JPS60173000A - モノクローナル抗体の精製 - Google Patents
モノクローナル抗体の精製Info
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- JPS60173000A JPS60173000A JP59242584A JP24258484A JPS60173000A JP S60173000 A JPS60173000 A JP S60173000A JP 59242584 A JP59242584 A JP 59242584A JP 24258484 A JP24258484 A JP 24258484A JP S60173000 A JPS60173000 A JP S60173000A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はマウス腹水液試料のモノクローン性抗体含量を
精製する方法に関する。より詳しくは、本発明は、結合
したポリエチレンイミン（ＰＣＩ）官能基を有するシリ
カゲルの個々の静的多孔性の桁上における液体クロマト
グラフィー、及び約ｐＨ６，０〜約８．３の水性緩衝液
によるポリエチレンイミン結合カラムからのモノクロー
ン性抗体の勾配溶離を杓用するマウスの腹水流体からモ
ノクローン性抗体形のＩｇＧを分離精製する方法に係る
。
精製する方法に関する。より詳しくは、本発明は、結合
したポリエチレンイミン（ＰＣＩ）官能基を有するシリ
カゲルの個々の静的多孔性の桁上における液体クロマト
グラフィー、及び約ｐＨ６，０〜約８．３の水性緩衝液
によるポリエチレンイミン結合カラムからのモノクロー
ン性抗体の勾配溶離を杓用するマウスの腹水流体からモ
ノクローン性抗体形のＩｇＧを分離精製する方法に係る
。
（問題を解決する為の手段）
結合したポリエチレンイミン官能基を有するシリカゲル
の個々の静的多孔性相即ち、本発明のクロマトグラフ充
填物には２つの形式がある。
の個々の静的多孔性相即ち、本発明のクロマトグラフ充
填物には２つの形式がある。
好ましい形式は米国特許出願第５５５，３６８号（ポリ
エチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤という名称で
本願と同日に出願）に記載されておりその内容は本明細
書に参照して取り入れる。関連するその出願の文章が以
下に報告される。
エチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤という名称で
本願と同日に出願）に記載されておりその内容は本明細
書に参照して取り入れる。関連するその出願の文章が以
下に報告される。
第二の形式のものはＧ、ＶａｎｅｃｅｋとＦ−Ｅ、Ｒｅ
ｇｎ！ｅｌ”＋Ａｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２１，
１５６−１５９ （＋９８２）及びＡ、Ｊ。
ｇｎ！ｅｌ”＋Ａｎａ１． Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２１，
１５６−１５９ （＋９８２）及びＡ、Ｊ。
Ａｌｐｅｒｔと Ｆ、Ｅ、Ｒｅｇｎｉｅｒ、Ｊ、Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒ、１８５，３７５−３９２（１９７８）
、に記載された吸着された架橋ＰＥＩシリカゲルの静
的な相である。この形式は商品名”５ｙｎＣｈｒｐａｋ
” の名称でインジアナ州リンデンのＳｙ口Ｃｂｒｏｍ
Ｉｎｃ、から市販されている。アルパート及びレグニ
アーハ、ポリエチレンイミン（’Ｉ’Ｅｌ）がシリカゲ
ル表面に吸着され架橋されて安定な重合層を形成するこ
とを示している。ＰＥＩの構造は十分な第１級及び第２
級アミノ基を与えるので、シリカゲル表面の隣接してい
るＰＥ１分子が多官能オキシランにより架橋され重合層
となりうる。親水性のクロスリンカ−例えばジグリシジ
ルエチレン、グリコールの使用を通して親水性の被覆が
造られ得る。
ｏｍａｔｏｇｒ、１８５，３７５−３９２（１９７８）
、に記載された吸着された架橋ＰＥＩシリカゲルの静
的な相である。この形式は商品名”５ｙｎＣｈｒｐａｋ
” の名称でインジアナ州リンデンのＳｙ口Ｃｂｒｏｍ
Ｉｎｃ、から市販されている。アルパート及びレグニ
アーハ、ポリエチレンイミン（’Ｉ’Ｅｌ）がシリカゲ
ル表面に吸着され架橋されて安定な重合層を形成するこ
とを示している。ＰＥＩの構造は十分な第１級及び第２
級アミノ基を与えるので、シリカゲル表面の隣接してい
るＰＥ１分子が多官能オキシランにより架橋され重合層
となりうる。親水性のクロスリンカ−例えばジグリシジ
ルエチレン、グリコールの使用を通して親水性の被覆が
造られ得る。
（ラムスデンの発明の詳細な記載）
本発明の非架橋共有結合ＰＥＩシリカケル生成物は次の
段階によって都合よく生成される。
段階によって都合よく生成される。
Ａ 平均粒径約３〜約７０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストロ一ム単位を有する微粒シリ
カゲルを、不活性有機溶媒スラリー中で、約４００〜約
１８００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロ
ピルトリメトキシシランの低級アルカノール性溶液と約
２〜約５０時間環境温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクションを反応混合物から回収し、 Ｃ上記固体フラクションを乾燥し且っシランをシリカゲ
ルに完全に結合するのに十分な温度及び時間で加熱する
。
０〜約１０００オングストロ一ム単位を有する微粒シリ
カゲルを、不活性有機溶媒スラリー中で、約４００〜約
１８００の平均分子量を有するポリエチレンイミノプロ
ピルトリメトキシシランの低級アルカノール性溶液と約
２〜約５０時間環境温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクションを反応混合物から回収し、 Ｃ上記固体フラクションを乾燥し且っシランをシリカゲ
ルに完全に結合するのに十分な温度及び時間で加熱する
。
本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結合された
」という用語は、ＰＥ１部分がシリカゲルに化学的相互
作用によって共有的に結合されていて、プロピル−シリ
ル（Ｐｒ−５ｔ＞″の結合を生じていることを意味し、
「非架橋」という用語は隣接する共有結合した ＰＥ１
部分上のイミノ及びアミノ基が架橋していない又は架橋
剤と反応し、重合層を形成していないことを意味する。
」という用語は、ＰＥ１部分がシリカゲルに化学的相互
作用によって共有的に結合されていて、プロピル−シリ
ル（Ｐｒ−５ｔ＞″の結合を生じていることを意味し、
「非架橋」という用語は隣接する共有結合した ＰＥ１
部分上のイミノ及びアミノ基が架橋していない又は架橋
剤と反応し、重合層を形成していないことを意味する。
結合がないことにより、反応は次のように２段階で完了
すると考えられる。
すると考えられる。
段階１ シラン上のシリカヒドロキシル及びメトキシ基
が反応して５ｉ−０−Ｓｉ結合及び遊離メタノールを形
成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のままでいる。
が反応して５ｉ−０−Ｓｉ結合及び遊離メタノールを形
成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のままでいる。
段Ｗｉ２ 残留メトキシ基との反応の完結がａ）及びｂ
）による熱硬化の間に行なわれる。
）による熱硬化の間に行なわれる。
１
１
１−ＯＦＩ
無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則及び球状
（好ましい）の微粒形で市販されており、また幾つかの
商品等級で得られ、メツシュ寸法が３−３−３２５（Ａ
ＳＴの範囲である。数学的なメツシュ寸法の表示に頼る
よりも、本発明の為のより正確な指標はシリカゲルの微
粒の平均粒径及び平均孔寸法がそれぞれ約３〜７０ミク
ロン及び約５０〜約１０００、好ましくは約２５０〜５
００オングストローム単位のものである。 ＨＰＬＣク
ロマトグラフカラム充填に使用する最終製品−のために
は、約３〜約１０ミクロンのシリカゲル出発物質が好ま
しく、低圧クロマトグラフィーカラム充填用には約４０
〜約７０ミクロンがこのましい。
（好ましい）の微粒形で市販されており、また幾つかの
商品等級で得られ、メツシュ寸法が３−３−３２５（Ａ
ＳＴの範囲である。数学的なメツシュ寸法の表示に頼る
よりも、本発明の為のより正確な指標はシリカゲルの微
粒の平均粒径及び平均孔寸法がそれぞれ約３〜７０ミク
ロン及び約５０〜約１０００、好ましくは約２５０〜５
００オングストローム単位のものである。 ＨＰＬＣク
ロマトグラフカラム充填に使用する最終製品−のために
は、約３〜約１０ミクロンのシリカゲル出発物質が好ま
しく、低圧クロマトグラフィーカラム充填用には約４０
〜約７０ミクロンがこのましい。
シリカゲル又はＣＰＧスラリーを調製するのに適した不
活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例えば、ヘキサン
、ヘプタンなと、芳香族炭化水素例えば、ヘンゼン、ト
ルエン、キシレンなど、低級アルカノール類例えば、エ
タノール、イソプロパツール、ブタノールなと、塩素化
メタン、例えば塩化メチレン、四塩化炭素等（注意その
ようなりロロ溶媒は高温で反応するかもしれない）、及
びテトラヒドロフラン、グライム（グリコールジメチル
エーテル）、ジグライム（ジエチレングリコールジメチ
ルエーテル）なとの他の不活性溶媒が適している。一般
に溶媒１に対しシリカゲル又はＣＰＧのグラム ｌ：５
の比が適当なスラリーを与える。細かい不溶のシリカゲ
ル及びＣＰＧ微粒の不溶性の為に真の溶液でなくスラリ
ーが得られる。
活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例えば、ヘキサン
、ヘプタンなと、芳香族炭化水素例えば、ヘンゼン、ト
ルエン、キシレンなど、低級アルカノール類例えば、エ
