CN118326087A - 基于微滴式数字PCR检测肝脏单细胞内HBV cccDNA的方法及试剂盒 - Google Patents

基于微滴式数字PCR检测肝脏单细胞内HBV cccDNA的方法及试剂盒 Download PDF

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CN118326087A CN202410615729.3A CN202410615729A CN118326087A CN 118326087 A CN118326087 A CN 118326087A CN 202410615729 A CN202410615729 A CN 202410615729A CN 118326087 A CN118326087 A CN 118326087A
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Abstract

本发明公开了基于微滴式数字PCR检测肝脏单细胞内HBV cccDNA的方法及试剂盒。本发明提供的检测方法，包括如下步骤：1)采用酶解法制备得到单细胞悬液；2)DNase I核酸酶消化；3)层流洗涤；4)ddPCR扩增，检测微滴荧光信号；根据所述微滴荧光信号，获得待测样本中HBV感染细胞所占比例和/或HBV感染细胞的病毒载量；本发明数字PCR检测HBV cccDNA的方法或试剂盒，具有以下有益效果：待测样本为患者肝脏活检组织，可以在单细胞水平实现对肝脏内HBV cccDNA的绝对定量，并得到被感染细胞的比例；检测灵敏度高，特异性强，反应体系小，反应迅速，高通量，便于临床大样本检测。

Description

基于微滴式数字PCR检测肝脏单细胞内HBV cccDNA的方法及 试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及基于微滴式数字PCR检测肝脏单细胞内HBVcccDNA的方法及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的乙型肝炎是全球公共卫生的重要威胁。而HBV感染是肝癌发生的重要因素，我国84％的肝癌由HBV感染引起。HBV以共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)形式长期存在于被感染的肝细胞核中，其以游离微型染色体的形式存在，极为稳定。cccDNA作为HBV复制转录的模板，是HBV持续感染、难以彻底治愈的最大临床挑战(Werle-Lapostolle B.etal.2004.Persistence of cccDNA during the natural history of chronic hepatitisB and decline during adefovir dipivoxil therapy.Gastroenterology[J]126(7),1750-1758.Fanning GC.et al.2019.Therapeutic strategies for hepatitis B virusinfection:towards a cure.Nat Rev Drug Discov[J]18(11),827-844)。
cccDNA作为HBV生命周期的核心环节，直接检测难度极大，替代的血清病毒学检测一直是评估cccDNA水平的主要手段。血清中HBV DNA定量主要用于评估HBV感染者病毒复制水平，是抗病毒治疗适应症选择及疗效判断的重要临床指标，与肝内cccDNA水平显著相关。然而，即使血清中HBV DNA水平持续低于检测下限，但患者肝内仍然可以检测到cccDNA(Lai,C.L.et al.2017.Reduction of covalently closed circular DNA with long-term nucleos(t)ide analogue treatment in chronic hepatitis B.J Hepatol 66,275-281)。此外，乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)定量也可反映cccDNA活性，HBsAg消失是CHB临床治愈目标。而研究表明，长期抗病毒治疗使HBsAg和cccDNA水平明显降低的同时伴随着血清HBsAg与cccDNA相关性显著下降。近年研究发现，血清中HBV RNA和乙型肝炎病毒核心相关抗原(Hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)水平在HBV DNA低于检测下限后能很好地反映肝内cccDNA复制与转录情况，其可作为替代指标反映CHB患者在病毒学抑制或HBsAg消失后肝内cccDNA转录活性，但其是否可应用于指导确定临床抗病毒治疗停药终点仍有待进一步探索(Mak,L.Y.et al.2018.Reviewarticle:hepatitis B core-related antigen(HBcrAg):an emerging marker forchronic hepatitis B virus infection.Aliment Pharmacol Ther 47,43-54)。因此，在临床应用中，直接检测肝组织中的cccDNA水平，对于了解HBV感染、传染性、疾病进展和预后等有重要参考价值(Allweiss,L.et al.2023.Quantification of the hepatitis Bvirus cccDNA:evidence-based guidelines for monitoring the key obstacle of HBVcure.Gut 72,972-983)。
目前针对肝活检组织的cccDNA检测主要是在组织水平(bulk)进行的，具体做法是取一部分肝活检组织进行DNA提取，然后再利用常规的Southern Blot、荧光定量PCR(qPCR)、数字PCR(digital PCR，dPCR)等手段进行测定。实际上得到的是一群细胞的信号均值，相同的信号无法区分是来自于少量细胞高拷贝数病毒感染或是大量细胞但低拷贝数感染；再加上起始细胞量和实验操作的误差，并不能真实反应肝组织内部被感染细胞的比例及被感染细胞内的病毒载量。同时，由于DNA提取等步骤带来的DNA损耗，对于肝内cccDNA水平很低的乙肝患者(<1拷贝/细胞)，尤其是功能性治愈的乙肝患者，正常肝活检组织能获得的DNA量很难实现有效的cccDNA检出。因此，亟需在单细胞水平上对肝活检组织进行cccDNA的测定。
