JPH05262799A - 抗体の精製方法 - Google Patents
抗体の精製方法Info
- Publication number
- JPH05262799A JPH05262799A JP4064307A JP6430792A JPH05262799A JP H05262799 A JPH05262799 A JP H05262799A JP 4064307 A JP4064307 A JP 4064307A JP 6430792 A JP6430792 A JP 6430792A JP H05262799 A JPH05262799 A JP H05262799A
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- JP
- Japan
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- antibody
- washing
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- protein
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- Pending
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- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 洗浄液量を適正化することにより精製能率の
向上と精製費用の低減を図ったアフィニティーカラムを
使用した抗体の精製方法を提供する。 【構成】 夾雑蛋白を数mg/ml のレベルで含有する細胞
培養上清等の原料液を無機質の硬質ゲルを基材としプロ
ティンＡを固定相としたアフィニティーカラムに通液、
洗浄、溶離して抗体を精製する。原料液中の夾雑蛋白濃
度をＹ（mg/ml)とし洗浄倍率をＸとしたとき、Ｙ＝(0.0
44±0.005)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗
浄液を用いて精製する方法である。
向上と精製費用の低減を図ったアフィニティーカラムを
使用した抗体の精製方法を提供する。 【構成】 夾雑蛋白を数mg/ml のレベルで含有する細胞
培養上清等の原料液を無機質の硬質ゲルを基材としプロ
ティンＡを固定相としたアフィニティーカラムに通液、
洗浄、溶離して抗体を精製する。原料液中の夾雑蛋白濃
度をＹ（mg/ml)とし洗浄倍率をＸとしたとき、Ｙ＝(0.0
44±0.005)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗
浄液を用いて精製する方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アフィニティーカラム
を使用した抗体の精製方法に関するものである。
を使用した抗体の精製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アフィニティーカラムは、図１に示すよ
うにカラムに原料液を流して必要物質を吸着させ、次に
カラムを洗浄液で洗浄して不要物質を除去したうえ、カ
ラムに吸着されている必要物質を溶離して取り出すもの
であり、このアフィニティーカラムを利用して、夾雑蛋
白を含有する原料液から抗体を精製することが知られて
いる。ところが従来は洗浄液量を経験的に定めていたた
めに安全を見て過剰量の洗浄液が使用されており、抗体
の精製能率や精製費用の点で問題が残されていた。
うにカラムに原料液を流して必要物質を吸着させ、次に
カラムを洗浄液で洗浄して不要物質を除去したうえ、カ
ラムに吸着されている必要物質を溶離して取り出すもの
であり、このアフィニティーカラムを利用して、夾雑蛋
白を含有する原料液から抗体を精製することが知られて
いる。ところが従来は洗浄液量を経験的に定めていたた
めに安全を見て過剰量の洗浄液が使用されており、抗体
の精製能率や精製費用の点で問題が残されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した従来
の問題点を解決して、洗浄液量を適正化することにより
精製能率の向上と精製費用の低減を図ることができるア
フィニティーカラムを使用した抗体の精製方法を提供す
るために完成されたものである。
の問題点を解決して、洗浄液量を適正化することにより
精製能率の向上と精製費用の低減を図ることができるア
フィニティーカラムを使用した抗体の精製方法を提供す
るために完成されたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、抗体と夾雑蛋白とを含有する原
料液を、無機質の硬質ゲルを基材としプロティンＡを固
定相としたアフィニティーカラムに通液後、洗浄、溶離
して抗体を精製するに当り、原料液中の夾雑蛋白の濃度
をＹ（mg/ml ）とし、カラム容量に対する洗浄液量の比
として定義される洗浄倍率をＸとしたとき、Ｙ＝(0.044
±0.005)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗浄
液を用いることを特徴とするものである。
めになされた本発明は、抗体と夾雑蛋白とを含有する原
