JPH0144314B2 - - Google Patents
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- JPH0144314B2 JPH0144314B2 JP59242584A JP24258484A JPH0144314B2 JP H0144314 B2 JPH0144314 B2 JP H0144314B2 JP 59242584 A JP59242584 A JP 59242584A JP 24258484 A JP24258484 A JP 24258484A JP H0144314 B2 JPH0144314 B2 JP H0144314B2
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
-
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はマウス腹水液試料のモノクローナル抗
体含量を精製する方法に関する。より詳しくは、
本発明は、結合したポリエチレンイミン（PEI）
官能基を有するシリカゲルの個々の静的多孔性の
相上における液体クロマトグラフイー、及び約PH
6.0約8.3の水性緩衝液によるポリエチレンイミン
結合カラムからのモノクローナル抗体の勾配溶離
を利用するマウスの腹水流体からモノクローナル
抗体形のIgGを分離精製する方法に係る。
体含量を精製する方法に関する。より詳しくは、
本発明は、結合したポリエチレンイミン（PEI）
官能基を有するシリカゲルの個々の静的多孔性の
相上における液体クロマトグラフイー、及び約PH
6.0約8.3の水性緩衝液によるポリエチレンイミン
結合カラムからのモノクローナル抗体の勾配溶離
を利用するマウスの腹水流体からモノクローナル
抗体形のIgGを分離精製する方法に係る。
（問題を解決する為の手段）
結合したポリエチレンイミン官能基を有するシ
リカゲルの個々の静的多孔性相即ち、本発明のク
ロマトグラフ充填物には２つの形式がある。
リカゲルの個々の静的多孔性相即ち、本発明のク
ロマトグラフ充填物には２つの形式がある。
好ましい形式は米国特許出願第555368号（ポリ
エチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤という
名称で本願と同日に出願）に記載されておりその
内容は本明細書に参照して取り入れる。関連する
その出願の文章が以下に報告される。
エチレンイミン結合クロマトグラフ充填剤という
名称で本願と同日に出願）に記載されておりその
内容は本明細書に参照して取り入れる。関連する
その出願の文章が以下に報告される。
第二の形式のものはジー・バネツクとエフ・イ
ー・レグニアー（G.VanecekとF.E.Regnier）、
あなる・バイオケム・（Anal.Biochem）．121、
156−159（1982）及びエイ・ジエー・アルパート
とエフ・イー・レグニアー（A.J.AlpertとF.E.
Regnier）、ジエー・クロマトグラ・（J.
Chromatogr.）185、375−392（1978）、に記載さ
れた吸着された架橋PEI−シリカゲルの静的な相
である。この形式は商品名「シンクロパツク」
（“SynChrpak”）の名称でインジアナ州リンデン
のシンクローム インク（SynChrom Inc.）か
ら市販されている。アルパート及びレグニアー
ハ、ポリエチレンイミン（PEI）がシリカゲル表
面に吸着され架橋されて安定な重合層を形成する
ことを示している。PEIの構造は十分な第１級及
び第２級アミノ基を与えるので、シリカゲル表面
の隣接しているPEI分子が多官能オキシランによ
り架橋され重合層となりうる。親水性のクロスリ
ンカー例えばジグリシジルエチレングリコールの
使用を通じて親水性の被覆が造られ得る。
ー・レグニアー（G.VanecekとF.E.Regnier）、
あなる・バイオケム・（Anal.Biochem）．121、
156−159（1982）及びエイ・ジエー・アルパート
とエフ・イー・レグニアー（A.J.AlpertとF.E.
Regnier）、ジエー・クロマトグラ・（J.
Chromatogr.）185、375−392（1978）、に記載さ
れた吸着された架橋PEI−シリカゲルの静的な相
である。この形式は商品名「シンクロパツク」
（“SynChrpak”）の名称でインジアナ州リンデン
のシンクローム インク（SynChrom Inc.）か
ら市販されている。アルパート及びレグニアー
ハ、ポリエチレンイミン（PEI）がシリカゲル表
面に吸着され架橋されて安定な重合層を形成する
ことを示している。PEIの構造は十分な第１級及
び第２級アミノ基を与えるので、シリカゲル表面
の隣接しているPEI分子が多官能オキシランによ
り架橋され重合層となりうる。親水性のクロスリ
ンカー例えばジグリシジルエチレングリコールの
使用を通じて親水性の被覆が造られ得る。
（ラムスデンの発明の詳細な記載）
本発明の非架橋共有結合PEIシリカゲル生成物
は次の段階によつて都合よく生成される。
は次の段階によつて都合よく生成される。
Ａ 平均粒径約３〜約70ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲルを、不活性有機溶媒スラリー中
で、約400〜約1800の平均分子量を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシランの
低級アルカノール性溶液と約２〜約50時間環境
温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクシヨンを反応混合物から回
収し、 Ｃ 上記固体フラクシヨンを乾燥し且つシランを
シリカゲルに完全に結合するのに十分な温度及
び時間で加熱する。
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲルを、不活性有機溶媒スラリー中
で、約400〜約1800の平均分子量を有するポリ
エチレンイミノプロピルトリメトキシシランの
低級アルカノール性溶液と約２〜約50時間環境
温度〜還流温度で反応させ、 Ｂ 生じる固体フラクシヨンを反応混合物から回
収し、 Ｃ 上記固体フラクシヨンを乾燥し且つシランを
シリカゲルに完全に結合するのに十分な温度及
び時間で加熱する。
本明細書で使用する「共有結合」又は「共有結
合された」という用語は、PEI部分がシリカゲル
に化学的相互作用によつて共有的に結合されてい
て、プロピル−シリル（Pr−Si）の結合を生じ
ていることを意味し、「非架橋」という用語は隣
接する共有結合したPEI部分上のイミノ及びアミ
ノ基が架橋していない又は架橋剤と反応し、重合
層を形成していないことを意味する。
合された」という用語は、PEI部分がシリカゲル
に化学的相互作用によつて共有的に結合されてい
て、プロピル−シリル（Pr−Si）の結合を生じ
ていることを意味し、「非架橋」という用語は隣
接する共有結合したPEI部分上のイミノ及びアミ
ノ基が架橋していない又は架橋剤と反応し、重合