dPCR是一种核酸分子绝对定量技术，主要是对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数的技术。相较于传统荧光定量PCR，数字PCR样本需求量低，灵敏度高，可以精确地检测低拷贝甚至单拷贝的混杂样本。目前dPCR体系主要包括微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和微阵列芯片式PCR(chamber-based digital PCR，cdPCR)。ddPCR技术利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，作为数字PCR的样品分散载体。不同于cdPCR技术依赖流道尺寸分离反应体系，ddPCR是利用水油两相拆分反应体系，其流道尺寸大、最终的反应体系体积大，非常适合于单细胞悬液的处理，在单细胞特异性基因或蛋白质的检测中显示出巨大优势(Fang W.etal.2024.Digital PCR for Single-Cell Analysis.Biosensors(Basel).14(2):64)。然而，目前仍没有在单细胞水平针对肝脏活检组织进行cccDNA检测的解决办法。因此，开发一套基于单细胞ddPCR的肝组织HBV cccDNA绝对定量检测方法，对于HBV的精准防治极其重要。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有检测技术存在的缺点与不足，提供一种能在单细胞水平上实现对乙肝或肝癌患者肝脏活检组织进行HBV cccDNA绝对含量检测的方法，提供患者肝组织HBV感染细胞所占比例和被感染细胞病毒载量两个维度的信息。
第一方面，本发明提供了一种检测待测样本的单细胞内HBV cccDNA的方法，包括如下步骤：
1)采用酶解法从待测样本中制备得到待测单细胞悬液；
2)用DNase I核酸酶去除所述待测单细胞悬浮液上清中的游离核酸，得到经DNaseI核酸酶处理后的待测细胞悬液；
3)采用层流洗涤对所述经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液进行洗涤，得到洗涤后细胞悬液；
4)利用ddPCR系统将所述洗涤后细胞悬液和ddPCR扩增体系包裹进液滴，形成微滴；再对所述微滴进行ddPCR扩增，检测微滴荧光信号；根据所述微滴荧光信号，获得待测样本中HBV感染细胞所占比例和/或HBV感染细胞的病毒载量；
所述ddPCR扩增体系包括β-actin引物对、β-actin探针、cccDNA引物对和cccDNA探针；
所述cccDNA引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成；所述cccDNA探针的核苷酸序列为序列6，且该探针的两端连接荧光基团和淬灭基团；
所述β-actin引物对由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述β-actin探针的核苷酸序列为序列3，且该探针的两端连接另一种荧光基团和所述淬灭基团。
在本发明的实施例中cccDNA探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；
β-actin探针的荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ1；
上文所述方法中，步骤1)中，所述酶解法采用的酶包括Collagenase I、DispaseII和DNase I。
所述采用酶解法从待测样本中制备得到待测单细胞悬液具体按照如下方法制备：用Collagenase I、Dispase II和DNase I酶解所述待测样本，得到待测单细胞悬浮液；
在本发明的实施例中，所述Collagenase I、Dispase II和DNase I酶和所述待测样本的配比为250μL Collagenase I(20mg/mL；Sigma，C0130，≥125CDU/mg solid)：100μLDispase II(100mg/mL；Sigma，D4693，≥0.5units/mg solid)：50μL DNase I(100μg/mL；Roche，10104159001)：0.5g(不超过0.5g)。
上文上述酶解的反应体系还包括含10％胎牛血清的RPMI1640；
所述酶解条件为：5％ CO2，37℃，160RPM，0.5-2h(肉眼可见组织块消失为止)。
上文步骤2)中，所述DNase I核酸酶去除游离核酸的消化体系包括DNase I核酸酶(100μg/mL；Roche，10104159001)4μL，待测单细胞悬浮液50μL(20万个细胞)；所述消化的条件为：5％ CO2，37℃，160RPM，15min。
上文步骤3)中，所述层流洗涤的目的是去除所述经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液的上清中残留的DNaseI核酸酶和细胞碎片等杂质；
具体为将经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液转移至层流洗涤孔板(CurioxBiosystems，16-DC-CL-10或96-DC-CL-05)的孔内，于4℃条件下，沉降30min，洗液为PBS(Gibco，10010023)，层流洗涤程序为：Cycles--28个，体积--80μL，流速--12。
上文步骤4)中，所述将洗涤后细胞悬液和ddPCR扩增体系包裹进液滴采用微滴生成所需试剂(包括微滴生成油和密封剂)进行包裹，具体为：向微滴发生芯片(永诺生物，S0100010201)的油孔中加入50μL微滴生成油(永诺生物，S0100010201)，将ddPCR反应体系(ddPCR扩增体系)转入微滴发生芯片的样品孔中，随后在每个样品孔中加入5μL密封剂(永诺生物，S0100010201)，将芯片置于微滴生成仪(永诺生物，MicroDrop-100A)中生产液滴，得到包裹单细胞和ddPCR反应液的微滴。
所述ddPCR扩增体系包括β-actin引物对、β-actin探针、cccDNA引物对和cccDNA探针、单细胞微滴式数字PCR用反应预混液(2X，永诺生物，S0200022901)、破膜剂(可以为其他破裂细胞膜的试剂，如SDS等)、5x KAPA Enhancer 1(Sigma，KK5517)和dNTP(NEB，N0447S)；
