electrólitos hidrófobos são as alquilaminas; cloreto de tetrametilamónio (TEMAC), cloreto de tetraetilamónio (TEAC), cloreto de tetrapropilamónio e cloreto de tetrabutilamónio.

Um "tampão" é uma solução tamponada que resiste a alterações no pH através da acção dos seus componentes ácido-base conjugados. O "tampão de equilíbrio" aqui é o utilizado para preparar a fase sólida (com Proteína A imobilizada) para carregar a proteína de interesse. O tampão de equilíbrio é de preferência isotónico e tem vulgarmente um pH no intervalo de cerca de 6 a cerca de 8. 0 tampão de equilíbrio do exemplo foi Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1. 0 "tampão de carga" é o que é utilizado para carregar a mistura da proteína contendo a região CH2/CH3 e contaminantes, sobre a fase sólida na qual a Proteína A está imobilizada.

Frequentemente, os tampões de equilíbrio e de carga são o mesmo. 0 "tampão de eluição" é utilizado para eluir a proteína contendo a região CH2/CH3 da Proteína A imobilizada. De preferência o tampão de eluição possui um pH baixo e rompe deste modo as interacções entre a Proteína A e a proteína de interesse. De preferência, o tampão de eluição de pH baixo possui um pH no intervalo de cerca de 2 a cerca de 5, de maior preferência no intervalo de cerca de 3 a cerca de 4. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro deste intervalo incluem os tampões fosfato, acetato, citrato e amónio, bem como suas combinações. Destes tampões, os preferidos são os tampões de citrato e acetato, de maior preferência os tampões de citrato de sódio ou acetato de sódio. Outros tampões de eluição estão contemplados incluindo 6 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ tampões de elevado ρΗ (p.ex., os que possuem um pH de 9 ou mais) ou tampões compreendendo um composto ou uma composição tal como MgCl2 (2 mM) para eluição da proteína de interesse. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais inteiros), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo desde que mantenham, ou sejam modificados para compreender, uma região CH2/CH3 tal como aqui definida. "Fragmentos de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo inteiro, geralmente a sua região de ligação ao antigénio ou variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; moléculas de anticorpo de cadeia simples; diacorpos; anticorpos lineares e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com as preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. O adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495, 1975 ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, p.ex., a Patente U.S. 4816567). Os "anticorpos 7 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et ai., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et ai., J. Mol. Bíol. 222: 581-597, 1991.

Os presentes anticorpos monoclonais incluem especificamente anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto que o restante da (s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como a fragmentos de tais anticorpos, desde que estes exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. 4816567; e Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984). O termo "região hipervariável" quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende os resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (i.e., os resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) do dominio variável da cadeia pesada (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "volta hipervariável" (i.e., os resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) do domínio variável da cadeia pesada (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). Os resíduos "estruturais" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável tal como aqui definidos.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murídeo) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são 8 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ imunoglobulinas humanas (anticorpo aceitador) nos quais os resíduos da região hipervariável do aceitador são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não se encontrem no anticorpo aceitador nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam o "domínio de ligação" de uma proteína "adesina" heteróloga (p.ex., um receptor, ligando ou uma enzima) com as funções efectoras de um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da sequência de aminoácidos de uma adesina com a especificidade de ligação desejada que é diferente da do local de reconhecimento e ligação ao antigénio (local de combinação com o antigénio) de um anticorpo (i.e., é "heteróloga") com uma sequência de domínio constante de uma imunoglobulina. A sequência do domínio constante da imunoglobulina na imunoadesina é de preferência derivada das cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 uma vez que as imunoadesinas compreendendo estas regiões podem ser purificadas através de cromatografia em Proteína A (Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62: 1-13, 1983). 9 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ Ο termo "domínio de ligação ao ligando" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer receptor nativo da superfície celular ou qualquer sua região ou derivado que mantenham pelo menos uma ligação qualitativa ao ligando de um receptor nativo correspondente. Numa concretização específica, o receptor é de um polipéptido da superfície celular possuindo um domínio extracelular que é homólogo a um membro da superfamília génica das imunoglobulinas. Outros receptores, que não são membros da superfamília génica das imunoglobulinas mas que estão contudo especificamente cobertos por esta definição, são os receptores de citoquinas e em particular os receptores com actividade de tirosina-quinase (tirosina-quinases receptoras), membros das superfamilias dos receptores da hematopoietina e dos factores de crescimento dos nervos, e moléculas de adesão celular, p.ex. selectinas (E, L e P). O termo "domínio de ligação ao receptor" é utilizado para designar qualquer ligando nativo para um receptor, incluindo moléculas de adesão celular ou qualquer região ou derivado de tal ligando nativo que mantenha pelo menos uma capacidade qualitativa de ligação ao receptor de um ligando nativo correspondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente as sequências de ligação de ligandos para os receptores mencionados acima.

