PT1900751E

PT1900751E - Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína a

Info

Publication number: PT1900751E
Application number: PT07021006T
Authority: PT
Inventors: Greg S Blank
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2010-02-23
Also published as: DK0950067T3; ES2337091T3; SI1900751T1; EP1897890B1; DK1900751T3; ES2335365T3; IL130061A0; US20040106180A1; ES2293661T3; ATE449111T1; EP0950067A1; PT950067E; ES2322299T3; ZA979996B; DK1864999T3; CA2271255C; DE69738075D1; HK1112253A1; EP1900751B1; ATE425990T1

Description

ΕΡ 1 900 751/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína A"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo do Invento 0 presente invento refere-se genericamente à purificação de proteínas. Em particular, o presente invento refere-se a um método para purificação de proteínas contendo uma região Ch2/Ch3, através de cromatografia de afinidade em Proteína A.

Descrição da Arte Relacionada A purificação rentável em larga escala de proteínas é um problema de crescente importância para a indústria biotecnológica. Geralmente, as proteínas são produzidas através de cultura celular, utilizando linhas celulares de mamífero ou bacterianas modificadas para produzirem a proteína de interesse através de inserção de um plasmídeo recombinante contendo o gene para essa proteína. Uma vez que as linhas celulares utilizadas são organismos vivos, têm de ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo açúcares, aminoácidos e factores de crescimento, habitualmente fornecidos a partir de preparações de soro animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos com que se alimentam as células e de subprodutos das próprias células até uma pureza suficiente para utilizar como terapêutico humano coloca um formidável desafio.

Os procedimentos para purificação de proteínas a partir de detritos celulares dependem inicialmente do local de expressão da proteína. Algumas proteínas podem ser levadas a ser segregadas directamente da célula para o meio de crescimento envolvente; outras são produzidas intracelularmente. Para estas últimas proteínas, o primeiro passo de um processo de purificação envolve a lise da célula, que pode ser feita através de uma variedade de métodos, incluindo ruptura mecânica, choque osmótico ou tratamentos enzimáticos. Esta ruptura liberta todo o conteúdo da célula 2 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ no homogenato e produz adicionalmente fragmentos subcelulares que são dificeis de remover devido ao seu pequeno tamanho. Estes são geralmente removidos através de centrifugação diferencial ou através de filtração. O mesmo problema surge, embora numa escala menor, com proteínas segregadas directamente devido à morte natural das células e à libertação de proteínas intracelulares das células hospedeiras no decurso do processo de produção proteica.

Uma vez obtida uma solução clarificada contendo a proteína de interesse, a sua separação das outras proteínas produzidas pela célula é habitualmente tentada utilizando uma combinação de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separam misturas de proteínas com base na sua carga, grau de hidrofobicidade ou tamanho. Várias resinas cromatográficas diferentes estão disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo uma adaptação precisa do esquema de purificação à proteína particular envolvida. A essência de cada um destes métodos de separação é que as proteínas possam ser levadas a mover-se a diferentes velocidades ao longo de uma longa coluna, alcançando uma separação física que aumenta à medida que passam mais para baixo na coluna ou a aderir selectivamente ao meio de separação, sendo então diferencialmente eluidos através de solventes diferentes. Nalguns casos, a proteína desejada é separada de impurezas quando as impurezas aderem especificamente à coluna, e a proteína de interesse não, isto é, a proteína de interesse está presente no "fluido eluente" ("flow-through") . A cromatográfia de afinidade, que explora uma interacção específica entre a proteína a purificar e um agente de captura imobilizado, pode também ser uma opção para algumas proteínas. A Proteína A é um adsorvente útil para cromatográfia de afinidade de proteínas, tais como anticorpos, que contêm uma região Fc. A Proteína A é uma proteína da parede celular de 41 kDa de Staphylococcus áureos que se liga com uma elevada afinidade (cerca de 1CT8 M para a igG humana) à região Fc dos anticorpos. 3 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ

SUMÁRIO DO INVENTO

Foi aqui identificado um problema associado à cromatografia em Proteína A de preparações proteicas contaminadas. Em particular, observou-se que na cromatografia em Proteína A utilizando uma superfície de vidro ou de sílica para adsorção da Proteína A (p.ex., quando a Proteína A é imobilizada numa coluna de vidro de poro controlado ou numa coluna de ácido silícico), os contaminantes na preparação proteica (tais como as proteínas de ovário de hamster chinês (CHOP), quando a preparação proteica é derivada de uma célula de CHO) aderem à superfície de vidro ou de sílica da fase sólida. Verificou-se que isto ocorre mesmo quando a fase sólida é revestida com um reagente (tal como glicerol) numa tentativa de prevenir aderência não específica. Foi aqui considerado um passo de lavagem intermédio que aborda este problema. Este passo de lavagem serve para remover os contaminantes, mas não a Proteína A imobilizada ou a proteína de interesse ligada à Proteína A, da fase sólida. Em particular, verificou-se que os electrólitos hidrófobos, cloreto de tetrametilamónio (TMAC), cloreto de tetraetilamónio (TEAC), cloreto de tetrapropilamónio e cloreto de tetrabutilamónio, podem ser utilizados neste passo de lavagem intermédio.

Assim, o presente invento proporciona um método para purificação de uma proteína a partir de uma sua solução contaminada, através de cromatografia em Proteína A, em que a referida proteína a purificar compreende uma região CH2/CH3 fundida com, ou conjugada com um polipéptido seleccionado do grupo de renina; uma hormona do crescimento; factor de libertação de hormonas do crescimento; hormona paratiroideia; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; anti-tripsina alfa-1; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; um factor da coagulação; um factor anti-coagulação; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio; bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; factor de necrose tumoral-alfa e -beta; encefalinase; RANTES (regulado por activação normalmente expresso em células T e segregado); proteína inflamatória dos macrófagos humanos 4 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ

(ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina do soro; substância inibidora da Muelleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; uma proteína microbiana; ADNase; IgE; um antigénio associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA); inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); um receptor para uma hormona ou factor do crescimento; Proteína D; um factor reumatóide; um factor neurotrófico; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); factor de crescimento dos fibroblastos; factor de crescimento epidérmico (EGF); um factor de crescimento transformante (TGF); factor de crescimento semelhante à insulina-I e -II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-lGF I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante a insulina; uma proteína CD; eritropoietina; um factor osteoindutor; uma imunotoxina; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão; um factor estimulante de colónias (CSF); uma interleucina; superóxido-dismutase; um receptor de células T; uma proteína da superfície da membrana; um factor acelerador do decaimento; um antigénio virai; uma proteína de transporte; um auto-receptor ("homing"); uma adressina; uma proteína reguladora; uma integrina; um antigénio associado a tumores; ou um fragmento de qualquer um dos polipéptidos listados acima; o método compreendendo os seguintes passos efectuados sequencialmente: a) adsorção da proteína à Proteína A imobilizada numa fase sólida compreendendo sílica ou vidro; b) remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo, em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetrapropilamónio, cloreto de tetrabutilamónio, cloreto de tetrametilamónio (TMAC) ou cloreto de tetraetilamónio (TEAC); e c) recuperação da proteína a partir da fase sólida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Definições