層を形成していないことを意味する。
結合がないことにより、反応は次のように２段
階で完了すると考えられる。
階で完了すると考えられる。
段階１
シラン上のシリカヒドロキシル及びメトキシ基
が反応してSi−Ｏ−Si結合及び遊離メタノールを
形成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のまま
でいる。
が反応してSi−Ｏ−Si結合及び遊離メタノールを
形成し、幾らかの残留メトキシ基が未反応のまま
でいる。
段階２
残留メトキシ基との反応の完結が(a)及び(b)によ
る熱硬化の間に行なわれる。
る熱硬化の間に行なわれる。
無定形のシリカからなるシリカゲルは、不規則
及び球状（好ましい）の微粒形で市販されてお
り、また幾つかの商品等級で得られ、メツシユ寸
法が３−325（ASTM）の範囲である。数字的な
メツシユ寸法の表示に頼るよりも、本発明の為の
より正確な指標はシリカゲルの微粒の平均粒径及
び平均孔寸法がそれぞれ約３〜70ミクロン及び約
50〜約1000、好ましくは約250〜500オングストロ
ーム単位のものである。HPLCクロマトグラフカ
ラム充填に使用する最終製品のためには、約３〜
約10ミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、
低圧クロマトグラフイーカラム充填用には約40〜
約70ミクロンがこのましい。
及び球状（好ましい）の微粒形で市販されてお
り、また幾つかの商品等級で得られ、メツシユ寸
法が３−325（ASTM）の範囲である。数字的な
メツシユ寸法の表示に頼るよりも、本発明の為の
より正確な指標はシリカゲルの微粒の平均粒径及
び平均孔寸法がそれぞれ約３〜70ミクロン及び約
50〜約1000、好ましくは約250〜500オングストロ
ーム単位のものである。HPLCクロマトグラフカ
ラム充填に使用する最終製品のためには、約３〜
約10ミクロンのシリカゲル出発物質が好ましく、
低圧クロマトグラフイーカラム充填用には約40〜
約70ミクロンがこのましい。
シリカゲル又はCPGスラリーを調製するのに
適した不活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例
えば、ヘキサン、ヘプタンなど、芳香族炭化水素
例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど、低
級アルカノール類例えば、エタノール、イソプロ
パノール、ブタノールなど、塩素化メタン、例え
ば塩化メチレン、四塩化炭素等（注意そのような
クロロ溶媒は高温で反応するかもしれない）、及
びテトラヒドロフラン、グライム（グリコールジ
メチルエーテル）、ジグライム（ジエチレングリ
コールジメチルエーテル）などの他の不活性溶媒
が適している。一般に溶媒mlに対しシリカゲル又
はCPGのグラム１：５の比が適当なスラリーを
与える。細かい不溶のシリカゲル及びCPG微粒
の不溶性の為に真の溶液でなくスラリーが得られ
る。
適した不活性有機溶媒のなかで脂肪族炭化水素例
えば、ヘキサン、ヘプタンなど、芳香族炭化水素
例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど、低
級アルカノール類例えば、エタノール、イソプロ
パノール、ブタノールなど、塩素化メタン、例え
ば塩化メチレン、四塩化炭素等（注意そのような
クロロ溶媒は高温で反応するかもしれない）、及
びテトラヒドロフラン、グライム（グリコールジ
メチルエーテル）、ジグライム（ジエチレングリ
コールジメチルエーテル）などの他の不活性溶媒
が適している。一般に溶媒mlに対しシリカゲル又
はCPGのグラム１：５の比が適当なスラリーを
与える。細かい不溶のシリカゲル及びCPG微粒
の不溶性の為に真の溶液でなくスラリーが得られ
る。
（Ｎ−トリメトキシシリルプロピル）−ポリエ
チレンイミンとしても知られているポリエチレン
イミノポロピルトリメトキシシランはポリエチレ
ンイミンとアミノプロピルトリメトキシシランと
の反応生成物で次の式によつて記載される。
チレンイミンとしても知られているポリエチレン
イミノポロピルトリメトキシシランはポリエチレ
ンイミンとアミノプロピルトリメトキシシランと
の反応生成物で次の式によつて記載される。
ここで本発明の目的にはｎは約４〜37の整数又
は平均分子量で表現すると約400〜1800である。
は平均分子量で表現すると約400〜1800である。
シラン(I)は反応中でシリカゲルまたはCPGと
の反応中に於いてシランを可溶化させる為の十分
なアルカノールを使用して低級C1〜C6アルカノ
ール溶液の形で使用される。50％（ｗ／ｗ）のイ
ソプロパノール溶液が好ましい。一般に約25〜
1000ｇのシラン又はこれに代わつて約50〜200ml
の50％（ｗ／ｗ）シランのアルカノール溶液が各
100ｇのシリカゲル又はCPGと反応するのに使用
される。反応は環境温度で実施できるが反応溶媒
系の還流までの高温を反応速度を強めるために使
用することが出来る。反応は実質的な完了（段階
１）迄に容易に２〜50時間内に進行する。反応体
の混合中に撹はんをするのが有利であるが、その
後の反応は更に撹はんすることなしに続き得る。
無水の条件は臨界的でなく、小量の水即ち約0.1
〜1.0ml／スラリー溶媒50mlの存在が反応に悪影
響を与えないことが見いだされている。
の反応中に於いてシランを可溶化させる為の十分
なアルカノールを使用して低級C1〜C6アルカノ
ール溶液の形で使用される。50％（ｗ／ｗ）のイ
ソプロパノール溶液が好ましい。一般に約25〜
1000ｇのシラン又はこれに代わつて約50〜200ml
の50％（ｗ／ｗ）シランのアルカノール溶液が各
100ｇのシリカゲル又はCPGと反応するのに使用
される。反応は環境温度で実施できるが反応溶媒
系の還流までの高温を反応速度を強めるために使
用することが出来る。反応は実質的な完了（段階
１）迄に容易に２〜50時間内に進行する。反応体
の混合中に撹はんをするのが有利であるが、その
後の反応は更に撹はんすることなしに続き得る。
無水の条件は臨界的でなく、小量の水即ち約0.1
〜1.0ml／スラリー溶媒50mlの存在が反応に悪影
響を与えないことが見いだされている。
生じる固体フラクシヨンは反応混合物から慣用
の物理的手段例えばろ過、遠心分離などによつて
回収される。一般にろ過手段は粒径５ミクロンを
保持するのに十分なものであるのに対し、遠心は
３ミクロンの粒子寸法に適している。
の物理的手段例えばろ過、遠心分離などによつて
回収される。一般にろ過手段は粒径５ミクロンを
保持するのに十分なものであるのに対し、遠心は
３ミクロンの粒子寸法に適している。
回収された固体フラクシヨンは次に、乾燥、そ
してシランとシリカゲル又はCPGの完全な共有
結合に十分な温度及び時間で熱硬化される。一般
に約40〜120℃に於ける１−４時間が十分である
ことが分かつた。このようにして得られた共有結
合し、非架橋の最終生成物は好ましくは約0.5〜
約3.8％の窒素を含有している。（以上でラムスデ