Uma "quimera de anticorpo-imunoadesina" compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo (tal como aqui definido) com pelo menos uma imunoadesina (tal como definida neste pedido). Quimeras exemplificativas de anticorpo-imunoadesina são as quimeras biespecíficas CD4-IgG descritas em Berg et al., PNAS (USA) 88: 4723-4727, 1991 e Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268, 1994.

Modos de Realização do Invento O presente processo envolve a purificação de uma proteína contendo uma região CH2/CH3 de contaminantes através de cromatografia em Proteína A. Em concretizações preferidas, a proteína a purificar utilizando cromatografia em Proteína A é um anticorpo, uma imunoadesina ou uma proteína fundida ou 10 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ conjugada com uma região CH2/CH3. As técnicas para criação de tais moléculas serão discutidas adiante. 1. Anticorpos i) Selecção e preparação de antigénios O presente anticorpo é dirigido contra um antigénio de interesse. De preferência, o antigénio é um polipéptido biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de uma doença ou um distúrbio pode resultar num beneficio terapêutico nesse mamífero. No entanto, anticorpos dirigidos contra antigénios não polipeptídicos (tais como antigénios glicolipídicos associados a tumores; ver Patente U.S. 5091178) estão também contemplados. Quando o antigénio é um polipéptido, pode ser uma molécula transmembranar (p.ex., receptor) ou um ligando tal como um factor de crescimento. Antigénios exemplificativos incluem as proteínas descritas na secção (3) adiante. Os alvos moleculares preferidos para os anticorpos englobados pelo presente invento incluem proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família dos receptores ErbB tais como o receptor de EGF, o receptor HER2, HER3 ou HER4; moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina αν/β3 incluindo as subunidades α ou β desta (p.ex., anticorpos anti-CDlla, anti-CDl8 ou anti-CDllb); factores de crescimento tais como VEGF; igE; antigénios do grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor da obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; proteína C, etc.

Antigénios solúveis ou seus fragmentos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogénios para a criação de anticorpos. Para moléculas transmembranares, tais como receptores, podem ser utilizados fragmentos destas (p.ex., o domínio extracelular de um receptor) como imunogénio. Alternativamente, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser utilizadas como imunogénio. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (p.ex., linhas celulares de cancro) ou podem ser células que tenham sido transformadas através de técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. 11 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ

Outros antigénios e suas formas úteis para a preparação de anticorpos serão evidentes par os peritos na especialidade. ii) Anticorpos policlonais

Os anticorpos policlonais são de preferência criados em animais através de múltiplas injecções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio a uma proteina que seja imunogénica na espécie a imunizar, p.ex., hemocianina da lapa, albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja, utilizando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de maleimidobenzoíl-sulfossuccinimida (conjugação através dos resíduos de cisteina), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, onde R e R1 são diferentes grupos alquilo.

Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos ou derivados, através da combinação de, p.ex. 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injectando a solução intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois os animais recebem reforços com 1/5 a 1/10 da quantidade original de antigénio ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injecção subcutânea em múltiplos locais. Sete a catorze dias depois, os animais são sangrados e o soro é ensaiado quanto ao título de anticorpos. Os animais são recebem reforços até o título estabilizar num patamar. De preferência, o animal recebe reforços com um conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um diferente reagente de ligação cruzada. Os conjugados podem também ser obtidos em cultura de células recombinantes na forma de proteínas de fusão. Também, agentes aglutinantes tais como o alúmen são adequadamente utilizados para estimular a resposta imunitária. 12 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ iii) Anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (Patente U.S. 4816567) .