Quando aqui utilizado, o termo "Proteína A" engloba Proteína A recuperada a partir de uma sua fonte nativa, Proteína A produzida sinteticamente (p.ex., através de síntese peptídica ou através de técnicas recombinantes) e suas variantes que mantenham a capacidade para se ligarem a 5 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ proteínas possuindo uma região CH2/CH3. A Proteína A pode ser adquirida comercialmente em Repligen, Pharmacia e Fermatech. A Proteína A é imobilizada numa fase sólida. Por "fase sólida" entenda-se uma matriz não aquosa à qual a Proteína A pode aderir. A fase sólida de interesse daqui é uma que compreende uma superfície de vidro ou de sílica. A fase sólida pode ser uma coluna de purificação ou uma fase descontínua de partículas discretas. Em concretizações preferidas, a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em certas concretizações, a fase sólida é revestida com um reagente (tal como glicerol) que se pretende que previna a aderência não específica de contaminantes à fase sólida. A proteína de interesse daqui é uma que compreende uma região Ch2/Ch3 e é portanto passível de purificação através de cromatografia em Proteína A. O termo "região CH2/CH3" quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos na região Fc de uma molécula de imunoglobulina que interagem com a Proteína A. Em concretizações preferidas, a região Ch2/Ch3 compreende uma região CH2 intacta seguida de uma região Ch3 intacta e compreende de preferência uma região Fc de uma imunoglobulina. Exemplos de proteínas contendo uma região Ch2/Ch3 incluem os anticorpos, as imunoadesinas e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de interesse fundida ou conjugada com uma região CH2/CH3. O "passo de lavagem intermédio" é um passo efectuado após a proteína de interesse ser carregada na fase sólida e adsorvida à Proteína A, mas antes da proteína ser recuperada da coluna. O passo de lavagem intermédio serve para remover contaminantes que se ligam não especificamente à fase sólida, sem eluir significativamente a proteína de interesse da fase sólida. No passo de lavagem intermédio, a fase sólida é lavada com um solvente electrólito hidrófobo (p.ex., o solvente electrólito hidrófobo é passado através da coluna de Proteína A, onde a fase sólida é uma coluna).

O "solvente electrólito hidrófobo" no passo de lavagem intermédio é o que é capaz de eluir os contaminantes ligados à fase sólida, sem eluir significativamente a Proteína A 6 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ imobilizada nem a proteína de interesse a ela adsorvida. De preferência, o solvente electrólito hidrófobo é um transportador aquoso (p.ex., um tampão) compreendendo um ou mais electrólitos hidrófobos. Os electrólitos hidrófobos são as alquilaminas; cloreto de tetrametilamónio (TEMAC), cloreto de tetraetilamónio (TEAC), cloreto de tetrapropilamónio e cloreto de tetrabutilamónio.

Um "tampão" é uma solução tamponada que resiste a alterações no pH através da acção dos seus componentes ácido-base conjugados. O "tampão de equilíbrio" aqui é o utilizado para preparar a fase sólida (com Proteína A imobilizada) para carregar a proteína de interesse. O tampão de equilíbrio é de preferência isotónico e tem vulgarmente um pH no intervalo de cerca de 6 a cerca de 8. O tampão de equilíbrio do exemplo foi Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1. O "tampão de carga" é o que é utilizado para carregar a mistura da proteína contendo a região CH2/CH3 e contaminantes, sobre a fase sólida na qual a Proteína A está imobilizada. Frequentemente, os tampões de equilíbrio e de carga são o mesmo. O "tampão de eluição" é utilizado para eluir a proteína contendo a região CH2/CH3 da Proteína A imobilizada. De preferência o tampão de eluição possui um pH baixo e rompe deste modo as interacções entre a Proteína A e a proteína de interesse. De preferência, o tampão de eluição de pH baixo possui um pH no intervalo de cerca de 2 a cerca de 5, de maior preferência no intervalo de cerca de 3 a cerca de 4. Exemplos de tampões que controlarão o pH dentro deste intervalo incluem os tampões fosfato, acetato, citrato e amónio, bem como suas combinações. Destes tampões, os preferidos são os tampões de citrato e acetato, de maior preferência os tampões de citrato de sódio ou acetato de sódio. Outros tampões de eluição estão contemplados incluindo tampões de elevado pH (p.ex., os que possuem um pH de 9 ou mais) ou tampões compreendendo um composto ou uma composição tal como MgCl2 (2 mM) para eluição da proteína de interesse. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais inteiros), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo desde que mantenham, ou sejam 7 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ modificados para compreender, uma região CH2/CH3 tal como aqui definida. "Fragmentos de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo inteiro, geralmente a sua região de ligação ao antigénio ou variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; moléculas de anticorpo de cadeia simples; diacorpos; anticorpos lineares e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui se utiliza refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Para além disso, em contraste com as preparações convencionais de anticorpos (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. O adjectivo "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a utilizar de acordo com o presente invento podem ser produzidos através do método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al.r Nature 256: 495, 1975 ou podem ser produzidos através de métodos de ADN recombinante (ver, p.ex., a Patente U.S. 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas fágicas de anticorpos utilizando as técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597, 1991.

