ES2567091T3

ES2567091T3 - Compuestos de amina para la preparación selectiva de muestras biológicas

Info

Publication number: ES2567091T3
Application number: ES13161644.3T
Authority: ES
Inventors: Stephen Gordon Will
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-04-05
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2016-04-19
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103361337B; US9371524B2; CN103361337A; EP2647709A1; JP6121780B2; US20130266951A1; CA2811435A1; JP2013215190A; EP2647709B1; CA2811435C

Abstract

Un método para aislar un ácido nucleico a partir de una muestra de fluido, dicho método comprende los pasos: a. combinar juntos un soporte sólido y dicha muestra de fluido en un recipiente de reacción durante un período de tiempo y en condiciones suficientes para permitir que dicho ácido nucleico sea inmovilizado sobre el soporte sólido, b. aislar el material del soporte sólido de los otros materiales presentes en la muestra de fluido en una estación de separación, c. purificar el ácido nucleico mediante la separación de la muestra de fluido del material de soporte sólido, d. lavar el material del soporte sólido una o más veces con un tampón de lavado que comprende una amina catiónica. en el que dicha amina catiónica es una amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la fórmula general I,**Fórmula** en donde R1 y R2 pueden ser, independientemente el uno del otro, un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, R3 puede ser un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, x es un número entero entre 1 y 12, R4 es un residuo de acuerdo con la fórmula general II**Fórmula** en el que R5 puede ser un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, R6 pueden ser un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, o -(CH2)3-NH2, o -(CH2)4-NH-(CH2)3- NH2, y R7 puede ser un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, o un par de electrones libres, en cuyo caso el nitrógeno vecino no tiene carga.

Description

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Este tipo de análisis puede comprender, por ejemplo, análisis de ácidos nucleicos como la PCR, incluyendo PCR en tiempo real o métodos de secuenciación, o análisis de proteínas tales como por ejemplo, ensayos basados en anticuerpos como ELISA u otros métodos. El análisis también puede incluir métodos para la detección del material biológico aislado, como por ejemplo, técnicas basadas en quimioluminiscencia o electroluminiscencia, radiografía u

5 otros métodos de detección. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se analiza mediante la amplificación, en algunas realizaciones por PCR, en otras formas de realización mediante PCR en tiempo real.

El método descrito anteriormente es particularmente útil en el contexto de aislamiento de ácidos nucleicos con un posible análisis posterior, por ejemplo, mediante PCR.

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Por lo tanto, en el método descrito anteriormente, el material diana biológico es un ácido nucleico.

Otro aspecto de la invención es el uso de un tampón de lavado que comprende una amina catiónica como se define en las reivindicaciones para la eliminación selectiva de un inhibidor del análisis de un ácido nucleico a partir de un

15 soporte sólido al que dicho ácido nucleico está unido.

"Eliminación selectiva ", en el contexto de la invención, significa la eliminación de la mayor parte de un compuesto no deseado de un objeto mientras que otros compuestos en gran medida permanecen unidos a este último. Más específicamente, significa la eliminación de la mayor parte de un inhibidor de análisis corriente abajo de un ácido

20 nucleico a partir de un soporte sólido al que dicho ácido nucleico está unido. Es evidente para una persona experta en la técnica que dicha selectividad por lo general no es cuantitativa, es decir, una parte menor del material diana puede retirarse del soporte sólido, junto con la mayor parte de las impurezas no deseadas.

El uso de una amina catiónica tal como se define en las reivindicaciones en un tampón de lavado para eliminar

25 impurezas de un soporte sólido es especialmente ventajoso cuando se aíslan ácidos nucleicos a partir de una muestra de fluido.

Por lo tanto, en el uso descrito anteriormente, el material diana biológico es un ácido nucleico y el análisis corriente abajo comprende o consiste en la amplificación del ácido nucleico.

30 Como se ha indicado anteriormente, los métodos analíticos que implican la amplificación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, PCR a menudo son muy sensibles a la inhibición por impurezas derivadas de muestras de fluidos que contienen material biológico, de manera que el método y el uso descrito anteriormente son especialmente útiles en este contexto.

