JPH0459798A - アフィニティクロマトグラフィーによる抗体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はプロティンＡあるいはプロティンＧをリガンド
とするアフィニティ担体を用いたアフィニティクロマト
グラフィーにより動物細胞培養上清等の原料液から抗体
を効率的に精製することができるアフィニティクロマト
グラフィーによる抗体の精製方法に関するものである。

（従来の技術） 動物細胞培養上清中に含まれるモノクローナル抗体等の
抗体の濃度は一般に０．０１〜０．１Ｂ／ａ＋１と非常
に希薄であるため、抗体を精製する際には大量の動物細
胞培養上清を原料液としてアフィニティ担体に流す必要
がある。

ところが上記のような目的で使用されるアフィニティ担
体としては、従来はアガロース系あるいはセルロース系
の比較的軟質のものが普通であったため、カラム内の線
速度を大きくすると圧密が生じて液が流れなくなる。そ
こでカラム内の吸着体体積Ｖを原料液の体積流量Ｆで割
ったＶ／Ｆの値が２００ｓｅｃ前後となるようにゆっく
りとした流速で原料液を供給し、精製を行っていた。

ところが抗体は原料液中の動物細胞が放出したプロテア
ーゼによって分解されるおそれがあるためにできるだけ
速く精製を完了することが求められ、このためにはカラ
ム体積を大きくする必要がある。従って設備が大型化し
、精製コストが高くなる欠点があった。

さらにまた、抗体等のタンパク質の濃度は一般に紫外線
（２８０■）の吸収で測定されるが、原料中の不純物に
も紫外線の吸収があるため、カラムから漏出した抗体の
濃度をモニターすることは本来不可能である。従って、
破過開始時間は計算により求めざるを得ないのであるが
、従来は原料液を供給する流速に対する破過開始時間を
正確に予測することができなかったために、安全を見て
破過開始のかなり前に原料液の供給を停止しており、−
度の精製工程により得られる抗体の量が少なく、精製さ
れた抗体の濃度を小さなものとしていた。また、破過が
開始されてから原料液の供給を止めた場合、精製された
抗体の濃度は高くなるものの、カラム外へ抗体が漏出し
てしまうため、経済的ではない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記した従来の問題点を解決して、カラム中へ
供給される原料液の速度を大きくすることにより精製コ
ストの低減を図るとともに、破過開始時間を正確に予測
することにより効率よく抗体を精製することができるア
フィニティクロマトグラフィーによる抗体の精製方法を
提供するために完成されたものである。

（課題を解決するための手段） 上記の課題を解決するためになされた第１の発明は、プ
ロティンＡおよびプロティンＧをリガンドとするアフイ
ニテイ担体を用いたアフイニテイクロマトグラフイーに
より原料液から抗体を精製する方法において、シリカ系
のアフイニテイ担体を用いるとともに、 ｔ　−（（Ａｏ／Ｃ）Ｘ（Ｖ／Ｆ）　Ｘ　Ｔ　）　＋（
Ｖε／Ｆ）但しＴ＝−１，６３Ｘ（１／ＮＰ、ｒ＠）　
＋　１Ｎ　ｌ、ｏｒ＊＝（Ｄｏｏｒｓ／ｒ”　）　Ｘ１
５Ｘ（Ｖ／Ｆ）　Ｘ（１−ｔ　）（ここでｔは破過開始
時間ｓｅｃ　、　Ａｓは原料液の抗体濃度に対する平衡
吸着容量ｓｇ／ｍ１−ｂｅｄ、　Ｃは原料液の抗体濃度
−ｇ／ｍｌ　、　Ｖはカラム内の吸着体体積ｍｌ、　Ｆ
は原料液の体積流量ｍｌ／ｓｅｃ、εはカラム内の担体
の粒子間の空隙率、Ｄ、。１．は有効粒内拡散係数ｄ／
ｓｅｅ、　ｒは担体の粒子半径ｌ）の式を用い、この式
に予め精製された不純物を含まない抗体をカラムに流す
ことにより得られたカラムの緒特性（ｐ−ｏおよびＤ９
゜ｒ＠　／ｒｔの値）を代入し、破過開始時間を予測す
るとともに予測された破過開始時間の寸前にカラムへの
原料液の供給を停止し、直ちにカラムを洗浄し溶離液を
流すことにより目的とする抗体を精製することを特徴と
するアフィニティクロマトグラフィーによる抗体の精製
方法を要旨とするものである。