No método do hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou um macaco macaque, é imunizado como aqui descrito acima para eliciar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e criadas num meio de cultura adequado que contém de preferência uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não tiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias estas que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As células de mieloma preferidas são as que se fundem eficientemente, suportam uma produção de anticorpos de nível elevado pelas células produtoras de anticorpos seleccionadas e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre estas, as linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma de murídeo, tais como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis em Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia EUA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis em American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma 13 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001, 1984; Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)). O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é ensaiado quanto a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio. De preferência, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA).

Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou actividade desejadas, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e criados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, DMEM ou RPMI-1640. Adicionalmente, as células de hibridoma podem ser criadas in vivo como tumores de ascites num animal.

Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, do fluido ascítico ou do soro através de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, cromatografia em Proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. De preferência é utilizado o procedimento de cromatografia em Proteína A aqui descrito. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através da utilização de sondas oligonucleotídicas que sejam capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transferidos para células hospedeiras tais como células de 14 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ Ε. colif células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outro modo não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O ADN pode também ser modificado, por exemplo, através da substituição pela sequência de codificação para domínios constantes das cadeias pesadas e leves humanas as sequências homólogas de murídeo (Patente U.S. 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851, 1984) ou através da ligação covalente, à sequência de codificação da imunoglobulina, de toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido que não imunoglobulina.

Tipicamente, estes polipéptidos que não imunoglobulinas substituem os domínios constantes de um anticorpo ou substituem os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo quimérico bivalente compreendendo um local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio e outro local de combinação com o antigénio possuindo especificidade para um antigénio diferente.

Noutra concretização, os anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990. Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Blol. 222: 581-597, 1991 descrevem o isolamento de anticorpos de murídeo e humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fágicas. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (gama de nM) através de combinação aleatória das cadeias ("Chain shuffling") (Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas fágicas muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21: 2265-2266, 1993). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionais do hibridoma para isolamento de anticorpos monoclonais. 15 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ ίν) Anticorpos humanizados e humanos

Um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos provenientes de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser efectuada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988), através da substituição por CDR ou sequências de CDR de roedor as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. 4816567) em que substancialmente menos de cerca de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos de anticorpos de roedor. A escolha dos domínios variáveis humanos, tanto leve como pesado, a utilizar na produção dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método designado do "melhor ajustamento", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é pesquisada contra a totalidade da sequências conhecidas do domínio variável humano. A sequência humana que estiver mais próxima daquela do roedor é então aceite como a FR humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151: 2296, 1993). Outro método utiliza uma determinada estrutura derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285, 1992; Presta et al., J. Immunol. 151: 2623, 1993) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de elevada afinidade para com o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se alcançar 16 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ este objectivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos tridimensionais de imunoglobulinas estão vulgarmente disponíveis e são familiares dos peritos na especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e apresentam estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas seleccionadas. A inspecção destas apresentações permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, í.e., a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, resíduos de FR podem ser seleccionados e combinados a partir das sequências do aceitador e de importação de forma a que seja alcançada a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o antigénio (s) alvo. Em geral, os resíduos de CDR estão directamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio.

Em alternativa, é actualmente possível produzir animais transgénicos (p.ex., ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinas endógenas. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união das cadeias pesadas dos anticorpos (JH) em ratinhos quiméricos e mutantes de linha germinal resulta na completa inibição da produção de anticorpos endógenos. A transferência da série génica da imunoglobulina da linha germinal humana em tais ratinhos mutantes da linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após provocação com o antigénio. Ver, p.ex., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551, 1993; Jakobovits et al., Nature 362: 255-258, 1993; Bruggermann et al., Year in Immuno. 7: 33, 1993; e Duchosal et al. Nature 355: 258, 1992. Os anticorpos humanos podem também ser derivados de bibliotecas de apresentação sobre fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991; Vaughan et al., Nature Biotech. 14: 309, 1996). 17 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ ν) Fragmentos de anticorpos

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos eram derivados através de digestão proteolitica de anticorpos intactos (ver, p.ex., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117, 1992 e Brennan et al., Science 229: 81, 1985). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos directamente através de células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas fágicas de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser directamente recuperados de E. coli e quimicamente ligados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10: 163-167, 1992). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados directamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para os peritos executantes. Noutras concretizações, o anticorpo de eleição é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185. vi) Anticorpos multiespecificos

Os anticorpos multiespecificos possuem especificidades de ligação para com pelo menos dois antigénios diferentes. Embora tais moléculas normalmente se liguem apenas a dois antigénios (í.e., anticorpos biespecificos, BsAb), anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecificos estão englobados por esta expressão quando aqui utilizada.