35 Entre las posibles muestras de fluidos, la sangre total es una matriz especialmente compleja. Dado que, por ejemplo, la hemina es abundante en la sangre total, el método y el uso descrito anteriormente son particularmente útiles en este contexto.

40 Por lo tanto, un aspecto de la invención es el método o el uso descrito anteriormente, en el que la muestra de fluido es sangre total.

En analogía con el método descrito más arriba, un aspecto de la invención es el uso descrito anteriormente, en el que dicha amina catiónica es una amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la fórmula general I,

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Fórmula I

en donde R1 y R2 pueden ser, independientemente el uno del otro, un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo

50 o heteroarilo, R3 puede ser un residuo de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo o heteroarilo, x es un número entero entre 1 y 12, R4 es un residuo de acuerdo con la fórmula general II

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Figura 1B: curvas de crecimiento de PCR de un control de inhibición de DNA (IC) se añadió a la mezcla maestra de PCR después de utilizar en la preparación de la muestra un tampón de lavado con putrescina (línea continua) y un tampón de lavado de referencia sin amina catiónica (línea de puntos). El resultado muestra que el rendimiento de la PCR es comparable en ambos casos.

Figura 1C: curvas de crecimiento de PCR de un control de de procesos completo de RNA (FPC) recuperado usando un tampón de lavado con putrescina (línea continua) y un tampón de lavado de referencia sin amina catiónica (línea de puntos). Las curvas muestran claramente un mejor resultado con tampón de lavado que contiene amina, lo que sugiere una mejora en la recuperación de RNA de manera significativa durante la preparación de la muestra.

Figura 1D: curvas de crecimiento de PCR de un control de inhibición de RNA (IC) se añadió a la mezcla maestra de PCR después de utilizar en la preparación de la muestra un tampón de lavado con putrescina (línea continua) y un tampón de lavado de referencia sin amina catiónica (línea de puntos). El resultado muestra que el rendimiento de la PCR es comparable en ambos casos.

Fig.2: tolerancia a la inhibición por heces como función del volumen de procesamiento con diferentes dispositivos de muestreo. Con putrescina en el tampón de lavado, la tolerancia de las heces inhibidor aumentó con una señal fluorescente aceptable (RFI) y los valores de Ct.

Ejemplos

Ejemplo 1

Ensayo de compuestos de amina para la preparación selectiva de muestras biológicas

Diseño experimental

Con el fin de obtener una medida exacta de la eficiencia de los procesos de preparación de muestras experimentales, se ideó un método para amplificar y detectar simultáneamente 2 dianas sintéticas. Estas dianas se introducen en la muestra de trabajo preparación/amplificación/detección en diferentes puntos del proceso, mediante el cual se introduce un control de proceso completo (FPC) en una matriz de muestras y un control de inhibición (IC) se introduce en la mezcla maestra de PCR. La detección del FPC está influenciado por la eficiencia con la que esta diana se recupera a través del proceso de preparación de muestras compuesto con el efecto de inhibidores de la PCR en la amplificación y detección de esta diana. El IC no pasa por el proceso de preparación de muestras, por lo que la amplificación y detección de este material está influida solamente por la presencia de inhibición de la PCR. De esta manera, el efecto de cambiar elementos del proceso de preparación de muestras, (por ejemplo, tipo de ácido nucleico, matriz de muestras, procesos y combinaciones de reactivos) en la recuperación de ácidos nucleicos puede ser evaluada y diferenciada del efecto de inhibición de la PCR. Las 2 dianas deberían ser amplificadas y detectadas con eficiencias similares, y deberían estar influenciadas por los inhibidores en sustancialmente la misma medida, a fin de que este diseño experimental sea válido.