在ddPCR扩增体系中，所述cccDNA引物对中每条引物、所述cccDNA探针、所述β-actin引物对中的每条引物和所述β-actin探针摩尔比为900:900:300:900:900:300。
上文中，根据所述微滴荧光信号，分析待测样本中HBV感染细胞所占比例和/或HBV感染细胞的病毒载量，分别定量标化单个液滴内的cccDNA量和β-actin量；进一步通过β-actin标定微滴中是否包含细胞，通过cccDNA标定细胞内是否有cccDNA。并以管家基因β-actin进行标化，最终实现对单细胞内cccDNA的绝对定量。进一步具体为：
仪器检测得到的每个微滴的荧光值，与阴性质控对照的荧光值相比，高于其的FAM通道的微滴为cccDNA+微滴，高于其的VIC通道的微滴为β-actin+微滴。
统计cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数。
根据cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数，计算含cccDNA的细胞比例，并进一步计算cccDNA+细胞内的cccDNA拷贝数。
cccDNA+细胞比例＝cccDNA+β-actin+微滴数/(cccDNA+β-actin+微滴数+cccDNA-β-actin+微滴数)*100％
以β-actin为内参，其实际拷贝数默认为2(癌症样本除外)：
平均cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL)*2；
cccDNA+细胞cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL*cccDNA+β-actin+细胞比例)*2。
上述公式中的cccDNA copies/20μL和β-actin copies/20μL均为微滴检测仪获得的所有微滴的cccDNA总拷贝数和β-actin总拷贝数。
所述HBV感染细胞所占比例通过cccDNA+细胞比例体现；
所述HBV感染细胞的病毒载量为HBV感染细胞中单个细胞中平均HBV病毒载量，通过cccDNA+细胞cccDNA含量体现。
所述微滴中单细胞数量不高于2000个，也就是所述ddPCR扩增反应体系中单细胞数量不高于2000个。
上述ddPCR扩增反应体系具体为：单细胞微滴式数字PCR用反应预混液(2X)10μL，20μMβ-actin引物(F+R)0.9μL，20μMβ-actin探针0.3μL，20μM cccDNA引物(F+R)0.9μL，20μMcccDNA探针0.3μL，破膜剂0.6μL，5x KAPA Enhancer1加2.6μL，10mM dNTP加0.4μL，单细胞悬液4μL；
上述ddPCR反应的条件为：85℃破膜60min，95℃预变性10min，95℃变性30s，60℃退火延伸1min，共55个循环，产物保存于16℃。
上文上述方法中，所述待测样本为离体样本，具体为肝癌组织或肝脏组织或含有HBV cccDNA的细胞系或疑似含有HBV cccDNA的细胞系。
上文所述方法中，所述检测为定量检测。
第二方面，本发明提供了一种检测待测样本的单细胞内HBV cccDNA的试剂盒，包括如下1)，或1)和2)：
1)第一方面中所述cccDNA引物对、所述cccDNA探针、所述β-actin引物对和所述β-actin探针；
其中，所述cccDNA引物对中两条引物、所述cccDNA探针、所述β-actin引物对中的两条引物和所述β-actin探针摩尔比为900:900:300:900:900:300。
2)DNase I核酸内切酶。
上文所述试剂盒还包括ddPCR扩增所需的试剂；
进一步地，所述ddPCR扩增所需的试剂包括单细胞微滴式数字PCR用反应预混液(2X，永诺生物，S0200022901)、破膜剂(可以为其他破裂细胞膜的试剂，如SDS等)、5x KAPAEnhancer 1(Sigma，KK5517)和dNTP(NEB，N0447S)。
所述试剂盒还可包括微滴生成所需试剂，具体包括微滴生成油和密封剂。
上文所述试剂盒还可包括酶解法所需试剂，所述酶解法所需试剂包括Collagenase I、Dispase II和DNase I。
上文所述试剂盒还可包括阳性质控样品和阴性质控样品。
所述阳性质控样品为HepG2.2.15细胞提取的DNA样品。
所述阴性质控样品可包括PBS，还可以包括来自健康人的PBMC细胞。
所述检测可为定量检测。
上文所述试剂盒中，所述待测样本为离体样本，具体为肝癌组织或肝脏组织或含有HBV cccDNA的细胞系或疑似含有HBV cccDNA的细胞系。
第三方面，本发明提供的第二方面所述试剂盒或所述试剂盒中任一物质或任意物质组合在制备诊断或辅助诊断HBV感染患者的产品中的应用。
上文所述产品为试剂盒。
本发明的HBV cccDNA定量检测ddPCR试剂盒分为检测系统和监控系统两个部分。检测系统包括上述2种引物对和相应探针。监控系统包括：(1)阳性质控，HepG2.2.15细胞提取的DNA样品，正常情况下，阳性质控应出现cccDNA和β-actin的阳性检出，作为试剂盒试剂是否合格的判断标准，若阳性质控不出现阳性信号则说明试剂质量有问题。需要说明的是，为了避免核酸污染，阳性对照不需要每次实验都设置，仅在定期检测试剂性能时使用，一般建议2月一次，或者新开试剂测试一次。(2)阴性质控，包括PBS，也可以包括健康人的PBMC单细胞悬液，实验过程中二选一设置阴性对照。对于PBMC阴性对照，正常情况下，仅有β-actin检出而无HBV cccDNA检出，若微滴扫描时阴性质控中出现HBV cccDNA阳性微滴，则表明加样过程中存在污染。对于PBS阴性对照，正常情况下，均无β-actin和HBV cccDNA检出，若微滴扫描时阴性质控中出现阳性微滴，则表明试剂或者实验过程中存在污染。
本发明数字PCR检测HBV cccDNA的方法或试剂盒，具有以下有益效果：(1)待测样本为患者肝脏活检组织，可以在单细胞水平实现对肝脏内HBV cccDNA的绝对定量，并得到被感染细胞的比例；(2)检测灵敏度高，特异性强，极大提升了现有检测方法的灵敏度和准确度；(3)反应体系小(20μL)，待测样本和ddPCR试剂用量少；(4)反应迅速，5小时即可获得实验结果，便于疾病诊断；(5)高通量，便于临床大样本检测。
附图说明
图1为实施例1用酶解法制备肝脏单细胞悬液的实验流程及结果。(A)酶解法解离肝脏组织的操作流程；(B)解离后的细胞状态(明场)；(C)解离后的细胞用AOPI染色后的结果图。