ン発明の説明終） 本発明の目的にクロマトグラフ充填物（“PEI
−シリカゲル”と都合上場合によつては述べられ
る）は利用されここで出発シリカゲルは約３〜約
40ミクロンの平均粒径を有するものに限られてい
る。平均孔寸法は約50〜約1000オングストローム
単位であるけれども250オングストロームより大
きい平均孔寸法が好ましい。
してシランとシリカゲル又はCPGの完全な共有
結合に十分な温度及び時間で熱硬化される。一般
に約40〜120℃に於ける１−４時間が十分である
ことが分かつた。このようにして得られた共有結
合し、非架橋の最終生成物は好ましくは約0.5〜
約3.8％の窒素を含有している。（以上でラムスデ
ン発明の説明終） 本発明の目的にクロマトグラフ充填物（“PEI
−シリカゲル”と都合上場合によつては述べられ
る）は利用されここで出発シリカゲルは約３〜約
40ミクロンの平均粒径を有するものに限られてい
る。平均孔寸法は約50〜約1000オングストローム
単位であるけれども250オングストロームより大
きい平均孔寸法が好ましい。
従つて、本発明は本質的に均質なモノクローナ
ル抗体形IgGを上記モノクローナル抗体を含有し
ているマウス腹水試料から液体クロマトグラフ手
段を用いて得る方法を提供するが、ここでクロマ
トグラフ充填剤は平均粒径約３〜約40ミクロン及
び平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単位
を有し、上記レグニアー等に従つて吸着された架
橋形で、又は上記ラムスデンに従つて共有結合非
架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合してい
る微粒シリカゲルからなるものである。後者に関
してはPEI−シリカゲルクロマトグラフ充填剤は
上記の微粒状シリカゲンルと約400〜1800の平均
分子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリ
メトキシシランとの反応生成物である。
ル抗体形IgGを上記モノクローナル抗体を含有し
ているマウス腹水試料から液体クロマトグラフ手
段を用いて得る方法を提供するが、ここでクロマ
トグラフ充填剤は平均粒径約３〜約40ミクロン及
び平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単位
を有し、上記レグニアー等に従つて吸着された架
橋形で、又は上記ラムスデンに従つて共有結合非
架橋形でポリエチレンイミン官能基が結合してい
る微粒シリカゲルからなるものである。後者に関
してはPEI−シリカゲルクロマトグラフ充填剤は
上記の微粒状シリカゲンルと約400〜1800の平均
分子量を有するポリエチレンイミノプロピルトリ
メトキシシランとの反応生成物である。
本発明に於いてそのようなクロマトグラフ充填
物が、液体クロマトグラフイー、特に結合形IgG
モノクローナル抗体及び他のそれを含有している
マウス腹水中の他の蛋白質のための高性能液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）に於いて特に滴して
いることがわかり、これによつて適当な水性緩衝
液を使用する勾配溶離により結合した蛋白の優先
的な分離を可能にしている。このようにして問題
の、本質的に均質なモノクローナル抗体を含め腹
水液中にもともと存在する幾つかの蛋白成分が得
られる。「本質的に均質な」というのは、本明細
書では定量的に回収されたIgG抗体溶離フラクシ
ヨン中に存在する蛋白質の＞90％が個々のIgGモ
ノクローナル抗体であることを意味する。精製％
はこの技術で来既知の手順、例えばドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ユ
ー・ケー・ラエムリ（U.K.Laemmli）、ネイチヤ
ー（Natsure）、227、680（1970）参照）によつて
確認することが出来る。
物が、液体クロマトグラフイー、特に結合形IgG
モノクローナル抗体及び他のそれを含有している
マウス腹水中の他の蛋白質のための高性能液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）に於いて特に滴して
いることがわかり、これによつて適当な水性緩衝
液を使用する勾配溶離により結合した蛋白の優先
的な分離を可能にしている。このようにして問題
の、本質的に均質なモノクローナル抗体を含め腹
水液中にもともと存在する幾つかの蛋白成分が得
られる。「本質的に均質な」というのは、本明細
書では定量的に回収されたIgG抗体溶離フラクシ
ヨン中に存在する蛋白質の＞90％が個々のIgGモ
ノクローナル抗体であることを意味する。精製％
はこの技術で来既知の手順、例えばドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ユ
ー・ケー・ラエムリ（U.K.Laemmli）、ネイチヤ
ー（Natsure）、227、680（1970）参照）によつて
確認することが出来る。
本発明はIgG形のすべてのサブクラス、例えば
IgG1、IgG2a、及びIgG1+3などのモノクローナル
抗体を含有するマウスの腹水液で使用するのに適
している。そのようなモノクローナル抗体を含ん
でいるマウスの腹水液を調製する方法はこの技術
分野で一般的なものであつて、例えば「モノクロ
ーナル抗体、ハイブリドマス；生物学的分析の新
しい次元」（Monoclonal Antibodies、
Hybridomas；Ａ New Dimension in
Biological Analyses）アール・エツチ・ケネツ
ト（R.H.Kennet）等、プレナムプレス発行ニユ
ーヨーク（1980）及び「メソツドインエンザイモ
ロジー」（Methods in Enzymology）ジー・ガ
ルフレツド及びシー・ミルスタイン（G.Galfred
とC.Milstein）、編集ジエー・ジエー・ランゴン
とエイチ・バン ブナキス（J.J.LangoneとH.
Van Vunakis）、73巻、31−46頁、アカデミツク
プレス1981年発行を参照。
IgG1、IgG2a、及びIgG1+3などのモノクローナル
抗体を含有するマウスの腹水液で使用するのに適
している。そのようなモノクローナル抗体を含ん
でいるマウスの腹水液を調製する方法はこの技術
分野で一般的なものであつて、例えば「モノクロ
ーナル抗体、ハイブリドマス；生物学的分析の新
しい次元」（Monoclonal Antibodies、
Hybridomas；Ａ New Dimension in
Biological Analyses）アール・エツチ・ケネツ
ト（R.H.Kennet）等、プレナムプレス発行ニユ
ーヨーク（1980）及び「メソツドインエンザイモ
ロジー」（Methods in Enzymology）ジー・ガ
ルフレツド及びシー・ミルスタイン（G.Galfred
とC.Milstein）、編集ジエー・ジエー・ランゴン
とエイチ・バン ブナキス（J.J.LangoneとH.
