CN103361337A - 用于选择性制备生物学样品的胺化合物 - Google Patents

用于选择性制备生物学样品的胺化合物 Download PDF

Info

Publication number
CN103361337A
CN103361337A CN2013101122567A CN201310112256A CN103361337A CN 103361337 A CN103361337 A CN 103361337A CN 2013101122567 A CN2013101122567 A CN 2013101122567A CN 201310112256 A CN201310112256 A CN 201310112256A CN 103361337 A CN103361337 A CN 103361337A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrogen
alkyl
cycloalkyl
aryl
solid support
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013101122567A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103361337B (zh
Inventor
S.G.威尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN103361337A publication Critical patent/CN103361337A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103361337B publication Critical patent/CN103361337B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于从生物学样品分离生物学靶材料的方法，所述方法包括使所述靶材料结合至固体支持物，其中通过用含有阳离子胺的清洗缓冲液清洗固体支持物来自其选择性除去杂质。本发明进一步提供了一种用于从生物学样品分离生物学靶材料的试剂盒，所述试剂盒包含含有阳离子胺的清洗缓冲液，以及相应的清洗缓冲液的用途。

Description

用于选择性制备生物学样品的胺化合物
发明领域
本发明涉及分析学领域。在此领域内，其关注从生物学样品分离生物学靶材料，包括使所述靶材料结合至固体支持物，其中通过用含有阳离子胺的清洗缓冲液清洗所述固体支持物自其选择性除去杂质。
发明背景
自复杂的生物学混合物诸如临床样品(如例如全血)分离生物学材料(诸如核酸或蛋白质)具有相当大的意义，尤其对于诊断目的。
本领域中已经开发出众多不同方法，例如，将样品中不想要的组分变性、沉淀并除去，随后沉淀并分离所讨论的分析物(例如基于醇的核酸沉淀)。
另一种办法是使待分离的生物学材料结合至固体支持材料，所述固体支持材料可以例如以层析柱形式提供。
出于诊断目的，且尤其为了自动化分离随后进行中或高通量分析的生物学材料，经常使用结合颗粒。
本领域中已知在分离过程期间，杂质经常结合到相应的固体支持物，并且如此共分离出来，而且这类杂质可能干扰对所讨论的生物学材料的下游分析。
现有技术已经尝试通过应用各种措施来处理上文提及的情况。
例如，
Figure BDA00003001886600011
微量制备手册(第2版，2006年12月)披露了一种用离液盐和乙醇清洗固体支持物的方法，并且CN101665785A披露了含有TritonX-100的固体支持物清洗缓冲液。这些办法展现出各种缺点。
发明概述
在第一个方面，如上文所列的，本发明涉及一种用于从流体样品分离生物学靶材料的方法。
此方法包括在第一步中在反应容器中将固体支持物和流体样品组合在一起，从而使生物学靶材料能够结合至固体支持物。随后，在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述流体样品中的其它材料分离，接着通过将所述流体样品与所述固体支持材料分开来纯化所述生物学靶材料。然后，用包含阳离子胺的清洗缓冲液将所述固体支持材料清洗一次或多次。
此外，本发明提供了包含阳离子胺的清洗缓冲液用于从生物学靶材料所结合的固体支持物选择性除去所述生物学靶材料的分析的抑制剂的用途。
本发明的另一个方面是一种用于从流体样品分离生物学靶材料的试剂盒，所述试剂盒包含下列组分：
·结合缓冲液
·固体支持物
·包含阳离子胺的清洗缓冲液
·任选地，洗脱缓冲液，
其中所述结合缓冲液和所述清洗缓冲液是装在不同容器中的不同缓冲液。
发明详述
如上文提及的，本发明在第一个方面涉及用于从流体样品分离生物学靶材料的方法，所述方法包括下列步骤：
a.在反应容器中将固体支持物和所述流体样品在一定条件下组合在一起达一段时间，该条件和时间段足以允许所述生物学靶材料在所述固体支持物上固定化，
b.在分离站中将所述固体支持物与存在于所述流体样品中的其它材料分离，
c.通过将所述流体样品与所述固体支持物分开来纯化所述生物学材料，
d.用包含阳离子胺的清洗缓冲液将所述固体支持物清洗一次或多次。
如上文概述的，诊断测试获得成功的常见前提是分离基本上未降解的生物学材料而不共分离大量的杂质，所述杂质可能干扰靶材料的下游加工。在例如分离和分析蛋白质或核酸期间可以是该情况。
术语“核酸”或“多核苷酸”可以互换使用，并且指可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物的聚合物。这包括核苷酸的聚合物诸如RNA和DNA，以及其合成形式、经修饰的(例如经化学或生物化学修饰的)形式，和混合的聚合物(例如包含RNA和DNA亚单位两者)。例示性的修饰包括甲基化、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物取代、核苷酸间修饰诸如不带电荷的连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)、悬垂模块(例如多肽)、插入剂(例如吖啶、补骨脂素(psoralen)等)、螯合剂、烷化剂、和经修饰的连接(例如α异头(anomeric)核酸等)。还包括在其经由氢键键合和其它化学相互作用而结合指定序列的能力上模拟多核苷酸的合成分子。通常，核苷酸单体经由磷酸二酯键连接，尽管核酸的合成形式可以包含其它连接(例如肽核酸，如记载于Nielsen等(Science254:1497-1500,1991)中的)。核酸可以是或可以包含例如染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针、和引物。核酸可以是例如单链、双链、或三链的且不限于任何特定长度。除非另外指出，在任何明确指出的序列外，具体的核酸序列包含或编码互补序列。
一些最广泛使用的核酸分析方法，诸如例如PCR(参见例如PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications;Innis等编，Academic Press,San Diego,USA,1990)牵涉靶分子的扩增。
术语“扩增”一般指从靶核酸生成多个核酸分子，其中引物与靶核酸分子上的特定位点杂交以提供通过聚合酶进行延伸的起始位点。可以通过本领域中通常已知的任何方法来实施扩增，所述方法诸如但不限于：标准PCR、长PCR、热启动PCR、qPCR、RT-PCR和等温扩增。