图2为实施例3HBV cccDNA和β-actin退火温度优化及ddPCR特异性检测cccDNA的结果图。X轴位微滴总数，Y轴为荧光信号强度，水平实线(红线)为荧光信号阈值。荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即绿色/蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。(A)使用HepG2.2.15细胞对cccDNA和β-actin引物进行退火温度优化，上图为β-actin引物退火温度优化结果，β-actin的荧光信号阈值为3369；下图为cccDNA引物退火温度优化结果；cccDNA的阈值为2880。(B)优选退火温度后，ddPCR特异性检测HepG2.2.15提取的DNA中cccDNA的结果，使用PBS作为空白对照，上图为β-actin的荧光信号值；下图为cccDNA的荧光信号值。
图3为实施例4单细胞ddPCR工作原理图及HepG2.2.15细胞中cccDNA含量检测的结果。(A)上图显示ddPCR工作流程示意图，下图显示液滴包裹单细胞的实际情况图。(B)ddPCR对HepG2.2.15单细胞中的cccDNA进行绝对定量，X轴位微滴总数，Y轴为荧光信号强度，水平实线(红线)为荧光信号阈值；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色/绿色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴。上图为HepG2.2.15单细胞中β-actin基因检测结果，下图为cccDNA检测结果。(C)HepG2.2.15单细胞中β-actin和cccDNA检测结果二维图，本实验分别设置PBMC作为阴性对照和PBS作为空白对照。
图4为实施例5ddPCR检测临床肝癌患者肿瘤组织单细胞中cccDNA含量结果。(A)利用单细胞ddPCR技术对肝癌患者肿瘤组织中的cccDNA进行绝对定量，X轴为微滴总数，Y轴为荧光信号强度，水平实线(红线)为荧光信号阈值；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即绿色/蓝色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴；上图为肿瘤单细胞中β-actin基因检测结果，下图为cccDNA检测结果。(B)肿瘤单细胞中β-actin和cccDNA检测结果二维图，本实验分别设置PBMC作为阴性对照和PBS作为空白对照。
图5为实施例6乙肝患者肝穿刺组织单细胞中cccDNA含量检测结果。(A)利用单细胞ddPCR技术对乙肝患者肝组织中的cccDNA进行绝对定量，X轴位微滴总数，Y轴为荧光信号强度，水平实线(红线)为荧光信号阈值；荧光信号强度大于阈值的微滴为阳性微滴，即蓝色/绿色微滴；荧光信号强度小于阈值的微滴为阴性微滴，即灰色微滴；上图为肝组织单细胞中β-actin基因检测结果，下图为cccDNA检测结果。(B)肝组织单细胞中β-actin和cccDNA检测结果二维图，本实验分别设置PBMC作为阴性对照和PBS作为空白对照。
图6为实施例7中ddPCR反应体系中引物的特异性检测结果图，(A)为β-actin引物扩增产物熔解曲线，(B)为cccDNA引物扩增产物熔解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置两次重复实验。
实施例1、用酶解法制备肝脏单细胞悬液
图1为实施例1用酶解法制备肝脏单细胞悬液的实验流程及结果。
1、组织保存与运输：将样品(来自云南大学附属医院肝穿刺手术后的活检组织样本或肝癌手术后切除的肝癌组织样本)完全浸泡于预冷的Tissue StorageSolution(<8℃，Mitenyl Biotec，130-100-008)中，冰上运输，避免出现气泡，防止长时间与空气接触。
2、组织前处理：用预冷的培养液(RPMI1640+体积百分含量10％ FBS)清洗组织；将组织浸入500μL培养液，用剪刀将组织剪碎成约2-4mm3的小块。
3、组织解离：将适量(500mg以内)组织块转移至T25细胞培养瓶中，补充培养液至4.5mL，分别加入250μL Collagenase I(20mg/mL；Sigma，C0130，≥125CDU/mg solid)，100μL Dispase II(100mg/mL；Sigma，D4693，≥0.5units/mg solid)，50μL DNase I(100μg/mL；Roche，10104159001)，于5％ CO2，37℃，160RPM条件下，解离0.5-2h，直到肉眼可见组织块消失为止。
4、细胞清洗：用70μm Cell Strainer过滤细胞悬液。过滤后的滤液于4℃离心机中，400g离心5min，去上清，收集细胞沉淀。
5、红细胞裂解：用适量eBioscienceTM1X红细胞裂解液(Invitrogen，00-4333-57)裂解上述细胞沉淀中的红细胞，终止反应后于4℃下条件下，500g离心5min，去除上清收集细胞沉淀，用适量培养液(RPMI 1640+体积百分含量10％ FBS)重悬细胞，得到单细胞悬浮液。
6、细胞浓度和活率测定：使用Countstar计数仪，通过AOPI方法测定细胞浓度和活率。
表1为10例临床样本解离后的细胞浓度与活率
实施例2、ddPCR引物探针的设计合成、方法的建立
一、ddPCR引物探针的设计合成
引物通过如下方法设计得到：从公开的核酸数据库中下载HBV全基因组序列，首先采用Primer Premier 6.0软件，针对HBV基因组序列，以跨松弛环状DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)双缺口DR1、DR2设计cccDNA引物对和探针。其次基于β-actin的基因序列设计β-actin的引物对和探针。然后通过NCBI-prime Blast在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对引物和探针进行特异性比对，通过试验筛选和验证，得到特异性强、灵敏度和扩增效率高的引物对和探针。
为提高HBV cccDNA扩增的特异性，设计跨rcDNA双缺口的cccDNA引物对和相应的荧光探针如下：
cccDNA-F：5'-CTTCTCATCTGCCGGACC-3'
cccDNA-R：5'-AGTATGCCTCAAGGTCGGTCGT-3'
cccDNA-probe：5'-荧光基团-CTCTGCACGTCGCATGGAGAC-淬灭基团-3'；
管家基因优先选择β-actin基因，β-actin的引物对和探针用于定量检测β-actin的含量，其序列为：