Desde una perspectiva de diagnóstico ambas formas de DNA y RNA de ácidos nucleicos son adecuados para el estudio. Por lo tanto, es ventajoso construir las dianas sintéticas para este marco experimental en ambas formas. Con el fin de normalizar la variación de las eficiencias de amplificación de las diferentes dianas, la secuencia de ácido nucleico de los amplicones debe ser la misma para ambas formas de cada una de las dianas. Sin embargo, ya que se introducen en los procesos bajo diferentes condiciones, estos no necesitan ser configurados en diferentes formas. El FPC de DNA puede introducirse en la matriz de muestras en 2 formas, como DNA plasmíodico o como construcción de DNA del fago λ encapsulado. Este último imita más estrechamente una partícula de virus de DNA recubierto de proteína, por ejemplo, de lo que lo haría el plásmido. La partícula de fago λ requiere la lisis con el fin de liberar el DNA encapsulado adecuado para la captura en una superficie de sílice. El IC correspondiente para esta diana de DNA también debe ser en forma de DNA, pero ya que este se introduce después de la lisis, este debería estar en la forma de un plásmido. Análogamente, para el RNA, el FPC es preferiblemente una construcción de RNA blindada, y el IC es un transcrito de RNA.

Con el fin de obtener un análisis más completo del eluato derivado de cualquier proceso de preparación de muestras, es conveniente analizar químicamente los eluatos, para medir cualquier cambio en la composición química del material eluido provocada por el cambio de proceso en estudio. Se desarrollaron métodos específicos para identificar y cuantificar los inhibidores específicos del proceso de PCR. El aislamiento de ácidos nucleicos a partir de especímenes de muestras complejas puede conducir a eluidos en el que el rendimiento de PCR es muy pobre debido a la copurificación de posibles inhibidores de la PCR junto con los ácidos nucleicos deseados. Se observó que mediante el procesamiento de la sangre total con reactivos de preparación de muestras estándar, se puede obtener un eluato rojizo lo que sugiere la presencia de moléculas que contienen hierro tales como la hemoglobina o hemina. Era importante establecer métodos analíticos para detectar y cuantificar dichos inhibidores. Otros ejemplos de inhibidores de la PCR conocidos, tales como bilirrubina, ácido húmico o melanina (como el que se obtiene a partir de muestras de tejido de melanoma) fueron candidatos para análisis de fluidos y se desarrollaron métodos analíticos adecuados para estos.

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Dos métodos experimentales se llevaron a cabo para la evaluación de la eliminación de inhibidor de flujos de trabajo de preparación de muestras. Con el fin de detectar posibles tampones de lavado por su capacidad para eliminar los inhibidores, se diseñaron sistemas modelo, en los que se añadieron inhibidores conocidos de plasma humano y se utilizó este plasma en las evaluaciones de los flujos de trabajo de preparación de muestras. De esta manera podrían examinarse muchas combinaciones de tampones de lavado, junto con varios inhibidores conocidos diferentes. El segundo tipo de experimento utilizó sangre total como muestra de entrada. Este experimento se utilizó para verificar el rendimiento de los tampones de lavado candidatos descubiertos por medio de el proceso de selección anterior.

Configuración experimental

Las muestras se sometieron a una preparación de muestras totalmente automatizada en un instrumento STAR de Hamilton modificado y la posterior amplificación/detección en un LightCycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim/DE). El volumen de proceso de muestras de 850 l fue constante para todas las matrices de muestras analizadas. Se implementó un volumen de entrada de plasma en EDTA y suero de muestras de 850 l. Un volumen de entrada de muestra de sangre total fresca (resp. muestra de cadaverina) de 150 l (resp. 100 l) se diluyó con 700 l (resp. 750 l) de diluyente de la muestra para alcanzar el volumen total del proceso de 850 l.

Preparación de muestras

Las muestras se sometieron a una preparación de muestras totalmente automatizada en un instrumento STAR de Hamilton modificado (comparar WO 2012/013733). El principio de la preparación de muestras se puede describir en cuatro etapas principales:

•: Montaje de la muestra

•: Lisis y unión

•: Lavado

•: Elución

Los siguientes párrafos describen los pasos individuales en más detalle.