Os presentes anticorpos monoclonais incluem especificamente anticorpos (imunoglobulinas) "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em 8 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma determinada classe ou subclasse de anticorpos, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como a fragmentos de tais anticorpos, desde que estes exibam a actividade biológica desejada (Patente U.S. 4816567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855, 1984). O termo "região hipervariável" quando aqui utilizado refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende os resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (i.e., os resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) do domínio variável da cadeia pesada (Kabat et al.r "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou os resíduos de uma "volta hipervariável" (i.e., os resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) do domínio variável da cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) do domínio variável da cadeia pesada (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). Os resíduos "estruturais" ou "FR" são os resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável tal como aqui definidos.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murídeo) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. Na sua maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo aceitador) nos quais os resíduos da região hipervariável do aceitador são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos da região estrutural Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Para além disso, os anticorpos humanizados podem compreender 9 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ resíduos que não se encontrem no anticorpo aceitador nem no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as voltas hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreenderá também opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992.

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam o "domínio de ligação" de uma proteína "adesina" heteróloga (p.ex., um receptor, ligando ou uma enzima) com as funções efectoras de um domínio constante de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão da sequência de aminoácidos de uma adesina com a especificidade de ligação desejada que é diferente da do local de reconhecimento e ligação ao antigénio (local de combinação com o antigénio) de um anticorpo (i.e., é "heteróloga") com uma sequência de domínio constante de uma imunoglobulina. A sequência do domínio constante da imunoglobulina na imunoadesina é de preferência derivada das cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 uma vez que as imunoadesinas compreendendo estas regiões podem ser purificadas através de cromatografia em Proteína A (Lindmark et al., J. Immunol Meth. 62: 1-13, 1983). O termo "domínio de ligação ao ligando" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer receptor nativo da superfície celular ou qualquer sua região ou derivado que mantenham pelo menos uma ligação qualitativa ao ligando de um receptor nativo correspondente. Numa concretização específica, o receptor é de um polipéptido da superfície celular possuindo um domínio extracelular que é homólogo a um membro da superfamília génica das imunoglobulinas. Outros receptores, que não são membros da superfamília génica das 10 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ imunoglobulinas mas que estão contudo especificamente cobertos por esta definição, são os receptores de citoquinas e em particular os receptores com actividade de tirosina-quinase (tirosina-quinases receptoras), membros das superfamilias dos receptores da hematopoietina e dos factores de crescimento dos nervos, e moléculas de adesão celular, p.ex. selectinas (E, L e P). O termo "domínio de ligação ao receptor" é utilizado para designar qualquer ligando nativo para um receptor, incluindo moléculas de adesão celular ou qualquer região ou derivado de tal ligando nativo que mantenha pelo menos uma capacidade qualitativa de ligação ao receptor de um ligando nativo correspondente. Esta definição, entre outras, inclui especificamente as sequências de ligação de ligandos para os receptores mencionados acima.

Uma "quimera de anticorpo-imunoadesina" compreende uma molécula que combina pelo menos um domínio de ligação de um anticorpo (tal como aqui definido) com pelo menos uma imunoadesina (tal como definida neste pedido). Quimeras exemplificativas de anticorpo-imunoadesina são as quimeras biespecificas CD4-IgG descritas em Berg et ai., PNAS (USA) 88: 4723-4727, 1991 e Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268, 1994.

Modos de Realização do Invento O presente processo envolve a purificação de uma proteína contendo uma região Ch2/Ch3 de contaminantes através de cromatografia em Proteína A. A proteína a purificar utilizando cromatografia em Proteína A é uma proteína fundida ou conjugada com uma região Ch2/Ch3 de acordo com a reivindicação 1. As técnicas para criação de tais moléculas serão discutidas adiante. 1. Outras proteínas contendo a região Ch2/Ch3 A proteína a purificar é uma que é fundida ou conjugada com uma região CH2/CH3. Tais proteínas de fusão podem ser produzidas de modo a aumentar a semivida no soro da proteína 11 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ e/ou facilitar a purificação da proteína através de cromatografia em Proteína A.

