JP2014501911A - ガードカラムを備えるクロマトグラフィーシステム - Google Patents

Abstract

クロマトグラフィー樹脂を含むメインカラム（１）と、第１のガードカラム（２）と、第２のガードカラム（３）とを備えるクロマトグラフィーシステム。第１のガードカラム（２）はメインカラムの第１の端部（４）に接続され、第２のガードカラム（３）はメインカラムの第２の端部（５）に接続され、前記第１及び第２のガードカラムのベッド体積はそれぞれ、メインカラムのベッド体積の約５０％未満である。
【選択図】 図１

Description

本発明は、クロマトグラフィー分離に関し、詳細には、モノクローナル抗体など生体分子の大規模クロマトグラフィー分離に関する。より詳細には、ガードカラムを備えるクロマトグラフィーシステム、及びかかるシステムを操作する半連続的方法に関する。

生物薬剤分野では、遺伝子工学及び細胞培養技術における最近の進歩により、発現レベルが以前より高くなっており、下流側の精製、特にキャプチャ段階に対して著しい負担がかかっている。新しいクロマトグラフィー樹脂の導入により、従来の単一カラムクロマトグラフィーに基づくプロセスの効率がかなり改善されるが、いくつかのカラムを用いた周期的モードで動作させることによって、さらなる改善を得ることができる。これは、異なる様々な連続的又は半連続的クロマトグラフィー、例えば、ＷＯ２００８１５３４７２に記載されているような疑似移動床クロマトグラフィー（ＳＭＢ）、及びＨｅｅｔｅｒらによって記述されたものなど周期的向流クロマトグラフィー（ＰＣＣ）に適用されている（Ｈｅｅｔｅｒ Ｇ．Ａ．及びＬｉａｐｉｓ Ａ．Ｉ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ７１１、３〜２１（１９９５年））。

溶質に対するクロマトグラフィーカラムの結合容量は、プロセスクロマトグラフィーにおいて極めて重要な要素である。結合容量は、クロマトグラフィー段階の生産性及びコストに直接影響を及ぼす。結合容量は、動的／漏出点容量の意味で、又は最大結合容量として定義されている。動的容量は、カラム容積と供給液流量との比として定義される滞留時間など、クロマトグラフィー媒体で充填されたカラムを通して溶液が流れる条件によって決まる。最大結合容量は、滞留時間が無限に長い場合の、カラムの漏出点容量を示している。初期漏出点容量は、結合溶質が最初に溶出液内で検出された時点でのカラムによって取り上げられる結合溶質の量として定義される。漏出点容量はまた、所与の割合の漏出点での容量として定義することができ、ここで、割合は供給液内に存在する溶質のパーセントで示すカラムからの溶出液に存在する結合溶質の量を表している。この定義によれば、最大結合容量は、漏出点の１００％での、すなわち、溶質をこれ以上カラムに結合させることができない点での、漏出点容量に等しい。したがって、最大容量を決定するために、漏出点容量は異なるレベルの漏出点で測定され、このレベルは試料充填中にカラムからの溶出液内で測定された溶質の濃度のレベルによって定義される。しばしば、かかる濃度は、溶出液ライン内に置かれた検出器を通る流れ内の信号を連続的に監視することによって決定される。時間（又は、充填量又は質量）に対するこれらの濃度（信号）のプロットは、漏出点曲線と呼ばれる。クロマトグラム上の漏出点の位置、及びその形状は、どれだけの溶質がカラム上に結合することができ、どれだけ迅速に全ての吸着部位が溶質で飽和されるかに関連している。これはまた、どれだけ多くの溶質を任意の所与の時間に、カラムに結合させることができるかを示している。不純物が存在する状態での溶質に対する漏出点結合容量は、精製プロトコルを開発する場合に最適化する最も重要なパラメータの１つである。

モノクローナル抗体の下流処理の典型的なプロセスは、極めて高い選択性を有する抗体を結合させるために、プロテインＡリガンドを有する樹脂を使用するキャプチャ段階を伴う。これは、不純物の大部分がここで除去されるという点で、非常に効率の良い段階である。しかし、プロテインＡ樹脂のコストにより、例えば、樹脂の結合容量の利用度を高める化学技術法によって、効率を最適化することが強く求められている。プロテインＡ段階の後、抗体はさらに、他のクロマトグラフィー段階、例えば、結合溶出陽イオン交換クロマトグラフィー及び／又は結合溶出又は流入マルチモーダル又は陰イオン交換クロマトグラフィーで精製される。また、これらの段階では、特に段階が結合溶出モードで行なわれる場合に、使用される樹脂の容量利用度を高める必要がある。