引起扩增的酶倾向于受到复杂的生物学样品(诸如例如全血)中含有的多种物质的抑制。因此，如果核酸扩增由于抑制而失败并且如此例如没有检测到临床样品中的病原体，那么这可能对所讨论的患者引起严重的后果。这类“假阴性结果”可以引起患者没有接受针对未检出疾病的治疗，这在某些情况中可能是威胁生命的。
为了试图避免共分离可抑制生物学靶材料下游分析的杂质，现有技术已经采用了各种办法(诸如上文所提及的)，包括用含有例如离液剂、乙醇或去污剂如Triton X-100的清洗缓冲液清洗生物学靶材料所结合的固体支持物。
然而，这些物质自身都是已知的PCR抑制剂，并且对其它分析方法也是有害的。因此，在清洗缓冲液中具有这类物质能够自身抑制下游分析学，或者为了再次除去这些组分，其能够使进一步的清洗步骤成为强制的，如此使相应的分离过程更复杂且最可能地更昂贵。还有，每个额外的步骤延迟获得结果前的时间，这特别在体外诊断学领域中可以是一个至关重要的因素。
此外，一些起分析方法抑制剂作用的杂质不能通过如上文所描述的、现有技术中披露的措施有效地除去。在此背景中，特别地，全血由于其复杂的组成而构成了一项重大的挑战。
解决此问题的一种常见策略是减少生物学样品的输入量。这试图降低抑制性杂质的输入水平，这会降低其在分离过程的输出中的浓度。这具有也降低靶分析物浓度的不期望的后果，其可以不利地影响分析方法的检测限。
或者，可以通过将洗脱物稀释到一定浓度，从而使下游分析方法不受残留浓度的抑制剂影响来降低来自分离过程的液体产物中的抑制剂的影响。也可以经由在下游分析中使用的洗脱物的体积减少来得到此潜在的益处。这两种方法都降低下游分析中抑制剂的浓度，但是伴随着所研究的生物学靶材料的浓度降低。这能够负面影响下游分析的灵敏度。
熟练技术人员会领会用于在分离过程期间选择性除去抑制剂的方法的价值，其会容许使用增加体积的输入生物学样品或消除对稀释来自分离的洗脱物的需要。
用于减轻抑制的备选方法包括来自生物学材料的蛋白质性材料的絮凝。其它方法包括使用糖基化酶来降解可能起下游分析抑制剂作用的多糖。这些方法都意图解决可能起抑制剂作用的大分子。熟练技术人员会领会用于除去较宽分子大小范围的抑制剂的方法的价值。
依照本发明的方法有效地减少杂质的共分离。通过用包含阳离子胺的清洗缓冲液清洗固体支持物，在保留与固相结合的生物学靶材料的情况中除去可能干扰下游加工(诸如对分离的靶材料的分析)的杂质。
上文所描述的方法的优点之一是其有效除去某些抑制剂的能力，所述抑制剂对分析方法诸如核酸扩增如PCR是特别有害的。氯高铁血红素(血红蛋白的分解产物，包含其氧结合部分)在许多全血样品中是丰富的，因为其经常在例如贮存期间从裂解的红血球释放出来。氯高铁血红素对例如核酸所结合的固体支持物具有相当大的亲和力。因此，在分析来自全血样品的核酸时，氯高铁血红素与核酸的共分离是一个问题，尤其是因为它是分析技术如PCR的强抑制剂。
如表1中显示的，依照上文所描述的方法应用具有阳离子胺的清洗缓冲液使得本领域技术人员能够从固体支持物除去氯高铁血红素，从而改善用于下游分析的反应条件。
此外，上文所描述的方法适合于除去其它抑制性杂质诸如例如胆红素、腐殖酸、黑色素或胆汁盐。
还有，上文所描述的方法自身不干扰下游分析学。在图1中，显示了与使用没有阳离子胺的清洗缓冲液的方法相比，对通过上文所描述的方法从血液或血浆分离的核酸实施的PCR是显著改善的。
在本发明的上下文中，生物学靶材料的术语“分离”、“纯化”或“提取”指以下情况：可以在诊断测定法中（例如通过扩增）分析生物学靶材料（如例如核酸）前，通常必须从含有不同组分的复杂混合物的生物学样品中将它们纯化、分离或提取。合适的方法是本领域技术人员已知的。
通常，第一步骤之一包括通过例如使用酶和/或化学试剂来释放细胞或病毒颗粒的内容物。此过程通常称为裂解。为了富集裂解物中所讨论的分析物，一种可用于结合核酸的规程需要使核酸在离液盐溶液中选择性结合至结合颗粒(诸如例如磁性颗粒)的玻璃表面以及将核酸与污染物诸如琼脂糖、蛋白质或细胞碎片分开。在一些实施方案中，使用WO96/41811中描述的凝胶溶胶过程来形成颗粒的玻璃。
“生物学靶材料”或“生物学材料”在本发明的意义中包含所有种类的生物学分子，例如蛋白质或核酸，而且还包含自然界中存在的其它分子或者是其衍生物或合成的类似物或变体。此外，术语“生物学材料”包括病毒和真核和原核细胞。
“流体样品”是可以进行诊断测定法的任何流体材料，并且在一些实施方案中，自生物学来源衍生。流体样品可以进行移液，从而术语“流体样品”包括同质的或匀浆化的液体，而且还包含乳液、悬浮液，等等。在一些实施方案中，所述流体样品自人衍生，并且是体液。在本发明的一个实施方案中，所述流体样品是人血液或血浆、尿液、痰、汗液、生殖器或口腔或鼻拭样、可移液的粪、或脊髓液。在其它实施方案中，所述流体样品是人血液或血浆。
术语“固体支持物”包含任何适合于结合生物学靶材料的材料，例如有或者没有玻璃涂层的磁性颗粒、硅胶、玻璃纤维、玻璃纤维滤器、滤纸等，尽管固体支持物不限于这些材料。固体支持物可以以例如层析柱、容器中的结合膜、结合颗粒诸如例如珠等形式提供。
在上文所描述的方法的一些实施方案中，所述固体支持物包括核酸结合颗粒，在别的实施方案中一种或多种选自下组的材料：硅土、金属、金属氧化物、塑料、聚合物和捕捉寡核苷酸。在又一些实施方案中，所述固体支持物是磁性玻璃颗粒。
术语“容器”或“反应容器”包括但不限于管、或板诸如微孔、深孔或其它类型多孔板的孔，其中发生生物学靶材料在固体支持物上的固定化。这类容器的外部界限或壁是化学惰性的，使得它们不干扰之内发生的固定化。
“固定化”在本发明的上下文中意指捕捉对象诸如生物学靶材料。具体地，“在固体支持物上固定化”意指出于将其与任何周围介质分开的目的，使一种或多种对象与固体支持物结合，并且可以例如通过在后来的点时与固体支持材料分开来回收。在此上下文中，“固定化”可以例如包括将核酸吸附至玻璃或固体材料的其它合适的表面，如上文所描述的。此外，可以通过结合捕捉寡核苷酸来特异性“固定化”核酸，其中核酸通过碱基配对而结合附着于固体支持物的、基本上互补的核酸。在后一种情况中，这类特异性固定化导致靶核酸的优势结合。
“分离站”是分析系统中允许固体支持物自流体样品中存在的其它材料分离的一种装置或组件。这类分离站可以例如包括但不限于这些组件，离心机、过滤管架、磁体、或其它合适的组件。在一些实施方案中，分离站包含一个或多个磁体。在某些实施方案中，将一个或多个磁体用于分离磁性颗粒，诸如例如作为固体支持物的磁性玻璃颗粒。如果例如流体样品和固体支持材料在多孔板的孔中组合在一起，那么分离站包含的一个或多个磁体可以例如通过将磁体引入孔中来与流体样品自身接触，或者可以使所述一个或多个磁体靠近孔的外壁以吸引磁性颗粒，随后将它们与周围液体分开。
“清洗缓冲液”是设计为除去不期望的组分(尤其在纯化规程中)的流体。这类缓冲液是本领域中公知的。在纯化生物学靶材料的背景中，清洗缓冲液适合于清洗固体支持材料以将固定化的生物学靶材料与任何不想要的组分分开。如上文所描述的，在本发明的背景中使用的清洗缓冲液包含阳离子胺。清洗缓冲液可以例如在缓冲溶液中含有乙醇和/或离液剂。清洗缓冲液也可以是没有乙醇和/或离液剂的缓冲溶液，如上文所描述的。在一些实施方案中，清洗缓冲液具有酸性pH值。还在一些实施方案中，清洗缓冲液由缓冲水性溶液和阳离子胺组成。清洗溶液或其它溶液经常以储备溶液提供，所述储备溶液在使用前必须稀释。清洗缓冲液(在一些实施方案中其是水性缓冲液)包含缓冲物质。一般地，缓冲物质对于维持溶液中某个pH值或pH范围是重要的。这是大多数生物学系统的先决条件，并且通常对于体外反应也是期望的。可用于本发明的背景中的缓冲物质是柠檬酸盐缓冲液诸如柠檬酸钠盐，而且还有Tris(三-(羟甲基)-氨基甲烷)缓冲液诸如Tris HCl、磷酸盐、N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、乙酸盐缓冲液，而且也可以在本发明上下文中使用其它缓冲物质。