料液を、無機質の硬質ゲルを基材としプロティンＡを固
定相としたアフィニティーカラムに通液後、洗浄、溶離
して抗体を精製するに当り、原料液中の夾雑蛋白の濃度
をＹ（mg/ml ）とし、カラム容量に対する洗浄液量の比
として定義される洗浄倍率をＸとしたとき、Ｙ＝(0.044
±0.005)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗浄
液を用いることを特徴とするものである。
【０００５】本発明においては、夾雑蛋白を数mg/ml 含
有する（例えば１〜５mg/ml 程度の牛血清アルブミンを
含有する）細胞培養上清、腹水等の原料液からアフィニ
ティーカラムを使用して抗体を精製する。また本発明に
おいてはこのアフィニティーカラムとして、シリカ、ア
ルミナ等の無機質の硬質ゲルを基材とし、プロティンＡ
を固定相としたものを使用する。このようなアフィニテ
ィーカラムは、従来のアガロース、セルロース等の軟質
ゲルを基材としたものとは異なり流速を高めても圧密し
ないので、流速を従来の１cm/min以下から50〜80cm/min
と飛躍的に速くすることができ、精製の能率を高めるこ
とができる。
有する（例えば１〜５mg/ml 程度の牛血清アルブミンを
含有する）細胞培養上清、腹水等の原料液からアフィニ
ティーカラムを使用して抗体を精製する。また本発明に
おいてはこのアフィニティーカラムとして、シリカ、ア
ルミナ等の無機質の硬質ゲルを基材とし、プロティンＡ
を固定相としたものを使用する。このようなアフィニテ
ィーカラムは、従来のアガロース、セルロース等の軟質
ゲルを基材としたものとは異なり流速を高めても圧密し
ないので、流速を従来の１cm/min以下から50〜80cm/min
と飛躍的に速くすることができ、精製の能率を高めるこ
とができる。
【０００６】上記のような条件下において抗体を精製す
るに当り、原料液中の夾雑蛋白濃度と洗浄液量とをさま
ざまに変えて実験を行った結果、洗浄液量によって精製
液中の夾雑蛋白濃度が変化することが分かった。その結
果を示したのが図２のグラフであり、洗浄液量を横軸に
取り精製液中の夾雑蛋白濃度を縦軸に取ってある。ここ
で洗浄液量は、カラム容量に対する洗浄液量の比（洗浄
液量／カラム容量）として定義される洗浄倍率Ｘにより
表示してある。
るに当り、原料液中の夾雑蛋白濃度と洗浄液量とをさま
ざまに変えて実験を行った結果、洗浄液量によって精製
液中の夾雑蛋白濃度が変化することが分かった。その結
果を示したのが図２のグラフであり、洗浄液量を横軸に
取り精製液中の夾雑蛋白濃度を縦軸に取ってある。ここ
で洗浄液量は、カラム容量に対する洗浄液量の比（洗浄
液量／カラム容量）として定義される洗浄倍率Ｘにより
表示してある。
【０００７】この図２に示されるように、原料液中の夾
雑蛋白濃度Ｙが５mg/ml と比較的高い場合であっても、
洗浄倍率Ｘが130 を超えると精製液中の夾雑蛋白濃度を
許容濃度である10μg/ml以下にすることができる。また
原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙが１mg/ml と比較的低い場合
には、洗浄倍率Ｘが50を越えると精製液中の夾雑蛋白濃
度を最適濃度である10μg/ml以下にすることができる。
従って原料液中の夾雑蛋白濃度をＹ（mg/ml ）とする
と、精製液中の夾雑蛋白濃度を許容濃度以下に維持する
ためには、洗浄倍率Ｘと原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙとの
間に図３に示すような関係が成立することとなる。図３
に示した中心線はＹ＝0.044 Ｘ−1 の直線であり、本発
明ではその上下に許容範囲を取って、Ｙ＝(0.044±0.00
5)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗浄液を用
いることとした。
雑蛋白濃度Ｙが５mg/ml と比較的高い場合であっても、
洗浄倍率Ｘが130 を超えると精製液中の夾雑蛋白濃度を
許容濃度である10μg/ml以下にすることができる。また
原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙが１mg/ml と比較的低い場合
には、洗浄倍率Ｘが50を越えると精製液中の夾雑蛋白濃
度を最適濃度である10μg/ml以下にすることができる。
従って原料液中の夾雑蛋白濃度をＹ（mg/ml ）とする
と、精製液中の夾雑蛋白濃度を許容濃度以下に維持する
ためには、洗浄倍率Ｘと原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙとの
間に図３に示すような関係が成立することとなる。図３
に示した中心線はＹ＝0.044 Ｘ−1 の直線であり、本発
明ではその上下に許容範囲を取って、Ｙ＝(0.044±0.00
5)Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗浄液を用
いることとした。
【０００８】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。図４は本発明
を実施するための装置の一例を示すもので、１はアフィ
ニティーカラムであり、その内部にはシリカ質の硬質ゲ