Exemplos de proteínas biologicamente importantes que podem ser conjugadas deste modo incluem a renina; uma hormona do crescimento, incluindo a hormona do crescimento humana e a hormona do crescimento bovina; o factor de libertação da hormona do crescimento, a hormona paratiroideia; a hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; anti-tripsina alfa 1; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulação tais como o factor vmc, o factor IX, o factor tecidual e factor de von Willebrand; factores anti-coagulação tais como a Proteína C; factor natriurético atrial, tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio, tal como a uroquinase ou o activador do plasminogénio da urina ou de tipo tecidual humano (t-PA); bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético, factor de necrose tumoral-alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulado por activação normalmente expresso em células T e segregado); proteína inflamatória dos macrófagos humanos (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina do soro tal como a albumina de soro humano; substância inibidora da Muelleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado à gonadotrofina de ratinho; uma proteína microbiana, tal como a beta-lactamase; ADNase; IgE; um antigénio associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; activina; factor de crescimento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormonas ou factores de crescimento; Proteína D; factores reumatóides; um factor neurotrófico tal como o factor neurotrófico derivado dos ossos (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos tal como NGF-β; factor de crescimento derivado das plaquetas (PDGF); factor de crescimento dos fibroblastos tal como aFGF e bFGF; factor de crescimento epidérmico (EGF); factor de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, TGF^2, TGF^3, TGF^4 ou TGF-βδ; factor de crescimento semelhante à insulina-I e II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina; proteínas CD tais como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina; 12 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ factores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão tal como interferão-alfa, beta e gama; factores estimulantes de colónias (CSF), p.ex., M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (IL), p.ex., IL-1 a IL-10; superóxido-dismutase; receptores de células T; proteínas da superfície da membrana; factor acelerador do decaimento; antigénio virai tal como, por exemplo, uma porção do envelope do VIH; proteínas de transporte; auto-receptores; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas tais como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antigénio associado a tumores tal como o receptor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer um dos polipéptidos acima listados. 2. Purificação da proteína A proteína a purificar utilizando o método aqui descrito é geralmente produzida utilizando técnicas recombinantes. Os métodos para produção de proteínas recombinantes estão descritos p.ex., nas Patentes U.S. 5534615 e 4816567. Em concretizações preferidas, a proteína de interesse é produzida numa célula CHO (ver, p.ex., WO 94/11026). A Patente US 5429746 divulga a purificação de anticorpos sobre Proteína A imobilizada em contas de vidro de poro controlado. Aí o passo de lavagem é realizado a pH 7 utilizando tampão de PBS/glicina.

Quando se utilizam técnicas recombinantes, a proteína pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático, ou ser directamente segregada para o meio. Se a proteína for produzida intracelularmente, como primeiro passo, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Quando a proteína é segregada para o meio, as células hospedeiras recombinantes podem ser separadas do meio de cultura celular através de, por exemplo, filtração de fluxo tangencial. A Proteína A imobilizada numa fase sólida é utilizada para purificar a proteína contendo a região CH2/CH3. A fase sólida é de preferência uma coluna compreendendo uma 13 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ superfície de vidro ou de sílica para imobilização da Proteína A. De preferência, a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Por vezes, a coluna foi revestida com um reagente, tal como glicerol, numa tentativa para prevenir a aderência não específica à coluna. A coluna PROSEP A™, comercialmente disponível em Bioprocessing Limited, é um exemplo de uma coluna de vidro de poro controlado de Proteína A que é revestida com glicerol. A fase sólida para a cromatografia em Proteína A é equilibrada com um tampão adequado. Por exemplo, o tampão de equilíbrio pode ser TRIS 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM, pH 7,1. A preparação contaminada derivada das células hospedeiras recombinantes é carregada na fase sólida equilibrada utilizando um tampão de carga que pode ser o mesmo que o tampão de equilíbrio. À medida que a preparação contaminada flui através da fase sólida, a proteína é adsorvida na Proteína A imobilizada e, tal como aqui constatado, outros contaminantes (tais como proteínas das células de ovário de hamster chinês, CHOP, quando a proteína é produzida numa célula CHO) ligam-se não especificamente à fase sólida. O passo seguinte efectuado sequencialmente implica a remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo num passo de lavagem intermédio. Em concretizações preferidas, o electrólito hidrófobo neste solvente de lavagem é TEMAC e/ou TEAC. Embora possa estar presente um único electrólito hidrófobo no solvente de lavagem, em certas concretizações, podem ser utilizados dois ou mais desses electrólitos. O electrólito hidrófobo é de preferência adicionado a uma solução de pH tamponado possuindo um pH no intervalo de cerca de 4 a cerca de 8 e de preferência no intervalo de cerca de 5 a cerca 7. Tampões adequados para este fim incluem os tampões Tris, fosfato, MES e MOPSO. A concentração final preferida para o electrólito hidrófobo no solvente de lavagem está no intervalo de cerca de 0,1 a cerca 14 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ de 1,0 Me de preferência no intervalo de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M.