依照本发明的方法中的清洗需要将固体支持物及其上固定化的生物学靶材料与清洗缓冲液进行程度不同的强烈接触。不同方法有可能实现这点，例如将层析柱与清洗缓冲液一起温育，或在结合颗粒诸如例如珠的情况中，在相应的一个或多个容器中或与相应的一个或多个容器一起摇动清洗缓冲液及固体支持物。另一种有利的方法是将包含清洗缓冲液和固体支持物的悬浮液抽吸并分配一次或多次。在一些实施方案中，使用移液管实施此方法，其中移液管在一些实施方案中包含抽吸所述悬浮液并将其再次分配的一次性移液管尖端。
“阳离子胺”在本发明的背景中意指包含至少一个带正电荷的氮原子的化合物。所述正电荷可以由于例如氨或伯胺、仲胺或叔胺的质子化，或由于胺的烷基化以形成季铵离子所致。在本发明的一些实施方案中，将所述阳离子胺作为盐，在某些实施方案中作为乙酸、氢氯酸或柠檬酸的盐添加至清洗缓冲液。
在一些实施方案中，所述正电荷依赖于周围介质的适当pH值。本领域技术人员熟悉以适当的方式调节pH值以维持阳离子胺的正电荷的措施。
上文所提及的pH依赖性的正电荷是水性溶液中质子化的结果。更具体地，如本发明的背景中使用的阳离子胺可以经由其至少一个氮原子的质子化而获得其正电荷。本领域技术人员知道如下的情况，即这类质子化是依赖于pH值的平衡函数，如上文所描述的。因此，在本发明的背景中，为了实现期望的技术效果不需要清洗缓冲液中所有胺分子都是质子化的。
在其它实施方案中，诸如在季胺的情况中，所述正电荷实际上不依赖于周围介质的pH值。
本发明的一个方面是上文所描述的方法，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
Figure BDA00003001886600081
式I
其中R1和R2可以彼此独立地是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
Figure BDA00003001886600082
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基。术语“烷基”指1至12个碳原子的单价线性的或分支的饱和碳氢化合物基团。在具体的实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，且在更具体的实施方案中1至4个碳原子。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、或叔丁基。
术语“芳基”指包含6至10个碳环原子的单价芳香族碳环单或双环环系统。芳基模块的例子包括苯基和萘基。
术语“环烷基”指3至10个环碳原子的单价的、饱和的、单环或双环碳氢化合物基团。在具体的实施方案中，环烷基指3至8个环碳原子的单价的、饱和的、单环碳氢化合物基团。双环意味着由共有一个或多个碳原子的两个饱和碳环组成。具体的环烷基是单环的。单环环烷基的例子是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。双环环烷基的例子是双环[2.2.1]庚烷基(heptanyl)或双环[2.2.2]辛烷基(octanyl)。
术语“杂芳基”指5至12个环原子的单价的、芳香族杂环单或双环环系统，包含选自N、O和S的1、2、3或4个杂原子，剩余的环原子是碳。杂芳基模块的例子包括吡咯基(pyrrolyl)、呋喃基(furanyl)、噻吩基(thienyl)、咪唑基(imidazolyl)、
Figure BDA00003001886600093
唑基(oxazolyl)、噻唑基(thiazolyl)、三唑基(triazolyl)、
Figure BDA00003001886600094
二唑基(oxadiazolyl)、噻二唑基(thiadiazolyl)、四唑基(tetrazolyl)、吡啶基(pyridinyl)、吡嗪基(pyrazinyl)、吡唑基(pyrazolyl)、哒嗪基(pyridazinyl)、嘧啶基(pyrimidinyl)、三嗪基(triazinyl)、氮杂
Figure BDA00003001886600091
基(azepinyl)、二氮杂
Figure BDA00003001886600092
基(diazepinyl)、异
Figure BDA00003001886600095
唑基(isoxazolyl)、苯并呋喃基(benzofuranyl)、异噻唑基(isothiazolyl)、苯并噻吩基(benzothienyl)、吲哚基(indolyl)、异吲哚基(isoindolyl)、异苯并呋喃基(isobenzofuranyl)、苯并咪唑基(benzimidazolyl)、苯并
Figure BDA00003001886600096
唑基(benzoxazolyl)、苯并异
Figure BDA00003001886600097
唑基(benzoisoxazolyl)、苯并噻唑基(benzothiazolyl)、苯并异噻唑基(benzoisothiazolyl)、苯并
Figure BDA00003001886600098
二唑基(benzooxadiazolyl)、苯并噻二唑基(benzothiadiazolyl)、苯并三唑基(benzotriazolyl)、嘌呤基(purinyl)、喹啉基(quinolinyl)、异喹啉基(isoquinolinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、或喹
Figure BDA00003001886600099
啉基(quinoxalinyl)。
在一些实施方案中，所述阳离子胺选自下组：腐胺、乙二胺、尸胺、亚精胺、精胺、亚丙基二胺(trimethylene diamine)、和铵。
在所描述的方法的一些实施方案中，所述阳离子胺是烷撑二胺。
“烷撑二胺”是用两个氨基基团取代的如上文所规定的“烷基”化合物。在一些实施方案中，所述氨基基团位于线性碳氢化合物链的各端。在本发明的背景中，烷撑二胺可以携带例如如由式I和II表征的取代基，或者它可以是未取代的。
未取代的烷撑二胺赋予的优点是，两个处于其质子化形式的末端氨基基团在空间上良好定位，从而与不期望的杂质(如例如氯高铁血红素)的带负电荷模块相互作用。
在一些实施方案中，烷撑二胺选自下组：乙二胺、腐胺和尸胺。
在烷撑二胺中，这些化合物在用于上文所描述的方法中时显示特别好的结果。它们在除去抑制性杂质中是有效的，并且不干扰下游分析。
如上文所提及的，生物学靶材料经常以将其进行分析方法为目的分离。
因此，本发明的一个方面是上文所描述的方法，其进一步包括步骤：
e.分析分离的生物学靶材料。
这类分析可以包括例如核酸分析学如PCR(包括实时PCR)或测序方法，或者蛋白质分析学诸如例如基于抗体的测定法如ELISA或其它方法。分析学还可以包括用于检测分离的生物学材料的方法，诸如例如基于化学发光或电致发光的技术、射线照相术或其它检测方法。在一些实施方案中，通过扩增(在一些实施方案中通过PCR，在别的实施方案中通过实时PCR)来分析分离的生物学靶材料。
上文所描述的方法在核酸分离及可能的后续分析(例如通过PCR)的背景中是特别有用的。