ルを基材としプロティンＡを固定相としたものが充填さ
れている（たとえばクロマトップ・プロテインＡ：4.6
φ×100 mm）。２は送液ポンプであり、図示のように原
料液、洗浄液、溶離液を順次アフィニティーカラム１に
供給することができるようになっている。３は検出器で
あり、その出力は制御装置４に送られ、制御装置４は前
記の関係式と原料液中の夾雑蛋白濃度とに基づいて算出
された流量となるよう、バルブ５〜バルブ９を制御する
ことによってアフィニティーカラム１を流れる洗浄液の
流量を制御するとともに、原料液や溶離液の流量を制御
する。
を実施するための装置の一例を示すもので、１はアフィ
ニティーカラムであり、その内部にはシリカ質の硬質ゲ
ルを基材としプロティンＡを固定相としたものが充填さ
れている（たとえばクロマトップ・プロテインＡ：4.6
φ×100 mm）。２は送液ポンプであり、図示のように原
料液、洗浄液、溶離液を順次アフィニティーカラム１に
供給することができるようになっている。３は検出器で
あり、その出力は制御装置４に送られ、制御装置４は前
記の関係式と原料液中の夾雑蛋白濃度とに基づいて算出
された流量となるよう、バルブ５〜バルブ９を制御する
ことによってアフィニティーカラム１を流れる洗浄液の
流量を制御するとともに、原料液や溶離液の流量を制御
する。
【０００９】
【作用】次に図１、図４に基づいて本発明の抗体の精製
方法を説明する。吸着工程では、原料液中の抗体濃度と
カラム容量に応じて所定量の原料液をアフィニティーカ
ラム１に送入し、基材に固定化されたプロティンＡに抗
体を吸着させるとともに、夾雑蛋白をアフィニティーカ
ラム１から処理液として流出させる。
方法を説明する。吸着工程では、原料液中の抗体濃度と
カラム容量に応じて所定量の原料液をアフィニティーカ
ラム１に送入し、基材に固定化されたプロティンＡに抗
体を吸着させるとともに、夾雑蛋白をアフィニティーカ
ラム１から処理液として流出させる。
【００１０】洗浄工程では、原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙ
を測定し、設定した関係式であるＹ＝(0.044±0.005)Ｘ
−１±0.5 により洗浄倍率Ｘを逆算する。例えば、図３
から原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙが３mg/ml のときは、洗
浄倍率Ｘは約90倍となる。このようにして算出された洗
浄倍率Ｘにアフィニティーカラム１のカラム容量を掛け
て算出された洗浄液量だけ洗浄液をアフィニティーカラ
ム１に流入させ、洗浄廃液をアフィニティーカラム１か
ら流出させる。なお洗浄液としてはグリシンの濃度が２
モル以上で、不活性無機塩（たとえば、Nacl、Mgcl
2 等）の濃度が３モル以上のものを使用することが好ま
しい。（PH＝８程度）
を測定し、設定した関係式であるＹ＝(0.044±0.005)Ｘ
−１±0.5 により洗浄倍率Ｘを逆算する。例えば、図３
から原料液中の夾雑蛋白濃度Ｙが３mg/ml のときは、洗
浄倍率Ｘは約90倍となる。このようにして算出された洗
浄倍率Ｘにアフィニティーカラム１のカラム容量を掛け
て算出された洗浄液量だけ洗浄液をアフィニティーカラ
ム１に流入させ、洗浄廃液をアフィニティーカラム１か
ら流出させる。なお洗浄液としてはグリシンの濃度が２
モル以上で、不活性無機塩（たとえば、Nacl、Mgcl
2 等）の濃度が３モル以上のものを使用することが好ま
しい。（PH＝８程度）
【００１１】溶離工程では、溶離液をアフィニティーカ
ラム１内に送入し、溶離された抗体を含有する精製液を
流出させるとともに、検出器３により精製液中の抗体濃
度を測定し、抗体濃度が所定の濃度以上のものを抗体と
して回収し、それ以下のものは排出する。そして採取さ
れた抗体中の夾雑蛋白濃度を別途測定し、測定された夾
雑蛋白濃度が許容濃度（例えば、10μg/ml) 以下である
場合にはこれを製品抗体として保存する。採取された抗
体中の夾雑蛋白の許容濃度と測定濃度とを対比し、この
偏差に応じて洗浄倍率を増減させる操作を繰り返すこと
によって、必要かつ十分な最適洗浄倍率を設定する。な
お、測定濃度が許容濃度以上の場合には採取抗体は再度
処理するものとする。また、溶離液としてはクエン酸の
濃度が0.1 モルのものを使用することが好ましい。（PH
＝６程度）
ラム１内に送入し、溶離された抗体を含有する精製液を
流出させるとともに、検出器３により精製液中の抗体濃
度を測定し、抗体濃度が所定の濃度以上のものを抗体と
して回収し、それ以下のものは排出する。そして採取さ
れた抗体中の夾雑蛋白濃度を別途測定し、測定された夾
雑蛋白濃度が許容濃度（例えば、10μg/ml) 以下である
場合にはこれを製品抗体として保存する。採取された抗
体中の夾雑蛋白の許容濃度と測定濃度とを対比し、この
偏差に応じて洗浄倍率を増減させる操作を繰り返すこと
によって、必要かつ十分な最適洗浄倍率を設定する。な
お、測定濃度が許容濃度以上の場合には採取抗体は再度
処理するものとする。また、溶離液としてはクエン酸の
濃度が0.1 モルのものを使用することが好ましい。（PH
＝６程度）
【００１２】
【発明の効果】以上に説明したように、本発明において
はアフィニティーカラムの洗浄倍率ＸをＹ＝(0.044±0.