Os métodos para produzir anticorpos biespecificos são conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos biespecificos inteiros baseia-se na co-expressão de dois pares cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (Millstein et al., Nature 305: 537-539, 1983). Devido à distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de 10 moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas um tem a estrutura biespecifica correcta. A purificação da 18 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ molécula correcta, que é habitualmente feita através de passos de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829 e em Traunecker et ai., EMBO J. 10: 3655-3659, 1991.

De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser modificada para maximizar a percentagem de heterodimeros que são recuperados da cultura celular recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (p.ex., tirosina ou triptofano). São criadas na interface da segunda molécula de anticorpo "cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à cadeia ou cadeias laterais grandes através da substituição das cadeias laterais grandes de aminoácidos por pequenas (p.ex., alanina ou treonina). isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos ligados de forma cruzada ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser ligado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos têm sido, por exemplo, propostos para direccionar as células do sistema imunitário para células indesejadas (Patente U.S. 4676980) e para tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos utilizando quaisquer métodos de ligação cruzada convenientes. Os agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na especialidade e são divulgados na Patente U.S. 4676980, juntamente com várias técnicas de ligação cruzada.

Foram também descritas na literatura, técnicas para criação de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando ligação química. Brennan et al., Science 229: 81, 1985 descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar 19 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas. O progresso recente facilitou a recuperação directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser quimicamente ligados para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225, 1992 descrevem a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecifico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' foi separadamente segregado a partir de E. coli e sujeito a ligação quimica direccionada in vitro para formar o anticorpo biespecifico. O anticorpo biespecifico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como de desencadear a actividade litica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumores da mama humanos.

Foram também descritas várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespecificos directamente a partir de cultura de células recombinantes. Por exemplo, foram produzidos anticorpos biespecificos utilizando "fechos de correr" de leucinas. Kostelny et al.r J. immunol. 148(5): 1547-1553, 1992. Os péptidos fechos de correr de leucinas das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão de genes. Os homodímeros do anticorpo foram reduzidos na região de charneira para formar monómeros e depois re-oxidados para formar os heterodímeros do anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia dos "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448, 1993 proporcionou um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um 20 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando deste modo dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos através da utilização de dímeros de Fv de cadeia simples (scFv). Ver Gruber et al., J. immunol. 152: 5368, 1994. Alternativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares" tal como descrito em Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995. Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em cadeia (Vh-Ch1-vh-Ch1) que formam um par de regiões de ligação ao antigénio. Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60, 1991. 2. Imunoadesinas O desenho mais simples e mais directo de imunoadesinas combina o domínio ou domínios de ligação da adesina (p.ex., o domínio extracelular (ECD) de um receptor) com as regiões de charneira e Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Vulgarmente, quando se preparam as imunoadesinas do presente invento, o ácido nucleico que codifica o domínio de ligação da adesina será fundido no terminal C ao ácido nucleico que codifica o terminal N de uma sequência do domínio constante de imunoglobulina, no entanto são também possíveis fusões N-terminais.

Tipicamente, nestas fusões o polipéptido quimérico codificado manterá pelo menos os domínios funcionalmente activos de charneira, CH2 e CH3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões são também feitas no terminal C da porção Fc de um domínio constante ou imediatamente N-terminais ao CHI da cadeia pesada ou da região correspondente da cadeia leve. O local exacto no qual 21 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ a fusão é feita não é crítico; locais particulares são bem conhecidos e podem ser seleccionados para optimizar a actividade biológica, a secreção ou as características de ligação da imunoadesina.