因此，本发明的一个方面是上文所描述的方法，其中所述生物学靶材料是核酸。
本发明的另一个方面是包含阳离子胺的清洗缓冲液用于从生物学靶材料所结合的固体支持物选择性除去所述生物学靶材料的分析的抑制剂的用途。
在本发明的背景中，“选择性除去”意指从对象中除去大部分的不期望的化合物，而其它化合物在很大程度上仍保持与该对象结合。更具体地，其意味着从生物学靶材料所结合的固体支持物除去所述生物学靶材料的下游分析的大部分抑制剂，其中所述生物学靶材料结合至所述固体支持物。本领域技术人员清楚的是，所述选择性通常不是定量的，即少部分靶材料可以与大部分不期望的杂质一起自固体支持物除去。
清洗缓冲液中的阳离子胺用于从固体支持物除去杂质的用途在从流体样品分离核酸时是特别有利的。
因此，本发明的另一个方面是上文所描述的用途，其中所述生物学靶材料是核酸，且下游分析包括核酸扩增或由核酸扩增组成。
如上文所列的，牵涉核酸扩增诸如例如PCR的分析方法经常对自含有生物学材料的流体样品衍生的杂质产生的抑制非常敏感，从而使得上文所描述的方法和用途在此背景中特别有用。
在可能的流体样品中，全血是特别复杂的基质。由于例如氯高铁血红素在全血中是丰富的，上文所描述的方法和用途在此背景中特别有用。
因此，本发明的一个方面是上文所描述的方法或用途，其中所述流体样品是全血。
与上文进一步描述的方法类似，本发明的一个方面是上文所描述的用途，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
Figure BDA00003001886600111
式I
其中R1和R2可以彼此独立地是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
Figure BDA00003001886600112
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基。
本发明的另一个方面是用于从流体样品分离生物学靶材料的试剂盒，所述试剂盒包含下列组分：
·结合缓冲液
·固体支持物
·包含阳离子胺的清洗缓冲液
·任选地，洗脱缓冲液，
其中所述结合缓冲液和所述清洗缓冲液是装在不同容器中的不同缓冲液。
与上文进一步描述的方法和用途类似，本发明的一个方面是上文所描述的试剂盒，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
Figure BDA00003001886600121
式I
其中R1和R2可以彼此独立地是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
Figure BDA00003001886600122
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基。
本发明的另一个方面是上文所描述的试剂盒，其中
·所述结合缓冲液包含离液剂，和/或
·所述固体支持物包含硅土和/或磁性材料，和/或
·所述包含阳离子胺的清洗缓冲液具有7以下的pH值，和/或
·所述洗脱缓冲液是水性的和/或包含防腐剂。
在上文中已经定义并描述了固体支持物和包含阳离子胺的清洗缓冲液。
“结合缓冲液”是促进生物学靶材料结合至固体支持物的液体介质。在一些实施方案中，所述结合缓冲液还充当裂解缓冲液以破坏细胞或病毒颗粒，由此释放出所述生物学靶材料。
离液剂(其通常扰乱溶液中水分子的有序结构以及分子之中和之间的非共价结合力)可以对样品制备规程做出数种贡献。具体但不仅仅，它们可以通过扰乱核酸酶三级结构作为RNA酶抑制剂应用。通常，当生物学靶材料是核酸时，不再必须对裂解缓冲液应用RNA酶抑制剂。此外，离液剂促成对生物膜，诸如质膜或细胞器膜(若存在的话)的破坏。还有，它们可以在核酸对表面如玻璃的粘着结合中起重要的作用。在本发明上下文中有用的离液剂是例如胍盐如硫氰酸胍或盐酸胍或氯化胍或异硫氰酸胍、尿素、过氯酸盐诸如例如过氯酸钾、其它硫氰酸盐或碘化钾。
在结合缓冲液中使用醇对于例如核酸制备也可以是有利的，如本领域技术人员已知的。在本发明上下文中有用的是例如聚多卡醇(polidocanol)，尽管其它醇也可以使用。聚多卡醇用于制备核酸的用途已经例如记载于EP1932913中。
还原剂也可以促成不期望的组分诸如例如降解酶的变性。具体地，如本领域中公知的还原剂切割对于许多蛋白质的三级结构特别重要的分子间和分子内二硫键。在本发明上下文中有用的是还原剂诸如例如二硫苏糖醇(DTT)，但是也可以采用本领域中已知的其它还原剂诸如例如2-巯基乙醇。
在本发明的上下文中，“洗脱缓冲液”是适合于将生物学靶材料与固体支持物分开的液体。这类液体可以是例如蒸馏水或水性盐溶液，诸如例如Tris缓冲液如Tris HCl、或HEPES、或熟练技术人员已知的其它合适的缓冲液。优选地，这类洗脱缓冲液的pH值是碱性或中性的。洗脱缓冲液可以进一步含有别的组分诸如防腐剂，如例如螯合剂如EDTA，其通过使降解酶失活来稳定化分离的生物学靶材料，诸如例如核酸。
如在上文所描述的方法和用途的背景中提及的，在上文所描述的试剂盒的一些实施方案中，所述生物学靶材料是核酸。还在上文所描述的试剂盒的一些实施方案中，所述流体样品是全血。
附图简述
图1：全过程对照(FPC)和抑制对照(IC)的PCR增长曲线。分别使用含有腐胺的清洗缓冲液或没有阳离子胺的参照清洗缓冲液从全血中回收FPC，将IC直接掺入PCR主混合物(mastermix)中。
图2：在不同取样装置情况中作为加工体积函数的抑制性粪容许量(tolerance)。
附图详述
图1显示了全过程对照(FPC)和抑制对照(IC)的不同PCR增长曲线。分别使用含有浓度22mM的二盐酸腐胺的清洗缓冲液或参照清洗缓冲液(后者没有阳离子胺，但是其它方面是相同配制的)从全血回收FPC。将IC直接掺入PCR主混合物中。
图1A：使用具有腐胺的清洗缓冲液(实线)和没有阳离子胺的参照清洗缓冲液(虚线)回收的DNA全过程对照(FPC)的PCR增长曲线。该曲线清楚地显示了使用含有胺的清洗缓冲液得到的改善结果，表明样品制备期间的DNA回收显著改善。
图1B：在样品制备中使用具有腐胺的清洗缓冲液(实线)和没有阳离子胺的参照清洗缓冲液(虚线)后掺入PCR主混合物中的DNA抑制对照(IC)的PCR增长曲线。该结果显示了PCR性能在这两种情况中是相当的。
图1C：使用具有腐胺的清洗缓冲液(实线)和没有阳离子胺的参照清洗缓冲液(虚线)回收的RNA全过程对照(FPC)的PCR增长曲线。该曲线清楚地显示了用含有胺的清洗缓冲液得到的改善结果，表明样品制备期间的RNA回收显著改善。
图1D：在样品制备中使用具有腐胺的清洗缓冲液(实线)和没有阳离子胺的参照清洗缓冲液(虚线)后掺入PCR主混合物中的RNA抑制对照(IC)的PCR增长曲线。该结果显示了PCR性能在这两种情况中是相当的。
图2：在不同取样装置情况中作为加工体积函数的抑制性粪容许量。凭借清洗缓冲液中的腐胺，抑制性粪容许量随可接受的荧光信号(RFI)和Ct值而升高。
实施例
实施例1：
胺化合物用于选择性制备生物学样品的测试
实验设计
为了获得实验样品制备过程效率的准确测量，设计了一种同时扩增并检测2种合成靶物的方法。将这些靶物在过程中的不同点时引入到样品制备/扩增/检测工作流中，其中将全过程对照(FPC)引入样品基质中，并将抑制对照(IC)引入PCR主混合物中。FPC的检测受到经由样品制备过程回收此靶物的效率影响，该影响与PCR抑制剂对此靶物扩增及检测的影响复合。IC不经历样品制备过程，因此此材料的扩增和检测仅受到PCR抑制存在影响。这样，能够评估改变样品制备过程要素(例如核酸类型、样品基质、过程和试剂组合)对核酸回收的影响，并且与PCR抑制效应区分。2种靶物应当以类似的效率扩增并检测，并且它们应当以基本上相同的程度受到抑制剂影响，从而使此实验设计有效。