Secuencia de montaje de muestras

Etapa de preparación de muestras

La muestra biológica a analizar (volumen en función de la matriz de la muestra) está, si es necesario, diluida con diluyente de muestra para alcanzar un volumen final del proceso de 850 l. Se añade un volumen total de 50 l de reactivo de FPC, seguido de 50 l de los reactivos de la proteasa. A esta mezcla se añaden 100 l de reactivo de partículas de vidrio magnéticas (MGP) (compárese el documento WO 96/41811; pigmentos magnéticos).

Etapa de lisis/unión

Para la muestra montada se añade 1250 l de tampón de lisis y la reacción de unión de lisis se lleva a cabo a 40 ° C durante 10 min. en agitación constante que permite la lisis celular y la unión de ácidos nucleicos a las partículas de vidrio magnéticas. Un campo magnético se aplica para permitir la separación magnética de los ácidos nucleicos unidos a MGP de los líquidos circundantes. La solución de lisis circundante al MGP se retira y el campo magnético se para.

Etapa de lavado

En una etapa inicial de lavado, un volumen total de 900 l de tampón de lavado se añade seguido de mezclado. Se añade un volumen adicional de 1500 l de tampón de lavado seguido de mezclado. Se aplica un campo magnético para permitir la separación magnética de los ácidos nucleicos unidos a MGP de los líquidos circundantes. La solución de lavado se elimina y el campo magnético se para. En una segunda etapa de lavado, un volumen total de 2000 l se añadió seguido de mezclado. Se aplica un campo magnético para permitir la separación magnética de los ácidos nucleicos unidos a MGP de los líquidos circundantes. La solución de lavado se elimina y el campo magnético se para.

Etapa de elución

Se añade un volumen total de 50 l de tampón de elución y los ácidos nucleicos se eluyen del MGP con lavados repetidos de 6 minutos a 80 °C. Se utiliza un volumen final de 25 l de eluido para la PCR de ensamblaje.

Reactivos de preparación de muestras

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Un volumen total de 25 l de eluato se transfiere a una placa de 96 micropocillos. El volumen de reacción de PCR de 50 l se monta como sigue:

Componente de reacción de PCR: Volumen

Eluato: 25 l

MMx R1: 5 l

MMx R2: 15 l

reactivo IC2: 5 l

Reactivo IC: Concentración

Tris, pH 8,0: 10 mM

EDTA: 0,1 mM

Azida de sodio: 0,05% (p/v)

Poli (rA) RNA: 20 mg/L

IC DNA (resp. de RNA): 50 copias/L (80 copias/l)

MMx R1 (en H2O): Concentración

Mn (Ac)2 * 4H2O (pH 6,1 ajustado con ácido acético): 50 mM

NaN3, tamponado con Tris 10 mM a pH 7: 0,36 M

MMx R2 (en H2O): Concentración

DMSO (%): 13,33 M

NaN3, tamponado con Tris 10 mM a pH 7: 366,667M

KOAc (pH 7,0): 0,09 M

Glicerol (%): 13,33 M

Tricina pH 8,0: 166,667 M

NTQ21-46A -aptámero: 0,741 M

UNG (U/L): 0,67 M

Igepal (solución madre precalentada a 37 °C) (%): 0,08 M

dGTP: 1,667 M

dATP: 1,667 M

dCTP: 1,667 M

dUTP: 3,333 M

ZO5-D de la polimerasa (U/l): 2 M

Id. de Sec. Nº: 1: 0,5 M

Id. de Sec. Nº: 2: 0,5 M

Id. de Sec. Nº: 3: 0,5 M

Id. de Sec. Nº: 4: 0,5 M

Id. de Sec. Nº: 5: 0,333 M

Id. de Sec. Nº: 6: 0.333 M

Amplificación y detección

10 Para la amplificación y detección, la placa de micropocillos se selló manualmente y se transfirió a un LightCycler 480. El siguiente perfil de PCR fue utilizado manualmente:

Ciclos: Objetivo (°C) Mantenimiento (hh:mm:ss) Rampa

Pre-PCR: 1 50 00:02:00 4,4

94: 00:00:05 4,4

55: 00:02:00 2,2

60: 00:06:00 4,4

65: 00:04:00 4,4

1.Medic.: 5 95 00:00:05 4,4

55: 00:00:30 2,2

2.Medic.: 45 91 00:00:05 4,4

58: 00:00:25 2.2

Post: 1 40 00:02:00 2.2

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Dianas sintéticas Las dianas sintéticas (FPC e IC) están constituidos por partículas de DNA plasmídico linealizado o transcripciones de RNA. Las partículas de ácido nucleico se utilizan en números de copias predefinidos por reacción.