Numa concretização preferida, a sequência da adesina é fundida com o terminal N do domínio Fc da imunoglobulina Gi (IgGl). É possível fundir a região constante inteira da cadeia pesada com a sequência da adesina. No entanto, de preferência, é utilizada na fusão uma sequência começando na região charneira imediatamente a montante do local de clivagem por papaína que define quimicamente o Fc de igG (i.e., o resíduo 216, tomando como primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada o 114), ou locais análogos de outras imunoglobulinas. Numa concretização particularmente preferida, a sequência de aminoácidos da adesina é fundida com os domínios (a) região charneira e Ch2 e Ch3 ou (b) ChI, charneira, CH2 e CH3, de uma cadeia pesada de igG.

Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são montadas na forma de multímeros e particularmente de heterodímeros ou heterotetrâmeros. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão unidades estruturais conhecidas. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma na qual existem a IgG, a IgD e a igE. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de maior peso molecular; a IgM existe geralmente na forma de um pentâmero de quatro unidades básicas mantidas juntas através de ligações dissulfureto. A globulina IgA e ocasionalmente a globulina IgG podem também existir em forma multimérica no soro. No caso do multímero, cada uma das quatro unidades pode ser a mesma ou diferente. Várias imunoadesinas montadas exemplificativas dentro do presente âmbito estão esquematicamente representadas abaixo. (a) ACl-ACl; (b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, OU VLCL-ACH) } (c) ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl~VhCh, VlCl-ACh, ou VlCl-VhCh) (d) ACl-VhCh- (ACh, OU ACl_VhCh, ou VlCl-ACh) ; (e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, OU VlCl-ACh) ; e (f) (A-Y) n_ (VlCl-VhCh) 2/ 22 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ em que cada A representa sequências de aminoácidos de adesinas idênticas ou diferentes; VL é um dominio variável da cadeia leve de imunoglobulina; VH é um dominio variável da cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um dominio constante da cadeia leve de imunoglobulina; CH é um dominio constante da cadeia pesada de imunoglobulina; n é um número inteiro maior que 1; Y designa o resíduo de um agente de ligação cruzada covalente.

No interesse da brevidade, as estruturas antecedentes apresentam apenas características chave; não indicam o domínio de união (J) ou outros das imunoglobulinas, nem mostram as ligações dissulfureto. No entanto, quando tais domínios são necessários para a actividade de ligação, esses devem ser entendidos como estando presentes nas localizações vulgares que ocupam nas moléculas de imunoglobulina.

Alternativamente, as sequências de adesina podem ser inseridas entre as sequências da cadeia pesada e da cadeia leve da imunoglobulina, de modo a que seja obtida uma imunoglobulina compreendendo uma cadeia pesada quimérica. Nesta concretização, as sequências de adesina são fundidas com a extremidade 3' de uma cadeia pesada de imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, entre a charneira e o domínio CH2, ou entre os domínios CH2 e CH3. Construções semelhantes foram relatadas por Hoogenboom, et al., Mol. Immunol. 28: 1027-1037, 1991.

Embora não seja necessária a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina nas imunoadesinas do presente invento, pode estar presente uma cadeia leve de imunoglobulina covalentemente associada a um polipéptido de fusão adesina-cadeia pesada de imunoglobulina ou directamente fundida com a adesina. No primeiro caso, o ADN que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o ADN que codifica a proteína de fusão adesina-cadeia pesada de imunoglobulina. Após secreção, a cadeia pesada híbrida e a 23 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ cadeia leve serão covalentemente associadas para proporcionar uma estrutura semelhante a imunoglobulina compreendendo dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina ligados por dissulfuretos. Os métodos adequados para a preparação de tais estruturas são divulgados, por exemplo, na Patente U.S. 4816567, publicada a 28 de Março de 1989.

As imunoadesinas são muito convenientemente construídas através da fusão da sequência de ADNc que codifica a porção de adesina em fase com uma sequência de ADNc de imunoglobulina. No entanto, pode também ser utilizada uma fusão com fragmentos genómicos de imunoglobulina (ver, p.ex., Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313, 1990; e Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144, 1991). Este último tipo de fusão requer a presença de sequências reguladoras de Ig para a expressão. Os ADNc que codificam as regiões constantes da cadeia pesada de IgG podem ser isolados com base em sequências publicadas a partir de bibliotecas de ADNc derivadas de linfócitos do baço ou do sangue periférico, através de hibridação ou através de técnicas de reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os ADNc que codificam a "adesina" e as partes de imunoglobulina da imunoadesina são inseridos em tandem num vector plasmídico que dirija uma expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas. 3. Outras proteínas contendo a região CH2/CH3

Noutras concretizações, a proteína a purificar é uma que é fundida ou conjugada com uma região CH2/CH3. Tais proteínas de fusão podem ser produzidas de modo a aumentar a semivida no soro da proteína e/ou facilitar a purificação da proteína através de cromatografia em Proteína A.