また上記の課題を解決するためになされた第２の発明は
、プロティンＡおよびプロティンＧをリガンドとするア
フィニティ担体を用いたアフィニティクロマトグラフィ
ーにより原料液から抗体を精製する方法において、アフ
ィニティ担体として平均粒子径２０〜４０ＩＩ１１、平
均細孔径２５０〜６５０Å、粒子間の空隙率εが０．２
〜０．４のシリカ系の担体を用い、カラムへ供給される
原料液の流速を前記のＶ／Ｆが８〜６０ｓｅｃとなるよ
うに調整しつつ精製を行わせることを特徴とするアフィ
ニティクロマトグラフィーによる抗体の精製方法を要旨
とするものである。

上記のように本発明の第１の特徴は、従来のアガロース
系あるいはセルロース系の担体に替えて硬質のシリカ系
の担体をアフィニティ担体として使用することである。

このような硬質・の担体はカラム内の原料液の線速度を
大きくしても圧密か生じることがない。またリガンドと
しては、抗体のＦｃｔｆＭ域に強い親和性を示し、各種
の抗体を精製できるプロティンＡあるいはプロティンＧ
が用いられる。

本発明の第２の特徴は、原料液の供給を開始してから破
過が開始するまでの時間を正確に予測する技術を確立し
たことである。

本発明者等の研究によれば、破過開始時間ｔはｔ　””
　（（ＡＯ／Ｃ）Ｘ（Ｖ／Ｆ）　　ＸＴ）　＋（Ｖε／
Ｆ）イ旦しＴ＝−１，６３Ｘ（１／Ｎｐｏｒｅ）　＋１
Ｎ　ｐｏｒ＊＝（Ｄｐｏｒ＊／ｒ”　　）ｘ１５ｘ（ｖ
／Ｆ）ｘ（１−ｔ　）の式により求められる。これらの
式はカラム内の物質収支式と担体粒子内の拡散方程式を
同時に解くことにより得られたものである。しかし実際
のカラムにこの式を適用するためには、予め精製された
不純物を含まない抗体をカラムに流すことにより、アフ
ィニティクロマトグラフィーに使用するカラムの緒特性
（Ｄｉ。ｒ−ａ／ｒ”　、Ａｏ等）を測定しておく必要
がある。具体的な方法は後の実施例に示すが、本発明者
等の研究により、従来は流速にかかわらず一定であると
考えられていたこれらの値がＶ／Ｆの関数であることが
明らかとなった。

第１の発明においては、上式により予測された破過開始
時間ｔの寸前にカラムへの原料液の供給を停止し、直ち
にカラムを洗浄し溶離液を流す。

このようにすれば、第１図に示されるように原料液中の
抗体のうちアフィニティ担体に吸着されずに流出する量
をゼロとすることができる。またアフィニティ担体の吸
着容量を最大限に利用することができ、精製される抗体
の濃度を固めることができるとともに、設備の小型化を
図ることができる。

ところで、前記のようにＤｐｏｒｅ／ｒ”　、Ａｏ等は
Ｆ／Ｖの関数であり、Ｐ／Ｖを大きくすると平衡吸着容
量Ａ０が減少する傾向があるものの、流速が大きくなっ
た効果により単位時間当たりに精製できる抗体の量は増
加する。この結果、Ｖ／Ｆを変化させると抗体の精製速
度が最も高くなる領域が存在することが初めて判明した
。

第２の発明はかかる知見に基づくものであり、アフィニ
ティ担体として平均粒子径２０〜４０μ酸、平均細孔径
２５０〜６５０Å、粒子間の空隙率εが０゜２〜０．４
のシリカ系の担体を用いた場合、Ｖ／Ｆが８〜６０．ｔ
ｅａとなるように調整しつつ精製を行わせるものである
。これらの数値限定のうち、平均粒子径、平均細孔径、
粒子間の空隙率の値は実用的なシリカ系の担体を表した
もので、それ自体には臨界的な意味はない。しかしＶ／
Ｆの値を特定するためにはこれらの数値が必要である。

またＶ／Ｐの値は８〜６０ｓｅｃの範囲を外れると抗体
の精製速度が低下する。そしてこの範囲内の速度で原料
液をカラムに供給すれば、迅速に抗体の精製を行うこと
が可能となる。

以下にこれらの発明を実施例により更に詳細に説明する
。

（実施例） 直径４．６論、長さ１００　ｍ　（容量１．６６ｍ１）
のシリカ系の担体（平均粒子径２０〜４０μｍ、平均細
孔径２５０〜６５０Å、ε＝０．２５）にプロティンＡ
をリガンドとして結合させたアフィニティ担体を用い、
抗体濃度が０．１ｍｇ／ｍｌの動物細胞培養上清を精製
した。流速をさまざまに変化させて実験した結果、この
アフィニティ担体の抗体に対するり、。ｒ、／ｒ”の値
は、第２図に示すように、 ｎｏｏｒｓ／ｒ”　＝　０．０６３　Ｘ　（Ｆ／Ｖ）　
”　”’（ｓｅｃ−’　）の実験式で整理できた。

また使用したアフィニティ担体の平衡吸着容量Ａは、第
３図に示すように、 Ａ　＝　６．５５　ｘ　（Ｐ／Ｖ）弓”３３（ｍｇ／ｍ
１−ｂｅｄ）　（７）実験式で整理できた。これらの値
を、 ｔ　＝　　（（Ａｏ／Ｃ）Ｘ（Ｖ／Ｆ）　　ｘ’ｒ）　
　＋（Ｖε／Ｆ）Ｔ＝−１，６３ｘ（１／Ｎ、。、、）
＋１Ｎ　ｐｏｒ＊＝（ｎｏｏｒｓ／ｒ”　　）　Ｘ１５
Ｘ（Ｖ／Ｆ）　　Ｘ（１−ａ　）の各式に代入した結果
、第１表に示したとおり各流速における破過時間、精製
速度が計算により予測できた。

（ここで精製速度は、第１表のｔまでの吸着量をｔと洗
浄−溶離−再平衡に要する時間で割った値と定義した。

洗浄と再平衡にはベツドボリュームの３０倍の液量を要
し、Ｖ／Ｆ　＝９．９６で行い、溶離にはベツドボリュ
ームの５倍の液量を要し、Ｖ／Ｆ　＝１９．９２で行う
ものとした。従って、精製速度 ＝ｔまでの吸着量ハｔ　＋９．９６ｘ３０＋１９．９２
　ｘ　５　）＝ｔまでの吸着量　／　（ｔ　＋３９８．
４）　（ｍｇ／ｍ１−ｓｅｃ）となる。） 第１表 第１表より、Ｆ　＝０．０８３３＋ｓｌ／ｓｅｃで精製
すれば最も速く精製できることが判明したため、以後の
精製はこの流速で行った。またこの場合、破過開始時間
ｔは９８２．２秒と予測されたが、抗体の流出によるロ
スを防ぐため、８８０秒（１４，７分）でカラムへの原
料液の供給を停止し、直ちにカラムの洗浄−溶離−再平
衡化を３９８秒（６，６分）で行った。このサイクルを
３回繰り返すことにより、約１時間で２２ｍｇの抗体を
精製することができた。抗体の回収率はほぼ１００％で
あり、計算通りほとんど抗体のロスがないことが確認さ
れた。

第４図は第１表の結果をグラフ化したものであり、Ｖ／
Ｆが８〜６０ｓｅｃのときに高い精製速度が得られるこ
とが分かる。

なお、従来の軟質ゲルのアフイニテイ担体ではカラム内
の線速度が小さい領域でしか操作することができないた
め、実施例のようにり、。ｆａｉｒ”の値や平衡吸着容
量Ａを実験式にまとめること自体が不可能であり、その
ような着想がなされたこともない、また最も大きな精製
速度を得るためには、圧密か生じない最大可能流速で原
料液を供給する必要があるが、その流速は、第１表の最
上段のＶ／Ｆ　＝９９．６秒の付近であり、従って精製
速度も０゜０５（ａｇ／ｍ１−ｓｅｃ）前後という低い
値となる。

（発明の効果） 以上に説明したように、本発明によればシリカ系の硬質
のアフィニティ担体を用いることによりカラム中へ供給
される原料液の速度を大きくすることができ、大型の装
置を用いなくても大量の動物細胞培養上清等の原料液を
アフィニティ担体に流すことができ、精製コストの低減
を図るとことができる。しかも本発明によれば、破過開
始時間を正確に予測することができ、効率よく抗体を精
製することができる。よって本発明は従来の問題点を一
掃したアフィニティクロマトグラフィーによる抗体の精
製方法として、産業の発展に寄与するところは極めて大
きいものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は吸着操作時間を横軸としカラムからの流出液中
の抗体の濃度を縦軸として表したグラフ、第２図は実施
例のアフィニティ担体におけるり、。ｒ＠／ｒ２の値と
Ｆ／Ｖの値との関係を示すグラフ、第３図は同じ〈実施
例のアフィニティ担体における平衡吸着容量Ａの値とＦ
／Ｖの値との関係を示すグラフ、第４図は実施例におけ
る精製速度とＶ／Ｆの値との関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プロテインＡ及びプロテインＧをリガンドとするア
   フィニティ担体を用いたアフィニティクロマトグラフィ
   ーにより原料液から抗体を精製する方法において、シリ
   カ系のアフィニティ担体を用いるとともに、 ｔ＝〔（Ａ＿０／Ｃ）×（Ｖ／Ｆ）×Ｔ〕＋（Ｖε／Ｆ
   ）但しＴ＝−１．６３×（１／Ｎ＿ｐ＿ｏ＿ｒ＿ｅ）＋
   １Ｎ＿ｐ＿ｏ＿ｒ＿ｅ＝（Ｄ＿ｐ＿ｏ＿ｒ＿ｅ／ｒ＾２
   ）×１５×（Ｖ／Ｆ）×（１−ε）（ここでｔは破過開
   始時間ｓｅｃ、Ａ＿０は原料液の抗体濃度に対する平衡
   吸着容量ｍｇ／ｍｌ−ｂｅｄ、Ｃは原料液の抗体濃度ｍ
   ｇ／ｍｌ、Ｖはカラム内の吸着体体積ｍｌ、Ｆは原料液
   の体積流量ｍｌ／ｓｅｃ、εはカラム内の担体の粒子間
   の空隙率、Ｄ＿ｐ＿ｏ＿ｒ＿ｅは有効粒内拡散係数ｃｍ
   ＾３／ｓｅｃ、ｒは担体の粒子半径ｃｍ）の式を用い、
   この式に予め精製された不純物を含まない抗体をカラム
   に流すことにより得られたカラムの諸特性（Ａ＿０およ
   びＤ＿ｐ＿ｏ＿ｒ＿ｅ／ｒ＾２の値）を代入し、破過開
   始時間を予測するとともに予測された破過開始時間の寸
   前にカラムへの原料液の供給を停止し、直ちにカラムを
   洗浄し溶離液を流すことにより、目的とする抗体を精製
   することを特徴とするアフィニティクロマトグラフィー
   による抗体の精製方法。 ２、プロテインＡおよびプロテインＧをリガンドとする
   アフィニティ担体を用いたアフィニティクロマトグラフ
   ィーにより原料液から抗体を精製する方法において、ア
   フィニティ担体として平均粒子径２０〜４０μｍ、平均
   細孔径２５０〜６５０Å、粒子間の空隙率εが０．２〜
   ０．４のシリカ系の担体を用い、カラムへ供給される原
   料液の流速を前記のＶ／Ｆが８〜６０ｓｅｃとなるよう
   に調整しつつ精製を行わせることを特徴とするアフィニ
   ティクロマトグラフィーによる抗体の精製方法。