Van Vunakis）、73巻、31−46頁、アカデミツク
プレス1981年発行を参照。
高度に精製された形のモノクローナル抗体の単
離は明らかに望ましい。例えば、生体内の治療目
的の為には、できるだけ精製され濃縮されている
モノクローナル抗体が悪い副作用を最小とし、意
図される治療目的を最大限にするために要求され
る。同様に試験管内診断目的の為にそのような精
製され濃縮されたモノクローナル抗体は個々の診
断試験の感度及び特異性を最大限とするために望
ましい。
離は明らかに望ましい。例えば、生体内の治療目
的の為には、できるだけ精製され濃縮されている
モノクローナル抗体が悪い副作用を最小とし、意
図される治療目的を最大限にするために要求され
る。同様に試験管内診断目的の為にそのような精
製され濃縮されたモノクローナル抗体は個々の診
断試験の感度及び特異性を最大限とするために望
ましい。
マウスの腹水液は、本発明の為に使用される前
に、干渉する微粒状物質を除く為に予備処理さ
れ、PEI−シリカゲル支持体へモノクローナル抗
体が結合することをを達成する為に適当なイオン
強度及び必要なPHに平衡化される。個々の微粒物
質は慣用の精製手段、例えばろ過、又は微粒物質
をペレツト化するに十分な力に於ける遠心によつ
て透明化される。微粒のないマウス腹水液の平衡
化はこの技術水準に於いて一般的な任意の手段に
より達成できる。例えば、適当な形式及び寸法の
分子ふるい、例えば商品名セフアデツクスの名で
市販されているもの、の上で適当な緩衝液によつ
てクロマトグラフイー的に脱塩することにより、
適当な緩衝液に対しての透析により、及びその他
によつて達成され、個々のIgGモノクローナル抗
体のplよりも大きいPH（このPHはモノクローナル
抗体がその環境に於いて正味のイオン荷電を有さ
ないもの）、及び後のマウス腹水液のクロマトグ
ラフ処理に於ける勾配溶離に使用される低イオン
強度緩衝液のイオン強度と同等か又はそれよりも
小さいイオン強度に平衡化される。
に、干渉する微粒状物質を除く為に予備処理さ
れ、PEI−シリカゲル支持体へモノクローナル抗
体が結合することをを達成する為に適当なイオン
強度及び必要なPHに平衡化される。個々の微粒物
質は慣用の精製手段、例えばろ過、又は微粒物質
をペレツト化するに十分な力に於ける遠心によつ
て透明化される。微粒のないマウス腹水液の平衡
化はこの技術水準に於いて一般的な任意の手段に
より達成できる。例えば、適当な形式及び寸法の
分子ふるい、例えば商品名セフアデツクスの名で
市販されているもの、の上で適当な緩衝液によつ
てクロマトグラフイー的に脱塩することにより、
適当な緩衝液に対しての透析により、及びその他
によつて達成され、個々のIgGモノクローナル抗
体のplよりも大きいPH（このPHはモノクローナル
抗体がその環境に於いて正味のイオン荷電を有さ
ないもの）、及び後のマウス腹水液のクロマトグ
ラフ処理に於ける勾配溶離に使用される低イオン
強度緩衝液のイオン強度と同等か又はそれよりも
小さいイオン強度に平衡化される。
液体クロマトグラフ、好ましくはHPLCに、使
用するのに好ましいクロマトグラフカラムは前記
の多孔性のPEI−シリカゲル固体支持体で充填さ
れている。スチール又はガラスクロマトグラフカ
ラムは長さが約５〜100cm及び内径が約１〜100mm
の寸法を有するものを含む。適当なクロマトグラ
フパラメーター、例えばカラム充填技術、カラム
寸法、カラム温度、圧力などを選択することは通
常の技術を有する者により容易に決定される。
用するのに好ましいクロマトグラフカラムは前記
の多孔性のPEI−シリカゲル固体支持体で充填さ
れている。スチール又はガラスクロマトグラフカ
ラムは長さが約５〜100cm及び内径が約１〜100mm
の寸法を有するものを含む。適当なクロマトグラ
フパラメーター、例えばカラム充填技術、カラム
寸法、カラム温度、圧力などを選択することは通
常の技術を有する者により容易に決定される。
充填されたカラムは適当な緩衝液をカラムに通
すことによつてクロマトグラフ中に於いて平衡化
される。この緩衝液平衡化段階の後、カラムはマ
ウス腹水液の蛋白成分のクロマトグラフ分離を行
なう為に使用されるが、上に記したようにマウス
腹水液は予め微粒物がないものとされており、適
当なイオン強度及びPHに平衡化されているもので
ある。そのような予め処理されたマウス腹水液の
試料は、次に緩衝液平衡化カラムにかけられ、そ
の成分蛋白質をPEI−シリカゲル充填物に結合さ
せる。
すことによつてクロマトグラフ中に於いて平衡化
される。この緩衝液平衡化段階の後、カラムはマ
ウス腹水液の蛋白成分のクロマトグラフ分離を行
なう為に使用されるが、上に記したようにマウス
腹水液は予め微粒物がないものとされており、適
当なイオン強度及びPHに平衡化されているもので
ある。そのような予め処理されたマウス腹水液の
試料は、次に緩衝液平衡化カラムにかけられ、そ
の成分蛋白質をPEI−シリカゲル充填物に結合さ
せる。
結合した蛋白は次に慣用の勾配溶離技術により
選択的に溶離されるがここで時間、流速、及び増
加するイオン強度又は減少するPHの勾配物を生ず
る勾配形などの相互に依存するクロマトグラフパ
ラメーターを考慮に入れる。PH約6.0〜約8.3の陰
イオン性緩衝液例えば燐酸カリウム、トリスアセ
テート、酢酸アンモニウムなどをそのような勾配
を生じ結合する蛋白をポリエチレンイミン官能基
から溶離するのに使用できる。例えば勾配は約30
分〜約４時間約0.1ml／分〜約２／分の流速で
形成するのが有利である。
選択的に溶離されるがここで時間、流速、及び増
加するイオン強度又は減少するPHの勾配物を生ず
る勾配形などの相互に依存するクロマトグラフパ
ラメーターを考慮に入れる。PH約6.0〜約8.3の陰
イオン性緩衝液例えば燐酸カリウム、トリスアセ
テート、酢酸アンモニウムなどをそのような勾配
を生じ結合する蛋白をポリエチレンイミン官能基
から溶離するのに使用できる。例えば勾配は約30
分〜約４時間約0.1ml／分〜約２／分の流速で
形成するのが有利である。
分割された蛋白質はこの技術に於いて一般的な
任意の手段、例えば280nｍに於ける紫外線吸収
をモニターすることにより同定出来る。分離され
た蛋白を含有している溶離フラクシヨンをフラク
シヨンコレクターを使用して集め得る。均質のモ
ノクローナル抗体を含有する溶離フラクシヨンを
例えば個々の抗体について展開されたラジオイミ
ノアツセにより、他の抗原抗体反応により、又は
ポリアクリルアミド電気泳動によつて同定するこ
とが出来る。
任意の手段、例えば280nｍに於ける紫外線吸収
をモニターすることにより同定出来る。分離され
た蛋白を含有している溶離フラクシヨンをフラク
シヨンコレクターを使用して集め得る。均質のモ
ノクローナル抗体を含有する溶離フラクシヨンを
例えば個々の抗体について展開されたラジオイミ
ノアツセにより、他の抗原抗体反応により、又は
ポリアクリルアミド電気泳動によつて同定するこ
とが出来る。
本発明の方法はモノクローナル抗体を含有する
マウス腹水液の全容量と独立にあることが分かり
クロマトグラフ充填に使用されるPEI−シリカゲ
ルの量を除いて限定する要因はない。即ちこの方
法は固体クロマトグラフ支持体の容量を越えない
かぎり実施可能である。
マウス腹水液の全容量と独立にあることが分かり
クロマトグラフ充填に使用されるPEI−シリカゲ
ルの量を除いて限定する要因はない。即ちこの方
法は固体クロマトグラフ支持体の容量を越えない
かぎり実施可能である。
本発明に従つてモノクローナル抗体形IgGを含
有する微粒物のないマウスの腹水液の試料がクロ
マトグラフ的に分離され、本質的に均質の形で上
記抗体を与える。より詳しく前に記されたように
好ましい方法は上記のモノクローナル抗体を含ん
でいる微粒のないマウスの腹水液の試料を以下に
より精製する。
有する微粒物のないマウスの腹水液の試料がクロ
マトグラフ的に分離され、本質的に均質の形で上
記抗体を与える。より詳しく前に記されたように
好ましい方法は上記のモノクローナル抗体を含ん
でいる微粒のないマウスの腹水液の試料を以下に
より精製する。
ａ 上記微粒物のないマウス腹水液の試料を後の
クロマトグラフイー分離及び回収段階での勾配
溶離に使用する低イオン強度緩衝液のイオン強