Após o passo de lavagem intermédio do parágrafo antecedente, a proteína de interesse é recuperada da coluna. Isto é normalmente conseguido utilizando um tampão de eluição adequado. A proteína pode, por exemplo, ser eluída da coluna utilizando um tampão de eluição possuindo um pH baixo, p.ex., no intervalo de cerca de 2 a cerca de 5 e de preferência no intervalo de cerca de 2,5 a cerca de 3,5. Exemplos de tampões de eluição para este fim incluem os tampões de citrato ou acetato. A preparação de proteína eluída pode ser sujeita a passos adicionais de purificação antes ou após o passo de cromatografia em Proteína A. Outros passos de purificação adicionais exemplificativos incluem cromatografia em hidroxilapatite; diálise; cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo para capturar a proteína; cromatografia de interacção hidrófoba (HIC); precipitação com sulfato de amónio; cromatografia de permuta aniónica ou catiónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica; cromatofocagem; e filtração em gel. A proteína assim recuperada pode ser formulada num transportador farmaceuticamente aceitável e ser utilizada para várias utilizações em diagnóstico, terapia ou outras utilizações conhecidas para tais moléculas. EXEMPLO 1 A coluna PROSEP A™ (Bioprocessing, Ltd.) tem Proteína A imobilizada numa coluna de vidro de poro controlado revestida com glicerol. O revestimento de glicerol reduz a superfície de vidro disponível para interacções não específicas com contaminantes mas, tal como aqui demonstrado, os contaminantes podem mesmo assim aderir à coluna. A cromatografia em Proteína A foi o passo de cromatografia inicial na purificação da proteína contendo a região CH2/CH3; o anticorpo anti-HER2 humanizado (humAb4D5-8) (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285-4289, 15 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 1992) . Este anticorpo anti-HER2 foi produzido de forma recombinante em células CHO. Após a produção e secreção da proteína para o meio de cultura celular, as células CHO foram separadas do meio de cultura celular através de filtração de fluxo tangencial (PROSTACK™). Neste sistema de expressão, verificou-se que os contaminantes mais predominantes eram proteínas de ovário de hamster chinês (CHOP). A coluna PROSEP A™ foi equilibrada com Tris 25 mM, NaCl 25 mM, edta 5 mM, pH 7,1 (Tampão A) . A cromatografia em Proteína A foi efectuada através da aplicação de Fluído de Cultura Celular Colhido (HCCF) das células CHO directamente para a coluna PROSEP A™ equilibrada utilizando Tampão A como tampão de carga. A coluna foi então lavada com Tampão A para remover por lavagem as proteínas de HCCF e as não ligadas. O anticorpo anti-HER2 foi eluído da coluna de Proteína A através de lavagem da coluna com Tampão B possuindo pH baixo (2,5-3,5). O Tampão B foi citrato de sódio 25 mM, pH 2,8. O pH baixo do Tampão B destruiu as interacções entre a Proteína A e o anticorpo anti-HER2. Destruiu também as interacções não específicas entre as superfícies de vidro expostas da coluna e as CHOP contaminantes ligadas de modo não específico. Isto resultou num nível de contaminação de CHOP no conjunto eluído de proteínas contendo anti-HER2 de »4000 ppm (Tabela 1).

