JPH05310780A - 抗体の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】簡便な操作で、収得された抗体の活性を保持さ
せて、抗体含有液から高純度の抗体を効率良く収得する
ことができる抗体の分離精製方法を提供する。 【構成】アニオン交換基とカチオン交換基を併有するイ
オン交換体を充填したカラムに抗体含有液を通液するこ
とにより、抗体含有流出分を収得した後、次いでヒドロ
キシアパタイトを充填したカラムに前記抗体含有流出分
を通液する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗体含有液から、簡便
な操作で高純度な抗体を収得することができる、新規な
分離精製方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】抗体は、免疫反応を司る蛋白質成分であ
るが、近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原蛋白質
の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高ま
っている。抗体は免疫した動物の血液或いは抗体産生能
を保有した細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から
収得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養
液は、抗体以外の蛋白質、又は細胞培養に用いた原料液
に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成
分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する
操作が通常必要である。即ち、硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウム或いはポリエチレングリコール等を多量に添
加して、それらの濃厚溶液から沈殿を採取し、次いでゲ
ル濾過クロマトグラフィー、更にＤＥＡＥセルロース等
の陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを経た後、プロ
テインＡ固定化カラム又は抗原固定化カラムクロマトグ
ラフィーで処理する手法が常用されて来た。このよう
に、従来の方法では多数の工程を経るため、多くの材料
と煩瑣な操作が必要であり、又プロテインＡ固定化カラ
ム及び抗原固定化カラムを用いる方法は、材料が高価で
あると共に、吸着された抗体を脱離する際に、抗体の生
物活性が喪失する危惧があるという問題がある。

【０００３】簡便な操作により抗体含有液から抗体を分
離精製する方法として、ヒドロキシアパタイトを充填材
として用いるクロマトグラフィーが知られている。即
ち、スタンカーらはヒドロキシアパタイト凝集体を充填
剤としたクロマトグラフィーでモノクローナル抗体を高
純度に分離し〔ジャーナル オブ イムノロジカル メ
ソッヅ、７６巻、１５７−１６９ページ、（１９８５
年）〕、又本発明者らは、蛋白質、核酸等の生体高分子
物質の分離精製に有効な分離用ヒドロキシアパタイトを
先に提案した（特開昭６２−１７６９０６号、米国特許
第５，０７３，３５７号）。しかし、ヒドロキシアパタ
イト単独では、吸着容量が一般に小さいために、血清或
いはハイブリドーマ培養液や腹水等の夾雑成分が多い抗
体含有液から抗体を分離精製しようとすると、多量のヒ
ドロキシアパタイトが必要となり、殊に工業的規模では
このことは大きな障害となる可能性がある。

【０００４】又、簡便な操作により抗体含有液から抗体
を分離精製する他の方法として、弱アニオン交換基と弱
カチオン交換基が結合した高分子を有するイオン交換体
を充填材として用いるクロマトグラフィーが知られてい
る。上記イオン交換体は、抗体蛋白質を主として吸着
し、他の蛋白質の大半を素通りさせる特性を有し、容易
に抗体蛋白質を濃縮分離できる特性を有しているが、こ
れを単独で用いて抗体含有液から抗体を分離した場合、
未だ夾雑成分がかなり残存しており、高純度の抗体が要
求される分野においては、更に抗体の純度を高めること
が望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便な操作
で、収得された抗体の活性を保持させて、抗体含有液か
ら高純度の抗体を効率良く収得することができる抗体の
分離精製方法を提供することを課題とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討した結果、まずアニオン交換基
とカチオン交換基を併有するイオン交換体（以下ＡＣイ
オン交換体ということがある）を充填材として用いてク
ロマトグラフィーを行い、その結果得られる抗体含有流
出分について、ヒドロキシアパタイトを吸着材として用
いるクロマトグラフィーを行なうことにより、極めて高
純度の抗体を得ることができることを見出し、本発明を
完成するに至った。即ち、本発明は液体クロマトグラフ
ィー法により抗体含有液中から抗体を分離精製する方法
において、ＡＣイオン交換体を充填したカラムに抗体含
有液を通液することにより、抗体含有流出分を収得した
後、次いでヒドロキシアパタイトを充填したカラムに前
記抗体含有流出分を通液することを特徴とする抗体の分
離精製方法である。以下、本発明を詳細に説明する。本
発明の分離精製方法は、液体クロマトグラフィー法によ
り抗体含有液中から抗体を分離するものであり、具体的
には例えば以下の操作により分離することができる。即
ち、固定相充填剤をカラムに詰め、抗体含有液をカラム
に注入することにより、固定相充填剤に抗体を吸着させ
る。その後、適当な移動相液を供給することにより、固
定相充填剤に吸着させた抗体を、固定相への分配の小さ
いものから順次溶出させる。分配が大きい抗体を分離す
る場合は、移動相液の組成を変化させて固定相への分配
を小さくして溶出させることが好ましい。本発明の分離
方法は、常圧下で充分に実施することができるが、必要
に応じて加圧下で実施することもできる。本発明はＡＣ
イオン交換体を充填材とする液体クロマトグラフィーを
第１工程とするものである。本発明における抗体含有液
は、含有される抗体の種類には全く制限がなく、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤに分類されるい
ずれの抗体でもよく、具体的には抗体を含む血清、マウ
ス腹水上清或いはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養液の上清等
がある。本発明の第１工程において使用するＡＣイオン
交換体は、抗体蛋白質を選択的に吸着する性質を有し、
他の蛋白質の大半を素通りさせる特性を有するものであ
り、アニオン交換基とカチオン交換基を併有するイオン
交換体である。アニオン交換基としては弱アニオン交換
基が好ましく、カチオン交換基としては弱カチオン交換
基が好ましく、具体的には弱アニオン交換基としてはア
ミン系のイオン交換基等があり、弱カチオン交換基とし
てはカルボン酸等のイオン交換基がある。本発明におけ
るＡＣイオン交換体として、弱カチオン交換基と弱カチ
オン交換基が結合した高分子を有するイオン交換体が好
ましく、ＡＣイオン交換体の好ましい具体例として、例
えば米国特許第５，０９２，９９２号、米国特許第５，
０８７，３５９号、米国特許第５，０８５，７７９号、
米国特許第５，０８７，３５９号、米国特許第５，０６
６，３９５号、米国特許第４，７２１，５７３号、米国
特許第４，６０６，８２５号、米国特許第４，６０４，
２３５号及び米国特許第４，４６９，６３０号等に記載
されたイオン交換体がある。ＡＣイオン交換体の市販品
として、ベーカーボンドＡＢｘ（米国Ｊ．Ｔ．ベーカー
社製商品名）等がある。ＡＣイオン交換体に抗体含有液
を通液する前に、予めＡＣイオン交換体塔を平衡化する
ことが好ましい。平衡化を行うには、例えば２５ｍＭの
２−モルホリノエタンスルホン酸（ｐＨ5.6 ）等の水溶
液を使用することができる。

【０００７】従来の抗体精製法においては、クロマトグ
ラフィーによる処理に先立って抗体含有液に硫酸アンモ
ニウム或いはポリエチレングリコール等を添加して、所
謂塩析によって抗体を含む沈殿を分取して、これを溶
解、次いで透析脱塩した上で供給するのが一般である。
これは、血清等の抗体含有液には抗体以外の蛋白質など
夾雑成分が多く含まれ、これをそのまま吸着剤に吸着さ
せると、高価な吸着剤を乱費することとなり、これを避
けるためである。本発明においては、この方法を採用す
ることに何ら支障はないが、これらの工程は本質的に無
用であり、本発明の第１工程においては、塩析工程を省
略して、抗体含有液を直ちにＡＣイオン交換体塔に供給
することができる。塩析工程を省略することは、特にｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養液を原料とする場合に有利であ
る。即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養液は、少なくとも
現時点においては産生抗体濃度が極めて低く、多くて
０．１ｍｇ／ｍｌであり、通例はその１／１０〜１／１
００であり、容量が立方メートル単位の工業的規模の場
合、塩析に要する塩の使用量は著しく多く、更に塩濃度
の高い有機性廃液の処理が難問として加わり、塩析工程
を無用とすることには大きな意義がある。

【０００８】抗体含有液を通液する条件は、液体クロマ
トグラフィーとして通常採用される条件をいずれも採用
できるが、好ましくは、水で希釈する等により、抗体含
有液の含有塩類濃度を略１００ｍＭ以下として、且つｐ
Ｈを４．５〜６．０の範囲に調整して、ＡＣイオン交換
体を充填した塔（以下ＡＣイオン交換体塔と略す）に通
液するのが良い。

【０００９】次に、ＡＣイオン交換体塔の展開溶離操作
に移る。このときの展開溶離操作は液体クロマトグラフ
ィー法で通常採用されている条件に準じて行うことがで
き、まず、稀溶離液を通液することにより、抗体以外の
蛋白質を主に含有する成分を流出させる。好ましい稀溶
離液としては、燐酸、酢酸、モルホリノエタンスルホン
酸（ＭＥＳ）及びモルホリノヒドロキシプロパンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳＯ）等のカリウム、ナトリウム、アンモ
ニウム塩の水溶液があり、これらの中でもＭＥＳは特に
好ましいものである。好ましい稀溶離液のｐＨ及び濃度
は、各々ｐＨが４．５〜６．０であり、濃度が１０〜１
００ｍＭであり、より好ましくはｐＨが４．８〜５．８
であり、濃度が１０〜５０ｍＭである。

【００１０】次に、グラジエント方式或いはステップワ
イズ方式により濃溶離液でＡＣイオン交換体塔を展開す
る。濃溶離液としては、上記稀溶離液の塩類の他に、硫
酸、塩酸等のカリウム、ナトリウム、アンモニウム塩の
水溶液を使用することができ、好ましいｐＨは５．０〜
８．０であり、濃度の上限を必要に応じて１Ｍにするこ
ともできる。ＡＣイオン交換体塔の流出液については、
例えば波長２８０ｎｍにおける紫外線吸収により、流出
液における蛋白質濃度の変化を観察して、抗体流出分
（以下第１工程流出分という）を分取して、これを第２
工程においてヒドロキシアパタイトを充填した塔（以下
ヒドロキシアパタイト塔という）に載荷する。

【００１１】本発明はヒドロキシアパタイトを充填材と
する液体クロマトグラフィーを第２工程とするものであ
る。第１工程流出分をそのままヒドロキシアパタイト塔
に載荷することも可能であるが、好ましくはｐＨを４．
５〜８．０、より好ましくは５．２〜７．０に調整した
上で載荷する。第２工程の展開は稀溶離液をもって始め
られ、濃溶離液をもって終わる。このときに使用する稀
溶離液として、第１工程において使用可能な溶離液はい
ずれも使用可能である。

【００１２】次いで、グラジエント方式或いはステップ
ワイズ方式により、濃溶離液を通液してヒドロキシアパ
タイト塔を展開する。このときの濃溶離液も第１工程に
おいて使用可能な溶離液はいずれも使用可能である。第
１工程によって夾雑成分を分離して、抗体をかなり濃縮
した流出分を収得することができ、第２工程の展開後に
おいて、第１工程において少量残存した不純分が更に分
離除去され、高度に精製された抗体含有流出分を収得す
ることができる。第２工程の流出液については、第１工
程と同様にして、紫外線吸収を観察して、抗体含有流出
分（以下第２工程流出分と略す）を分取することができ
る。又、第２工程流出分から、適宜脱塩して更に高純度
の抗体標品を収得することができる。