从诊断角度来讲，核酸的DNA和RNA形式两者都适用于研究。因此，以这两种形式构建用于此实验框架的合成靶物是有利的。为了标准化不同靶物扩增效率的变化，扩增子的核酸序列对于每种靶物的这两种形式都应该是相同的。然而，由于它们在不同条件下引入过程中，它们确实需要以不同形式配置。可以以2种形式(即以质粒DNA或以包囊的噬菌体λDNA构建体)将DNA FPC引入样品基质中。例如，此后者比质粒更接近地模拟蛋白质包被的DNA病毒颗粒。噬菌体λ颗粒需要裂解以释放出适合于在硅土表面上捕捉的包囊DNA。此DNA靶物的相应IC在形式上也应该是DNA，但是由于这是在裂解后引入的，这应当为质粒形式。类似地，对于RNA，FPC优选为装甲的RNA构建体，而IC是RNA转录物。
为了获得对自任何样品制备过程衍生的洗脱物的更完全的分析，合理的是化学分析洗脱物，以测量由所研究的过程变化引起的洗脱物化学组成的任何变化。开发出鉴定及定量PCR过程的特定抑制剂的特定方法。从复杂的样品标本分离核酸能够产生如下的洗脱物，其中PCR性能由于与期望的核酸一起共纯化可能的PCR抑制剂而非常差。观察到通过用标准的样品制备试剂来加工全血，能够获得微红的洗脱物，这提示存在含有铁的分子诸如血红蛋白或氯高铁血红素。建立检测及量化这类抑制剂的分析方法是重要的。已知的PCR抑制剂的其它例子(诸如胆红素、腐殖酸或黑色素(如会从黑素瘤组织样品获得的))是洗脱物分析的候选物，并且开发出适合这些的分析方法。
执行两种实验方法来评估从样品制备工作流除去抑制剂。为了对潜在的清洗缓冲液筛选其除去抑制剂的能力，设计了模型系统，其中向人血浆添加已知的抑制剂，并在样品制备工作流的评估中使用此掺入的血浆。这样，与数种不同的已知抑制剂一起，能够检查清洗缓冲液的许多组合。第二类实验使用全血作为样品输入。使用此实验来验证经由上述筛选过程发现的候选清洗缓冲液的性能。
实验设置
样品在改良Hamilton STAR仪上进行全自动化样品制备，随后在LightCycler480(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim/DE)上进行扩增/检测。对于所测试的所有样品基质，850μL标本过程体积是恒定的。执行850μLEDTA血浆和血清标本输入体积。将150μL(另为100μL)新鲜全血标本(另为尸体标本)输入体积用700μL(另为750μL)标本稀释剂稀释以达到总过程体积850μL。
样品制备
样品在改良Hamilton STAR仪上进行全自动化样品制备(比较WO2012/013733)。可以以4个主要步骤描述样品制备的原理：
·样品装配
·裂解和结合
·清洗
·洗脱
下列章节更为详细地描述了单一步骤。
样品制备的顺序
样品装配步骤
若需要的话，将待测试的生物学样品(体积取决于样品基质)用标本稀释剂稀释以达到最终过程体积850μL。添加总体积50μL FPC试剂，接着是50μL蛋白酶试剂。向此混合物添加100μL磁性玻璃颗粒(MGP)试剂(比较WO96/41811；磁性色素)。
裂解/结合步骤
向装配的样品添加1250μL裂解缓冲液，并于40°C以恒定的混合实施裂解结合反应达10分钟，从而允许细胞裂解以及核酸与磁性玻璃颗粒的结合。施加磁场以允许MGP结合的核酸从周围液体的磁性分离。除去MGP周围的裂解溶液，并解除磁场。
清洗步骤
在起始的清洗步骤中，添加总体积900μL清洗缓冲液，接着混合。再添加体积1500μL清洗缓冲液，接着混合。施加磁场以容许MGP结合的核酸与周围液体的磁性分开。除去清洗溶液，并解除磁场。在第二清洗步骤中，添加总体积2000μL，接着混合。施加磁场以容许MGP结合的核酸与周围液体的磁性分开。除去清洗溶液，并解除磁场。
洗脱步骤
添加总体积50μL洗脱缓冲液，并重复于80°C混合6分钟从MGP洗脱核酸。使用终体积25μL洗脱物进行PCR装配。
样品制备的试剂
Figure BDA00003001886600171
Figure BDA00003001886600172
Figure BDA00003001886600173
Figure BDA00003001886600181
Figure BDA00003001886600182
Figure BDA00003001886600183
清洗缓冲液的其它例子
在上文所描述的(最佳模式)含有腐胺的清洗缓冲液外，在本文中描述的样品制备规程中已经成功应用数种含有胺的清洗缓冲液(数据未显示)。腐胺可以由下列胺替换：
Figure BDA00003001886600184
PCR测定法
PCR装配
将总体积25μL洗脱物转移至96微孔板。如下装配50μL的PCR反应体积：
Figure BDA00003001886600191
Figure BDA00003001886600192
Figure BDA00003001886600193
Figure BDA00003001886600201
扩增和检测
对于扩增和检测，将微孔板手动密封，并转移至LightCycler480。使用以下PCR概况：
Figure BDA00003001886600202
合成的靶物
合成的靶物(FPC和IC)由线性化的质粒DNA颗粒或RNA转录物组成。每个反应以预定的拷贝数使用核酸颗粒。
这些靶物的一般设计概念由常见核酸序列组成，所述常见核酸序列会是RNA或DNA，并且本身会在称作装甲RNA(MS2噬菌体外壳蛋白颗粒)或装甲DNA(λ噬菌体颗粒)的颗粒中装甲。每种靶物会具有要在所有测定法中使用的相应组的特异性引物和经差异荧光标记的TaqMan探针，如此消除对样品制备效率评估的靶物类型依赖性影响。为此，使用NCBI Blast程序和EMBOSSshuffleseq(欧洲分子生物学开放软件包(European Molecular Biology OpenSoftware Suite))设计每种靶物以及其相应的引物和探针以生成独特的序列。用CY5标记FPC探针，并用HEX染料标记IC探针。设计并克隆构建体以用于进一步的评估。为了生成装甲RNA，将序列克隆到载体pCP-1中。为了生成转录物，将序列克隆到pSP64a中。为了生成装甲DNA，将序列克隆到λGT11中。
Figure BDA00003001886600211
DNA：线性化质粒
使用多聚(A)克隆载体pSP64a(Promega)构建重组质粒，其用限制酶EcoRI线性化。
重组质粒pEF054的感兴趣区域(FPC)
用限制酶EcoRI线性化的重组质粒pEF054的感兴趣序列、多聚(A)克隆载体pSP64a中(bp270后)的IC对应于SEQ ID NO.7。
重组质粒pEF066(IC)
用限制酶EcoRI线性化的重组质粒pEF066的感兴趣序列、多聚(A)克隆载体pSP64a中(bp503后)的IC对应于SEQ ID NO.8。
洗脱物化学分析(ISS)
在筛选不同清洗缓冲液的实验期间，开发出一种监测抑制剂除去效率的方式。在用先前描述的样品制备过程获得的洗脱物中分析候选PCR抑制剂。使用这些特定抑制剂的除去来监测清洗缓冲液的效率。通过以相应化合物的不同浓度将它们直接掺入PCR中并观察PCR应答来评估其PCR抑制特性。对于加工全血的实验，氯高铁血红素是选出的抑制剂。为了测试清洗缓冲液中添加的胺是否可以与其它困难的样品标本一起使用，通过在样品制备过程中向人血浆添加黑色素、胆汁盐和腐殖酸来模拟这些后一种。开发出分析方法来实现洗脱物中特定化合物的相对定量。