タノール、イソプロパツール、ブタノールなと、塩素化
メタン、例えば塩化メチレン、四塩化炭素等（注意その
ようなりロロ溶媒は高温で反応するかもしれない）、及
びテトラヒドロフラン、グライム（グリコールジメチル
エーテル）、ジグライム（ジエチレングリコールジメチ
ルエーテル）なとの他の不活性溶媒が適している。一般
に溶媒１に対しシリカゲル又はＣＰＧのグラム ｌ：５
の比が適当なスラリーを与える。細かい不溶のシリカゲ
ル及びＣＰＧ微粒の不溶性の為に真の溶液でなくスラリ
ーが得られる。
（Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエチレンイ
ミンとしても知られているポリエチレンイミノボロビル
トリメトキシシランはポリエチレンイミンとアミノプロ
ピルトリメトキシシランとの反応生成物で次の式によっ
て記載される。
ミンとしても知られているポリエチレンイミノボロビル
トリメトキシシランはポリエチレンイミンとアミノプロ
ピルトリメトキシシランとの反応生成物で次の式によっ
て記載される。
ｉ１Ｍｅ
ＭｅＯ−５ｉ−ＣＨ２ＣＨ２ＣｌＩ２ −ＮＨ−（ＣＨ
２ＣＨ２Ｎ１１）ｎ −Ｍｅ −Ｃｌｈ ＣＨ２’ −ＮＩ＋２ （１）ここで本発明
の目的にはｎは約４〜３７の整数又は平均分子量で表現
すると約４００〜＋８００である。
２ＣＨ２Ｎ１１）ｎ −Ｍｅ −Ｃｌｈ ＣＨ２’ −ＮＩ＋２ （１）ここで本発明
の目的にはｎは約４〜３７の整数又は平均分子量で表現
すると約４００〜＋８００である。
シラン（１）は反応中でシリカゲルまたはＣＰＧとの反
応中に於いてシランを可溶化させる為の十分なアルカノ
ールを使用して低級ｃ１〜ｃ６ ブルカノール溶液の形
で使用される。５０χ（Ｗ／Ｗ）のイソブロバノール溶
液が好ましい。一般に約２５〜１０００ ｇのシラン又
はこれに代わって約５０〜２００１の５０χ（Ｗ／Ｗ）
シランのアルカノール溶液が各１００ ｇのシリカゲル
又はＣＰＧと反応するのに使用される。反応は環境温度
で実施できるが反応溶媒系の還流までの高温を反応速度
を強めるために使用することが出来る。反応は実質的な
完了（段階１）迄に容易に２〜５０時間内に進行する。
応中に於いてシランを可溶化させる為の十分なアルカノ
ールを使用して低級ｃ１〜ｃ６ ブルカノール溶液の形
で使用される。５０χ（Ｗ／Ｗ）のイソブロバノール溶
液が好ましい。一般に約２５〜１０００ ｇのシラン又
はこれに代わって約５０〜２００１の５０χ（Ｗ／Ｗ）
シランのアルカノール溶液が各１００ ｇのシリカゲル
又はＣＰＧと反応するのに使用される。反応は環境温度
で実施できるが反応溶媒系の還流までの高温を反応速度
を強めるために使用することが出来る。反応は実質的な
完了（段階１）迄に容易に２〜５０時間内に進行する。
反応体の混合中に攪はんをするのが有利であるが、その
後の反応は更に撹はんすることなしに続き得る。無水の
条件は臨界的でなく、小量の水即ち約０．１〜１．０
ｍｌ ／スラリー溶媒５０ ｍｌの存在が反応に忠影響
を与えないことが見いだされている。
後の反応は更に撹はんすることなしに続き得る。無水の
条件は臨界的でなく、小量の水即ち約０．１〜１．０
ｍｌ ／スラリー溶媒５０ ｍｌの存在が反応に忠影響
を与えないことが見いだされている。
生しる固体フラクションは反応混合物から慣用の物理的
手段例えばろ過、遠心分離などによって回収される。一
般にろ過手段は粒径５ミクロンを保持するのに十分なも
のであるのに刻し、遠心は３ミクロンの粒子寸法に適し
ている。
手段例えばろ過、遠心分離などによって回収される。一
般にろ過手段は粒径５ミクロンを保持するのに十分なも
のであるのに刻し、遠心は３ミクロンの粒子寸法に適し
ている。
回収された固体フラクションは次に、乾燥、モしてシラ
ンとシリカゲル又はＣＰＧの完全な共有結合に十分な温
度及び時間で熱硬化される。一般に約４０〜１２０℃に
於ける １−４時間が十分であることが分かった。この
ようにして得られた共有結合し、非架橋の最終生成物は
好ましくは約０．５〜約３．８％の窒素を含有している
。（以上でラムスデン発明の説明路） 本発明の目的にクロマトグラフ充填物（”ＰＥ１−シリ
カゲル″と都合上場合によっては述べられる）は利用さ
れここで出発シリカゲルは約３〜約４０ミクロンの平均
粒径を有するものに限られている。
ンとシリカゲル又はＣＰＧの完全な共有結合に十分な温
度及び時間で熱硬化される。一般に約４０〜１２０℃に
於ける １−４時間が十分であることが分かった。この
ようにして得られた共有結合し、非架橋の最終生成物は
好ましくは約０．５〜約３．８％の窒素を含有している
。（以上でラムスデン発明の説明路） 本発明の目的にクロマトグラフ充填物（”ＰＥ１−シリ
カゲル″と都合上場合によっては述べられる）は利用さ
れここで出発シリカゲルは約３〜約４０ミクロンの平均
粒径を有するものに限られている。
平均孔寸法は約５０〜約１０００オングストローム単位
であるけれども２５０オングストロームより大きい平均
孔寸法が好ましい。
であるけれども２５０オングストロームより大きい平均
孔寸法が好ましい。
従って、本発明は本質的に均一なモノクローン性抗体形
のＩｇＧを上記モノクローン性抗体を含有しているマウ
ス腹水試料から液体クロマトグラフ手段を用いて得る方
法を提供するが、ここでクロマトグラフ充填剤は平均粒
径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜約１０
００オングストロ一ム単位を有し、上記レグニア−等に
従って吸着された架橋形で、又は上記ラムスデンに従っ
て共有結合非架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合
している微粒シリカゲルからなるものである。後者に関
してはＩ’ＥＩ−シリカゲルクロマトグラフ充填剤は上
記の微粒状シリカゲンルと約４００〜１８００の平均分
子量を有するポリオチレンイミノブロビルトリメトキシ
シランとの反応生成物である。
のＩｇＧを上記モノクローン性抗体を含有しているマウ
ス腹水試料から液体クロマトグラフ手段を用いて得る方
法を提供するが、ここでクロマトグラフ充填剤は平均粒
径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜約１０
００オングストロ一ム単位を有し、上記レグニア−等に
従って吸着された架橋形で、又は上記ラムスデンに従っ
て共有結合非架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合
している微粒シリカゲルからなるものである。後者に関
してはＩ’ＥＩ−シリカゲルクロマトグラフ充填剤は上
記の微粒状シリカゲンルと約４００〜１８００の平均分
子量を有するポリオチレンイミノブロビルトリメトキシ
シランとの反応生成物である。
本発明に於いてそのようなりロマトグラフ充填物が、液
体クロマトグラフィー、特に結合形１ｇＧモノクローン
性抗体及び他のそれを含有しているマウス腹水中の他の
蛋白質のための高性能液体クロマトグラフィー〇１ＰＬ
Ｃ）に於いて特に適していることがわかり、これによっ
て適当な水性緩衝液を使用する勾配溶離により結合した
蛋白の優先的な分離を可能にしている。このようにして
問題の、本質的に均質なモノクローン性抗体を含１め腹
水液中にもともと存在する幾つかの蛋白成分が得られる
。「本質的に均質な」というのは、本明細書では定量的
に回収されたＩｇＧ抗体溶離フラクション中に存在する
蛋白質の〉９０χが個々の １ｇＧモノクローン性抗体
であることを意味する。精製％はこの技術で来既知の手
順、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（Ｕ、Ｋ。
体クロマトグラフィー、特に結合形１ｇＧモノクローン
性抗体及び他のそれを含有しているマウス腹水中の他の
蛋白質のための高性能液体クロマトグラフィー〇１ＰＬ
Ｃ）に於いて特に適していることがわかり、これによっ
て適当な水性緩衝液を使用する勾配溶離により結合した
蛋白の優先的な分離を可能にしている。このようにして
問題の、本質的に均質なモノクローン性抗体を含１め腹
水液中にもともと存在する幾つかの蛋白成分が得られる
。「本質的に均質な」というのは、本明細書では定量的
に回収されたＩｇＧ抗体溶離フラクション中に存在する
蛋白質の〉９０χが個々の １ｇＧモノクローン性抗体
であることを意味する。精製％はこの技術で来既知の手
順、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（Ｕ、Ｋ。
Ｌａｅｍｍｌｉ 、Ｎａｔｓｕｒｅ、 ２２７，６８０
（＋９７０）参照）によって確認することが出来る。
（＋９７０）参照）によって確認することが出来る。
本発明はＩｇＧ形のすべてのサブクラス、例えばＩｇＧ
１１ｇＧ２ 、及び＋ｇｃ、などのモノクローン性抗体
を含有するマウスの腹水液で使用するのに適しでいる。
１１ｇＧ２ 、及び＋ｇｃ、などのモノクローン性抗体
を含有するマウスの腹水液で使用するのに適しでいる。
そのようなモノクローン性抗体を含んでいるマウスの腹
水液を調製する方法はこの技術分野て一般的なものてあ
フて、例えば”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ、 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ； Ａ Ｎｅ１ｒ Ｄ
ｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｅｓ” Ｒ，Ｉｌ、 Ｋｅｎｎｅｔ等−ブレナ
ムプレス発行ニューヨーク（１９８０）及び” Ｍ ｅ
ｔ ＩＴ Ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｇ
、 Ｇａ１ｆｒｅｄとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、編集Ｊ、
Ｊ、 Ｌａｎｇｏｎｅ とＩｆ、 Ｖａｎ Ｖｕｎａｋ
ｉｓ、 ７３巻、３１−４６頁、アカデミツクプレス１
９８１年発行を参照。
水液を調製する方法はこの技術分野て一般的なものてあ