より大きなカラムの前に小さな使い捨てガードカラムを使用することは、メインカラムの寿命を長くする手段として、単一カラムクロマトグラフィーでよく知られている。不可逆汚損が起こると、ガードカラムだけが損傷を受け、新しいカラムに交換することができる。しかし、かかる構成は、樹脂容量利用度を少しも改善しない。

ＳＭＢ及びＰＣＣのような連続的クロマトグラフィー法は、容量利用を改善する潜在力があるが、設定し運用するのが複雑な方法であり、多数のバルブ及びカラムの制御が必要である。そこで、単一カラムクロマトグラフィーと比べて、容量利用度を高める単純でロバストな解決法の必要性がある。

日本特許第６０４３１４５号

本発明の一態様は、生体分子の大規模クロマトグラフィー分離のための効率的なプロセスを提供することである。これは、請求項１で定義されるクロマトグラフィーシステム、及び請求項１３で定義されるクロマトグラフィー法で達成される。

かかるシステム及び方法での１つの利点は、クロマトグラフィー媒体の結合容量が効率的に利用されることである。別の利点は、クロマトグラフィー媒体の寿命が延長されることである。これらの効果は共に、クロマトグラフィー分離の経済性の改善に貢献する。

本発明の別の適切な実施形態は、添付の特許請求の範囲に記載されている。

本発明によるクロマトグラフィーシステムを示す図である。 本発明によるクロマトグラフィー分離方法を示す図である。

本明細書中で「供給液」という用語は、クロマトグラフィーシステムに供給される液体であって、精製すべき目標物質を含む液体を意味する。目標物質は、モノクローナル抗体など生体分子であってもよい。供給液の例としては、清澄化発酵ブロス、生体液などと、前の分離段階から生じ、一部精製された目標物質を含む液体を挙げることができる。

本明細書中で「ガードカラム」という用語は、メインクロマトグラフィーカラムに直列に接続され、メインカラムよりも容積が格段に小さいクロマトグラフィーカラムを意味する。

図１に示す一態様では、本発明は、クロマトグラフィー樹脂を含むメインカラム１と、第１のガードカラム２と、第２のガードカラム３とを備えるクロマトグラフィーシステムを開示しており、第１のガードカラム２はメインカラム１の第１の端部４に接続され、第２のガードカラム３はメインカラムの第２の端部５に接続される。すなわち、１つのガードカラムが、メインカラムの各端部に接続される。メインカラムの各端部に接続された１つのガードカラムを有することの利点は、クロマトグラフィー樹脂の容量利用度を改善して分離を行なうことが可能であることである。

特定の実施形態では、第１及び第２のガードカラムのベッド体積はそれぞれ、メインカラム１のベッド体積の約２５％未満、約１５％未満、又は約１０％未満など約５０％未満である。この利点は、クロマトグラフィー樹脂がより効率的に使用されることである。樹脂容量利用度を高めることが重要な場合、例えば、生物薬剤の分離のための大規模予備クロマトグラフィーにおいて本発明を利用する特定の利点があるので、メインカラムのベッド体積は、１０Ｌ以上、又は１００Ｌ以上など、１Ｌ以上である可能性がある。

いくつかの実施形態では、第１の濃度検出器６は、メインカラム１の第１の端部４と第１のガードカラム２の間に接続され、第２の濃度検出器７はメインカラム１の第２の端部５と第２のガードカラム３の間に接続される。第１及び第２の濃度検出器は、例えば、タンパク質の濃度を検出するのに好都合な、紫外線吸収検出器とすることができる。しかし、例えば、非ＵＶ吸収物質を検出するために使用することができる屈折率検出器であってもよく、又は様々な目標物質又は汚染物質に対する特定の検出器であってもよい。これらの位置に検出器を備える利点は、上向及び下向方向の両方でメインカラムの漏出点を監視して、漏出点が検出されるとシステムを通して流路を制御することが可能になることである。漏出点の監視は、手動で又は自動で行なうことができ、流路の制御を手動で又は自動で行なうことができる。