Tabela Ia

Amostra Condições CHOP (pg/ml) (ppm) HCCF Carga 760 1461538 Conj. de Anticorpo Sem lavagem 32 4270 Conj. de Anticorpo TMAC, lavagem a pH 5,0 3 408 Conj. de Anticorpo TEAC, lavagem a pH 5,0 2 317 Conj. de Anticorpo TMAC, lavagem a pH 7,1 4 537 Conj. de Anticorpo TEAC, lavagem a pH 7,1 5 620 a O tampão de lavagem foi Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 5 mM incluindo TMAC ou TEAC 0,5 M ao pH indicado. Após a lavagem, a proteína foi eluída a pH 2,8._

Para abordar este problema relativamente aos contaminantes no conjunto de proteínas eluídas, foi avaliado um "passo intermédio de lavagem". Antes de se eluir o 16 ΕΡ 1 900 751/ΡΤ anticorpo da coluna, a coluna de Proteína A foi lavada com tampão de lavagem (a diferentes pH) ao qual foram adicionadas várias concentrações de TMAC ou TEAC (Tabela 1).

Tal como mostrado na Tabela 1, o passo de lavagem intermédio utilizando um tampão contendo TMAC ou TEAC foi eficaz para baixar o nível de CHOP no conjunto de anticorpo eluído. A concentração de TMAC ou TEAC foi de preferência de pelo menos 0,25 M. Assim, verificou-se que as concentrações preferidas de TMAC ou TEAC no solvente de lavagem são de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 Me de preferência de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M.

Quanto às variações no pH da solução de lavagem, verificou-se que quanto menor o pH, maior a remoção de CHOP no passo de lavagem. No entanto, a pH inferior a 7,0, a proteína pode também ser parcialmente eluída durante o passo de lavagem. Portanto, os pH preferidos para o passo de lavagem intermédio são de cerca de 4 a cerca de 8 e de preferência de cerca de 5 a cerca de 7.