フて、例えば”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ、 Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ； Ａ Ｎｅ１ｒ Ｄ
ｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｅｓ” Ｒ，Ｉｌ、 Ｋｅｎｎｅｔ等−ブレナ
ムプレス発行ニューヨーク（１９８０）及び” Ｍ ｅ
ｔ ＩＴ Ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｇ
、 Ｇａ１ｆｒｅｄとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、編集Ｊ、
Ｊ、 Ｌａｎｇｏｎｅ とＩｆ、 Ｖａｎ Ｖｕｎａｋ
ｉｓ、 ７３巻、３１−４６頁、アカデミツクプレス１
９８１年発行を参照。
高度に精製された形のモノクローン性抗体の単離は明ら
かに望ましい。例えば、生体内の治療目的の為には、で
きるだけｗｉｇされ濃縮されているモノクローン性抗体
が悪い副作用を最小とし、意図される治療目的を最大限
にするために要求される。同様に試験管内診断目的の為
にそのような精製され濃縮されたモノクローン性抗体は
個々の診断試験の感度及び特異性を最大限とするために
望ましい。
かに望ましい。例えば、生体内の治療目的の為には、で
きるだけｗｉｇされ濃縮されているモノクローン性抗体
が悪い副作用を最小とし、意図される治療目的を最大限
にするために要求される。同様に試験管内診断目的の為
にそのような精製され濃縮されたモノクローン性抗体は
個々の診断試験の感度及び特異性を最大限とするために
望ましい。
マウスの腹水液は、本発明の為に使用される前に、干渉
する微粒状物質を除く為に予備処理され、ＰＥｌ−シリ
カゲル支持体へモノクローン性抗体が結合することをを
達成する為に適当なイオン強度及び必要なρ１１に平衡
化される。個々の微粒物質は慣用の精製手段、例えはろ
過、又は微粒物質をペレット化するに十分な力に於ける
遠心によって透明化される。微粒のないマウス腹水液の
平衡化はこの技術水準に於いて一般的な任意の手段によ
り達成できる。例えば、適当な形式及び寸法の分子ふる
い、例えば商品名セファデックスの名で市販されている
もの、の上て適当な緩衝液によってクロマトグラフィー
的に脱塩することにより、適当な緩？ｔｊ液に対しての
透析により、及びその他によって達成され、個々のＩｇ
Ｇモノクローン性抗体のｐｌよりも大きいｐＨ（このｐ
Ｈはモノクローン性抗体がその環境に於いて正味のイオ
ン荷電を有さないもの）、及び後のマウス腹水液のクロ
マトグラフ処理に於ける勾配溶離に使用される低イオン
強度緩衝液のイオン強度と同等か又はそれよりも小さい
イオン強度に平衡化される。
する微粒状物質を除く為に予備処理され、ＰＥｌ−シリ
カゲル支持体へモノクローン性抗体が結合することをを
達成する為に適当なイオン強度及び必要なρ１１に平衡
化される。個々の微粒物質は慣用の精製手段、例えはろ
過、又は微粒物質をペレット化するに十分な力に於ける
遠心によって透明化される。微粒のないマウス腹水液の
平衡化はこの技術水準に於いて一般的な任意の手段によ
り達成できる。例えば、適当な形式及び寸法の分子ふる
い、例えば商品名セファデックスの名で市販されている
もの、の上て適当な緩衝液によってクロマトグラフィー
的に脱塩することにより、適当な緩？ｔｊ液に対しての
透析により、及びその他によって達成され、個々のＩｇ
Ｇモノクローン性抗体のｐｌよりも大きいｐＨ（このｐ
Ｈはモノクローン性抗体がその環境に於いて正味のイオ
ン荷電を有さないもの）、及び後のマウス腹水液のクロ
マトグラフ処理に於ける勾配溶離に使用される低イオン
強度緩衝液のイオン強度と同等か又はそれよりも小さい
イオン強度に平衡化される。
液体クロマトグラフ、好ましくはＩＩ Ｐ Ｌ Ｃに、
使用するのに好ましいクロマトグラフカラムは前記の多
孔性のＰＣＩ−シリカゲル固体支持体で充填されている
。スチール又はカラスクロマトグラフカラムは長さが約
５〜１００ ｃｍ及び内径が約１〜１００ ｍｍの寸法
を有するものを含む。適当なりロマトグラフパラメータ
ー、例えばカラム充填技術、カラム寸法、カラム温度、
圧力などを選択することは通常の技術を有する者により
容易に決定される。
使用するのに好ましいクロマトグラフカラムは前記の多
孔性のＰＣＩ−シリカゲル固体支持体で充填されている
。スチール又はカラスクロマトグラフカラムは長さが約
５〜１００ ｃｍ及び内径が約１〜１００ ｍｍの寸法
を有するものを含む。適当なりロマトグラフパラメータ
ー、例えばカラム充填技術、カラム寸法、カラム温度、
圧力などを選択することは通常の技術を有する者により
容易に決定される。
充填されたカラムは適当な緩衝液をカラムに通すことに
よってクロマトグラフ中に於いて平衡化される。この緩
衝液平衡化段階の後、カラムはマウス腹水液の蛋白成分
のクロマトグラフ分離を行なう為に使用されるが、上に
記したようにマウス腹水液は予め微粒物がないものとさ
れており、適当なイオン強度及びｐｌ＋に平衡化されて
いるものである。そのような予め処理されたマウス腹水
液の試料は、次に緩衝液平衡化カラムにかけられ、その
成分蛋白質をＰＥｌ−シリカゲル充填物に結合させる。
よってクロマトグラフ中に於いて平衡化される。この緩
衝液平衡化段階の後、カラムはマウス腹水液の蛋白成分
のクロマトグラフ分離を行なう為に使用されるが、上に
記したようにマウス腹水液は予め微粒物がないものとさ
れており、適当なイオン強度及びｐｌ＋に平衡化されて
いるものである。そのような予め処理されたマウス腹水
液の試料は、次に緩衝液平衡化カラムにかけられ、その
成分蛋白質をＰＥｌ−シリカゲル充填物に結合させる。
結合した蛋白は次に慣用の勾配溶離技術により選択的に
溶離されるがここで時間、流速、及び増加するイオン強
度又は減少するｐＨの勾配物を生ずる勾配形なとの相互
に依存するクロマトグラフパラメーターを考慮に入れる
。ｐｌ＋約６．０〜約８．３の陰イオン性緩衝液例えば
燐酸カリウム、トリスアセテ−１・、酢酸アンモニウム
などをそのような勾配を生し結合する蛋白をポリエチレ
ンイミン官能基から溶離するのに使用できる。例えば勾
配は約３０分〜約４時間約０．１ ｍｌ／分〜約２１７
分の流速で形成するのが有利である。
溶離されるがここで時間、流速、及び増加するイオン強
度又は減少するｐＨの勾配物を生ずる勾配形なとの相互
に依存するクロマトグラフパラメーターを考慮に入れる
。ｐｌ＋約６．０〜約８．３の陰イオン性緩衝液例えば
燐酸カリウム、トリスアセテ−１・、酢酸アンモニウム
などをそのような勾配を生し結合する蛋白をポリエチレ
ンイミン官能基から溶離するのに使用できる。例えば勾
配は約３０分〜約４時間約０．１ ｍｌ／分〜約２１７
分の流速で形成するのが有利である。
分割された蛋白質はこの技術に於いて一般的な任意の手
段、例えば２８０ ｎｍに於ける紫外線吸収をモニター
することにより同定出来る。分離された蛋白を含有して
いる溶離フラクションをフラクションコレクターを使用
して集め得る。均質のモノクローン性抗体を含有する溶
離フラクションを例えば個々の抗体にってい展開された
ラジオイミュノアッセにより、他の抗原抗体反応により
、又はポリアクリルアミド電気泳動によって同定するこ
とが出来る。
段、例えば２８０ ｎｍに於ける紫外線吸収をモニター
することにより同定出来る。分離された蛋白を含有して
いる溶離フラクションをフラクションコレクターを使用
して集め得る。均質のモノクローン性抗体を含有する溶
離フラクションを例えば個々の抗体にってい展開された
ラジオイミュノアッセにより、他の抗原抗体反応により
、又はポリアクリルアミド電気泳動によって同定するこ
とが出来る。
本発明の方法はモノクローン性抗体を含有するマウス腹
水液の全容量と独立にあることが分かりクロマトグラフ
充填に使用されるＰＣＩ−シリカゲルの量を除いて限定
する要因はない。即ちこの方法は固体クロマトグラフ支
持体の容蚤を越えないかぎり実施可能である。
水液の全容量と独立にあることが分かりクロマトグラフ
充填に使用されるＰＣＩ−シリカゲルの量を除いて限定
する要因はない。即ちこの方法は固体クロマトグラフ支
持体の容蚤を越えないかぎり実施可能である。
本発明に従ってモノクローン性抗体形１８Ｇを含有する
微粒物のないマウスの腹水液の試料がクロマトグラフ的
に分離され、本質的に均質の形で上記抗体を与える。よ
り詳しく前に記されたように好ましい方法は上記のモノ
クローン性抗体を含んでいる微粒のないマウスの腹水液
の試料を以下により精製する。
微粒物のないマウスの腹水液の試料がクロマトグラフ的
に分離され、本質的に均質の形で上記抗体を与える。よ
り詳しく前に記されたように好ましい方法は上記のモノ
クローン性抗体を含んでいる微粒のないマウスの腹水液
の試料を以下により精製する。
ａ、上記微粒物のないマウス腹水液の試料を後のクロマ
トグラフィー分離及び回収段階での勾配溶離に使用する
低イオン強度緩衝液のイオン強度と同等又はそれより小
さいイオン強度に、又個々のモノクローン性抗体のｐｌ
よりも大きいｐｌ＋に平衡化させ、 ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
カゲルと約４００〜約１８００の平均分子量を有するポ
リエチレンイミノプロピルトリメトキシシランの反応生
成物からなるクロマトグラフィー充填物を使用する液体
クロマトグラフィ一手段によって、上記モノクローン性
抗体形１ｇＧを上記試料から分離回収する。
トグラフィー分離及び回収段階での勾配溶離に使用する
低イオン強度緩衝液のイオン強度と同等又はそれより小
さいイオン強度に、又個々のモノクローン性抗体のｐｌ
よりも大きいｐｌ＋に平衡化させ、 ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
カゲルと約４００〜約１８００の平均分子量を有するポ
リエチレンイミノプロピルトリメトキシシランの反応生
成物からなるクロマトグラフィー充填物を使用する液体
クロマトグラフィ一手段によって、上記モノクローン性
抗体形１ｇＧを上記試料から分離回収する。
以下の実施例の助けにより本発明はより容易に理解され
るがこれらは単に説明のために与えられており本発明を
制限するものではない。