度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローナル抗体のplよりも大きいPH
に平衡化させ、 ｂ 平均粒径約３〜約40ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲルと約400〜約1800の平均分子量を
有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの反応生成物からなるクロマトグラフ
イー充填物を使用する液体クロマトグラフイー
手段によつて、上記モノクローナル抗体形IgG
を上記試料から分離回収する。
クロマトグラフイー分離及び回収段階での勾配
溶離に使用する低イオン強度緩衝液のイオン強
度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローナル抗体のplよりも大きいPH
に平衡化させ、 ｂ 平均粒径約３〜約40ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲルと約400〜約1800の平均分子量を
有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの反応生成物からなるクロマトグラフ
イー充填物を使用する液体クロマトグラフイー
手段によつて、上記モノクローナル抗体形IgG
を上記試料から分離回収する。
以下の実施例の助けにより本発明はより容易に
理解されるがこれらは単に説明のために与えられ
ており本発明を制限するものではない。
理解されるがこれらは単に説明のために与えられ
ており本発明を制限するものではない。
実施例 １
平均粒径5.25ミクロン及び平均孔寸法330オン
グストロームを有し、ザセツプＡ段RAタイオン
ズグループ、ヘスペリア、カリフオルニアから商
品名“Vydac Ａ”カタログNo.101T9B5の商品名
で球状のシリカとして市販されているシリカゲル
20ｇの100mlトルエン及び２mlの水中のスラリー
を調製し、そして10分間室温で撹はんする。これ
に撹はんしながら39.4ｇの平均分子量500を有す
るポリオキシエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの50％（ｗ／ｗ）イソプロパノール溶液
39.4ｇを加え、混合物をさらに５分間撹はんす
る。混合物を次に室温で一夜放置する。混合物を
次に1.0ミクロンフイルターのろうとを使用して
ろ過する。ろ液を50mlのトルエンで２回そして50
mlのメタノールで２回洗い次にろうと上で空気乾
燥し最後に80〜85℃で約３時間30オーブン乾燥し
共有結合したPEI結合されたシリカゲル製品約
2.85％Ｎを生成する。
グストロームを有し、ザセツプＡ段RAタイオン
ズグループ、ヘスペリア、カリフオルニアから商
品名“Vydac Ａ”カタログNo.101T9B5の商品名
で球状のシリカとして市販されているシリカゲル
20ｇの100mlトルエン及び２mlの水中のスラリー
を調製し、そして10分間室温で撹はんする。これ
に撹はんしながら39.4ｇの平均分子量500を有す
るポリオキシエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの50％（ｗ／ｗ）イソプロパノール溶液
39.4ｇを加え、混合物をさらに５分間撹はんす
る。混合物を次に室温で一夜放置する。混合物を
次に1.0ミクロンフイルターのろうとを使用して
ろ過する。ろ液を50mlのトルエンで２回そして50
mlのメタノールで２回洗い次にろうと上で空気乾
燥し最後に80〜85℃で約３時間30オーブン乾燥し
共有結合したPEI結合されたシリカゲル製品約
2.85％Ｎを生成する。
実施例 ２
細菌のリポポリサツカライド細胞壁に対し特異
的であつて、慣用のザブクラス特異性抗血清によ
つて決定されるようにサブクラスIgG1に属する
モノクローナル抗体を含有しているマウス腹水液
２ml試料を15600×重力で５分間遠心した。上澄
み液を次に10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.73へ、
１夜（17時間）２回のチエンジの１−リツトル10
ｍＭ燐酸緩衝液PH6.37に対して透析することによ
り平衡化した。ステンレス鋼のクロマトグラフカ
ラム25cm×0.46mmに実施例１から得られたPEI−
シリカゲル3.8ｇを充填しPH6.73の0.01モル燐酸カ
リウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で20分ポンプで送ることによつて平衡化し
た。マウス腹水液の0.25mlの平衡化された試料を
ポリエチレンイミン結合シリカゲルカラムにか
け、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から0.25モル燐
酸カリウムPH6.8への流速１ml／分における60分
間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより
蛋白分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおけ
るUV吸収を使用して検出したがフルスケールの
吸収は0.64吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収
ピークの一連のものを約３分〜約25分の保持時間
の範囲で検出した。約16分に於ける蛋白ピークは
上に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じ
モノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグ
ラフイングによつて抗リポポリサツカライドモノ
クローナル抗体として同定された。
的であつて、慣用のザブクラス特異性抗血清によ
つて決定されるようにサブクラスIgG1に属する
モノクローナル抗体を含有しているマウス腹水液
２ml試料を15600×重力で５分間遠心した。上澄
み液を次に10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.73へ、
１夜（17時間）２回のチエンジの１−リツトル10
ｍＭ燐酸緩衝液PH6.37に対して透析することによ
り平衡化した。ステンレス鋼のクロマトグラフカ
ラム25cm×0.46mmに実施例１から得られたPEI−
シリカゲル3.8ｇを充填しPH6.73の0.01モル燐酸カ
リウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で20分ポンプで送ることによつて平衡化し
た。マウス腹水液の0.25mlの平衡化された試料を
ポリエチレンイミン結合シリカゲルカラムにか
け、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から0.25モル燐
酸カリウムPH6.8への流速１ml／分における60分
間の線形勾配を使用して勾配溶離することにより
蛋白分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおけ
るUV吸収を使用して検出したがフルスケールの
吸収は0.64吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収
ピークの一連のものを約３分〜約25分の保持時間
の範囲で検出した。約16分に於ける蛋白ピークは
上に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じ
モノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグ
ラフイングによつて抗リポポリサツカライドモノ
クローナル抗体として同定された。
約16分に於いて溶離する蛋白ピークは二つの基
準によつて90％純度より大であると評価された。
先ず第一は集められた蛋白ピークはエフ・ビー・
レグニアー（F.B.Regnier）、サイエンス
（Science）、222、245（1983）に従つてポリエチレ
ンイミン結合シリカゲルカラム上のクロマトグラ
フ後対称のピークを与えた。第二に、本質的にユ