005)Ｘ−１±0.5 の式により決定し、この範囲内の洗浄
液量でアフィニティーカラムの洗浄を行う。従って本発
明によれば、従来の過剰量の洗浄液を使用していた方法
に比較して洗浄液量を大幅に減少させ、精製能率の向上
と精製費用の低減を図ることができる。よって本発明は
従来の問題点を解消した抗体の精製方法として、産業の
発展に寄与するところは極めて大きいものである。
はアフィニティーカラムの洗浄倍率ＸをＹ＝(0.044±0.
005)Ｘ−１±0.5 の式により決定し、この範囲内の洗浄
液量でアフィニティーカラムの洗浄を行う。従って本発
明によれば、従来の過剰量の洗浄液を使用していた方法
に比較して洗浄液量を大幅に減少させ、精製能率の向上
と精製費用の低減を図ることができる。よって本発明は
従来の問題点を解消した抗体の精製方法として、産業の
発展に寄与するところは極めて大きいものである。
【図１】アフィニティーカラムの原理図である。
【図２】精製液中の夾雑蛋白濃度と洗浄倍率との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図３】原料液中の夾雑蛋白濃度と洗浄倍率との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図４】本発明を実施するための装置の一例を示すフロ
ーシートである。
ーシートである。
１ アフィニティーカラム ２ 送液ポンプ ３ 検出器 ４ 制御装置 ５ バルブ ６ バルブ ７ バルブ ８ バルブ ９ バルブ
Claims (1)
- 【請求項１】 抗体と夾雑蛋白とを含有する原料液を、
無機質の硬質ゲルを基材としプロティンＡを固定相とし
たアフィニティーカラムに通液後、洗浄、溶離して抗体
を精製するに当り、原料液中の夾雑蛋白の濃度をＹ（mg
/ml ）とし、カラム容量に対する洗浄液量の比として定
義される洗浄倍率をＸとしたとき、Ｙ＝(0.044±0.005)
Ｘ−１±0.5 の式で表される範囲内の量の洗浄液を用い
ることを特徴とする抗体の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4064307A JPH05262799A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 抗体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4064307A JPH05262799A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 抗体の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05262799A true JPH05262799A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=13254458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4064307A Pending JPH05262799A (ja) | 1992-03-23 | 1992-03-23 | 抗体の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05262799A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998023645A1 (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-04 | Genentech, Inc. | Affinity purification of polypeptide on protein a matrix |
-
1992
- 1992-03-23 JP JP4064307A patent/JPH05262799A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998023645A1 (en) * | 1996-11-27 | 1998-06-04 | Genentech, Inc. | Affinity purification of polypeptide on protein a matrix |
| US6127526A (en) * | 1996-11-27 | 2000-10-03 | Genentech, Inc. | Protein purification by Protein A chromatography |
| US6333398B1 (en) | 1996-11-27 | 2001-12-25 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| US6797814B2 (en) | 1996-11-27 | 2004-09-28 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| EP1864999A1 (en) * | 1996-11-27 | 2007-12-12 | Genentech, Inc. | Affinity purification of polypeptide on protein a matrix |
| EP1897890A1 (en) * | 1996-11-27 | 2008-03-12 | Genentech, Inc. | Affinity purification of polypeptide on protein A matrix |
| EP1900751A1 (en) * | 1996-11-27 | 2008-03-19 | Genentech, Inc. | Affinity purification of polypeptide on protein a matrix |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20011120 |