るがこれらは単に説明のために与えられており本発明を
制限するものではない。
実施例１
平均粒径５．２５ミクロン及び平均孔寸法３３０オング
ストロームを有し、ザセップＡ Ｒａタイオンズグルー
プ、ヘスペリア、カリフォルニアがら商品名”Ｖｙｄａ
ｃ Ａ”カタログＮｏ、 ｌ０ＩＴ９Ｂ５の商品名で球
状のシリカとして市販されているシリカゲル２０ ｇの
ｌｏｏｍｌ）ルエン及び２ｍｌの水中のスラリーを調製
し、そして１０分間室温で攪はんする。これに撹はんし
ながら３９．４ ｇの平均分子量５００を有するポリオ
キシエチレンイミノプロピルトリメトキシシランの５０
χ（Ｗ／Ｗ）イソプロパツールｆｆ７ ｔ（１３９，４
ｇを加え、混合物をさらに５分間攪はんする。
ストロームを有し、ザセップＡ Ｒａタイオンズグルー
プ、ヘスペリア、カリフォルニアがら商品名”Ｖｙｄａ
ｃ Ａ”カタログＮｏ、 ｌ０ＩＴ９Ｂ５の商品名で球
状のシリカとして市販されているシリカゲル２０ ｇの
ｌｏｏｍｌ）ルエン及び２ｍｌの水中のスラリーを調製
し、そして１０分間室温で攪はんする。これに撹はんし
ながら３９．４ ｇの平均分子量５００を有するポリオ
キシエチレンイミノプロピルトリメトキシシランの５０
χ（Ｗ／Ｗ）イソプロパツールｆｆ７ ｔ（１３９，４
ｇを加え、混合物をさらに５分間攪はんする。
混合物を次に室温で一夜放置する。混合物を次に１．０
ミクロンフィルターのろうとを使用してろ過する。ろ液
を５０ｍ１のトルエンで２回そして５゜１のメタノール
で２回洗い次にろうと上で空気乾燥し最後に８０〜８５
℃で約３時間３ｏオーフン乾燥し共有結合した ＰＥＩ
結合されたシリカゲル製品約２．８５Ｘ Ｎを生成する
。
ミクロンフィルターのろうとを使用してろ過する。ろ液
を５０ｍ１のトルエンで２回そして５゜１のメタノール
で２回洗い次にろうと上で空気乾燥し最後に８０〜８５
℃で約３時間３ｏオーフン乾燥し共有結合した ＰＥＩ
結合されたシリカゲル製品約２．８５Ｘ Ｎを生成する
。
実施例２
細菌のりボボリサッヵライド細胞壁に対し特異的であっ
て、慣用のザブクラス特異性抗血清にょって決定される
ようにサブクラス １８Ｇ１ に属するモノクローン性
抗体を含有しているマウス腹水液２１試料を １５，６
００ ｘ重力で５分間遠心した。上澄み液を次にｌ０ｍ
Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨＧ、７３へ、１夜（１７時間
）２回のチェンジの１−リットル１゜ｎ＋Ｍ燐酸緩衝液
ｐＨ６，３７に対して透析することにより平衡化した。
て、慣用のザブクラス特異性抗血清にょって決定される
ようにサブクラス １８Ｇ１ に属するモノクローン性
抗体を含有しているマウス腹水液２１試料を １５，６
００ ｘ重力で５分間遠心した。上澄み液を次にｌ０ｍ
Ｍ燐酸カリウム緩衝液ｐＨＧ、７３へ、１夜（１７時間
）２回のチェンジの１−リットル１゜ｎ＋Ｍ燐酸緩衝液
ｐＨ６，３７に対して透析することにより平衡化した。
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ
Ｏ，４６ｍｍに実施例１から得られたＰＥ１−シリカゲ
ル３．８ｇを充填しρＩＩ ６．７３の０．０１モル燐
酸カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１ｍ１
７分で２０分ポンプで送ることによって平衡化した。マ
ウス腹水液の０．２５ ｍｌの平衡化された試料をポリ
エチレンイミン結合シリカゲルカラムにかけ、０．０１
モル燐酸カリウムｐＨ６，７３から０．２５モル燐酸カ
リウムｐＨ６，８への流速１ｍｌ／分におりる６０分間
の線形勾配を使用して勾配溶離することにより蛋白分離
を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵ■吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．６４吸
光度単位にセットした。２８０ ｎｍ吸収ピークの一連
のものを約３分〜約２５分の保持時間の範囲で検出した
。約１６分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配
プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の均一試
料とのコクロマトグラフィックによって抗リポポリサッ
カライドモノクローン性抗体として同定された。
Ｏ，４６ｍｍに実施例１から得られたＰＥ１−シリカゲ
ル３．８ｇを充填しρＩＩ ６．７３の０．０１モル燐
酸カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１ｍ１
７分で２０分ポンプで送ることによって平衡化した。マ
ウス腹水液の０．２５ ｍｌの平衡化された試料をポリ
エチレンイミン結合シリカゲルカラムにかけ、０．０１
モル燐酸カリウムｐＨ６，７３から０．２５モル燐酸カ
リウムｐＨ６，８への流速１ｍｌ／分におりる６０分間
の線形勾配を使用して勾配溶離することにより蛋白分離
を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵ■吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．６４吸
光度単位にセットした。２８０ ｎｍ吸収ピークの一連
のものを約３分〜約２５分の保持時間の範囲で検出した
。約１６分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配
プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の均一試
料とのコクロマトグラフィックによって抗リポポリサッ
カライドモノクローン性抗体として同定された。
約１６分に於いて溶離する蛋白ピークは二つの基準によ
って９（Ｈ純度より大であると評価された。
って９（Ｈ純度より大であると評価された。
先ず第一は集められた蛋白ピークはＦ、Ｂ、レグニア−
、サイエンス、２２２，２４５（＋９８３）に従ッテポ
リエチレンイミン結合シリカゲルカラム上のクロマトグ
ラフ後対称のピークを与えた。第二に、本質的にＵ、に
、Ｌａｅｍｍｌ ｔ 、ネイチャー、２２７，６８０（
１９７０）、に記載されるように実施されたＦデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は５００
００ダルトン（ＩｇＧの重い鎖）及び２５０００ダルト
ン（１８Ｇの軽い鎖）の分子量に相当する本質的に二つ
の主要なりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーバンド
と、全体の染色された蛋白の１０％に満たないものを表
わす第三のかすかなりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブ
ルーバンドを与えた。
、サイエンス、２２２，２４５（＋９８３）に従ッテポ
リエチレンイミン結合シリカゲルカラム上のクロマトグ
ラフ後対称のピークを与えた。第二に、本質的にＵ、に
、Ｌａｅｍｍｌ ｔ 、ネイチャー、２２７，６８０（
１９７０）、に記載されるように実施されたＦデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は５００
００ダルトン（ＩｇＧの重い鎖）及び２５０００ダルト
ン（１８Ｇの軽い鎖）の分子量に相当する本質的に二つ
の主要なりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーバンド
と、全体の染色された蛋白の１０％に満たないものを表
わす第三のかすかなりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブ
ルーバンドを与えた。
実施例３
ミオシンに対し特異的であって慣用のザブクラス特異性
抗血清によって決定されるようにサブクラス １８Ｇ２
に属するモノクローン性抗体を含有しているマウス腹水
液２ｍｌ試料を １５，６００ ｘ重力で５分間遠心し
た。上澄み液を次にｌ０ｍＭ燐酸カリウム緩衝ｔ（１’
ａｌｌ ６．７３へ、１夜２つの１−リットルのチェ
ンジのｌ０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液ｐｌ＋ａｌｌ３７に
対して透析することにより平衡化した。ステンレス鋼の
クロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ Ｏ，４６＋ｎｍ
に実施例１から得られたＰＣＩ−シリカゲル生成物３．
８８を充填し、ｐＨ６，７３の０．０１モル燐酸カリウ
ム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１ ｍｌ／分で
２０分ポンプで送って通ずことによって平衡化した。マ
ウス腹水液の０．２５ ｉｆの平衡化された試料をポリ
エチレンイミン結合シリカゲルカラムにかけ、０．０１
％ル燐酸カリウム１１１１６．７３から０．２５モル
燐酸カリウムｐＨ６，８への流速１ｍｌ／分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより蛋
白分離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵ
ｖ吸収を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．
６４吸光度単位にセットした。２８０ ｎｍ吸収ピーク
の一連のものを約３分〜約２５分の保持時間の範囲で検
出した。約１６分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同
し勾配プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の
均一試料とのコクロマトグラフインクによってアンチミ
オシンモノクローン性抗体として同定された。
抗血清によって決定されるようにサブクラス １８Ｇ２
に属するモノクローン性抗体を含有しているマウス腹水
液２ｍｌ試料を １５，６００ ｘ重力で５分間遠心し
た。上澄み液を次にｌ０ｍＭ燐酸カリウム緩衝ｔ（１’