Exemplos de proteínas biologicamente importantes que podem ser conjugadas deste modo incluem a renina; uma hormona do crescimento, incluindo a hormona do crescimento humana e a hormona do crescimento bovina; o factor de libertação da hormona do crescimento, a hormona paratiroideia; a hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; anti-tripsina alfa 1; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como o 24 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ factor VIIIC, ο factor IX, ο factor tecidual e factor de Willebrand; factores anti-coagulação tais como a Proteína C; factor natriurético atrial, tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio, tal como a uroquinase ou o activador do plasminogénio da urina ou de tipo tecidual humano (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético, factor de necrose tumoral-alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulado por activação normalmente expresso em células T e segregado); proteína inflamatória dos macrófagos humanos (MlP-l-alfa); uma albumina do soro tal como a albumina de soro humano; substância inibidora da Muelleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como a beta-lactamase; ADNase; IgE; um antigénio associado a linfócitos τ citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; factor de crescimento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; Proteína A ou D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como o factor neurotrófico derivado dos ossos (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos tal como NGF-β; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF) ; factor de crescimento dos fibroblastos tal como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, TGF^4 ou TGF-p5; factor de crescimento semelhante à insulina-I e II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; factores osteoinductores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão tal como interferão-alfa, beta e gama; factores estimulantes de colónias (CSF), p.ex., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), p.ex., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas da superfície da membrana; factor acelerador do decaimento; antigénio virai tal como, por exemplo, uma porção do envelope do VIH; proteínas de transporte; auto-receptores; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antigénio associado a tumores tal 25 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ como ο receptor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer um dos polipéptidos acima listados. 4. Purificação da proteína A proteína a purificar utilizando o método aqui descrito é geralmente produzida utilizando técnicas recombinantes. Os métodos para produção de proteínas recombinantes estão descritos p.ex., nas Patentes U.S. 5534615 e 4816567, especificamente aqui incorporadas por referência. Em

concretizações preferidas, a proteína de interesse é produzida numa célula CHO (ver, p.ex., WO 94/11026). Exemplos de proteínas que podem ser purificadas utilizando o processo aqui descrito incluem o anticorpo anti-HER2 humanizado (WO 92/22653); anticorpo anti-IgE humanizado (Presta et al. J. Immunol. 151: 2623-2632, 1993); anticorpo quimérico anti-CD20 (WO 94/11026); e imunoadesina receptora de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535- 10539, 1991) .