Lisboa, 2010-02-17

Claims

ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método para purificação de uma proteína, a partir de uma sua solução contaminada, através de cromatografia em Proteína A, em que a referida proteína a purificar compreende uma região CH2/CH3 fundida ou conjugada com um polipéptido seleccionado do grupo de renina; uma hormona do crescimento; factor de libertação de hormonas do crescimento; hormona paratiroideia; hormona estimuladora da tiróide; lipoproteínas; anti-tripsina alfa-1; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pró-insulina; hormona estimuladora do folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; um factor da coagulação; um factor anti-coagulação; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; um activador do plasminogénio; bombesina; trombina; factor de crescimento hematopoiético; factor de necrose tumoral-alfa e -beta; encefalinase; RANTES (regulado por activação normalmente expresso em células T e segregado); proteína inflamatória dos macrófagos humanos (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina do soro; substância inibidora da Muelleriana; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; péptido associado à gonadotropina de ratinho; uma proteína microbiana; ADNase; igE; um antigénio associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA); inibina; activina; factor de crescimento endotelial vascular (VEGF); um receptor para uma hormona ou factor do crescimento; Proteína D; um factor reumatóide; um factor neurotrófico; factor de crescimento derivado das plaquetas (pdgf); factor de crescimento dos fibroblastos; factor de crescimento epidérmico (EGF); um factor de crescimento transformante (TGF); factor de crescimento semelhante à insulina-l e -II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-lGF I (IGF-I do cérebro), proteínas de ligação ao factor de crescimento semelhante à insulina; uma proteína CD; eritropoietina; um factor osteoindutor; uma imunotoxina; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão; um factor estimulante de colónias (CSF); uma interleucina; superóxido-dismutase; um receptor de células T; uma proteína da superfície da membrana; um factor acelerador do decaimento; um antigénio virai; uma proteína de transporte; um auto-receptor (receptor "homing"); uma adressina; uma proteína reguladora; uma integrina; um antigénio associado a tumores; ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 2/5 ou um fragmento de qualquer um dos polipéptidos listados acima; o método compreendendo: a) a adsorção da proteína à Proteína A imobilizada numa fase sólida compreendendo sílica ou vidro; b) a remoção dos contaminantes ligados à fase sólida através de lavagem da fase sólida com um solvente electrólito hidrófobo, em que o solvente electrólito hidrófobo compreende cloreto de tetrapropilamónio, cloreto de tetrabutilamónio, cloreto de tetrametilamónio (TMAC) ou cloreto de tetraetilamónio (TEAC); e c) a recuperação da proteína a partir da fase sólida.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou um seu fragmento..
3. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um receptor para uma hormona ou um factor do crescimento, ou é um seu fragmento, e a hormona ou o factor de crescimento é VEGF.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma hormona do crescimento seleccionada entre hormona do crescimento humana e hormona do crescimento bovina, ou é um fragmento de qualquer destas.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um actor da coagulação seleccionado entre factor VIIIC, factor IX, factor tecidual e factor de von Willebrand, ou é um fragmento de qualquer destes.
6. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um factor anti-coagulação que é Proteína C, ou é um seu fragmento.
7. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um activador do plasminogénio seleccionado entre uroquinase, activador do plasminogénio da urina e de tipo tecidual (t-PA) humano, ou é um fragmento de qualquer destes. ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 3/5
8. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma albumina do soro que é albumina do soro humana, ou é um seu fragmento..
9. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma proteína microbiana que é beta-lactamase, ou é um seu fragmento.
10. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um CTLA que é CTLA-4, ou é um seu fragmento.
11. método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um factor neurotrófico seleccionado entre factor neurotrófico derivado dos ossos (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou um factor de crescimento dos nervos, ou é um fragmento de qualquer destes.
12. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um factor de crescimento dos nervos que é NGF-β, ou é um seu fragmento.
13. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um factor de crescimento dos fibroblastos que é aFGF ou bFGF, ou é um fragmento de qualquer destes.
14. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um TGF e é seleccionado entre TGF-alfa ou TGF-beta, ou é um fragmento de qualquer destes.
15. Método de acordo com a reivindicação 14 em que o polipéptido é um TGF-beta seleccionado entre TGF-βΙ, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 e TGF-βδ, ou é um fragmento de qualquer destes.
16. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma proteína CD seleccionada entre CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20, ou é um fragmento de qualquer destes.
17. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um interferão seleccionado entre interferão-alfa, interferão-beta e interferão-gama, ou é um fragmento de qualquer destes. ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 4/5
18. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um CSF seleccionado entre M-CSF, GM-CSF e G-CSF, ou é um fragmento de qualquer destes.
19. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma IL seleccionada entre qualquer de IL-1 a IL-10, ou é um fragmento de qualquer destes.
20. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um antigénio virai que é uma porção do envelope do HIV, ou é um seu fragmento.
21. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é uma integrina seleccionada entre CDlla, CDllb, CDllc, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM, ou é um fragmento de qualquer destes.
22. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o polipéptido é um antigénio associado a tumores seleccionado entre um receptor HER2, um receptor HER3 e um receptor HER4, ou é um fragmento de qualquer destes.
23. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado.
24. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a fase sólida é uma coluna de ácido silicico.
25. Método de acordo com a reivindicação 1 em que os contaminantes são Proteínas de Ovário de Hamster Chinês (CHOP) .
26. Método de acordo com a reivindicação 1 em que a concentração do electrólito hidrófobo no solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 M.
27. Método de acordo com a reivindicação 26 em que a concentração do electrólito hidrófobo no solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 0,25 a cerca de 0,5 M. ΕΡ 1 900 751/ΡΤ 5/5
28. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o pH do solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 4 a cerca de 8.
29. Método de acordo com a reivindicação 28 em que o pH do solvente electrólito hidrófobo está na gama de cerca de 5 a cerca de 7.
30. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o passo (c) compreende a eluição da proteina utilizando um tampão de eluição possuindo um pH na gama de cerca de 2,0 a cerca de 5,0.
31. Método de acordo com a reivindicação 30 em que o passo (c) compreende a eluição da proteína utilizando um tampão de eluição possuindo um pH na gama de cerca de 2,5 a cerca de 3,5. Lisboa, 2010-02-17