氯高铁血红素检测(ISS)
在与Agilent PDA检测器偶联的Agilent1100液体层析装置上于20°C实施氯高铁血红素的基于HPLC的检测。使用介于200和800nm之间的3D吸收光谱集来实施测量，并且通过在λ=254和400nm两者处的单波检测给出输出。将洗脱物样品于25°C以4000rpm离心3分钟，并使用上清液进行分析。注射30μL洗脱物样品，并在5μm
Figure BDA00003001886600212
4.1x100mm Hamilton PRP-1聚合HPLC柱上分开。所有流动相都由Sigma Aldrich提供的HPLC级化合物制备。向Milli-Q过滤水添加CF3COOH(0.1%v/v)来制备流动相(A)。添加此物质以抑制肽电离。流动相(B)是层析级乙腈。以恒定流动模式操作HPLC分析，并将流速保持为1mL/分钟。层析分析的结果由Agilent Chemstation Modular3D软件处理，并且在使用含有腐胺作为阳离子胺的清洗缓冲液时如下：
表1：在用和不用腐胺生成的洗脱物中17.7分钟时的氯高铁血红素峰的面积
分离期间使用的梯度是：
Figure BDA00003001886600222
通过对氯高铁血红素(BioXtra，猪的，≥98.0%(HPLC)Sigma Aldrich,MatNr51280)的真实样品的HPLC分析(其给出相同的HPLC保留时间和UV吸收光谱)确认来自全血洗脱物的氯高铁血红素化合物的身份。
胆红素检测(ISS)
如上文所描述的，在HPLC系统上实施对胆红素的检测。
分离期间使用的梯度是：
Figure BDA00003001886600223
Figure BDA00003001886600231
使用商品化的胆红素(≥98.0%Sigma Aldrich,Mat Nr B4126)来实施胆红素化合物的鉴定。结果与氯高铁血红素检测获得的结果是相当的。
黑色素检测(ISS)
使用多孔板阅读器(Tecan Infinity500)通过λ=562nm处的吸光度测量来检测黑色素。
对于黑色素的定量，建立应答的线性(R2=0.9998)。使用溶解于洗脱缓冲液(5mM Tris缓冲液,0.2%(w/v)对羟基苯甲酸甲酯,pH8.5)中的商品化合成黑色素(Sigma Aldrich,Mat Nr M8631)，并使用用0ppm黑色素生成的洗脱物作为空白样品(100μL)，来测量在7.8和500ppm之间的黑色素溶液的吸光度。结果与氯高铁血红素检测获得的结果是相当的。使用下列参数进行分析：
实施例2：
含有腐胺的清洗缓冲液用于制备粪样品的测试
在本文中描述的用靶向艰难梭菌(Clostridium difficile)的测定法的一系列实验中，显示了可以通过在第一步中用于清洗磁性玻璃颗粒(MGP)的清洗缓冲液中引入腐胺来降低由样品材料(粪)中含有的固有抑制剂所致的PCR抑制。在使用含有腐胺的清洗缓冲液的情况中容许较高的粪输入体积，导致改善的测定法灵敏度。
实验设置
除非另有指示，仪器和工作流如实施例1所描述的。如上文，将MGP清洗两次，期间在第一次清洗步骤中采用含有腐胺的清洗缓冲液。
1)在可变的样品输入体积的情况中的抑制性粪容许量
方法
在研究中使用合并的艰难梭菌阳性(通过商品化的Cepheid
Figure BDA00003001886600233
艰难梭菌/Epi测定法测定)抑制性粪样品。使用两种粪取样装置(接种环和植绒拭子(flocked swab))将粪转移入
Figure BDA00003001886600241
PCR介质(Roche Diagnostics,产品目录编号06466281190)中。当使用10μL接种环作为粪转移装置时，使用粪悬浮液的最大允许输入体积(400μL)以补偿非常少量的初始标本。当使用转移大得多的初始标本量的植绒拭子时，评估多个体积的粪悬浮液以找到容许量上限。表2显示了在本研究中测试的条件。在测试的每份样品中包含内部对照(IC)。
表2：用于抑制性粪容许量的实验设计，N=8
Figure BDA00003001886600242
结果
在图2中汇总了来自此研究的结果。当使用植绒拭子来进行粪取样时，大多数重复在清洗缓冲液中没有腐胺的情况下在150μL输入没有显示荧光信号，这指示抑制。凭借腐胺，抑制性粪容许量升高，在多达200μL粪悬浮液输入的情况中观察到可接受的荧光信号和Ct值。当使用接种环进行粪转移时(400μL粪悬浮液输入体积)，信号在清洗缓冲液中没有腐胺的情况下受到完全抑制。通过向清洗缓冲液添加腐胺消除了抑制。
结论
MGP清洗缓冲液中的腐胺允许较高的粪输入，因此潜在地提高测定法灵敏度。
靶物信号和抑制程度之间的最佳平衡似乎在使用植绒拭子作为粪转移装置时用150μL粪悬浮液输入用含有腐胺的清洗缓冲液达到(参见图2)。
2)在可变的样品输入体积的情况中的分析灵敏度比较
方法
用如表3中所描述的粪取样装置和粪悬浮液加工体积的四种组合评估上文所提及的测定法的分析灵敏度。将艰难梭菌阳性(通过商品化的Cepheid
Figure BDA00003001886600251
艰难梭菌/Epi测定法测定)标本以7个水平连续稀释入非抑制性阴性标本的集合中。对每种条件以24个重复测试每个稀释水平。使用Probit分析来测定检测限(LoD)。
表3：测定法分析灵敏度测试的条件
取样装置 加工体积(μL) 清洗缓冲液中的腐胺
接种环 400 否
接种环 400 是
植绒拭子 75 否
植绒拭子 150 是
结果
在表4中汇总了来自此研究的结果。来自研究1的用于容许抑制的最佳条件(植绒拭子粪取样及150μL输入和清洗缓冲液中的腐胺，参见上文)也显示最佳的灵敏度。
表4：在不同条件下的分析灵敏度比较
Figure BDA00003001886600252
*：对于此比较，将最低可检测水平设为1.0
结论
来自此研究的结果确认通过腐胺从粪标本除去抑制剂允许较多的粪输入，因此提高测定法灵敏度。
3)与Cepheid
Figure BDA00003001886600253
艰难梭菌/Epi测定法、产毒性和参照艰难梭菌培养物的 比较
方法
在美国的健康护理机构收集临床标本。使用上文所提及的测试来测试标本，并将结果与Cepheid
Figure BDA00003001886600261
艰难梭菌/Epi测定法和参照培养物结果进行比较。对于艰难梭菌测定法，对每份粪标本测试4种条件(参见表5)。利用聚酯拭子作为粪转移装置。
表5：使用个体临床粪标本测试的条件
取样装置 加工体积(μL) 清洗缓冲液中的腐胺
植绒拭子 75 否
植绒拭子 150 是
聚酯拭子 75 否
聚酯拭子 150 是
结果
在表6和表7中汇总了结果。表6显示了与Cepheid
Figure BDA00003001886600262
艰难梭菌/Epi测定法的性能比较，而表7显示了与参照培养物(产毒性艰难梭菌的直接和富集的菌落分离的组合)的性能比较。以“CDiff无效”显示的结果指示抑制。与Cepheid
Figure BDA00003001886600263
艰难梭菌/Epi测定法的阳性百分比一致性和使用参照艰难梭菌培养物作为标准品时的灵敏度随着粪悬浮液体积的增加和含有腐胺的清洗缓冲液的使用而略微改善。
表6：与Cepheid
Figure BDA00003001886600264
艰难梭菌/Epi测定法相比的测试性能
Figure BDA00003001886600265