Quando se utilizam técnicas recombinantes, a proteína pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático, ou ser directamente segregada para o meio. Se a proteína for produzida intracelularmente, como primeiro passo, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Quando a proteína é segregada para o meio, as células hospedeiras recombinantes podem ser separadas do meio de cultura celular através de, por exemplo, filtração de fluxo tangencial. A Proteína A como ligando específico para o isolamento de uma imunoglobulina é divulgada em "Basic and Clinicai Immunology - Seventh Edition", editado por DP Sites and AI Terr, página 233 e em US 5429746. A Proteína A imobilizada numa fase sólida é utilizada para purificar a proteína contendo a região CH2/CH3. A fase sólida é de preferência uma coluna compreendendo uma superfície de vidro ou de sílica para imobilização da Proteína A. De preferência, a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Por 26 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ vezes, a coluna foi revestida com um reagente, tal como glicerol, numa tentativa para prevenir a aderência não específica à coluna. A coluna PROSEP A™, comercialmente disponível em Bioprocessing Limited, é um exemplo de uma coluna de vidro de poro controlado de Proteína A que é revestida com glicerol. A fase sólida para a cromatografia em Proteína A é equilibrada com um tampão adequado. Por exemplo, o tampão de equilíbrio pode ser TRIS 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1. A preparação contaminada derivada das células hospedeiras recombinantes é carregada na fase sólida equilibrada utilizando um tampão de carga que pode ser o mesmo que o tampão de equilíbrio. À medida que a preparação contaminada flui através da fase sólida, a proteína é adsorvida na Proteína A imobilizada e, tal como aqui constatado, outros contaminantes (tais como proteínas das células de ovário de hamster chinês, CHOP, quando a proteína é produzida numa célula CHO) ligam-se não especificamente à fase sólida. 0 passo seguinte efectuado sequencialmente implica a remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo num passo de lavagem intermédio em que a solução compreende cloreto de tetrapropilamónio, cloreto de tetrabutilamónio, cloreto de tetrametilamónio (TMAC) e/ou cloreto de tetraetilamónio (TEAC) como electrólito (hidrófobo). Em concretizações preferidas, o electrólito hidrófobo neste solvente de lavagem é TEMAC e/ou TEAC. Embora possa estar presente um único electrólito hidrófobo no solvente de lavagem, em certas concretizações, podem ser utilizados dois ou mais desses electrólitos. O electrólito hidrófobo é de preferência adicionado a uma solução de pH tamponado possuindo um pH no intervalo de cerca de 4 a cerca de 8 e de preferência no intervalo de cerca de 5 a cerca 7. Tampões adequados para este fim incluem os tampões Tris, fosfato, MES e MOPSO. A concentração final preferida para o electrólito hidrófobo no solvente de lavagem está no intervalo de cerca 27 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ de 0,1 a cerca de 1,0 Me de preferência no intervalo de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M.

Após o passo de lavagem intermédio do parágrafo antecedente, a proteína de interesse é recuperada da coluna. Isto é normalmente conseguido utilizando um tampão de eluição adequado. A proteína pode, por exemplo, ser eluída da coluna utilizando um tampão de eluição possuindo um pH baixo, p.ex., no intervalo de cerca de 2 a cerca de 5 e de preferência no intervalo de cerca de 2,5 a cerca de 3,5. Exemplos de tampões de eluição para este fim incluem os tampões de citrato ou acetato. A preparação de proteína eluída pode ser sujeita a passos adicionais de purificação antes ou após o passo de cromatografia em Proteína A. Outros passos de purificação adicionais exemplificativos incluem cromatografia em hidroxilapatite; diálise; cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo para capturar a proteína; cromatografia de interacção hidrófoba (HIC); precipitação com sulfato de amónio; cromatografia de permuta aniónica ou catiónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica; cromatofocagem; e filtração em gel. A proteína assim recuperada pode ser formulada num transportador farmaceuticamente aceitável e ser utilizada para várias utilizações em diagnóstico, terapia ou outras utilizações conhecidas para tais moléculas.

Os seguintes exemplos são dados para ilustração e não como limitação. EXEMPLO 1 A coluna PROSEP A™ (Bioprocessing, Ltd.) tem Proteína A imobilizada numa coluna de vidro de poro controlado revestida com glicerol. O revestimento de glicerol reduz a superfície de vidro disponível para interacções não específicas com contaminantes mas, tal como aqui demonstrado, os contaminantes podem mesmo assim aderir à coluna. 28 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ A cromatografia em Proteína A foi o passo de cromatografia inicial na purificação da proteína contendo a região CH2/CH3; o anticorpo anti-HER2 humanizado (humAb4D5-8) (Cárter et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289, 1992) . Este anticorpo anti-HER2 foi produzido de forma recombinante em células CHO. Após a produção e secreção da proteína para o meio de cultura celular, as células CHO foram separadas do meio de cultura celular através de filtração de fluxo tangencial (PROSTACK™). Neste sistema de expressão, verificou-se que os contaminantes mais predominantes eram proteínas de ovário de hamster chinês (CHOP). A coluna PROSEP A™ foi equilibrada com Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1 (Tampão A) . A cromatograf ia em Proteína A foi efectuada através da aplicação de Fluído de Cultura Celular Colhido (HCCF) das células CHO directamente para a coluna PROSEP A™ equilibrada utilizando Tampão A como tampão de carga. A coluna foi então lavada com Tampão A para remover por lavagem as proteinas de HCCF e as não ligadas. O anticorpo anti-HER2 foi eluido da coluna de Proteína A através de lavagem da coluna com Tampão B possuindo pH baixo (2,5-3,5). O Tampão B foi citrato de sódio 25 mM, pH 2,8. O pH baixo do Tampão B destruiu as interaeções entre a Proteína A e o anticorpo anti-HER2. Destruiu também as interaeções não específicas entre as superfícies de vidro expostas da coluna e as CHOP contaminantes ligadas de modo não específico. Isto resultou num nível de contaminação de CHOP no conjunto eluido de proteínas contendo anti-HER2 de -4000 ppm (Tabela 1).

Tabela Ia

Amostra Condições CHOP (pg/ml) (ppm) HCCF Carga 760 1461538 Conj. de Anticorpo Sem lavagem 32 4270 Conj. de Anticorpo TMAC, lavagem a pH 5,0 3 408 Conj. de Anticorpo TEAC, lavagem a pH 5,0 2 317 Conj. de Anticorpo TMAC, lavagem a pH 7,1 4 537 Conj. de Anticorpo TEAC, lavagem a pH 7,1 5 620 a O tampão de lavagem foi Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM incluindo TMAC ou TEAC 0,5 M ao pH indicado. Após a lavagem, a proteína foi eluída a pH 2,8._ 29 ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ

Para abordar este problema relativamente aos contaminantes no conjunto de proteínas eluídas, foi avaliado um "passo intermédio de lavagem". Antes de se eluir o anticorpo da coluna, a coluna de Proteína A foi lavada com tampão de lavagem (a diferentes pH) ao qual foram adicionadas várias concentrações de TMAC ou TEAC (Tabela 1).

Tal como mostrado na Tabela 1, o passo de lavagem intermédio utilizando um tampão contendo TMAC ou TEAC foi eficaz para baixar o nível de CHOP no conjunto de anticorpo eluído. A concentração de TMAC ou TEAC foi de preferência de pelo menos 0,25 M. Assim, verificou-se que as concentrações preferidas de TMAC ou TEAC no solvente de lavagem são de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 Me de preferência de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M.

Quanto às variações no pH da solução de lavagem, verificou-se que quanto menor o pH, maior a remoção de CHOP no passo de lavagem. No entanto, a pH inferior a 7,0, a proteína pode também ser parcialmente eluída durante o passo de lavagem. Portanto, os pH preferidos para o passo de lavagem intermédio são de cerca de 4 a cerca de 8 e de preferência de cerca de 5 a cerca de 7.

Lisboa

Claims (18)

1. ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para purificação de uma proteína, que compreende uma região CH2/CH3, a partir de uma sua solução contaminada através de cromatografia em Proteína A compreendendo: a) a adsorção da proteína à Proteína A imobilizada numa fase sólida compreendendo sílica ou vidro; b) a remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo, em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetrapropilamónio, cloreto de tetrabutilamónio, cloreto de tetrametilamónio (TMAC) ou cloreto de tetraetilamónio (TEAC); e c) a recuperação da proteína a partir da fase sólida.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteína é um anticorpo.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a proteína é uma imunoadesina.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2 em que o anticorpo é um anticorpo anti-HER2 humanizado.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 2 em que o anticorpo é um anticorpo anti-IgE humanizado.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 2 em que o anticorpo é um anticorpo anti-CD20 quimérico.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 3 em que a imunoadesina é uma imunoadesina receptora de TNF.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetrametilamónio (TMAC).
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetraetilamónio (TEAC). ΕΡ Ο 950 067/ΡΤ 2/2
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a fase sólida é uma coluna de ácido silicico.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1 em que os contaminantes são Proteínas de Ovário de Hamster Chinês (CHOP) .
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a concentração do electrólito hidrófobo no solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 M.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que a concentração do electrólito hidrófobo no solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o pH do solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 4 a cerca de 8.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15 em que o pH do solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 5 a cerca de 7.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o passo (c) compreende a eluição da proteína utilizando um tampão de eluição possuindo um pH na gama de cerca de 2,0 a cerca de 5,0.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17 em que o passo (c) compreende a eluição da proteína utilizando um tampão de eluição possuindo um pH na gama de cerca de 2,5 a cerca de 3,5. Lisboa,