ー・ケイ・ラエムリ（U.K.Laemmli）、ネイチヤ
ー（Nature）、227、680（1970）に記載されるよ
うに実施されたドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動は50000ダルトン（IgG
の重い鎖）及び25000ダルトン（IgGの軽い鎖）
の分子量に相当する本質的に二つの主要なクマシ
ー（coomassie）ブルーバンドと、全体の染色さ
れた蛋白の10％に満たないものを表わす第三のか
すかなクマシー（coomassie）ブルーバンドを与
えた。
準によつて90％純度より大であると評価された。
先ず第一は集められた蛋白ピークはエフ・ビー・
レグニアー（F.B.Regnier）、サイエンス
（Science）、222、245（1983）に従つてポリエチレ
ンイミン結合シリカゲルカラム上のクロマトグラ
フ後対称のピークを与えた。第二に、本質的にユ
ー・ケイ・ラエムリ（U.K.Laemmli）、ネイチヤ
ー（Nature）、227、680（1970）に記載されるよ
うに実施されたドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動は50000ダルトン（IgG
の重い鎖）及び25000ダルトン（IgGの軽い鎖）
の分子量に相当する本質的に二つの主要なクマシ
ー（coomassie）ブルーバンドと、全体の染色さ
れた蛋白の10％に満たないものを表わす第三のか
すかなクマシー（coomassie）ブルーバンドを与
えた。
実施例 ３
ミオシンに対し特異的であつて慣用のザブクラ
ス特異性抗血清によつて決定されるようにザブク
ラスIgG2aに属するモノクローナル抗体を含有し
ているマウス腹水液２ml試料を15600×重力で５
分間遠心した。上澄み液を次に10ｍＭ燐酸カリウ
ム緩衝液PH6.73へ、１夜２つの１−リツトルのチ
エンジの10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.37に対し
て透析することにより平衡化した。ステンレス鋼
のクロマトグラフカラム25cm×0.46mmに実施例１
から得られたPEI−シリカゲル生成物3.8ｇを充填
し、PH6.73の0.01モル燐酸カリウム緩衝液で、こ
の緩衝液をカラムに流速１ml／分で20分ポンプで
送つて通すことによつて平衡化した。マウス腹水
液の0.25mlの平衡化された試料をポリエチレンイ
ミン結合シリカゲルカラムにかけ、0.01モル燐酸
カリウムPH6.73から0.25モル燐酸カリウムPH6.8へ
の流速１ml／分における60分間の線形勾配を使用
して勾配溶離することにより蛋白分離を達成し
た。蛋白溶離は280nｍにおけるUV吸収を使用し
て検出したフルスケールの吸収は0.64吸光度単位
にセツトした。280nｍ吸収ピークの一連のもの
を約３分〜約25分の保持時間の範囲で検出した。
約16分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾
配プロフイールを有する同じモノクローナル抗体
の均一試料とのコクロマトグラフイングによつて
アンチミオシンモノクローナル抗体として同定さ
れた。
ス特異性抗血清によつて決定されるようにザブク
ラスIgG2aに属するモノクローナル抗体を含有し
ているマウス腹水液２ml試料を15600×重力で５
分間遠心した。上澄み液を次に10ｍＭ燐酸カリウ
ム緩衝液PH6.73へ、１夜２つの１−リツトルのチ
エンジの10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.37に対し
て透析することにより平衡化した。ステンレス鋼
のクロマトグラフカラム25cm×0.46mmに実施例１
から得られたPEI−シリカゲル生成物3.8ｇを充填
し、PH6.73の0.01モル燐酸カリウム緩衝液で、こ
の緩衝液をカラムに流速１ml／分で20分ポンプで
送つて通すことによつて平衡化した。マウス腹水
液の0.25mlの平衡化された試料をポリエチレンイ
ミン結合シリカゲルカラムにかけ、0.01モル燐酸
カリウムPH6.73から0.25モル燐酸カリウムPH6.8へ
の流速１ml／分における60分間の線形勾配を使用
して勾配溶離することにより蛋白分離を達成し
た。蛋白溶離は280nｍにおけるUV吸収を使用し
て検出したフルスケールの吸収は0.64吸光度単位
にセツトした。280nｍ吸収ピークの一連のもの
を約３分〜約25分の保持時間の範囲で検出した。
約16分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾
配プロフイールを有する同じモノクローナル抗体
の均一試料とのコクロマトグラフイングによつて
アンチミオシンモノクローナル抗体として同定さ
れた。
約16分に於いて溶離する蛋白ピークは実施例２
に述べられた二つの基準によつて90％純度より大
であると評価された。
に述べられた二つの基準によつて90％純度より大
であると評価された。
実施例 ４
特異性の知られていないIgGモノクローナル抗
体を含有しているマウス腹水液、２ml試料を、
15600×重力で５分間遠心した。上澄み液を次に
10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.73へ、１夜２つの
１−リツトルのチエンジの10ｍＭ燐酸カリウム緩
衝液PH6.37に対して透析することにより平衡化し
た。ステンレス鋼製のクロマトグラフカラム25cm
×0.46mmに実施例１のポリエチレンイミンシリカ
ゲム生成物3.8ｇを充填し、PH6.73の0.01モル燐酸
カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で20分ポンプで送つて通すことによつて平
衡化した。マウス腹水液の0.25mlの平衡化された
試料をポリエチレンイミンシリカゲルカラムにか
け、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から0.25モル燐
酸カリウムPH6.8への60分間の線形勾配を使用し
て勾配溶離することにより分離を達成した。蛋白
溶離は280nｍにおけるUV吸収を使用して検出し
たが、フルスケールの吸収は0.64吸光度単位にセ
ツトした。280nｍ吸収ピークの一連のものを約
３分〜約25分の保持時間の範囲で検出した。約16
分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プ
ロフイールを有する同じモノクローナル抗体の均
一試料とのコクロマトグラフイングによつてモノ
クローナル抗体として同定された。
体を含有しているマウス腹水液、２ml試料を、
15600×重力で５分間遠心した。上澄み液を次に
10ｍＭ燐酸カリウム緩衝液PH6.73へ、１夜２つの
１−リツトルのチエンジの10ｍＭ燐酸カリウム緩
衝液PH6.37に対して透析することにより平衡化し
た。ステンレス鋼製のクロマトグラフカラム25cm
×0.46mmに実施例１のポリエチレンイミンシリカ
ゲム生成物3.8ｇを充填し、PH6.73の0.01モル燐酸
カリウム緩衝液で、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で20分ポンプで送つて通すことによつて平
衡化した。マウス腹水液の0.25mlの平衡化された
試料をポリエチレンイミンシリカゲルカラムにか
け、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から0.25モル燐
酸カリウムPH6.8への60分間の線形勾配を使用し
て勾配溶離することにより分離を達成した。蛋白
溶離は280nｍにおけるUV吸収を使用して検出し
たが、フルスケールの吸収は0.64吸光度単位にセ
ツトした。280nｍ吸収ピークの一連のものを約
３分〜約25分の保持時間の範囲で検出した。約16
分に於ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プ
ロフイールを有する同じモノクローナル抗体の均
一試料とのコクロマトグラフイングによつてモノ
クローナル抗体として同定された。
約16分に於いて溶離する蛋白ピークはＯ・ガブ
リエル；“Methods in Enzymology”W.B.