β-actin-F：5'-GCTAAGTCCTGCCCTCATTTC-3'
β-actin-R：5'-ATCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3'
β-actin-probe：5'-荧光基团-TGACGTGGACATCCGCAAAGAC-淬灭基团-3'。
因此，选用合适的荧光基团和淬灭基团后的引物和探针核苷酸序列如下表2所示：
表2为引物和探针序列
二、cccDNA检测方法的建立
1、收集细胞
若待测样品为细胞，则培养该细胞，且当T25细胞培养瓶中的待测细胞覆盖率达到80％时，弃原培养液，加1mL PBS洗涤1次，随后加入1mL 0.25％ Trypsin-EDTA Solution溶液(Gibco，25200056)，将T25细胞培养瓶置于37℃的CO2细胞孵箱中消化3min，加入2mL含FBS的培养基(RPMI 1640+体积百分含量10％ FBS)终止消化，用枪头轻柔吹打分散细胞，收集单细胞悬浮液。
若待测样品为肝穿刺活检组织样本或肝癌组织样本，则按照实施例1的方法制备单细胞悬浮液。
在获得单细胞悬浮液后可以将上述单细胞悬浮液用PBS洗涤细胞2次，再加500μLPBS重悬细胞，得到单细胞悬浮液进行如下步骤，也可以直接进行如下步骤：
于CountStar中对待测细胞悬液进行细胞活率及浓度测定。
2、DNase I核酸酶处理待测单细胞：
取50μL上述待测细胞悬浮液(20万细胞)置于一新的1.5mL EP管中，加入DNase I核酸酶(100μg/mL；Roche，10104159001)4μL，用枪头将DNase I核酸酶与待测细胞悬浮液共54μL体系混匀，将该EP管置于37℃，160RPM的孵箱中，消化30min，得到经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液。
3、层流洗涤：用层流洗涤方式去除待测细胞悬液上清中的残留的DNase I核酸酶和细胞碎片等杂质，具体如下：
将经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液转移至层流洗涤孔板(CurioxBiosystems，16-DC-CL-10或96-DC-CL-05)的孔内，于4℃条件下，沉降30min，洗液为PBS(Gibco，10010023)，层流洗涤程序为：Cycles--28个，体积--80μL，流速--12。
4、细胞悬液回收及细胞计数：层流洗涤完成后，孔里残留25μL细胞悬液，加25μL新的PBS，轻吹重悬细胞，将其转移至1.5mL的离心管中，最终定容至100μL，得到洗涤后单细胞悬液。
于CountStar中对洗涤后单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定，调整浓度至≤500cells/μL。
5、ddPCR反应体系配制
按照下表3所示体系：将上述步骤4得到的洗涤后单细胞悬液按照如下表3所示体系配制ddPCR反应体系，其中单细胞数量不超过2000个单细胞。
表3为ddPCR反应体系
以PBS(Gibco，10010023)替换表3中单细胞悬液作为阴性质控对照。
6、制备微滴
向微滴发生芯片(永诺生物，S0100010201)的油孔中加入50μL微滴生成油(永诺生物，S0100010201)，将上述步骤5制备的ddPCR反应体系转入微滴发生芯片的样品孔中，随后在每个样品孔中加入5μL密封剂(永诺生物，S0100010201)，将芯片置于微滴生成仪(永诺生物，MicroDrop-100A)中生产液滴，得到包裹单细胞和ddPCR反应液的微滴。
7、ddPCR扩增
使用低吸附吸头将上述6制备好的微滴转移至配套专用的96孔PCR反应板中，并用配套铝膜热封(190℃，5sec)，于PCR仪器中进行ddPCR扩增，为保证每个微滴的稳定性，样品孔的升温速率设定不高于2℃/sec，ddPCR扩增反应程序如下表4所示：
表4为ddPCR扩增程序
8、微滴检测和结果计算分析
ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪(永诺生物，MicroDrop-100B)中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，分析计算cccDNA+和β-actin+微滴数和两者的拷贝数。
具体如下：
将扩增产物进行微滴分析扫描，以拷贝数检测方法对微滴数目进行检测，每孔制备微滴总数必须超过50000个，阴性质控品不出现阳性微滴，表明实验成功。仪器检测得的每个微滴的荧光值，与阴性质控对照(此处为空白对照PBS)的荧光值相比，高于其的FAM通道的微滴为cccDNA+微滴，高于其的VIC通道的微滴为β-actin+微滴。
统计cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数。
根据cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数，计算含cccDNA的细胞比例，并进一步计算cccDNA+细胞内的cccDNA拷贝数。
cccDNA+细胞比例＝cccDNA+β-actin+微滴数/(cccDNA+β-actin+微滴数+cccDNA-β-actin+微滴数)*100％
以β-actin为内参，正常人细胞为二倍体：
平均cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL)*2；
cccDNA+细胞cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20
μL*cccDNA+β-actin+细胞比例)*2。
上述公式中的cccDNA copies/20μL和β-actin copies/20μL均为微滴检测仪获得的所有微滴的cccDNA总拷贝数和β-actin总拷贝数。
三、cccDNA检测试剂盒
本发明的单细胞HBV cccDNA检测ddPCR试剂盒，包括HBV cccDNA定量检测所需体系；
所述HBV cccDNA定量检测所需体系包含cccDNA引物对和cccDNA探针，及管家基因β-actin引物对和β-actin探针；
所述HBV cccDNA定量检测所需体系还包括：DNase I核酸酶(Roche，10104159001)、ddPCR扩增所需的试剂；