【００１３】本発明において、ヒドロキシアパタイトと
して特開昭６２−１７６９０６号公報又は米国特許第
５，０７３，３５７号に記載されたものを使用すること
は、本発明の効果を高度に発揮させる上で有効である。
このヒドロキシアパタイト凝集体は、六角柱状又は針状
のヒドロキシアパタイト単結晶が凝集した平均粒径６０
〜１００μｍの凝集体である。従来のヒドロキシアパタ
イトは板状又は鱗片状をなし、通液性が低い傾向がある
ことは周知であり、分析に用いる程度の流速を得るにも
加圧が必要であり、現にこれが適用されている。しかし
ながら、加圧は特別の装備を必要とし、特に多量の処理
が要請される調製用途には障害となる。殊に、本発明の
第１工程において使用するＡＣイオン交換体は、通常常
圧で高流速をもって抗体含有液を処理できるように、粒
径を適宜選択して用いられていることからして、第２工
程において使用する充填材であるヒドロキシアパタイト
もこれに均衡したものを用いることが望ましく、これに
よって本発明の技術的価値は最も高まるのである。上記
ヒドロキシアパタイト凝集体は、極めて高い通液性を有
し、常圧においても充分に第１工程に対応する流速が確
保され、特に抗体の大量調製に威力を発揮する。

【００１４】ヒドロキシアパタイト凝集体は、細孔容積
が１〜５ml/gであることが好ましく、より好ましい細孔
容積は、１．５〜３ml/gである。ここで細孔容積とは、
ヒドロキシアパタイト凝集体に含まれる細孔の全容積の
ことをいい、水銀接触角を１３０゜とし、表面張力を４
８４dyn/cmとする条件下で、水銀圧入法により、測定さ
れる値である。細孔容積が１ml/g未満のものは、十分な
流速が得られ難いほか、目詰まりを起こし易く、又抗体
の吸着量も十分ではない。他方、細孔容積が５ml/gを越
えるものは、凝集体の強度が長時間使用するには充分で
はない。

【００１５】また、ヒドロキシアパタイト凝集体の好ま
しい平均粒子径は、６０〜１００μｍであり、ヒドロキ
シアパタイト凝集体のうち、粒径１０μｍ未満の微小凝
集体の割合が１vol%以下であることが好ましい。粒径１
０μｍ未満の微小凝集体の割合が１vol%を越えると、こ
れらの微小凝集体が細孔に入り込み、目詰まりを起こし
易く、分離性能が低下する原因となり、さらに、カラム
にヒドロキシアパタイト凝集体を充填する際、上澄みに
存在する微粒子をデカンテーションで除去する必要性が
生じることがある。

【００１６】ヒドロキシアパタイト凝集体は、例えばモ
ネタイトの六角柱状または針状結晶を合成し、しかる後
にアルカリ添加によりヒドロキシル化して製造すること
が出来るが、１〜５ml/gの好ましい細孔容積を持つヒド
ロキシアパタイト凝集体を得るには、六角柱状または針
状のモネタイト結晶を加熱下アルカリ処理する際に、使
用するアルカリとしてＫＯＨ又はＬｉＯＨを選択するこ
とが好ましい。

【００１７】ヒドロキシアパタイト凝集体の合成例を以
下に示す。 合成例 先ず、針状ヒドロキシアパタイト凝集体を以下のように
して合成した。即ち、攪拌機及び冷却管を取りつけた３
l フラスコに純水１l を仕込み、９５℃に加熱した後、
０．５モル／l の塩化カルシウム水溶液と０．５モル／
l のリン酸２ナトリウム水溶液各１l を５時間かけて滴
下し、針状結晶のモネタイトからなる凝集体を得た。引
き続き同温度で、１モル／l の水酸化カリウム水溶液３
００mlを１時間かけて滴下し、針状ヒドロキシアパタイ
ト凝集体を得た。

【００１８】上記のようにして得た針状ヒドロキシアパ
タイト凝集体について、以下のようにして細孔容積、粒
度分布及び通液性に関する評価を行った。 （細孔容積）水銀接触角を１３０゜とし、表面張力を４
８４dyn/cmとする条件下で、水銀圧入法により、ヒドロ
キシアパタイト凝集体の細孔容積を測定した。 （粒度分布）堀場製作所製レーザー回折式粒度分布測定
装置ＬＡ−５００を用いて、粒度分布を測定し、平均粒
径を求めた。 （通液性試験）内径１．２５ｃｍ、長さ４０cmのガラス
製オープンカラムにベッドボリューム１５mlとなるよう
にヒドロキシアパタイト凝集体を充填し、さらに１０mM
燐酸緩衝液（ｐＨ6.8 ）を加えて全量が３０mlとなるよ
う調製した。前記緩衝液を常圧下で通液し、単位時間当
りの流出量（ml/Hr）を測定した。細孔容積、平均粒
径、通液性試験及び充填率の結果を以下に記す。 細孔容積：１．８ml/g 平均粒径：８９μm（１０μm以下の割合：０．３％） 充填率 ：４．８％ 通液性 ：２４０ml

【００１９】本発明の抗体分離方法では、第２工程のヒ
ドロキシアパタイト塔の充填率を１０％以下にすること
が好ましく、より好ましくは塔の充填率を２〜８％、更
により好ましくは３〜５％にする。充填率が１０％を越
えると、常圧下で充分な流速が得られ難い傾向がある。
ここで、充填率（Ａ）は下式で算出される値である。

【００２０】充填率は、ヒドロキシアパタイト凝集体の
粒度分布及び細孔容積等により容易に制御することがで
きる。このように低い充填率を有するカラムを調製する
には、前記のヒドロキシアパタイト凝集体を溶媒中に分
散させ、適当な濃度のスラリー状になったものをカラム
に充填すればよい。分散させる溶媒としては、液体クロ
マトグラフィーを行う際に用いる溶液、例えば、５〜１
０mM燐酸緩衝液でよい。

【００２１】上記ヒドロキシアパタイト凝集体の市販品
として、ギガパイト（東亞合成化学工業株式会社製商品
名）等がある。

【００２２】ヒドロキシアパタイト凝集体を用いた、そ
の他の分離操作については、一般的な液体クロマトグラ
フィー法の操作に従えば良いが、好ましい条件として
は、例えば以下のものがある。流速：一般にカラムの大
きさにより違うが、分析用では０．５〜１ml/min、分取
用では３〜５ml/minが適当であり、例えば内径１．２５
ｃｍ、長さ４０cmのガラス製オープンカラムでは、２〜
３ml/minが適当である。 移動相液の通液量：カラムに充填したヒドロキシアパタ
イト凝集体の約１０倍の体積量。 移動相液の組成：燐酸緩衝液、より好ましくは燐酸カリ
ウム緩衝液。 溶出条件：１〜１０mMから３００mMまでの勾配溶出。 カラム温度：室温。抗体の変質を防止するため、より好
ましくは４℃。 抗体含有液の負荷量：最大吸着量の約１０分の１。

【００２３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。 実施例１ 〔第一工程〕ＡＣイオン交換体としてベーカーボンドＡ
Ｂｘ４０μｍ（米国Ｊ．Ｔ．ベーカー社製商品名）を用
い、その１６ｍｌを内径１．５ｃｍφの管に高さ９ｃｍ
充填した。１０ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ5.5 ）を２ｍ
ｌ／ｍｉｎで流して安定させた後、ヒト絨毛性性腺刺激
ホルモンβサブユニット（ｈＣＧ−β）モノクローナル
抗体（ＩｇＧ）産生ハイブリドーマを接種増殖したマウ
ス腹水上清をｐＨ５．５として、その２０ｍｌを２ｍｌ
／ｍｉｎで通液した。次いで、溶離液を稀溶離液である
１０ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ5.5 ）から濃溶離液であ
る５００ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ5.5 ）へ、直線勾配
で５０％迄６０分で２ｍｌ／ｍｉｎで移行した。塔流出
液を紫外線吸収（波長２８０ｎｍ）で追跡した状況を図
１に示す。図１において、横軸は通液時間を示し、又縦
軸は紫外線の吸光度（実線）及び溶離液の濃度勾配（点
線）を示す（以下図２〜図７においてその表記方法は図
１と同じである。）。予備実験により図１の斜線部に抗
体が含まれていることがわかっており、この流出分
（ａ）を分取して、第２段工程に移行する。なお、流出
分（ａ）の少量を純度検査用に使用する。図１によれ
ば、流出分（ａ）以外に多数の紫外線吸収ピークが認め
られ、夾雑成分が分離除去されていることがわかる。

【００２４】〔第２工程〕ヒドロキシアパタイトとして
１８．５ｍｌのギガパイト（東亞合成化学工業株式会社
製商品名）を内径１．５ｃｍの管に高さ１０．５ｃｍ充
填した。１０ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ5.5 ）を２ｍｌ
／ｍｉｎで流して平衡化し、次いで第１工程の流出分
（ａ）２０ｍｌを２ｍｌ／ｍｉｎで通液した後、稀溶離
液１０ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ5.5 ）から濃溶離液５
００ｍＭ−ＫＨ₂ ＰＯ₄ （ｐＨ7.0 ）へ、直線勾配で５
０％迄６０分で２ｍｌ／ｍｉｎで移行した。塔流出液を
紫外線吸収（波長２８０ｎｍ）で追跡した状況を図２に
示す。斜線部が抗体を含み、この流出分を（ｂ）とし
て、流出分（ｂ）を第１工程における流出分（ａ）と同
様に純度検査に使用する。図２によれば、流出分（ｂ）
以外に若干の紫外線吸収ピークが認められ、流出分
（ａ）から流出分（ｂ）以外の夾雑成分が分離除去され
ていることがわかる。

【００２５】〔純度検査〕図８は１％ＳＤＳ加１２．５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す写真であ
り、レーンＭは分子量マーカー、レーンＡは抗体原料
液、レーン１は第１工程で収得した流出分（ａ）、レー
ン２は第２工程で収得した流出分（ｂ）を示す。又、５
０Ｋ付近に現れる蛋白質は、抗体ＩｇＧの重鎖、２８Ｋ
付近に現れる蛋白質は抗体ＩｇＧの輕鎖を示す。図８に
示されるとおり、抗体原料より第１工程を経て収得した
流出分（ａ）は夾雑成分が除去され、第２工程によって
更に精製されていることが明らかである。

【００２６】実施例２ 〔第１工程〕実施例１と同様に、ベーカーボンドＡＢｘ
４０μｍを充填した塔に抗体含有液を供給した。但し、
平衡化用液及び稀溶離液として２５ｍＭ−〔２−モルホ
リノエタンスルホン酸（ｐＨ5.5 ）〕を使用し、濃溶離
液として１Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ7.0 ）を用いて展
開溶離した。紫外線吸収（波長２８０ｎｍ）による追跡
は図３の通りであり、斜線部を分取し、流出分（ｃ）と
して第２工程の原料液として使用した。

【００２７】〔第２工程〕第１工程の流出分（ｃ）を受
け、実施例１の第２工程と同様に操作して図４の斜線部
である流出分（ｄ）を収得した。 〔純度検査〕１％ＳＤＳ加１２．５％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動像を示す写真であり、レーン３は第１工
程で収得した流出分（ｃ）、レーン４は第２工程で収得
した流出分（ｄ）を示す。図８に示される通り、第１工
程の溶離液の選択によって精製度の向上と共に第２工程
の収得物の一層の高純度化が達成される。

【００２８】〔抗体活性の確認〕実施例に用いた抗体の
抗原であるヒト絨毛性性腺刺激ホルモンβサブユニット
に対する酵素標識抗原抗体反応試験（ＥＬＩＳＡ）を行
った。各試料についての蛋白量の検出限界は、抗体原料
液については０．１２５ｍｇ／ｍｌであり、第１工程を
経た流出分（ｃ）については０．０６３ｍｇ／ｍｌであ
り、第２工程を経た流出分（ｄ）については０．０３２
ｍｇ／ｍｌであった。これより、本発明の方法により収
得される抗体はその活性を傷害するものではないこと、
更にＥＬＩＳＡ法の精度から定量的ではないが、第１工
程から第２工程へと抗体純度の向上が明確に認められ
る。