Jakaby編第22巻565〜578頁（アカデミツクプレ
ス発行）（1971）に記載されるように実施される
ポリアクリルアミド電気泳動によつて95％純度よ
り大であると評価された。これは単一のクマシー
（coomassie）ブルーバンドを与えた。このバン
ドの易動度は標準のモノクローナル抗体について
観察されるものと対応している。
リエル；“Methods in Enzymology”W.B.
Jakaby編第22巻565〜578頁（アカデミツクプレ
ス発行）（1971）に記載されるように実施される
ポリアクリルアミド電気泳動によつて95％純度よ
り大であると評価された。これは単一のクマシー
（coomassie）ブルーバンドを与えた。このバン
ドの易動度は標準のモノクローナル抗体について
観察されるものと対応している。
実施例 ５
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム25cm×
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル生成物3.8ｇを充填し、PH6.73の0.01モル燐
酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／
分で20分ポンプで送つて通すことによつて平衡化
した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液
の0.6μの平衡化された試料をPEI−シリカゲル
カラムにかけ、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から
0.25モル燐酸カリウムPH6.8への流速１ml／分に
おける120分間の線形勾配を使用して勾配溶離す
ることにより分離を達成した。蛋白溶離は280n
ｍにおけるUV吸収を使用して検出したがフルス
ケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトした。
280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜約50
分の保持時間の範囲で検出した。約28分に於ける
蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイール
を有する同じモノクローナル抗体の均一試料との
コクロマトグラフイングによつてアンチリポポリ
サツカライドモノクローナル抗体として同定され
た。
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル生成物3.8ｇを充填し、PH6.73の0.01モル燐
酸カリウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／
分で20分ポンプで送つて通すことによつて平衡化
した。実施例２で利用されたと同じマウス腹水液
の0.6μの平衡化された試料をPEI−シリカゲル
カラムにかけ、0.01モル燐酸カリウムPH6.73から
0.25モル燐酸カリウムPH6.8への流速１ml／分に
おける120分間の線形勾配を使用して勾配溶離す
ることにより分離を達成した。蛋白溶離は280n
ｍにおけるUV吸収を使用して検出したがフルス
ケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトした。
280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜約50
分の保持時間の範囲で検出した。約28分に於ける
蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイール
を有する同じモノクローナル抗体の均一試料との
コクロマトグラフイングによつてアンチリポポリ
サツカライドモノクローナル抗体として同定され
た。
実施例 ６
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム25cm×
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル3.8ｇを充填し、PH8.3の0.01モル燐酸カリ
ウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／分で30
分ポンプで送つて通すことによつて平衡化した。
実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の6μ
の平衡化された試料をPEI−シリカゲルカラム
にかけ、0.01モル燐酸カリウムPH8.3から0.25モル
燐酸カリウムPH8.3への流速１ml／分における60
分間の線形勾配を使用して勾配溶離することによ
り分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおける
UV吸収を使用して検出したがフルスケールの吸
収は0.01吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収ピ
ークの一連のものを約３分〜約50分の保持時間の
範囲で検出した。約12分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じモ
ノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フイングによつてアンチリポポリサツカライドモ
ノクローナル抗体として同定された。
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル3.8ｇを充填し、PH8.3の0.01モル燐酸カリ
ウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／分で30
分ポンプで送つて通すことによつて平衡化した。
実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の6μ
の平衡化された試料をPEI−シリカゲルカラム
にかけ、0.01モル燐酸カリウムPH8.3から0.25モル
燐酸カリウムPH8.3への流速１ml／分における60
分間の線形勾配を使用して勾配溶離することによ
り分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおける
UV吸収を使用して検出したがフルスケールの吸
収は0.01吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収ピ
ークの一連のものを約３分〜約50分の保持時間の
範囲で検出した。約12分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じモ
ノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フイングによつてアンチリポポリサツカライドモ
ノクローナル抗体として同定された。
実施例 ７
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム25cm×
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル3.8ｇを充填し、PH6.0の0.01モル燐酸カリ
ウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／分で20
分ポンプで送つて通すことによつて平衡化した。
実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の6μ
の平衡化された試料をPEI−シリカゲルカラム
にかけ、0.01モル燐酸カリウムPH6.0から0.25モル
燐酸カリウムPH6.0への流速１ml／分における60
分間の線形勾配を使用して勾配溶離することによ
り分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおける
UV吸収を使用して検出したがフルスケールの吸
収は0.01吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収ピ
ークの一連のものを約３分〜約14分の保持時間の
範囲で検出した。約12分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じモ
ノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フイングによつてアンチリポポリサツカライドモ
ノクローナル抗体として同定された。
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル3.8ｇを充填し、PH6.0の0.01モル燐酸カリ
ウムで、この緩衝液をカラムに流速１ml／分で20
分ポンプで送つて通すことによつて平衡化した。
実施例２で利用されたと同じマウス腹水液の6μ
の平衡化された試料をPEI−シリカゲルカラム
にかけ、0.01モル燐酸カリウムPH6.0から0.25モル
燐酸カリウムPH6.0への流速１ml／分における60
分間の線形勾配を使用して勾配溶離することによ
り分離を達成した。蛋白溶離は280nｍにおける
UV吸収を使用して検出したがフルスケールの吸
収は0.01吸光度単位にセツトした。280nｍ吸収ピ
ークの一連のものを約３分〜約14分の保持時間の
範囲で検出した。約12分に於ける蛋白ピークは上
に述べたと同じ勾配プロフイールを有する同じモ
ノクローナル抗体の均一試料とのコクロマトグラ
フイングによつてアンチリポポリサツカライドモ
ノクローナル抗体として同定された。
実施例 ８
ステンレス鋼のクロマトグラフカラム25cm×
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル生成物3.8ｇを充填し、PH6.79の0.01モル酢