其中ddPCR扩增所需的试剂具体为单细胞微滴式数字PCR用反应预混液(2X，永诺生物，S0200022901)、破膜剂(可以为其他类型破膜剂，如SDS等)、5xX KAPA Enhancer 1(Sigma，KK5517)、dNTP(NEB，N0447S)。
所述试剂盒还包括微滴生成所需试剂(永诺生物，S0200022901)，具体包括微滴生成油和密封剂。
上述试剂盒还包括肝脏组织解离单细胞所需体系，上述肝脏组织解离单细胞所需体系具体包括Collagenase I、Dispase II和DNase I。
上述试剂盒还可包括cccDNA阴性质控品和阳性质控品；
其中阴性质控品包括PBS(Gibco，10010023)，还可以包括健康人的PBMC。
阳性质控品为含有cccDNA的HepG2.2.15细胞提取的DNA。
实施例3、ddPCR引物探针退火温度优化及cccDNA阳性质控品检测
一、ddPCR引物探针退火温度优化
使用HepG2.2.15细胞作为引物探针退火温度优化的样品。
1、收集细胞：与实施例2相同。
2、DNase I核酸酶处理待测单细胞：与实施例2相同。
3、层流洗涤：与实施例2相同。
4、细胞悬液回收及细胞计数：与实施例2相同。
5、ddPCR反应体系配制：与实施例2相同。
6、制备微滴：与实施例2相同。
7、ddPCR扩增：
使用低吸附吸头将上述步骤6制备好的微滴转移至配套专用的96孔PCR反应板中，并用配套铝膜热封(190℃，5sec)，于PCR仪器中进行ddPCR扩增，为保证每个微滴的稳定性，样品孔的升温速率设定不高于2℃/sec，ddPCR扩增反应程序如下表5所示：
表5为ddPCR扩增程序
8、微滴检测和结果计算分析
ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，按照实施例2的方法分析计算cccDNA+和β-actin+微滴数。
结果如图2A所示，上图为β-actin引物退火温度优化结果，β-actin的荧光信号阈值为3369；下图为cccDNA引物退火温度优化结果；cccDNA的阈值为2880，可以看出，在55.3℃时β-actin和cccDNA的荧光信号阴阳分界是最明显的。因此，最佳退火温度为55.3℃，一般取值为55℃。
二、cccDNA阳性质控品检测
以HepG2.2.15细胞提取的DNA作为阳性质控品。
1、收集细胞
T25细胞培养瓶中的HepG2.2.15细胞覆盖率达到80％时，弃原培养液，加1mL PBS洗涤1次，随后加入1mL 0.25％ Trypsin-EDTA Solution溶液(Gibco，25200056)，将T25细胞培养瓶置于37℃的CO2细胞孵箱中消化3min，加入2mL含FBS的培养基(RPMI 1640+体积百分含量10％ FBS)终止消化，用枪头轻柔吹打分散细胞，收集细胞悬液于1.5mL EP管中，500g离心5min，弃上清。
2、DNA提取
使用天根生化科技有限公司的“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(DP304)”进行DNA的提取。
3、按照下表6所示体系配制ddPCR反应体系。
表6为ddPCR反应体系
4、制备微滴：与实施例2相同。
5、ddPCR扩增：
使用低吸附吸头将上述步骤2制备好的微滴转移至配套专用的96孔PCR反应板中，并用配套铝膜热封(190℃，5sec)，于PCR仪器中进行ddPCR扩增，为保证每个微滴的稳定性，样品孔的升温速率设定不高于2℃/sec，ddPCR扩增反应程序如下表7所示：
表7为ddPCR扩增程序
6、微滴检测和结果计算分析
ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，按照实施例2的方法分析计算cccDNA+和β-actin+微滴数和拷贝数。
结果如表8和图2B所示。
表8为HepG2.2.15DNA中cccDNA检测结果
注：以β-actin为内参，其实际拷贝数默认为2，cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL)*2。cccDNA copies/20μL和β-actin copies/20μL均为仪器读取获得。
实施例4、单细胞ddPCR特异性检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA阳性细胞比例和cccDNA含量
1、收集细胞：当T25细胞培养瓶中的待测细胞覆盖率达到80％时，弃原培养液，加1mL PBS洗涤1次，随后加入1mL 0.25％ Trypsin-EDTA Solution溶液(Gibco，25200056)，将T25细胞培养瓶置于37℃的CO2细胞孵箱中消化3min，加入2mL含FBS的培养基终止消化，用枪头轻柔吹打分散细胞，收集细胞悬液于1.5mL EP管中，500g，离心5min，弃上清。
用PBS洗涤细胞2次，最后加500μL PBS重悬细胞，得到HepG2.2.15细胞悬液。
于CountStar中对HepG2.2.15细胞悬液进行细胞活率及浓度测定。
上述待测细胞为如下：HepG2.2.15样本1、HepG2.2.15样本2、20％ PBMC+80％HepG.2.15、40％ PBMC+60％ HepG.2.15、50％ PBMC+50％ HepG.2.15、60％ PBMC+40％HepG.2.15、80％ PBMC+20％ HepG.2.15。
以PBMC为阴性对照。以PBS为空白对照。
HepG2.2.15样本1和HepG2.2.15样本2分别为HepG2.2.15细胞系的两次实验。
20％ PBMC+80％ HepG.2.15为将上述HepG2.2.15细胞悬液和PBMC细胞悬液按照细胞数量百分比为80％和20％混匀。
上述各个细胞悬液的缓冲液均为PBS。
40％ PBMC+60％ HepG.2.15为将上述HepG2.2.15细胞悬液和PBMC细胞悬液按照细胞数量百分比为60％和40％混匀。
50％ PBMC+50％ HepG.2.15为将上述HepG2.2.15细胞悬液和PBMC细胞悬液按照细胞数量百分比为50％和50％混匀。
60％ PBMC+40％ HepG.2.15为将上述HepG2.2.15细胞悬液和PBMC细胞悬液按照细胞数量百分比为40％和60％混匀。
80％ PBMC+20％ HepG.2.15为将上述HepG2.2.15细胞悬液和PBMC细胞悬液按照细胞数量百分比为20％和80％混匀。