一実施形態では、クロマトグラフィーシステムはまた、第１の濃度検出器６及び第２の濃度検出器７に電気接続され、メインカラムの一端部４、５に与えられる供給液材料の組成を示している供給液信号、及びメインカラムの他端部５、４からの溶出液を示している溶出液信号を検出する決定ユニット１８を備えている。決定ユニット１８は、一実施形態では、メインカラム１の漏出点及び／又は飽和点を決定するように適合させることができる。決定ユニット１８は、コンピュータ、プログラマブル論理制御装置、又は濃度検出器信号から算出された関数によってバルブを制御することが可能なあらゆる他のタイプのデジタル又はアナログユニットであってもよい。漏出点は、第１の検出器６及び第２の検出器７上で測定された信号を比較することによって算出することができる。第１の検出器６上で測定された信号は、（ＵＶ検出器の場合）供給液内に存在する全てのＵＶ吸収成分、すなわち、第１のガードカラム２に結合するもの、及び通過するものの両方の濃度を示している。信号は、非吸収物質がガードカラム２を通り抜ける場合に、第１の平坦域に到達し、第１のガードカラム２が飽和となった場合に、第２の平坦域に到達する。第２の平坦域は、供給液流内に存在する全ての物質の合計濃度を示している。第２の検出器７は、カラム１からの溶出液流内の物質の濃度を監視する。第２の検出器上で測定された信号間の差が、第１の検出器上で測定された第２の平坦域と第２の検出器上で測定された第１の平坦域の間の差の例えば１％の所定の値に到達した場合に、第１の漏出点に到達する。飽和点と呼ばれる、第２の漏出点は、２つの検出器上で測定された信号間の差が、別の値、例えば７０％に到達した場合を除いて、アナログで決定される。

特定の実施形態では、第１のガードカラム２は、供給液タンク８又は廃棄物レセプタクル９のいずれかに第１のバルブ１０を介して接続され、第２のガードカラム３は、供給液タンク１５又は廃棄物レセプタクル１６のいずれかに第２のバルブ１７を介して接続されるが、但し、第１のガードカラムが供給液タンクに接続される場合、第２のガードカラムは廃棄物レセプタクルに接続され、第１のガードカラムが廃棄物レセプタクルに接続される場合、第２のガードカラムは供給液タンクに接続される。一実施形態では、決定ユニット１８は、第１及び第２のバルブに電気接続され、前記第１及び第２のバルブの位置を制御する。この構成の利点は、決定ユニットが漏出点又は飽和点を検出した場合、出口流れをメインカラムから、例えば供給液タンクに自動的に迂回させることができることである。

いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーシステムはまた、流体をメインカラム１から溶出液タンク１１、又は廃棄物レセプタクル１６に迂回させる、メインカラム１と第１のガードカラム２の間の第３のバルブ１２と、流体をメインカラム１から溶出液タンク１３、又は廃棄物レセプタクル１６に迂回させる、メインカラム１と第２のガードカラム３の間の第４のバルブ１４とを備えており、決定ユニット１８は、第３及び第４のバルブの位置を制御する。この構成の１つの利点は、決定ユニットが洗浄サイクルの完了を検出した場合に、溶出サイクルを自動的に開始させることである。この構成の第２の利点は、決定ユニットが漏出点を検出した場合に、自動的に第２のガードカラム３をメインカラム１と直列に接続させることができることである。これにより、第２のガードカラム３が、製品劣化供給液流に露出されるのを防ぐ。

特定の実施形態では、前記第１及び第２のガードカラムは、メインカラム内のクロマトグラフィー樹脂と基本的に同じ選択性を有するクロマトグラフィー樹脂を含む。これは、ガードカラム及びメインカラム内の樹脂は、イオン強度、ｐＨなど所与の条件で同じ物質と結合することを意味する。同じ選択性を与えるために、樹脂を、好適にはほぼ同じリガンド含有量を有する、又はリガンド含有量の約２０％未満の差を有する、同じタイプのリガンドと置換することができる。基本的に同じ選択性を有する利点は、メインカラムからのあらゆる目標物質漏出点が、メインカラムの後にガードカラムでキャプチャされることである。

いくつかの実施形態では、前記メインカラム及び前記第１及び第２のガードカラムは、Ｆｃ断片結合親和性リガンドを備えるクロマトグラフィー樹脂を含む。かかるリガンドは一般的に、モノクローナル抗体処理のキャプチャ段階で使用され、その高いコストが段階効率、及び樹脂の寿命の増大に圧力を与える。これらは、抗体に対する非常に高い選択性を有し、本発明の方法及びシステムに特に有利である、溶出に対する単一段階勾配の使用が可能になる。親和性リガンドは、例えば、プロテインＡ、例えば、ＥＰ１４８５４０７Ｂ１、ＷＯ２００８０３９１４１、ＷＯ２０１００８００６５、ＥＰ２２０２３１０Ａ２、ＥＰ２１５７０９９Ａ１、特開２００６−３０４６３３号、米国特許出願公開第２０１０／０１６８３９５号、ＣＮ１０１３３７９８６、ＷＯ２００９１４６７５５などに記載されているようなプロテインＡの変異種、プロテインＧ又は例えば、ＷＯ２００９０１１５７２に記載されているようなＦｃ結合単一ドメイン抗体断片など、タンパク性リガンドであってもよい。あるいは、親和性リガンドは、ペプチド、核酸、又は有機小分子であってもよい。樹脂のリガンド含有量は、例えば、１〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲の樹脂であってもよい。

いくつかの実施形態では、前記第１及び第２のガードカラムは、メインカラム内のクロマトグラフィー樹脂の体積平均粒径より高い、約２５％以上又は約５０％以上など約１０％以上での体積平均粒径を有するクロマトグラフィー樹脂を含む。メインカラム樹脂の平均粒径は、８０〜９５μｍなど約５０〜１００μｍであってもよく、ガードカラム樹脂の平均粒径は、１３０〜２１０μｍなど約１００〜２５０μｍであってもよい。樹脂の平均粒径は有利には、第１及び第２のガードカラムを通して同じである可能性がある。特定の例では、メインカラムに、８５μｍ平均粒径のプロテインＡ機能ＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填させることができ、ガードカラムに、例えば、ＥＰ８７３３５３Ｂ１に記載されているような当技術分野で知られている方法により、プロテインＡで官能基化された２００μｍの平均粒径のＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填させることができる。ガードカラム内のより大きな粒径樹脂を有する利点は、背圧がより低く、ガードカラムをその漏出点の近傍で使用しなくてもよいので、より大きな粒子に通常関連する漏出点曲線のより低い勾配は問題にならないことである。

図２に示す一態様では、本発明は、目標物質のクロマトグラフィー分離方法であって、ａ）供給液を供給液タンク８から第１のガードカラム２を介してメインカラム１を通して、ｉ）廃棄物レセプタクル１６に、又はｉｉ）第２のガードカラム３を介して廃棄物レセプタクル１６に運ぶことによって、メインカラム１上に目標物質を充填する段階と、ｂ）洗浄流体を第１のガードカラム２を介してメインカラム１及び第２のガードカラム３を通して運ぶことによって、カラムを洗浄する段階と、ｃ）溶出流体を第１のガードカラム２又は第２のガードカラム３を介してメインカラム１を通して、溶出液タンク１１、１３に運ぶことによって、目標物質を溶出させる段階とを含む方法を開示している。

充填段階ａ）では、目標物質、例えば、タンパク質、免疫グロブリン、ＩｇＧ又はモノクローナル抗体など生体分子を、第１のガードカラム内又はメインカラム内でクロマトグラフィー樹脂に結合させることができ、それによって、劣化供給液のみが、廃棄物レセプタクルに運ばれる。これは、メインカラムが製品漏出点を示すまで、続く可能性がある。この時点で、第２のガードカラムを、メインカラムに接続させることができ、メインカラム上に結合されていない目標物質はその後、第２のガードカラム上で吸着される。このプロセスは、第１のガードカラム及びメインカラムが飽和となり、いくつかの目標物質が第２のガードカラム内のクロマトグラフィー樹脂に結合されるまで、続く可能性がある。流れをその後、段階ｂ）で洗浄モードに変更することができ、洗浄流体は、好ましくは段階ａ）と同じ方向であるが、あらゆる方向に３つのカラム全てを通して運ばれ、メインカラムから浸出するあらゆる目標物質は、メインカラムの後にガードカラムによってキャプチャされる。洗浄が完了すると、流れを、段階ｃ）で溶出モードに変更することができ、溶出流体は、第２のガードカラム、その後メインカラムを通して溶出液タンクまでなど、好ましくは段階ａ）と同じ方向であるが、任意の方向にガードカラム及びメインカラムの１つを通して運ばれ、ここで分離された目標物質が収集される。この方法の利点は、メインカラムからのあらゆる漏出点目標物質を、充填及び洗浄の両方の最中にガードカラムによってキャプチャすることができ、溶出の最中に回収することができることである。

特定の実施形態では、方法はさらに、ｄ）供給液を供給液タンク１５から第２のガードカラム３を介してメインカラム１を通して、ｉ）廃棄物レセプタクル９に、又はｉｉ）第１のガードカラム２及び廃棄物レセプタクル９に運ぶことによって、メインカラム１上に目標物質を充填する段階を含む。この充填段階は、充填段階ａ）と反対の方向で行なわれ、例えば、段階ａ）、ｂ）、及びｃ）のシーケンスの後にその順番で行なわれる可能性がある。この利点は、第１のガードカラムは、漏出点を通過するメインカラムを通り抜け始めるあらゆる製品をキャプチャする準備ができていることである。

特定の実施形態では、段階ｂ）及びｃ）は段階ｄ）の後に繰り返され、繰り返された段階ｂ）及びｃ）の流れは、元の段階ｂ）及びｃ）での流れと反対の方向に流される。繰り返された段階ｃ）の流れは、第２のガードカラムを通して、その後、メインカラムを通して溶出液タンク１３に流される。

いくつかの実施形態では、段階ａ）はさらに、メインカラムから出る流体内の目標物質の濃度を測定する段階と、前記濃度が所定の値に到達した場合に段階ａ）を終了させる段階とを含む。

特定の実施形態では、段階ａ）はさらに、メインカラムの漏出点又は飽和点を決定する段階と、前記漏出点又は飽和点に到達した場合に段階ａ）を終了させる段階とを含む。この利点は、メインカラム内の樹脂が効率的に利用され、基本的に全ての漏出点目標物質がガードカラムによってキャプチャされることである。

いくつかの実施形態では、段階ｂ）はさらに、メインカラムから出る流体内の目標物質の濃度を測定する段階と、前記濃度が所定の値より低い場合に段階ｂ）を終了させる段階とを含む。この利点は、洗浄流体の消費が最小限に抑えられることである。

本明細書では、本発明を最良の形態を含めて開示するとともに、装置又はシステムの製造・使用及び方法の実施を始め、本発明を当業者が実施できるようにするため、例を用いて説明してきた。本発明の特許性を有する範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者に自明な他の例も包含する。かかる他の例は、特許請求の範囲の文言上の差のない構成要素を有しているか、或いは特許請求の範囲の文言と実質的な差のない均等な構成要素を有していれば、特許請求の範囲に記載された技術的範囲に属する。

Claims (21)