酸アンモニウムで、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で30分ポンプで送つて通すことによつて平
衡化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹
水液の6μの平衡化された試料をPEI−シリカゲ
ルカラムにかけ、0.01モル酢酸アンモニウムPH
6.79から1.0モル酢酸アンモニウムPH6.79への流速
１ml／分における30分間の線形勾配を使用して勾
配溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離
は280nｍにおけるUV吸収を使用して検出したが
フルスケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトし
た。280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜
約25分の保持時間の範囲で検出した。約12分に於
ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイ
ールを有する同じモノクローナル抗体の均一試料
とのコクロマトグラフイングによつてアンチリポ
ポリサツカライドモノクローナル抗体として同定
された。
4.6mmに実施例１のポリエチレンイミン結合シリ
カゲル生成物3.8ｇを充填し、PH6.79の0.01モル酢
酸アンモニウムで、この緩衝液をカラムに流速１
ml／分で30分ポンプで送つて通すことによつて平
衡化した。実施例２で利用されたと同じマウス腹
水液の6μの平衡化された試料をPEI−シリカゲ
ルカラムにかけ、0.01モル酢酸アンモニウムPH
6.79から1.0モル酢酸アンモニウムPH6.79への流速
１ml／分における30分間の線形勾配を使用して勾
配溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離
は280nｍにおけるUV吸収を使用して検出したが
フルスケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトし
た。280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜
約25分の保持時間の範囲で検出した。約12分に於
ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイ
ールを有する同じモノクローナル抗体の均一試料
とのコクロマトグラフイングによつてアンチリポ
ポリサツカライドモノクローナル抗体として同定
された。
実施例 ９
シンクロムインク（SynChrom Inc.）の、
SynChropak AX300クロマトグラフカラム25cm
×4.1mmをPH6.73の0.01モル燐酸カリウムで、この
緩衝液をカラムに流速１ml／分で20分ポンプで送
つて通すことによつて平衡化した。実施例２で利
用されたと同じマウス腹水液の6μの平衡化さ
れた試料をカラムにかけ、0.01モル燐酸カリウム
PH6.73から0.25M燐酸カリウムPH6.8への流速１
ml／分における60分間の線形勾配を使用して勾配
溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離は
280nｍにおけるUV吸収を使用して検出したがフ
ルスケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトし
た。280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜
約30分の保持時間の範囲で検出した。約20分に於
ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイ
ールを有する同じモノクローナル抗体の均一試料
とのコクロマトグラフイングによつてアンチリポ
ポリサツカライドモノクローナル抗体として同定
された。
SynChropak AX300クロマトグラフカラム25cm
×4.1mmをPH6.73の0.01モル燐酸カリウムで、この
緩衝液をカラムに流速１ml／分で20分ポンプで送
つて通すことによつて平衡化した。実施例２で利
用されたと同じマウス腹水液の6μの平衡化さ
れた試料をカラムにかけ、0.01モル燐酸カリウム
PH6.73から0.25M燐酸カリウムPH6.8への流速１
ml／分における60分間の線形勾配を使用して勾配
溶離することにより分離を達成した。蛋白溶離は
280nｍにおけるUV吸収を使用して検出したがフ
ルスケールの吸収は0.01吸光度単位にセツトし
た。280nｍ吸収ピークの一連のものを約３分〜
約30分の保持時間の範囲で検出した。約20分に於
ける蛋白ピークは上に述べたと同じ勾配プロフイ
ールを有する同じモノクローナル抗体の均一試料
とのコクロマトグラフイングによつてアンチリポ
ポリサツカライドモノクローナル抗体として同定
された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 本質的に均質のモノクローナル抗体形lgGを
上記のモノクローナル抗体を含有するマウスの腹
水液から得る方法に於いて、上記モノクローナル
抗体を上記試料から液体クロマトグラフイー手段
を用いて分離し、回収することからなるが、その
場合にクロマトグラフ充填物が、平均粒径約３〜
約40ミクロン及び平均孔寸法約50〜約1000オング
ストローム単位を有し、そして共有結合非架橋形
又は吸着された架橋形でポリエチレンイミン官能
基が結合されている微粒シリカゲルから本質的に
なる方法。 ２ 本質的に均質のモノクローナル抗体形lgGを
上記のモノクローナル抗体を含有するマウスの腹
水液から得る方法に於いて、上記モノクローナル
抗体を上記試料から液体クロマトグラフイー手段
を用いて分離し、回収することからなるが、その
場合にクロマトグラフ充填物が、平均粒径約３〜
約40ミクロン及び平均孔寸法約50〜約1000オング
ストローム単位を有する微粒シリカゲルと、約
400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレン
イミノプロピルトリメトキシシランとの反応生成
物から本質的になるものである特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 ３ 本質的に均質のモノクローナル抗体形lgGを
上記のモノクローナル抗体を含有するマウスの腹
水液から得る方法に於いて、上記モノクローナル
抗体を上記試料から液体クロマトグラフイー手段
を用いて分離し、回収することからなるが、その
場合にクロマトグラフ充填物が、平均粒径約３〜
約40ミクロン及び平均孔寸法約50〜約1000オング
ストローム単位を有し、吸着された架橋形でポリ
エチレンイミン官能基が結合している微粒シリカ
ゲルから本質的になるものである特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 ４ 本質的に精製されたモノクローナル抗体形
lgGを上記のモノクローナル抗体を含有する微粒
物のないマウスの腹水液から得る方法に於いて、 ａ 上記微粒物のないマウス腹水液の試料を後の
クロマトグラフイー分離及び回収段階での勾配
溶離に使用する低イオン強度緩衝液のイオン強
度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローナル抗体のplよりも大きいPH
に平衡化させ、 ｂ 平均粒径約３〜約40ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有し、吸
着された架橋形でポリエチレンイミン官能基が
結合している微粒シリカゲルから本質的になる
クロマトグラフイー充填物を使用するクロマト
グラフイー手段によつて、上記モノクローナル
抗体形lgGを上記試料から分離回収することか
らなる方法。 ５ 本質的に精製されたモノクローナル抗体形
lgGを上記のモノクローナル抗体を含有する微粒
物のないマウスの腹水液から得る方法に於いて、 ａ 上記微粒物のないマウス腹水液の試料を後の
クロマトグラフイー分離及び回収段階での勾配
溶離に使用する低イオン強度緩衝液のイオン強
度と同等又はそれより小さいイオン強度に、又
個々のモノクローナル抗体のplよりも大きいPH
に平衡化させ、 ｂ 平均粒径約３〜約40ミクロン及び平均孔寸法
約50〜約1000オングストローム単位を有する微
粒シリカゲルと約400〜約1800の平均分子量を
有するポリエチレンイミノプロピルトリメトキ
シシランの反応生成物からなるクロマトグラフ
イー充填物を使用するクロマトグラフイー手段
によつて、上記モノクローナル抗体形lgGを上
記試料から分離回収することからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US555023 | 1983-11-25 | ||
| US06/555,023 US4469630A (en) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Purification of monoclonal antibodies |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60173000A JPS60173000A (ja) | 1985-09-06 |
| JPH0144314B2 true JPH0144314B2 (ja) | 1989-09-27 |
Family
ID=24215670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59242584A Granted JPS60173000A (ja) | 1983-11-25 | 1984-11-19 | モノクローナル抗体の精製 |
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