2、DNase I核酸酶处理待测单细胞：取50μL HepG2.2.15细胞悬液(20万细胞)置于一新的1.5mL EP管中，加入DNase I核酸酶(100μg/mL；Roche，10104159001)4μL，用枪头将DNase I核酸酶与HepG2.2.15单细胞悬液混匀，将该EP管置于37℃，160RPM的孵箱中，消化30min，得到经DNase I核酸酶处理后的HepG2.2.15细胞悬液。
3、层流洗涤：用层流洗涤方式去除HepG2.2.15细胞悬液上清中的残留的DNase I核酸酶和DNA，具体如下：
将经DNase I核酸酶处理后的HepG2.2.15细胞悬液转移至层流洗涤孔板(CurioxBiosystems，16-DC-CL-10或96-DC-CL-05)的孔内，于4℃条件下，沉降30min，洗液为PBS(Gibco，10010023)，层流洗涤程序为：Cycles--28个，体积--80μL，流速--12。
4、细胞悬液回收及细胞计数：层流洗涤完成后，孔里残留25μL细胞悬液，加25μL新的PBS，轻吹重悬细胞，将其转移至1.5mL的离心管中，最终定容至100μL，得到洗涤后HepG2.2.15单细胞悬液。
于CountStar中对洗涤后HepG2.2.15单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定，调整浓度至≤500cells/μL。
5、ddPCR反应：按照实施例2的二的方法将上述4得到的洗涤后单细胞悬液配制ddPCR反应体系。
6、制备微滴：与实施例2相同。
7、ddPCR扩增：与实施例2相同。
8、微滴检测和结果计算分析：ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，分析计算cccDNA+和β-actin+微滴数和两者的拷贝数。
与实施例2相同，根据cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数，计算含cccDNA的细胞比例，并进一步计算cccDNA+细胞内的cccDNA拷贝数。
结果如图3、表9和表10所示，可以实现目标检测。
表9为HepG2.2.15细胞系中cccDNA+细胞比例检测结果
注：cccDNA+细胞比例＝cccDNA+β-actin+微滴数/(cccDNA+β-actin+微滴数+cccDNA-β-actin+微滴数)*100％
表10为HepG2.2.15细胞系中cccDNA+细胞中cccDNA载量检测结果
注：以β-actin为内参，其实际拷贝数默认为2：
平均cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL)*2；cccDNA+细胞cccDNA含量＝(cccDNA copies/20μL)/(β-actin copies/20μL*cccDNA+β-actin+细胞比例)*2
实施例5、单细胞ddPCR特异性检测肝癌患者肿瘤组织中HBV cccDNA阳性细胞比例及cccDNA+细胞中的病毒载量
1、肿瘤单细胞悬浮液的制备
肝肿瘤组织单细胞悬液制备：将待测肝肿瘤组织按照实施例1的方法完成肝肿瘤组织单细胞悬液的制备，得到肿瘤单细胞悬浮液。
收集细胞悬液于1.5mL EP管中，500g，离心5min，弃上清。
用PBS洗涤细胞2次，最后加500μL PBS重悬细胞，于CountStar中对肿瘤单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定。
待测肝肿瘤组织为来自肝癌患者1、肝癌患者2和肝癌患者3。
以PBMC为阴性对照，PBMC1和PBMC2为来自两名健康人。以PBS为空白对照，空白对照1和2分别为2次实验。
2、DNase I核酸酶处理待测肿瘤单细胞：按照实施例2的方法，得到经DNase I核酸酶处理后的细胞悬液。
3、层流洗涤：按照实施例2的方法。
4、细胞悬液回收及细胞计数：按照实施例2的方法，得到洗涤后待测肿瘤单细胞悬液。
于CountStar中对洗涤后待测肿瘤单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定，调整浓度至≤500cells/μL。
5、配制ddPCR反应体系：按照实施例2的所示的体系将上述4得到洗涤后待测肿瘤单细胞悬液进行配制得到ddPCR反应体系。
6、制备微滴：与实施例2相同。
7、ddPCR扩增：与实施例2相同。
8、微滴检测和结果计算分析：ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，分析计算cccDNA+β-actin+阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数及其拷贝数。根据cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数，计算含cccDNA的细胞比例，并进一步计算cccDNA+细胞内的cccDNA拷贝数。
结果如图4、表11和表12所示，可以实现目标检测。
表11为临床肝癌患者肿瘤组织中cccDNA+细胞比例检测结果
注：cccDNA+细胞比例计算方法见实施例4。
表12为临床肝癌患者肝组织cccDNA+细胞中cccDNA载量检测结果
注：此处以β-actin为内参，其实际拷贝数默认为2，由于肿瘤样本可能发生基因组拷贝数变异，因此这里计算的cccDNA拷贝数是相对拷贝数，不能算真实值。平均cccDNA含量和cccDNA+细胞cccDNA含量计算方法见实施例4。
实施例6、单细胞ddPCR特异性检测乙肝患者肝组织中HBV cccDNA阳性细胞比例及cccDNA+细胞中的病毒载量
1、肝组织单细胞悬浮液的制备
肝组织单细胞悬液制备：将待测肝组织按照实施例1的方法完成肝穿组织的单细胞悬液制备，得到肝穿组织单细胞悬浮液。
收集细胞悬液于1.5mL EP管中，500g，离心5min，弃上清。
加500μL PBS重悬细胞，于CountStar中对肝组织单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定。
待测肝组织为来自肝炎患者1、肝炎患者2、肝炎患者3和肝炎患者4。
以PBMC为阴性对照，PBMC1和PBMC2为来自两名健康人。以PBS为空白对照，空白对照1和2分别为2次实验。
2、DNase I核酸酶处理待测肝组织单细胞：按照实施例2的方法，得到经DNase I核酸酶处理后的细胞悬液。
3、层流洗涤：按照实施例2的方法。
4、细胞悬液回收及细胞计数：按照实施例2的方法，得到洗涤后待测肝组织单细胞悬液。
于CountStar中对洗涤后待测肝组织瘤单细胞悬液进行细胞活率及浓度测定，调整浓度至≤500cells/μL。
5、配制ddPCR反应体系：按照实施例2的所示的体系将上述4得到洗涤后待测肝穿组织单细胞悬液进行配制得到ddPCR反应体系。
6、制备微滴：与实施例2相同。
7、ddPCR扩增：与实施例2相同。
8、微滴检测和结果计算分析：ddPCR扩增结束后，将反应板置于配套的微滴检测仪中进行FAM和VIC通道的检测，利用泊松分布原理，分析计算cccDNA+和β-actin+微滴数和两者的拷贝数。根据cccDNA+β-actin+双阳微滴和cccDNA-β-actin+单阳微滴数，计算含cccDNA的细胞比例，并进一步计算cccDNA+细胞内的cccDNA拷贝数。
结果如图5、表13和表14所示，可以实现目标检测。
表13为临床乙肝患者肝组织中cccDNA+细胞比例检测结果
注：cccDNA+细胞比例计算方法见实施例4。
表14为临床乙肝患者肝组织cccDNA+细胞中cccDNA载量检测结果
注：平均cccDNA含量和cccDNA+细胞cccDNA含量计算方法见实施例4。
实施例7、ddPCR反应体系中引物的特异性检测
从公开的核酸数据库中下载HBV全基因组序列，首先采用Primer Premier 6.0软件，针对HBV基因组序列，以跨rcDNA双缺口DR1、DR2设计出20对cccDNA引物对和探针；其次基于β-actin的基因序列设计出20对β-actin引物对和探针。随后通过NCBI-prime Blast在线工具对设计的引物对和探针进行特异性比对，最后筛选出2对特异性较好的β-actin引物对和探针及3对特异性较好的cccDNA引物对和探针，引物对和探针序列见表15。
表15为引物对和探针序列
为了进一步验证引物的特异性、扩增效率和扩增产物的单一性，以HepG2.2.15细胞提取的DNA为模版，通过实时定量PCR(qPCR)进行验证，其中qPCR的CT值见表16，扩增产物的熔解曲线见图6。
表16为qPCR检测结果
熔解曲线的Tm值是熔解曲线中的重要参数，目标基因熔解曲线的Tm值是由其产物长度和GC含量共同决定，目标基因的qPCR产物长度越长、GC含量越高，Tm值越大。不同的qPCR产物因其长度与GC含量不同，其Tm值大小也不一样。若用于qPCR扩增的引物不特异，则会出现非特异性扩增产物，实验中所得到的qPCR产物由目的产物与非特异性产物共同构成，因两者长度与GC含量不同，故而在熔解曲线上会出现两个Tm值，即两个波峰。若熔解曲线呈现单峰但不尖锐，则可能是非特异性扩增产物Tm值与目的产物的Tm值接近，导致熔解曲线出现宽峰，因此通过判断产物的熔解曲线峰形是否为单一窄峰，即可判定该引物是否特异。
图6A为β-actin1、β-actin2扩增HepG2.2.15细胞DNA的溶解曲线图；图6B为cccDNA1、cccDNA2、cccDNA3扩增HepG2.2.15细胞DNA的溶解曲线图。可以看出，β-actin2和cccDNA3引物对扩增出的产物其熔解曲线均为单一窄峰，说明这两者的产物特异性较好，结合二者的CT值结果(β-actin2与β-actin1接近；cccDNA3的CT值小于其他两对引物，说明其扩增效率较高)，最后确定β-actin2和cccDNA3引物对为最优，因此选择β-actin2(实施例2中的引物)和cccDNA3引物对(实施例2中的引物)作为后续实验使用引物。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (9)

1.一种检测待测样本的单细胞内HBV cccDNA的方法，包括如下步骤：
1)采用酶解法从待测样本中制备得到待测单细胞悬液；
2)用DNase I核酸酶去除所述待测单细胞悬浮液上清中的游离核酸，得到经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液；
3)采用层流洗涤对所述经DNase I核酸酶处理后的待测细胞悬液进行洗涤，得到洗涤后细胞悬液；
4)利用ddPCR系统将所述洗涤后细胞悬液和ddPCR扩增体系包裹进液滴，形成微滴；再对所述微滴进行ddPCR扩增，检测微滴荧光信号；根据所述微滴荧光信号，获得待测样本中HBV感染细胞所占比例和/或HBV感染细胞的病毒载量；
所述ddPCR扩增体系包括β-actin引物对、β-actin探针、cccDNA引物对和cccDNA探针；
所述cccDNA引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成；所述cccDNA探针的核苷酸序列为序列6，且该探针的两端连接荧光基团和淬灭基团；
所述β-actin引物对由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述β-actin探针的核苷酸序列为序列3，且该探针的两端连接另一种荧光基团和所述淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述酶解法采用的酶包括Collagenase I、Dispase II和DNase I。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述待测样本为肝癌组织或肝脏组织或含有HBV cccDNA的细胞系或疑似含有HBV cccDNA的细胞系。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述检测为定量检测。
5.一种检测待测样本的单细胞内HBV cccDNA的试剂盒，包括如下1)，或1)和2)：
1)权利要求1-4中所述cccDNA引物对、所述cccDNA探针、所述β-actin引物对和所述β-actin探针；
2)DNase I核酸内切酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括ddPCR扩增所需的试剂。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶解法所需试剂，所述酶解法所需试剂包括Collagenase I、Dispase II和DNase I。
8.根据权利要求5-7中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述待测样本为肝癌组织或肝脏组织或含有HBV cccDNA的细胞系或疑似含有HBV cccDNA的细胞系。
9.权利要求5-7任一所述试剂盒或所述试剂盒中任一物质或任意物质组合在制备诊断或辅助诊断HBV感染患者的产品中的应用。
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