El concepto general de diseño para estas dianas consiste en una secuencia de ácido nucleico común que puede ser bien RNA o DNA, y será blindado como tal en partículas denominadas RNA blindado (partículas de proteína de recubrimiento de fago MS2) o de DNA blindado (partículas de fago lambda). Cada diana tendrá un correspondiente juego de cebadores específicos y sondas TaqMan diferencialmente marcadas con fluorescencia para utilizarse en todos los ensayos, eliminando así la influencia en función del tipo de diana sobre la estimación de la eficiencia de preparación de muestras. Para este fin, cada diana, junto con sus correspondientes cebadores y sondas, se diseñó utilizando el programa BLAST del NCBI y shuffleseq EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) para generar una secuencia única. La sonda FPC se marcó con Cy5 y la sonda IC se marcó con tinción HEX. Las construcciones se diseñaron y se clonaron para su posterior evaluación. Para producir RNA blindado la secuencia se clonó en el vector pCP-1. Para producir transcripción la secuencia se clonó en pSP64a. Para producir el DNA blindado la secuencia se clonó en lambda GT11.

Control interno: Número de copias (cp) por reacción (rxn)

DNA IC (resp. RNA): 100 cp/rxn (300 cp/rxn)

DNA FPC (resp. RNA): 250 cp/rxn (400 copias/L)

DNA: plásmido linealizado

Un plásmido recombinante construido usando el vector de clonación poli(A) pSP64a (Promega) se linealizó con la enzima de restricción EcoRI.

Región de interés del plásmido recombinante pEF054 (FPC)

La secuencia de interés del plásmido pEF054 recombinante se linealizó con la enzima de restricción EcoRI IC en el vector de clonación poli (A) pSP64a (después de 270 pb) que corresponde a Id. de Sec. Nº: 7:

Plásmido recombinante pEF066 (IC)

La secuencia de interés del plásmido pEF066 recombinante se linealizó con la enzima de restricción EcoRI IC en el vector de clonación poli (A) pSP64a (después de 503 pb) que corresponde a Id. de Sec. Nº: 8.

Análisis químico del eluato (ISS)

Durante los experimentos en los que se analizaron diferentes tampones de lavado, se desarrolló una forma de controlar la eficacia de la eliminación de inhibidores. Los inhibidores de la PCR candidatos se analizaron en los eluatos obtenidos con el proceso de preparación de la muestra descrito anteriormente. La eliminación de estos inhibidores específicos se utiliza para monitorizar la eficiencia de los tampones de lavado. Sus propiedades inhibidoras de la PCR se evaluaron al añadirlos directamente en la PCR y observando la respuesta de la PCR con diferentes concentraciones de los correspondientes compuestos. Para los experimentos en los que se procesa la sangre total, el inhibidor de elección era hemina. Para analizar si la amina añadida en el tampón de lavado se puede utilizar con otros especímenes de muestras difíciles, estas últimos se simularon mediante la adición de melanina, sales biliares y ácido húmico al plasma humano en el proceso de preparación de muestras. Los métodos de análisis se desarrollaron para permitir la cuantificación relativa de los compuestos específicos en los eluatos.