ａｌｌ ６．７３へ、１夜２つの１−リットルのチェ
ンジのｌ０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液ｐｌ＋ａｌｌ３７に
対して透析することにより平衡化した。ステンレス鋼の
クロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ Ｏ，４６＋ｎｍ
に実施例１から得られたＰＣＩ−シリカゲル生成物３．
８８を充填し、ｐＨ６，７３の０．０１モル燐酸カリウ
ム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１ ｍｌ／分で
２０分ポンプで送って通ずことによって平衡化した。マ
ウス腹水液の０．２５ ｉｆの平衡化された試料をポリ
エチレンイミン結合シリカゲルカラムにかけ、０．０１
％ル燐酸カリウム１１１１６．７３から０．２５モル
燐酸カリウムｐＨ６，８への流速１ｍｌ／分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより蛋
白分離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵ
ｖ吸収を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．
６４吸光度単位にセットした。２８０ ｎｍ吸収ピーク
の一連のものを約３分〜約２５分の保持時間の範囲で検
出した。約１６分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同
し勾配プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の
均一試料とのコクロマトグラフインクによってアンチミ
オシンモノクローン性抗体として同定された。
約１６分に於いて溶離する蛋白ピークは実施例２に述べ
られた二つの基準によって９ｏχ純度より大であると評
価された。
られた二つの基準によって９ｏχ純度より大であると評
価された。
実施例４
特異性の知られていない ＩｇＧモノクローン性抗体を
含有しているマウス腹水液、２ｍｌ試料を、＋５，６０
０ ｘ重力で５分間遠心した。上澄み液を次に１０ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，７３へ、１夜２つの１−リ
ットルのチェンジの１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６
，３７に対して透析することにより平衡化した。ステン
レス鋼製のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ Ｏ，
４６ｎｏｗに実施例１のポリエチレンイミンシリカゲル
生成物３．８８を充填し、ａｌｌ ６．７３の０．０１
モル燐酸カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速
１１／分で２０分ポンプで送って通すことによって平衡
化した。マウス腹水液の０．２５１の平衡化された試料
をポリエチレンイミンシリカゲルカラムにかけ、０．Ｏ
１モル燐酸カリウムｐ）１６．７３から０．２５モル燐
酸カリウムρ■６．８への６０分間の線形勾配を使用し
て勾配溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離は
２８００ｍにおけるＵｖ吸収を使用して検出したが、フ
ルスケールの吸収は０．６４吸光度単位にセットした。
含有しているマウス腹水液、２ｍｌ試料を、＋５，６０
０ ｘ重力で５分間遠心した。上澄み液を次に１０ｍＭ
燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６，７３へ、１夜２つの１−リ
ットルのチェンジの１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ６
，３７に対して透析することにより平衡化した。ステン
レス鋼製のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ Ｏ，
４６ｎｏｗに実施例１のポリエチレンイミンシリカゲル
生成物３．８８を充填し、ａｌｌ ６．７３の０．０１
モル燐酸カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速
１１／分で２０分ポンプで送って通すことによって平衡
化した。マウス腹水液の０．２５１の平衡化された試料
をポリエチレンイミンシリカゲルカラムにかけ、０．Ｏ
１モル燐酸カリウムｐ）１６．７３から０．２５モル燐
酸カリウムρ■６．８への６０分間の線形勾配を使用し
て勾配溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離は
２８００ｍにおけるＵｖ吸収を使用して検出したが、フ
ルスケールの吸収は０．６４吸光度単位にセットした。
２８０ ｎｆｆ１吸収ピークの一連のものを約３分〜約
２５分の保持時間の範囲で検出した。約１６分に於ける
蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有す
る同じモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグ
ラフィックによってモノクローン性抗体として同定され
た。
２５分の保持時間の範囲で検出した。約１６分に於ける
蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有す
る同じモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグ
ラフィックによってモノクローン性抗体として同定され
た。
約１６分に於いて溶離する蛋白ピークは０．ガブリエル
；”Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ”
Ｗ、Ｂ、 Ｊａｋａｂｙ編第２２巻５６５〜５７８頁
（アカデミツクプレス発行）（１９７１）に記載される
ように実施されるポリアクリルアミド電気泳動によって
９５％純度より大であると評価された。これは単一のク
マシー（ｃｏｏｍａｓｓ ｉ ｅ）ブルーバンドを与え
た。このバンドの易動度は標準のモノクローン性抗体に
ついて観察されるものと対応している。
；”Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ”
Ｗ、Ｂ、 Ｊａｋａｂｙ編第２２巻５６５〜５７８頁
（アカデミツクプレス発行）（１９７１）に記載される
ように実施されるポリアクリルアミド電気泳動によって
９５％純度より大であると評価された。これは単一のク
マシー（ｃｏｏｍａｓｓ ｉ ｅ）ブルーバンドを与え
た。このバンドの易動度は標準のモノクローン性抗体に
ついて観察されるものと対応している。
実施例５
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ４
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル生成物３．８８を充填し、ｐＨ６，７３の０．０１
モル燐酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ ｍ
ｌ／分て２０分ポンプで送って通ずことによって平衡化
した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の０．
６μｍの平衡化された試料をＰＣＩ−シリカゲルカラム
にかけ、０．０１モル燐酸カリウムｐＨ６，７３から０
．２５モル燐酸カリウムｐＨ６，，８への流速１ｍｌ／
分における １２０分間の線形勾配を使用して勾配溶離
することにより分離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎ
ｉにおけるＵ■吸収を使用して検出したがフルスケール
の吸収は０．０１吸光度単位にセットした。２８Ｏｒ＋
ｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜約５０分の保持時
間の範囲で検出した。約２８分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフィールを有する同じモノクロ
ーン性抗体の均一試料とのコクロマトグラフィックによ
ってアンチリポポリサッカライドモノクローン性抗体と
して同定された。
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル生成物３．８８を充填し、ｐＨ６，７３の０．０１
モル燐酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ ｍ
ｌ／分て２０分ポンプで送って通ずことによって平衡化
した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の０．
６μｍの平衡化された試料をＰＣＩ−シリカゲルカラム
にかけ、０．０１モル燐酸カリウムｐＨ６，７３から０
．２５モル燐酸カリウムｐＨ６，，８への流速１ｍｌ／
分における １２０分間の線形勾配を使用して勾配溶離
することにより分離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎ
ｉにおけるＵ■吸収を使用して検出したがフルスケール
の吸収は０．０１吸光度単位にセットした。２８Ｏｒ＋
ｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜約５０分の保持時
間の範囲で検出した。約２８分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフィールを有する同じモノクロ
ーン性抗体の均一試料とのコクロマトグラフィックによ
ってアンチリポポリサッカライドモノクローン性抗体と
して同定された。
実施例６
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ４
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル３．８ｇを充填し、ｐＨ８，３の０．０１モル燐酸
カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ｍ１７分で３
０分ポンプで送って通すことによって平衡化した。実施
例２で利用されたと同じマウス腹水液の６μｌの平衡化
された試料なＰＥｌ−シリカゲルカラムにかけ、０．Ｏ
１モル燐酸カリウムｐ）１８．３から０．２５モル燐酸
カリウムｐｌ＋ ８．３への流速１ｍｌ／分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ｎｍにおけるＵｖ吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．Ｏ１１
吸光単位にセットした。
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル３．８ｇを充填し、ｐＨ８，３の０．０１モル燐酸
カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ｍ１７分で３
０分ポンプで送って通すことによって平衡化した。実施
例２で利用されたと同じマウス腹水液の６μｌの平衡化
された試料なＰＥｌ−シリカゲルカラムにかけ、０．Ｏ
１モル燐酸カリウムｐ）１８．３から０．２５モル燐酸
カリウムｐｌ＋ ８．３への流速１ｍｌ／分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ｎｍにおけるＵｖ吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．Ｏ１１
吸光単位にセットした。
２８０ ｎｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜約５０
分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に於ける蛋白
ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有する同
じモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグラフ
ィックによってアンチリポポリサッカライドモノクロー
ン性抗体として同定された。
分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に於ける蛋白
ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有する同
じモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグラフ
ィックによってアンチリポポリサッカライドモノクロー
ン性抗体として同定された。
実施例７
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ４
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル３．８ｇを充填し、ｐＨ６，０の０．０１モル燐酸
カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ ｍｌ／分で
２０分ポンプで送って通すことによって平衡化した。実
施例２で利用されたと同じマウス腹水液の６μｍの平衡
化された試料をＰＣＩ−シリカゲルカラムにかけ、０．
０１モル燐酸カリウムｐＨ６，０から０．２５モル燐酸
カリウムｐｌ＋ ６．０への流速１ｍ１７分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ｎｍにおけるＵｖ吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．０１吸
光度単位にセットした。
．６ ｍｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリカ
ゲル３．８ｇを充填し、ｐＨ６，０の０．０１モル燐酸
カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ ｍｌ／分で
２０分ポンプで送って通すことによって平衡化した。実
施例２で利用されたと同じマウス腹水液の６μｍの平衡
化された試料をＰＣＩ−シリカゲルカラムにかけ、０．
０１モル燐酸カリウムｐＨ６，０から０．２５モル燐酸
カリウムｐｌ＋ ６．０への流速１ｍ１７分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ｎｍにおけるＵｖ吸収
を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．０１吸
光度単位にセットした。
２８０ ｎｏ＋吸収ピークの一連のものを約３分〜約１
４分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に於ける蛋
白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有する
同しモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フィックによってアンチリポポリサッカライドモノクロ
ーン性抗体として同定された。
４分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に於ける蛋
白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィールを有する
同しモノクローン性抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フィックによってアンチリポポリサッカライドモノクロ
ーン性抗体として同定された。
実施例日
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム２５ ｃｍ ｘ４
．６ ｎ＋ｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル３．８ｇを充填し、ｐ）１６．７９の０．０１モ
ル酢酸アンモニウムで、この緩衝液をカラムに流速ｌ
ｍｌ／分で３０分ポンプで送って通すことによって平衡
化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の６
μｌの平衡化された試料をＰＥｌ−シリカゲルカラムに
かけ、０．Ｏ１モル酢酸アンモニウムｐＨ６，７９から
１．０モル酢酸アンモニウムρ１１６．７９への流速
１ｍｌ／分における３０分間の線形勾配な使用して勾配
溶離することにより分離を達成した。
．６ ｎ＋ｍに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル３．８ｇを充填し、ｐ）１６．７９の０．０１モ
ル酢酸アンモニウムで、この緩衝液をカラムに流速ｌ
ｍｌ／分で３０分ポンプで送って通すことによって平衡
化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の６
μｌの平衡化された試料をＰＥｌ−シリカゲルカラムに
かけ、０．Ｏ１モル酢酸アンモニウムｐＨ６，７９から
１．０モル酢酸アンモニウムρ１１６．７９への流速
１ｍｌ／分における３０分間の線形勾配な使用して勾配
溶離することにより分離を達成した。
蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵ■吸収を使用して検
出したがフルスケールの吸収は０．０１吸光度単位にセ
ットした。２８０ ｎｍ吸収ピークの一連のものを約３
分〜約２５分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に
於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィール
を有する同しモノクローン性抗体の均一試料とのコクロ
マトグラフイングによってアンチリポポリサッカライド
モノクローン性抗体として同定された。
出したがフルスケールの吸収は０．０１吸光度単位にセ
ットした。２８０ ｎｍ吸収ピークの一連のものを約３
分〜約２５分の保持時間の範囲で検出した。約１２分に
於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフィール
を有する同しモノクローン性抗体の均一試料とのコクロ
マトグラフイングによってアンチリポポリサッカライド
モノクローン性抗体として同定された。
実施例９
ジンクロムインク（ＳｙｎＣｈｒｏｍ Ｉｎｃ、）の、
５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＡＸ３００クロマトグラフカ
ラム２５ ｃｍ ｘ ４．１ｍｍをｐＨ６，７３の０．
０１モル燐酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速Ｉ
ｌ１ｌｔ／分で２０分ポンプで送って通すことによっ
て平衡化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水
液の６μｌの平衡化された試料なカラムにかけ、０．０
１モル燐酸カリウムｐ）ｌ ６．７３から０．２５ Ｍ
燐酸カリウムｐｕ ０．８への流速１１７分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵｖ吸
収を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．０１
吸光度単位にセットしたｅ ２８０ ｎｍ吸収ピークの
一連のものを 約３分〜約３０分の保持時間の範囲で検
出した。約２０分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同
じ勾配プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の
均一試料とのコクロマトグラフィックによってアンチリ
ポポリサッカライドモノクローン性抗体として同定され
た。
５ｙｎＣｈｒｏｐａｋ ＡＸ３００クロマトグラフカ
ラム２５ ｃｍ ｘ ４．１ｍｍをｐＨ６，７３の０．
０１モル燐酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速Ｉ
ｌ１ｌｔ／分で２０分ポンプで送って通すことによっ
て平衡化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水
液の６μｌの平衡化された試料なカラムにかけ、０．０
１モル燐酸カリウムｐ）ｌ ６．７３から０．２５ Ｍ
燐酸カリウムｐｕ ０．８への流速１１７分における６
０分間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより分
離を達成した。蛋白溶離は２８０ ｎｍにおけるＵｖ吸
収を使用して検出したがフルスケールの吸収は０．０１
吸光度単位にセットしたｅ ２８０ ｎｍ吸収ピークの
一連のものを 約３分〜約３０分の保持時間の範囲で検
出した。約２０分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同
じ勾配プロフィールを有する同じモノクローン性抗体の
均一試料とのコクロマトグラフィックによってアンチリ
ポポリサッカライドモノクローン性抗体として同定され
た。
出願人 ジェイ ティー ペイカー ケミカル手続補正
書（頴゛） 特シ午庁長官 志 賀 学 殿 昭和−１０Ｋ ３°乙
８１ ＠件の表示 昭和５９年特許願第２４２５８４号
３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 件 所 アメリカ合衆国０８８６５ニユーシヤーシー州
フイリツプスパークルツドスクールレーン２２２ 氏名（名称） ジエイ ティー ヘイカー ケミカル
カンパニー４代理人 住 所 東京都新宿区新宿２丁目８番１号新宿セブンヒ
ル３０３号６ 補ｔｃこより増加する発明の数 増加ぜ
す７ 補正の対象 明細書（う、ｌ’ｌ−，２２員）明
細書第５頁１１行〜６頁６行「第二の・・・・・造られ
得る。」を以下に訂正する。
書（頴゛） 特シ午庁長官 志 賀 学 殿 昭和−１０Ｋ ３°乙
８１ ＠件の表示 昭和５９年特許願第２４２５８４号
３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 件 所 アメリカ合衆国０８８６５ニユーシヤーシー州
フイリツプスパークルツドスクールレーン２２２ 氏名（名称） ジエイ ティー ヘイカー ケミカル
カンパニー４代理人 住 所 東京都新宿区新宿２丁目８番１号新宿セブンヒ
ル３０３号６ 補ｔｃこより増加する発明の数 増加ぜ
す７ 補正の対象 明細書（う、ｌ’ｌ−，２２員）明
細書第５頁１１行〜６頁６行「第二の・・・・・造られ
得る。」を以下に訂正する。
「第二の形式のものはジー、バネツクどエフ、イー、レ
グニア−（Ｇ、ＶａｎｅｃｅｋとＦ、Ｅ、 Ｒ＋４ｎｉ
ｅｒ）、アナル、バイオケム、 （Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｌ＋ｅｍ、） １２１．１５６−１５９（１９８２）
及びエイ、シュー。アルパートとエフ、イー、レグニア
＝（Ａ、、１．ＡｌｐｅｒｔとＦ、Ｅ、 Ｒｅｇｎｉｅ
ｒ）＋シュー。クロマトグラ、 （Ｊ、 Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ、＞１８５，３７５−３９２（１９７８）、に
記載された吸収された架橋１）ローシリカケルの静的な
相である。この形式は商品名「シンクロパック」 （”
Ｓ ｙ ｎ Ｃｈ ｒ １〕ａ ｋ”）の名でインジア
ナ州リンデンのジンクローム インク。
グニア−（Ｇ、ＶａｎｅｃｅｋとＦ、Ｅ、 Ｒ＋４ｎｉ
ｅｒ）、アナル、バイオケム、 （Ａｎａｌ、 Ｂｉｏ
ｃｌ＋ｅｍ、） １２１．１５６−１５９（１９８２）
及びエイ、シュー。アルパートとエフ、イー、レグニア
＝（Ａ、、１．ＡｌｐｅｒｔとＦ、Ｅ、 Ｒｅｇｎｉｅ
ｒ）＋シュー。クロマトグラ、 （Ｊ、 Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ、＞１８５，３７５−３９２（１９７８）、に
記載された吸収された架橋１）ローシリカケルの静的な
相である。この形式は商品名「シンクロパック」 （”
Ｓ ｙ ｎ Ｃｈ ｒ １〕ａ ｋ”）の名でインジア
ナ州リンデンのジンクローム インク。
（ＳｙｎＣ１＋ｒｏ＋ｉ Ｉｎｃ、）から市販されてい
る。アルパート及びレグニア−は、ポリエチレンイミン
（ＰＣＩ）がシリカゲル表面に吸収され架橋されて安定
な重合層を形成することを示している。ＰＣＩの構造は
十分な第１級及び第２級アミノ基を与えるので、表面の
隣接しでいる ＰＣＩ分子が多官能オキシランにより架
橋され重合層となりうる。親水性のクロスリンカ−例え
ばジグリシジルエチレングリコールの使用を通して親水
性の被覆か造られ１ａる。」明細書第１４頁 １行〜１
４頁１７行「精製％は・・・・１９８１年発行を参照。
る。アルパート及びレグニア−は、ポリエチレンイミン
（ＰＣＩ）がシリカゲル表面に吸収され架橋されて安定
な重合層を形成することを示している。ＰＣＩの構造は
十分な第１級及び第２級アミノ基を与えるので、表面の
隣接しでいる ＰＣＩ分子が多官能オキシランにより架
橋され重合層となりうる。親水性のクロスリンカ−例え
ばジグリシジルエチレングリコールの使用を通して親水
性の被覆か造られ１ａる。」明細書第１４頁 １行〜１
４頁１７行「精製％は・・・・１９８１年発行を参照。
」を以下に訂正する。
ｒ精製％はこの技術て来既知の手順、例えば、ドデシル
硫酸すトリウムポリアクリルアミドゲル気泳動（ニー、
ケー．ラエムリ（Ｕ．に、 Ｌａｅｍｍｌｉ）＋ネイチ
＋ − （ＮａＩＪｕｒｅ）、 ２２７，６８０（＋９
７０）参１（へ）によって確認することか出来る。
硫酸すトリウムポリアクリルアミドゲル気泳動（ニー、
ケー．ラエムリ（Ｕ．に、 Ｌａｅｍｍｌｉ）＋ネイチ
＋ − （ＮａＩＪｕｒｅ）、 ２２７，６８０（＋９
７０）参１（へ）によって確認することか出来る。
本発明はＩｇＧ形のすへてのサブクラス、例えはＩｇＧ
１ １ｇＧＬ＋及び １８Ｇ□なとのモノクローン性抗
体を含有するマウスの腹水液で使用するのに適している
。そのようなモノクローン性抗体を含んでいるマウスの
腹水液を調製する方法はこの技術分野で一般的なもので
あって、「モノクローナル抗体、バイブリドマス；生物
学的分析の新しい次元Ｊ （ＭｏｎｏＣｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ； Ａ，
／ｆＮｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ）アール。
１ １ｇＧＬ＋及び １８Ｇ□なとのモノクローン性抗
体を含有するマウスの腹水液で使用するのに適している
。そのようなモノクローン性抗体を含んでいるマウスの
腹水液を調製する方法はこの技術分野で一般的なもので
あって、「モノクローナル抗体、バイブリドマス；生物
学的分析の新しい次元Ｊ （ＭｏｎｏＣｌｏｎａｌ Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ； Ａ，
／ｆＮｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ ）アール。
エッチ、ケネット（Ｒ． Ｈ． Ｋｅｎｎｅｔ）等、プ
レナムプレス発行ニューヨーク（＋９８０）及び「メソ
ットインエンザイモロジーＪ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）ジー、カルフレット及びシ
ー、ミルスタイン（Ｇ。
レナムプレス発行ニューヨーク（＋９８０）及び「メソ
ットインエンザイモロジーＪ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）ジー、カルフレット及びシ
ー、ミルスタイン（Ｇ。
（ｉａｌｆｒｅｄ Ｃ，Ｈｉｌｓｔｅｉｎ）、編集ジｘ
−、シ３−−１う゛ンゴンとエイチ、ハン ブナギス（
Ｊ、Ｊ、 ＬａｎｇｏｎｅとＩｆ、 Ｖａｎ Ｖｕｎａ
ｌ、１ｓ）１７３ 巻、３１−４６頁、アカデミツクプ
レス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８］年発行
を参照。Ａ明細書第２２頁６行〜２２頁２０行「約１６
分に於ける・・・・ブルーバント゛を与えた。」を以下
に訂正する。
−、シ３−−１う゛ンゴンとエイチ、ハン ブナギス（
Ｊ、Ｊ、 ＬａｎｇｏｎｅとＩｆ、 Ｖａｎ Ｖｕｎａ
ｌ、１ｓ）１７３ 巻、３１−４６頁、アカデミツクプ
レス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９８］年発行
を参照。Ａ明細書第２２頁６行〜２２頁２０行「約１６
分に於ける・・・・ブルーバント゛を与えた。」を以下
に訂正する。
「約１６分に於いて溶離する蛋白ピークは二つの基準に
よって９０λ純度より大であると評価され１２゜先ず第
一は集められた蛋白ビークはエフ、ヒー。
よって９０λ純度より大であると評価され１２゜先ず第
一は集められた蛋白ビークはエフ、ヒー。
レグニア−（Ｆ、Ｂ、 ＲＢｎｉｅｒ）、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ’） 、？２２ユ２４５（＋９８３）に
従ってポリエチレンイミン結合シリカケルカラム上のク
ロマトグラフ段対称のピークを与えた。第二に、木質的
にニー、ジー。
Ｓｃｉｅｎｃｅ’） 、？２２ユ２４５（＋９８３）に
従ってポリエチレンイミン結合シリカケルカラム上のク
ロマトグラフ段対称のピークを与えた。第二に、木質的
にニー、ジー。
ラエムリ＜ｌＪ、ｌｊ、Ｌａｅ＋１ｍｕｌｉ）、ネイチ
（−−（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７．０８０（１９７０）
、に記載されるように実施されたドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミ）・ゲル電気泳動は５００００ダル
トン（ＩｇＧの重い鎖）及び２５０００ダルトン（Ｉｇ
Ｇの軽い鎖）の分子里に相当する本質的に二つの主要な
りマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）フルーバントと、全体