【００２９】実施例３ 第１工程は実施例２と同様にして操作して、第２工程に
おいては稀溶離液として２５ｍＭ−〔２−モルホリノエ
タンスルホン酸（ｐＨ5.5 ）〕を使用し、濃溶離液とし
て１Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ7.0 ）を用いて展開溶離
した。このときの溶離状況を図５に示した。この図にお
ける斜線部の流出分（ｅ）についての１％ＳＤＳ加１
２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動像を図８にお
けるレーン５に示した。レーン５のスペクトルから明ら
かなように流出分（ｅ）おいては全く他の夾雑成分を見
ない極めて高純度に精製されていることが判る。

【００３０】実施例４ マウス腎臓基底膜由来モノクローナル抗体ＩｇＭ含有マ
ウス腹水を抗体含有液として実施例１と同様にして精製
した。第１工程の溶離状況を図６に示す。この図の斜線
部は抗体ＩｇＭを含む画分であり、これを分取して流出
分（ｆ）とした。第２工程の溶離状況を図７に示す。斜
線部が抗体ＩｇＭを含み、これを分取して流出分（ｇ）
とした。図６において抗体以外の夾雑成分が除去されて
いるのが認められ、図７において更に他の夾雑成分が分
離除去されていることが認められ、抗体の純度を一層高
めることができたことが明らかである。

【００３１】

【発明の効果】本発明は、本質的に僅か２工程からな
り、従来法に比較して極めて簡便な工程で、常圧下にお
いても高い流速で抗体を高純度で分離精製することを可
能とするものであり、温和な条件下で且つ僅かな工程で
分離精製することができることから、本発明により、抗
体を高い収率で収得することができ、しかも抗体活性を
保持させることができる。特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞
培養からの抗体調製で、塩析を省略することは、分離精
製に必要な材料の消費と廃液処理を節減することができ
ることにつながり、今後の工業的規模での発展を促進す
ることが期待される。又、抗体ＩｇＭの精製が本発明に
より可能となったことは、従来法による抗体の精製の重
要な手段とされていたプロテインＡ固定化吸着材がＩｇ
Ｍに対して非力であったことから、此の分野に新しい有
力な技術を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の第１工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムである。実線は波長が２８０ｎｍである紫
外線の吸光度を示し、点線は溶離液の濃度勾配推移を示
す。

【図２】実施例１の第２工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図３】実施例２の第１工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図４】実施例２の第２工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図５】実施例３の第２工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図６】実施例４の第１工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図７】実施例４の第２工程流出液の観測結果を示すク
ロマトグラムであり、実線及び点線は図１と同じ意味で
ある。

【図８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動像で
あり、レーンＡは実施例１，２及び３において使用した
抗体含有液の像であり、レーン１，２，３，４及び５は
各々流出分（ａ）、流出分（ｂ）、流出分（ｃ）、流出
分（ｄ）及び流出分（ｅ）の像である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体クロマトグラフィー法により抗体含有
   液中から抗体を分離精製する方法において、アニオン交
   換基とカチオン交換基を併有するイオン交換体を充填し
   たカラムに抗体含有液を通液することにより、抗体含有
   流出分を収得した後、次いでヒドロキシアパタイトを充
   填したカラムに前記抗体含有流出分を通液することを特
   徴とする抗体の分離精製方法。
2. 【請求項２】ヒドロキシアパタイトとして、六角柱状ま
   たは針状のヒドロキシアパタイトの凝集体であり、細孔
   容積が１〜５ml/gであるヒドロキシアパタイト凝集体を
   用いることを特徴とする請求項１記載の抗体の分離精製
   方法。