Detección de hemina (ISS)

La detección basada en HPLC de hemina se llevó a cabo a 20 °C en un aparato de cromatografía líquida Agilent 1100 acoplado con un detector agilent PDA. La medición se llevó a cabo utilizando la colección de espectros de absorbancia 3D entre 200 y 800 nm y la salida se proporcionó mediante la detección de onda única, tanto en λ = 254 como a 400 nm. Las muestras de eluato se centrifugaron durante 3 min a 4000 rpm y 25 °C y el sobrenadante se utilizó para el análisis. Se inyectó una muestra de 30 l del eluato y se separó en una columna de HPLC polimérico 5 m 100 Å 4,1 x 100 mm Hamilton PRP-1. Todas las fases móviles se prepararon con compuestos de calidad HPLC proporcionados por Sigma Aldrich. La fase móvil (A) se preparó añadiendo CFCOOH (0,1% v/v) para el agua filtrada Milli-Q. Este último se añadió con el fin de suprimir la ionización del péptido. La fase móvil (B) fue acetonitrilo de calidad cromatográfica. El análisis de HPLC se operó en un modo de flujo constante y el caudal se mantuvo a 1 mL/min. Los resultados del análisis cromatográfico fueron procesados por el programa Agilent ChemStation modular 3D y fue como sigue cuando se utiliza un tampón de lavado que contiene putrescina como una amina catiónica:

Tabla 1: El área del pico de la hemina a 17,7 min en eluato producido con y sin putrescina

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arriba) sin amina catiónica (3 repeticiones): arriba) dihidrocloruro que contiene putrescina (3 repeticiones)

100 l de sangre total envejecida 24h: media: 30,88 DESVEST: 1,78 promedio: 3,56 DESVEST: 0,55

100 l de sangre total envejecida 48h: media: 43,74 DESVEST: 4,16 promedio: 2,92 DESVEST: 0,19

El gradiente utilizado durante la separación fue:

Tiempo/min: (A) (B)

0-5: 100 0

5-10: 90 10

10-15: 50 50

15-20: 0 100

5 La identificación del compuesto de hemina a partir del eluato de la sangre total se confirmó mediante análisis HPLC de una muestra auténtica de hemina (BioXtra, porcina, ≥98.0% (HPLC) Sigma Aldrich, Mat Nº 51280) que proporcionó tiempos de retención de HPLC y espectros de absorbancia UV idénticos.

Detección de bilirrubina (ISS)

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La detección de la bilirrubina se llevó a cabo en un sistema de HPLC como se ha descrito anteriormente. El gradiente utilizado durante la separación fue:

Tiempo/min: (A) (B)

0-5: 100 0

5-15: 0 100

15-30: 0 100

30-31: 50 50

31-32: 100 0

32-40: 100 0

15 La identificación del compuesto de bilirrubina se llevó a cabo utilizando bilirrubina comercialmente disponible (≥98.0% Sigma Aldrich, Mat Nº B4126). Los resultados fueron comparables a los obtenidos para la detección de la hemina.

20 Detección de melanina (ISS)

La melanina se detectó mediante mediciones de absorbancia a λ = 562 nm usando un lector de placa de múltiples pocillos (Tecan Infinity 500).

25 Para la cuantificación de la melanina, se estableció la linealidad de la respuesta (R2 = 0,9998). La absorbancia de las soluciones de melanina entre 7,8 y 500 ppm, se midió con el uso de melanina sintética disponible comercialmente (Sigma Aldrich, Mat Nº M8631) disuelto en tampón de elución (tampón Tris 5 mM, 0,2% (p/v) metilparabeno, pH 8,5) y utilizando un eluato producido con melanina 0 ppm como una muestra en blanco (100 l). Los resultados fueron comparables a los obtenidos para la detección de la hemina. Los siguientes parámetros se utilizaron para los

30 análisis:

Varias lecturas por pocillo (círculo (lleno)): 4x4 15

Varias lecturas por pocillo (borde): 1350 mm

Longitud de onda: 562 nm

Ancho de banda de: 5 nm

Cantidad de Disparos: 10 ms

Tiempo establecido: 1 20

Ejemplo 2

35 Prueba de un tampón de lavado que contiene putrescina para la preparación de muestras de heces

En la serie de experimentos con un ensayo dirigido a Clostridium difficile descrito en el presente documento, se demostró que la inhibición de la PCR por los inhibidores intrínsecos contenidos en el material de la muestra (heces) se podría reducir mediante la introducción de putrescina en el tampón de lavado utilizado en el primer paso para

lavar las partículas de vidrio magnéticas (MGP). Un volumen de entrada de heces más alta fue tolerada durante el uso de un tampón de lavado que contiene putrescina, lo que mejora la sensibilidad del ensayo.