の染色された蛋白の１０２１に満たないものを表わす第
三のかすかなりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーバ
ントを与えた。Ｊ
（−−（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７．０８０（１９７０）
、に記載されるように実施されたドデシル硫酸ナトリウ
ムポリアクリルアミ）・ゲル電気泳動は５００００ダル
トン（ＩｇＧの重い鎖）及び２５０００ダルトン（Ｉｇ
Ｇの軽い鎖）の分子里に相当する本質的に二つの主要な
りマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）フルーバントと、全体
の染色された蛋白の１０２１に満たないものを表わす第
三のかすかなりマシー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルーバ
ントを与えた。Ｊ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、本質的に均質のモノクローン性抗体形１ｇＧを上記
のモクローン性抗体を含有するマウスの腹水液から得る
方法に於いて、上記モノクローン性抗体を上記試料から
液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回収する
ことからなるが、その場合にクロマトグラフ充填物が、
平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜
約１０００オングストローム単位を有し、そして共有結
合非架橋形又は吸着された架橋形でポリエチレンイミン
官能基が結合されている微粒シリカゲルから本質的にな
る方法。 ２、本質的に均質のモノクローン性抗体形 １ｇＧを上
記のモクローン性抗体を含有するマウスの腹水液から得
る方法に於いて、上記モノクローン性抗体を上記試料か
ら液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回収す
ることからなるが、その場合にクロマトグラフ充填物が
、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０
〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリカ
ゲルと、約４００〜約１８００の平均分子ｔを有するポ
リエチレンイミノプロピルトリメトキシシランとの反応
生成物から本質的になるものである特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 ３、本質的に均質のモノクローン性抗体形１３Ｇを上記
のモクローン性抗体を含有するマウスの腹水液から得る
方法に於いて、上記モノクローン性抗体を上記試料から
液体クロマトグラフィ一手段を用いて分離し、回収する
ことからなるが、その場合にクロマトグラフ充填物が、
平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５０〜
約１０００オングストローム単位を有し、吸着された架
橋形でポリエチレンイミン官能基が結合している微粒シ
リカゲルから本質的になるものである特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 ４、本質的に精製されたモノクローン性抗体形１８Ｇを
上記のモクローン性抗体を含有する微粒物のないマウス
の腹水液から得る方法に於いて、ａ、上記微粒物のない
マウス腹水液の試料を後のクロマトグラフィー分離及び
回収段階での勾配溶離に使用する低イオン強度緩衝液の
イオン強度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローン性抗体のｐｌよりも大きい１■に平
衡化させ、 ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有する微粒シリ
カゲルと約４００〜約１８００の平均分子量を有するポ
リエチレンイミノプロピルトリメトキシシランの反応生
成物からなるクロマトグラフィー充填物を使用するクロ
マトグラフィ一手段によって、上記モノクローン性抗体
形１８Ｇを上記試料から分離回収することからなる方法
。 ５、本質的に精製されたモノクローン性抗体形１ｇＧを
上記のモクローン性抗体を含有する微粒物のないマウス
の腹水液から得る方法に於いて、ａ、上記微粒物のない
マウス腹水液の試料を後のクロマトグラフィー分離及び
回収段階での勾配溶離に使用する低イオン強度緩衝液の
イオン強度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローン性抗体のｐｌよりも大きいｐＨに平
衡化させ、 ｂ、平均粒径約３〜約４０ミクロン及び平均孔寸法約５
０〜約１０００オングストローム単位を有し、吸着され
た架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合している微
粒シリカゲルから本質的になるクロマトグラフィー充填
物を使用するクロマトグラフィ一手段によって、上記モ
ノクローン性抗体形１ｇＧを上記試料から分離回収する
ことからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US555023 | 1983-11-25 | ||
| US06/555,023 US4469630A (en) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Purification of monoclonal antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60173000A true JPS60173000A (ja) | 1985-09-06 |
| JPH0144314B2 JPH0144314B2 (ja) | 1989-09-27 |
Family
ID=24215670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59242584A Granted JPS60173000A (ja) | 1983-11-25 | 1984-11-19 | モノクローナル抗体の精製 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4469630A (ja) |
| EP (1) | EP0144028B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60173000A (ja) |
| KR (1) | KR870001435B1 (ja) |
| AT (1) | ATE48614T1 (ja) |
| AU (1) | AU577330B2 (ja) |
| CA (1) | CA1212052A (ja) |
| DE (1) | DE3480709D1 (ja) |
| IL (1) | IL73497A (ja) |
| NZ (1) | NZ210127A (ja) |
| ZA (1) | ZA848887B (ja) |
Cited By (1)
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| JPS61249996A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-11-07 | ジェイ ティー ベイカー インコーポレーテッド | 免疫グロブリンｇの精製 |
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| US4533496A (en) * | 1984-05-08 | 1985-08-06 | Monsanto Company | Method of isolating monoclonal antibodies from hybridoma cultures |
| US4604235A (en) * | 1984-05-23 | 1986-08-05 | J. T. Baker Chemical Company | Purification of monoclonal antibodies |
| US4562003A (en) * | 1984-10-26 | 1985-12-31 | California Biotechnology, Inc. | Monoclonal antibodies against alveolar surfactant protein |
| US4551245A (en) * | 1985-04-22 | 1985-11-05 | J. T. Baker Chemical Co. | Acylated polyethylenimine bound chromatographic packing |
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| US5087359A (en) * | 1989-08-07 | 1992-02-11 | J. T. Baker Inc. | Quaternized PEI silica solid supports for chromatography |
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| US5695882A (en) * | 1995-08-17 | 1997-12-09 | The University Of Montana | System for extracting soluble heavy metals from liquid solutions |
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| CN105524137A (zh) * | 2015-12-24 | 2016-04-27 | 利穗科技(苏州)有限公司 | 采用高分子氨基聚合物键合硅胶纯化卡非佐米的方法 |
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