1. クロマトグラフィー樹脂を含むメインカラム（１）と、第１のガードカラム（２）と、第２のガードカラム（３）とを備えるクロマトグラフィーシステムであって、前記第１のガードカラム（２）は前記メインカラム（１）の第１の端部（４）に接続され、前記第２のガードカラム（３）は前記メインカラムの第２の端部（５）に接続される、クロマトグラフィーシステム。
2. 前記第１のガードカラム（２）及び前記第２のガードカラム（３）のベッド体積はそれぞれ、前記メインカラム（１）のベッド体積の約２５％未満、又は約１５％未満など約５０％未満である、請求項１記載のクロマトグラフィーシステム。
3. 第１の濃度検出器（６）は、前記メインカラム（１）の前記第１の端部（４）と前記第１のガードカラム（２）の間に接続され、第２の濃度検出器（７）は前記メインカラム（１）の前記第２の端部（５）と前記第２のガードカラム（３）の間に接続される、請求項１又は請求項２記載のクロマトグラフィーシステム。
4. 前記第１及び第２の濃度検出器（６、７）は、紫外線吸収検出器である、請求項３記載のクロマトグラフィーシステム。
5. 前記第１及び第２の濃度検出器に電気接続され、前記メインカラムの一端部（４、５）に与えられる供給液材料の組成を示している供給液信号、及び前記メインカラムの他端部（５、４）からの溶出液を示している溶出液信号を検出する決定ユニット（１８）をさらに備える、請求項３又は請求項４記載のクロマトグラフィーシステム。
6. 前記決定ユニット（１８）は、前記メインカラム（１）の漏出点及び／又は飽和点を決定する、請求項５記載のクロマトグラフィーシステム。
7. 前記第１のガードカラム（２）は、供給液タンク（８）又は廃棄物レセプタクル（９）のいずれかに第１のバルブ（１０）を介して接続され、前記第２のガードカラム（３）は、供給液タンク（１５）又は廃棄物レセプタクル（１６）のいずれかに第２のバルブ（１７）を介して接続されるが、但し、前記第１のガードカラムが供給液タンクに接続される場合、前記第２のガードカラムは廃棄物レセプタクルに接続され、前記第１のガードカラムが廃棄物レセプタクルに接続される場合、前記第２のガードカラムは供給液タンクに接続される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載のクロマトグラフィーシステム。
8. 決定ユニット（１８）は、前記第１及び第２のバルブに電気接続され、前記第１及び第２のバルブの位置を制御する、請求項７記載のクロマトグラフィーシステム。
9. 流体を前記メインカラム（１）から溶出液タンク（１１）、又は前記廃棄物レセプタクル（１６）に迂回させる、前記メインカラム（１）と前記第１のガードカラム（２）の間の第３のバルブ（１２）と、流体を前記メインカラム（１）から溶出液タンク（１３）、又は前記廃棄物レセプタクル（１６）に迂回させる、前記メインカラム（１）と前記第２のガードカラム（３）の間の第４のバルブ（１４）とをさらに備えるクロマトグラフィーシステムであって、前記決定ユニット（１８）は、前記第３及び第４のバルブの位置を制御する、請求項８記載のクロマトグラフィーシステム。
10. 前記第１及び第２のガードカラムは、前記メインカラム内の前記クロマトグラフィー樹脂と基本的に同じ選択性を有するクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載のクロマトグラフィーシステム。
11. 前記メインカラム及び前記第１及び第２のガードカラムは、Ｆｃ断片結合親和性リガンドを備えるクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載のクロマトグラフィーシステム。
12. 前記第１及び第２のガードカラムは、前記メインカラム内の前記クロマトグラフィー樹脂の体積平均粒径より高い、約２５％又は約５０％以上など約１０％以上での体積平均粒径を有するクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載のクロマトグラフィーシステム。
13. 目標物質のクロマトグラフィー分離方法であって、
    ａ）供給液を供給液タンク（８）から第１のガードカラム（２）を介してメインカラム（１）及び第２のガードカラム（３）を通して廃棄物レセプタクル（１６）に運ぶことによって、メインカラム（１）上に前記目標物質を充填する段階と、
    ｂ）洗浄流体を前記第１のガードカラム（２）を介して前記メインカラム（１）及び前記第２のガードカラム（３）を通して運ぶことによって、前記カラムを洗浄する段階と、
    ｃ）溶出流体を前記第１のガードカラム（２）又は前記第２のガードカラム（３）を介して前記メインカラム（１）を通して、溶出液タンク（１１、１３）に運ぶことによって、前記目標物質を溶出させる段階とを含む方法。
14. ｄ）供給液を供給液タンク（１５）から前記第２のガードカラム（３）を介して前記メインカラム（１）及び前記第１のガードカラム（２）を通して廃棄物レセプタクル（９）に運ぶことによって、前記メインカラム（１）上に前記目標物質を充填する段階をさらに含む、請求項１３記載の方法。
15. 段階ａ）はさらに、前記メインカラムから出る前記流体内の目標物質の濃度を測定する段階と、前記濃度が所定の値に到達した場合に段階ａ）を終了させる段階とを含む、請求項１３又は請求項１４記載の方法。
16. 段階ａ）はさらに、前記メインカラムの漏出点又は飽和点を決定する段階と、前記漏出点又は飽和点に到達した場合に段階ａ）を終了させる段階とを含む、請求項１３乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
17. 段階ｂ）はさらに、前記メインカラムから出る前記流体内の目標物質の濃度を測定する段階と、前記濃度が所定の値より低い場合に段階ｂ）を終了させる段階とを含む、請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
18. 前記第１及び第２のガードカラムは、前記メインカラム内のクロマトグラフィー樹脂と基本的に同じ選択性を有するクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１３乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
19. 前記メインカラム及び前記第１及び第２のガードカラムは、Ｆｃ断片結合親和性リガンドを備えるクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
20. 前記第１及び第２のガードカラムは、前記メインカラム内の前記クロマトグラフィー樹脂の体積平均粒径より高い、約２５％又は約５０％以上など約１０％以上での体積平均粒径を有するクロマトグラフィー樹脂を含む、請求項１３乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
21. 前記第１（２）及び第２（３）のガードカラムのベッド体積はそれぞれ、前記メインカラム（１）のベッド体積の約２５％未満、又は約１５％未満など約５０％未満である、請求項１３乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。