Configuración experimental

5

A menos que se indique lo contrario, los instrumentos y el flujo de trabajo fueron como se describe para el Ejemplo

1. Las MGP se lavaron dos veces como anteriormente, mientras que el tampón de lavado que contiene putrescina fue empleado en la primera etapa de lavado.

10 1) Tolerancia a la inhibición por heces con volumen de entrada variable de las muestras

Método

Se utilizaron en el estudio muestras de heces de inhibición juntadas de C.difficile positiva (determinada por el ensayo

15 disponible comercialmente Cepheid Xpert® C.difficile/Epi). Se utilizaron dos dispositivos de toma de muestras de heces (asa de siembra, e torunda) para transferir heces en medio de PCR cobas® (Roche Diagnostics, art 06466281190). Cuando se utiliza un asa de siembra de inoculación de 10 l como dispositivo de transferencia de las heces, se utilizó el volumen de entrada máxima permitida de suspensión de heces (400 l) para compensar una cantidad muy baja de la muestra primaria. Cuando se utiliza un hisopo flocado que transfiere cantidades mucho más

20 grandes de la muestra primaria, se evaluaron varios volúmenes de suspensión de heces para encontrar el límite superior de tolerancia. La Tabla 2 muestra las condiciones que se probaron en este estudio. Un control interno (IC) se incluyó en cada muestra analizada.

Tabla 2: Diseño Experimental para la tolerancia a la inhibición por heces, N = 8

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Dispositivos de toma de muestras: volumen de entrada de la suspensión de heces (l) putrescina en el tampón de lavado heces en cada extracción de la muestra (l)

Asa de siembra: 400 No 0.9

Asa de siembra: 400 Sí 0,9

Hisopo flocado: 75 No 2,6

Hisopo flocado: 100 No 3.5

Hisopo flocado: 150 No 5.2

Hisopo flocado: 200 No 7.0

Hisopo flocado: 75 Sí 2,6

Hisopo flocado: 150 Sí 5.2

Hisopo flocado: 200 Sí 7.0

Resultado

Los resultados de este estudio se resumen en la figura 2. Al utilizar muestras de heces en torundas, la mayoría de

30 las réplicas no mostraron ninguna señal de fluorescencia a 150 l de entrada sin putrescina en el tampón de lavado, lo que indica inhibición. Con la putrescina, la tolerancia a la inhibición por heces aumentó con una señal fluorescente aceptable y valores de Ct observados hasta 200 l de entrada de suspensión de heces. Cuando se utiliza un asa de siembra para la transferencia de las heces (400 l volumen de entrada de suspensión heces), la señal se inhibió completamente sin putrescina en el tampón de lavado. La inhibición se eliminó por adición de putrescina al tampón

35 de lavado.

Conclusiones

La putrescina en el tampón de lavado de MGP permite una mayor entrada de heces, por lo tanto, potencialmente el 40 aumento de la sensibilidad del ensayo.

El mejor equilibrio entre la señal diana y el grado de inhibición parece alcanzarse con 150 l de entrada de suspensión de heces con tampón de lavado que contiene putrescina al utilizar torundas como dispositivo de transferencia de materia fecal (véase la figura 2)

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2) Comparación de la sensibilidad analítica con volumen de entrada de muestra variable

Método

50 La sensibilidad analítica del ensayo antes mencionado se evaluó con cuatro combinaciones de dispositivos de muestreo de heces y los volúmenes de procesamiento de heces en suspensión como se describe en la Tabla 3. La muestra de C.difficile positiva (determinada por el ensayo Cepheid Xpert® C.difficile/Epi disponible comercialmente) se diluyó en serie 7 veces en un conjunto de muestras negativas no inhibitorias. Cada nivel de dilución se analiza en 24 repeticiones para cada condición. Se utilizó el análisis Probit para determinar el límite de detección (LoD).

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Claims

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