Figure BDA00003001886600271
表7：与艰难梭菌参照培养物相比的测试性能
Figure BDA00003001886600272
汇总
来自这些研究的数据证明了含有腐胺的清洗缓冲液降低PCR抑制并提高分析灵敏度。
Figure IDA00003001887300011
Figure IDA00003001887300021
Figure IDA00003001887300041
Figure IDA00003001887300051

Claims (14)

1.一种用于从流体样品分离生物学靶材料的方法，所述方法包括下列步骤：
a.在反应容器中将固体支持物和所述流体样品在一定条件下组合在一起达一段时间，该条件和时间段足以允许所述生物学靶材料在所述固体支持物上固定化，
b.在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述流体样品中的其它材料分离，
c.通过将所述流体样品与所述固体支持材料分开来纯化所述生物学材料，
d.用包含阳离子胺的清洗缓冲液将所述固体支持材料清洗一次或多次。
2.权利要求1的方法，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
Figure FDA00003001886500011
式I
其中所述R1和R2可以彼此独立地是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或自由电子对，在该情况中相邻的氮没有电荷。
3.权利要求2的方法，其中所述阳离子胺是烷撑二胺。
4.权利要求3的方法，其中所述烷撑二胺是未取代的。
5.权利要求4的方法，其中所述阳离子胺选自下组：乙二胺、腐胺和尸胺。
6.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括步骤
e.分析分离的生物学靶材料。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物学靶材料是核酸。
8.包含阳离子胺的清洗缓冲液用于从生物学靶材料所结合的固体支持物选择性除去所述生物学靶材料的分析的抑制剂的用途。
9.权利要求8的用途，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
式I
其中R1和R2可以彼此独立地是氢或烷基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
Figure FDA00003001886500022
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基。
10.依照权利要求8至9中任一项的用途，其中所述生物学靶材料是核酸，且下游分析包括核酸扩增或由核酸扩增组成。
11.一种用于从流体样品分离生物学靶材料的试剂盒，所述试剂盒包含下列组分：
·结合缓冲液
·固体支持物
·包含阳离子胺的清洗缓冲液
·任选地，洗脱缓冲液，
其中所述结合缓冲液和所述清洗缓冲液是装在不同容器中的不同缓冲液。
12.依照权利要求11的试剂盒，其中所述阳离子胺是通式I的伯、仲、叔或季胺，
Figure FDA00003001886500031
式I
其中R1和R2可以彼此独立地是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R3可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
x是1至12的整数，
R4可以是氢或依照通式II的残基
Figure FDA00003001886500032
式II
其中R5可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基，
R6可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基、或–(CH2)3-NH2、或–(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，且
R7可以是氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基残基。
13.权利要求11至12中任一项的试剂盒，其中
·所述结合缓冲液包含离液剂，和/或
·所述固体支持物包含硅土和/或磁性材料，和/或
·所述包含阳离子胺的清洗缓冲液具有7以下的pH值，和/或
·所述洗脱缓冲液是水性的和/或包含防腐剂。
14.前述权利要求中任一项的方法、用途或试剂盒，其中所述流体样品是全血或血浆。
CN201310112256.7A 2012-04-05 2013-04-02 用于选择性制备生物学样品的胺化合物 Active CN103361337B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12163497 2012-04-05
EP12163497.6 2012-04-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103361337A true CN103361337A (zh) 2013-10-23
CN103361337B CN103361337B (zh) 2017-12-29

Family

ID=47915136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310112256.7A Active CN103361337B (zh) 2012-04-05 2013-04-02 用于选择性制备生物学样品的胺化合物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9371524B2 (zh)
EP (1) EP2647709B1 (zh)
JP (1) JP6121780B2 (zh)
CN (1) CN103361337B (zh)
CA (1) CA2811435C (zh)
ES (1) ES2567091T3 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406824A (zh) * 2015-03-24 2017-11-28 3M创新有限公司 纯化生物组合物的方法及用于其的制品

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106461682B (zh) 2014-05-06 2018-09-21 德赛诊断系统有限公司 HbA1c的酶促测定
US10319502B2 (en) 2014-10-23 2019-06-11 Corning Incorporated Polymer-encapsulated magnetic nanoparticles
US10661250B2 (en) 2018-04-13 2020-05-26 Agilent Technologies, Inc. Synthetic silica as packing material in supported liquid extraction

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3615545B2 (ja) * 1993-02-01 2005-02-02 キアゲン・エヌ・ブイ 第四級アンモニウム塩界面活性剤及びそのｒｎａの単離剤
US5429746A (en) * 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
EP1003556B1 (en) * 1996-11-04 2006-03-01 Qiagen GmbH Cationic reagents for transfection
ES2335365T3 (es) * 1996-11-27 2010-03-25 Genentech, Inc. Purificacion por afinidad de polipeptido en una matriz de proteina a.
US7683035B1 (en) * 1999-02-23 2010-03-23 Qiagen, Gmbh Method of stabilizing and/or isolating nucleic acids
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
US20040180445A1 (en) * 2003-03-12 2004-09-16 Domanico Michael J. Methods and compositions for purification of nucleic acid from a host cell
US8158354B2 (en) * 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7964343B2 (en) * 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
US20080026374A1 (en) * 2006-07-31 2008-01-31 Sigma Aldrich Co. Compositions and Methods for Isolation of Biological Molecules
EP1925940A1 (en) * 2006-11-23 2008-05-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Circulating ve-cadherin as a predictive marker of sensitivity or resistance to anti-tumoral treatment, and improved method for the detection of soluble proteins
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
JP5253953B2 (ja) * 2008-09-30 2013-07-31 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸抽出効率向上剤、核酸抽出法及び核酸抽出装置
CN101481400B (zh) * 2009-01-07 2010-12-08 戴立忠 从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法及专用磁性分离器
CN101665785B (zh) 2009-09-24 2011-02-16 戴立忠 一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法
WO2012013733A1 (en) 2010-07-29 2012-02-02 F. Hoffmann - La Roche Ag Generic sample preparation

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406824A (zh) * 2015-03-24 2017-11-28 3M创新有限公司 纯化生物组合物的方法及用于其的制品
CN107406824B (zh) * 2015-03-24 2021-02-05 3M创新有限公司 纯化生物组合物的方法及用于其的制品

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013215190A (ja) 2013-10-24
US20130266951A1 (en) 2013-10-10
JP6121780B2 (ja) 2017-04-26
CA2811435A1 (en) 2013-10-05
CA2811435C (en) 2018-08-28
CN103361337B (zh) 2017-12-29
US9371524B2 (en) 2016-06-21
EP2647709A1 (en) 2013-10-09
ES2567091T3 (es) 2016-04-19
EP2647709B1 (en) 2016-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7408229B2 (ja) ポリヌクレオチド捕捉材料およびその使用方法
EP2859121B1 (en) Aptamer-based multiplexed assays
CA2895945C (en) Target capture system
US7374881B2 (en) Method for collecting and using nuclear mRNA
CN103361337A (zh) 用于选择性制备生物学样品的胺化合物
CN108138244A (zh) 病毒组捕获测序平台、设计和构建方法以及使用方法
CN107109698A (zh) Rna stitch测序：用于直接映射细胞中rna:rna相互作用的测定
US20130231261A1 (en) Rnase h-based rna profiling
AU2020202825B2 (en) Polynucleotide capture materials, and methods of using same
AU2023282224A1 (en) Polynucleotide capture materials, and methods of using same
JP2023020580A (ja) 標的核酸の検出方法及び核酸－プローブーキャリア複合体
CN103866045B (zh) Hav检测
Class et al. Patent application title: Method For Affinity Purification Inventors: Maxim V. Berezovski (Ottawa, CA) Mohamed Wehbe (Ottawa, CA) Mahmoud Aziz Mahmoud Labib (Ottawa, CA) Darija Muharemagic (Gatineau, CA) Anna S. Zamay (Krasnoyarsk, RU) Shahrokh Ghobadloo (Ottawa, CA) Assignees: UNIVERSITY OF OTTAWA
Roberts Nucleic Acid Sample-Prep Tools Break New Ground

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant