KR870001435B1 - 모노클로날 항체의 정제방법 - Google Patents

모노클로날 항체의 정제방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

모노클로날 항체의 정제방법
본 발명은 쥐 복수(服水)액 시뇨의 모노클로날 항체성분을 정제하는 방법에 관한 것이다.
더욱 상세히는, 본 발명은 결합된 폴리에틸이민(PEI)기능을 지닌 실리카겔의 특유한 다공정 고정상(stationary phases)에서 약 pH6.0 내지 약 pH8.3의 수성 완충액으로 폴리에틸렌이민 결합된 컬럼으로 부터 모노클로날 항체의 기울기 용리를 하는 액체 컬럼 크로마코그라피를 이용하는 쥐 복수액으로부터 모노클로날 항체 IgG형을 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.
결합된 폴리에틸렌이민 기능을 지니는 실리카겔의 특유한 다공정 고정상 즉, 본발명에서 이용된 크로마토 그라피 충전은 두 가지 형태이다.
우선적인 형태는 본원과 같은 날짜에 허 램스든(Hugh Ramsden)이 출원한 "폴리에틸렌이민 결합 크로마토그라피 충전"이라는 명칭의 미국 특허출원 일련번호 555,368에 기재되어 있는데, 그 내용은 본원에 참조하여 병합되어 있다.
본원의 관련원문을 이하에 재현한다.
두번째 형태는 바네섹과 레그니에(G. Vanecek & F.E. Regnier, Anal Biochem, 121, 156-159(1982)), 그리고 알퍼트와 레그니에(A.J. Alpert & F.E. Regnien J. Chromatogr. 185, 375-392(1978))에 의해 기술된 흡착된 가교결합 PEI-실리카겔 고정상인데 이 형태는 상업적으로 "신크로팍(SynChro-pak)"이라는 상호로 인디아나주린덴의 신크롬 사(SynChrom, Inc. of Linden, Indiana)로부터 구입할 수 있다.
알퍼트와 레그니에는 폴리에틸렌이민(PEI)이 실리카겔 표면에 흡착되며 안정한 폴리아민층을 형성하기 위하여 가교결합될 수 있음을 밝혔다.
PEI의 구조는 인접한 실리카겔의 표면상에 흡착된 분자가 다 기능기의 옥시란에 의해 가교결합되어 중합체 층으로 될 수 있는 충분한 1차 및 2차 아미노기를 제공한다. 디글리시딜에틸렌 글리콜과 같은 친수성 가교제의 사용을 통하여 침수성 코우팅이 일어날 수 있다.
(RAMSDEN) 발명의 상세한 설명은 다음과 같다.
본 발명의 비-가교 공유결합된 PEI 실리카겔 생성물은 다음과 같은 단계들에 따라 편리하게 제조된다.
A. 평균 입경이 약 3내지 70미크론이고 평균 기공크기가 약 50내지 1000Å 단위인 입상 실리카겔을 비활성 유지용매 슬러리내에서 평균분자량이 약 400내지 약 1800인 폴리에틸렌 아미노프로필 트리메톡시실란의 저급 알칸올성 용액과 함께 반응시키며, 이 반응은 실온 내지 환류온도에서 약 2시간 내지 50시간 동안 수행한다.
B. 반응혼합물로부터 생성 고형분별물을 회수한다.
C. 실란을 건조시켜서 실리카겔에 완전히 결합되기에 충분한 온도와 시간으로 상기 고형 분별물을 가열한다.
여기에서 사용된 "공유결합된"이란 용어는 PEI 기가화학적인 상호작용에 의하여 실리카겔에 부착되어 프로필-실릴(Pr-Si) 연결을 생성시킴을 의미하며, "비-가교된"이란 용어는 인접한 공유결합된 PEI 기상의 이미노 및 아미노기가 가교되거나 가교체와 반응하지 않고 중합제층을 형성하는 것을 의미한다.
그것으로 결함됨이 없이 반응은 다음과 같은 2단계로 진행, 완결되는 것으로 생각된다.
단계 1 : 실린상의 실리카 히드록실과 메톡시가 약간의 미반응된 잔류 메톡시와 반응하여 Si-O-Si결합과 유리메탄올을 형성한다.
Figure kpo00001
단계 2 : 잔류 메톡시기와 반응의 완결은 a)와 b)에 의하여 가열 경화중에 수행한다.
Figure kpo00002
무정형 실리카 로구성되는 실리카겔은 불규칙한 구형(바람직한 것)입상의 형태로, 3내지 325(ASTM)에 이르는 메시 크기로 여러 상용등급으로 시판되고 있다. 그러나 메시크기의 숫적표시를 신뢰하기보다는 본 발명의 목적을 위한 더 정확한 표시는 실리카겔 입자의 평균 직경과 평균 기공크기가 각각 약 3내지 약 70미크론 및 약 50내지 약 1000, 바람직하게는 250 내지 500옹스트롬 단위인 것이다.
HPLC 크로마토그라피 컬럼 충전에 있어서 최종생성물 용도로는 약 3 내지 약 10미크론의 실리카겔 출발물이 바람직하고, 저압 크로마토그라피 충전을 위하여는 약 40 내지 70미크론이 바람직하다.
실리카겔 슬러리를 제조하는데 적합한 비활성 유기용매중에는, 예컨대 헥산, 헵탄 등과 같은 지방족 탄화
수소 ; 벤젠, 틀루엔, 크실렌 등과 같은 방향족 탄화
수소 ; 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등과 같은 저급
알칸올 ; 염화메틸렌, 클로로포름, 사염화탄소 등과 같은 염화메탄(주의 : 이러한 염소용매는 고온에서 반응할 수도 있다 !) ; 및 테트라히드로푸란, 글라임(glyme), 디글라임 등과 같은 기타 비활성용매 등이 있다.
일반적으로 gr으로의 실리카겔의 ml로의 용매에 대한 비율 1 : 5는 적당한 슬러리를 부여할 수 있다.
입상 실리카겔의 미세성과 불용성으로 인하여 전용액보다는 슬러리를 얻게 된다.
(N-트리메시톡실릴프로필)-폴리에틸렌이민으로도 공지된 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란은 폴리에틸렌이민과 아미노프로필 트리메톡시 실란의 반응생성물이며 다음의 일반식으로 표시된다.
Figure kpo00003
상기 식에서, 본 발명의 목적을 위하여는, n은 약 4 내지 약 37의 정수이며, 또는 평균분자량으로 표현하면 약 400 내지 약 1800이다.
실란(I)은 실란을 용해하기에 충분한 알칸올을 사용하면서 저급 C1-C6알칼올성 용액의 형태로 실리카겔의 반응에 사용된다.
50% w/w 이소프로판올성 용액이 바람직하다.
일반적으로, 실란의 50% w/w 알칸올성 용액 약 25-100gr 또는 대신으로 약 50-200ml가 실리카겔 각각 100gr과 반응하는데 사용된다.
반응속도를 증진시키기 위해서는 반응용매계의 환류온도까지의 고온이 이용될 수 있을지라도 반응은 실온에서 수행될 수 있다.
반응은 용이하게 진행되어 실질적으로 2내지 50시간내에 완결된다(단계 1).
반응물의 혼합중 교반하는 것이 유리하나 그 후 반응은 더 교반하지 않고 계속될 수 있다.
무수조건이 중대하지는 않으나, 소량의 수분의 존재, 예를들면 슬러리 용매 50ml당 약 0.1-1.0ml는 반응에 악영향을 미치지 않는다.
종래의 물리적 방법, 예를들면 여과, 원심분리 등에 의하여 반응혼합물로부터 생성 고형분별물을 회수한다. 일반적으로, 5 미크론의 입도를 보유하기 충분한 여과 방법이 적당하지만 3 미크론의 입도에 대하여는 원심분리가 알맞다.
회수된 고형분별물은 다음에 실란을 건조하여 실리카겔에 완전히 공유 결합되기에 충분한 온도와 시간으로 가열 경화한다. 일반적으로, 약 40 내지 120℃에서 약 1 내지 4시간이 충분한 것으로 발견되었다.
이와같이 얻어진 공유결합된 비-가교의 최종생성물은 바람직하게는 약 5.0 내지 약 3.8%의 질소를 함유한다.
(재현된 명세서 끝)
본 발명의 목적을 위하여, 이후부터 때때로 편리상 "PEI-실리카겔"로서 일컫는 크로마토그라피 충전이 이용되는데 그 안의 출발 실리카겔은 평균입경이 약 3 내지 40미크론인 것으로 제한한다.
평균 기공크기는 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위일수 있으나, 250옹스트롬 단위보다 더 큰것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은, 크로마토그라피 충전이 레그니에 등(Regnyer et al., ibid)에 따르는 흡착된 가교결합 형태로, 램스든(Ramsden, ibid)에 따르는 공유결합된 비-가교형태로 폴리에틸렌이민 기능이 결합되어 있는 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위인 입상 실리카겔로 이루어지는 액체 크로마토그라피 방법을 사용함으로써 필수적으로 균일한 모노클로날 항체 IgG형을 이 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액의 시료로부터 얻는 방법을 제공한다.
후자의 비-가교 공유결합형태에 관여하는, PEI-실리카겔크로마토그라피 충전은 전술한 입상 실리카겔의 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란과의 반응생성물인데 약 400 내지 약 1800의 평균분자량을 갖는다.
이제 이러한 크로마토그라피 충전은 IgG형 모노클로날 항체와 그것을 포함하는 쥐 복수액내의 다른 단백질을 결합시키고 적당한 수성완충액을 사용하면서 기울기 용리에 의하여 결합된 단백질의 선택적인 분리를 하도록 하게 하기 위한 액체 크로마토그라피, 특히 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)에의 용도로 특히 적합함을 발견하였다. 이와같이 하여 흥미있는 필수적으로 균일한 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액내에 본질적으로 존재하는 많은 단백질성분을 얻게 된다. 여기에서 사용된 "필수적으로 균일한"은 정량적으로 회수된 IgG 항체 용리액 분별물내에 존재하는 단백질의 90% 이상이 특유의 IgG 모노클로날 항체인 것을 의미한다.
퍼센트 순도는 예로써, 도데실 황산나트륨 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(U.K. Laemmli, Nature, 227,680(1970))에 의해서와 같은 본분야의 공지의 방법으로 입증될 수 있다.
본 발명은 IgG 형의 모든 서브클라스, 예를들면 IgG1, IgG2a및 IgG1+3등의 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액의 사용에 적합하다.
모노클로날 항체를 함유하는 이러한 쥐 복수액을 제조하는 방법론은 본분야의 공통이며, 예를들어서 "모노클로날 항체, 히브리도마 ; 생물 분석의 새차원"(by R.H. Kennet et al., published by Pleum Press, N.Y. 1980)과 "효소학의 방법"(by G. Galfred and C. Milstein, edited by J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol.73, p.31-46, publ. by Academic Press, 1981)을 참조할 수 있다.
고도로 정제된 형태의 모노클로날 항체의 분리가 바람직함이 명백하다.
예를들면, 체내 치료의 목적으로는 불리한 부작용을 극소화하고 의도한 치료의 목적을 극대화하기 위하여 가능한 한 순수하고 농축된 모노클로날 항체가 요구된다.
마찬가지로, 체외진단의 목적으로도 특수한 진단시험의 감수성과 특이성을 극대화하기 위해 이러한 정제되고 농축된 모노클로날 항체가 바람직하다.
쥐 복수액은 본 발명에 사용되기 이전에, 전처리하여 방해하는 입상물질을 제거하며 PEI-실리카겔 지지체에 모노클로날 항체의 결합을 이루는데 필요한 적당한 이온강도와 pH로 평형이 되게 한다.
입상물질은 종래의 정화방법, 예로써 여과 또는 입상물질을 펠릿화하기에 충분한 힘으로 원심분리에 의하여 제거될 수 있다. 무-입자 쥐 복수액의 평형은 본 분야의 일반적인 어떠한 방법에 의해서도 달성될 수 있는데, 예를들면 "세파텍스"라는 상호로 상용 시판되는 것과 같은 적당한 형과 기공크기의 분자체상에서 적당한 완충액으로 크로마토그라피적인 탈염에 의하거나, 적당한 완충액에 대한 투석에 의하여 특수한 IgG 모노클로날 항체의 pI(모노클로날 항체가 그 주위에 순 이온전하를 운반하지 않는 pH) 보다 더 큰 pH와 쥐 복수액의 잇다른 크로마토그라피 처리에서 기울기 용리에 사용되는 낮은 이온강도 완충액의 이온강도와 같거나 또는 보다 낮은 이온강도로 평형이 되게 한다.
액체 크로마토그라피, 바람직하게는 HPLC에 사용하기에 적합한 크로마토그라피 컬럼은 앞서 기재한 다공성 PEI-실리카겔 고체 지지체로 충전시킨다.
알맞은 강철 또는 유리 크로마토그라피 컬럼은 길이가 약 5-100cm, 내경이 약 1-100mm인 것을 포함한다. 예로써, 컬럼 충전기술, 컬럼크기, 컬럼온도, 압력 등과 같은 적당한 크로마토그라피 파라미터들의 선택은 통상의 기술로 쉽게 결정된다.
충전된 컬럼은 적당한 완충용액을 컬럼을 통하여 통과시킴으로써 크로마토그라프에 평형이 되게 한다.
이 완충액-평평화 단계후, 지시한바와 같이 입상물질을 없애고 적당한 이온강도와 pH로 평형이 되게 한 쥐 복수액의 단백질성분의 크로마토그라피 분리를 하는데에 컬럼을 사용한다.
이러한 전처리한 쥐 복수액의 시료를 다음에 완충액-평형 컬럼에 적용하여 그이 단백질성분을 -PEI실리카겔 충전에 결합되도록 한다.
결합된 단백질은 다음에, 이온강도를 증가시키거나 또는 pH를 감소시키는 기울기를 가져오도록 시간, 유속 및 기울기 모양의 상호의존 크로마토그라피 파라미터를 고려하면서, 종래의 기울기 용리기법에 의하여 선택적으로 용리시킬 수 있다.
음이온성 완충액, 예를들면 pH 약 6.0 내지 8.3의 인산칼륨, 트리스-이세테이트, 암모늄 아세테이트 등을 폴리에틸렌이민 기능으로부터 결합된 단백질을 용리시키기 위한 이러한 기울기를 가져오는 데에 사용할 수 있다.
예를들면, 기울기는 약 0.1ml/분 내지 약 2l/분의 유속으로 약 1시간반 내지 약 4시간에 유리하게 형성될 수 있다.
용해된 단백질은 본 분야의 일반적인 어떠한 방법으로도, 예를들면 280nm에서의 자외선 흡광도를 검사함에 의하여 확인될 수 있다.
분리된 단백질을 포함하는 용리액 분별물은 분별 수집기를 사용함으로써 수집할 수 있다.
균일한 모노클로날 항체를 포함하는 용리액 분별물은, 예로써 특수한 항체에 대해 전개한 방사면역측정(radioimmunoassay)에 의하거나, 다른 항체-황원반응, 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서와 같은 본 분야의 이미 확립된 방법에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명 방법은 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액의 총 부피에 관계가 없으며 크로마토그라피 충전으로서 사용된 PEI-실리카겔의 양을 제외하고는 제한되는 요인이 없는 점 즉, 고체 크로마토그라피 지지체의 용량을 초과하지 않는한 본 발명의 실시가 가능함을 발견하였다.
그러므로, 본 발명의 방법에 따르면 모노클로날 항체 IgG 형을 포함하는 쥐 복수액의 시료는 필수적으로 균일한 형태로 상기 항체를 제공하기 위하여 크로마토그라피 분리를 한다.
지금까지 더 충분히 기재한 바와 같이, 바람직한 방법은 다음의 단계들,
a. 잇다른 크로마토그라피 분리와 회수단계에서 기울기 용리에 사용되는 낮은 이온강도 완충액의 이농 강도와 같거나, 보다 낮은 이온강도, 그리고 특수한 IgG 모노클로날 항체의 pI 보다 더 클 pH로 상기 무-입자 쥐 복수액 시료를 평형화시키는 단계, 그리고
b. 크로마토그라피 충전은 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 1000옹스트롬 단위인 입상 실리카겔의, 평균분자량이 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸렘이미노프로필 트리메톡시 실란과의 반응생성물로 필수적으로 이루어지는 액체 크로마토그라피 방법을 사용함으로써 상기 시료로부터 상기 모노클로날 항체 IgG형을 분리하고 회수하는 단계에 의해서 상기 모노클로날 항체를 포함하는 무-입자 쥐 복수액의 시료를 정제하는 것으로 이루어진다.
발명은 이하에 계속되는 실시예에 의하여 더욱 쉽게 이해될 수 있는데, 본 발명의 예시로서만 주어진것이며 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
"비닥 A(Vydac A)", 카탈로그 No. 101T9B5이라는 상품명으로 구형 실리카로서 캘리포니아, 헤스페리아의 세 파 라 치온 그룹(Sep A Ra Tions Group)으로부터 상업적으로 구입할 수 있는 평균 직경 5.25미크론이고 평균 기공크기가 330옹스트롬인 실리카겔 20gr의 톨루엔 100ml과 물 2ml 중의 슬러리를 제조하고 실온에서 10분간 교반하였다.
여기에 평균분자량이 500인 폴리에틸렌이미노프로필 트리메톡시 실란의 50% w/w 이소프로판올성 용액 39.4gr을 교반하면서 가하고 혼합물을 5분간 더 교반하였다.
다음에 혼합물을 실온에서 하룻밤 방치하였다.
혼합물은 다음에 1.0미크론 여과기 깔떼기를 사용하여 여과하였다. 여액을 톨루엔 50ml로 2회, 메탄올 50ml로 2회 세척한 다음 깔떼기상에서 공기중 건조시키고 최종적으로 80-85℃에서 약 3시간 30분간 오븐 건조시켜 공유결합된, 비-가교 PEI-실리카겔 생성물을 N 약 2.85%로 얻었다.
[실시예 2]
박테리아의 리포폴리삭카라이드 세포벽에 특이하고, 종래의 서브클라스 특이성 항혈청에 의해 결정된바와 같이 서브클라스 IgG1에 속하는 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액의 시료 2ml을 15,600X 중력으로 5분간 원심분리하였다.
다음에 상징액을 10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.73,의 2 1-리터 변화에 대하여 하룻밤(약 17시간)투석함으로써 10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.73,으로 평형이 되게 하였다.
스테인레스스겔 크로마토그라피 컬럼, 25cm×0.46mm,을 실시예 1에서 얻은 PEI-실리카겔 생성물로 충전하고 0.01M 인산칼륨 완충액, pH 6.73,으로 1ml/분의 유속으로 20분간 이 완충액을 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 한다.
쥐 복수액의 평형화된 시료 0.25ml을 폴리에틸렌이민-결합된 실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01M 인산칼륨, pH 6.73, 내지 0.25M 인산칼륨, pH 6.8,의 60분 선형기울기를 1ml/분의 유속으로 사용하면서 기울기 용리에 의해 단백질 분리를 성취하였다.
280mm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.64흡광도 단위로 전면적인(full scale)흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다.
지연시간(retention time)이 약 3 분 내지 약 25분에 이르는 일련의 280mm 흡수피이크를 검출하였다. 약 16분에서의 단백질 피이크는 상기에 개설한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료로 상호-크로마토그라함에 의하여 항 리포폴리삭카라이드 모노클로날 항체로서 확인되었다.
약 16분에서 용리하는 단백질 피이크는 두 가지 기준에 의하여 90% 순도 이상인 것으로 평가되었다.
첫째, 수집된 단백질 피이크는 레그니에(F.B. Regnier), 과학(Science), 222,245(1983)에 따라, 폴리에틸렌 이민-결합된 실리카겔 컬럼상에서 크로마토그라피후 대칭적인 피이크를 얻었다.
둘째, 래믈리(U.K. Laemmli), 자연(Nature), 227,680(1970)에 기재된대로 수행한 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 50,000달톤(daltons)(IgG의 중사슬)과 25,000달톤(IgG의 경사슬)의 분자량에 해당하는 두 주요 코오마시 블루우(Coomassie blue) 띠와 총 착색 단백질의 10%이하를 나타내는 제3의 열은 코오마시 블루우띠를 얻었다.
[실시예 3]
미오신에 특이한 모노클로날 항체를 포함하는 종래의 서브클라스 특이성 항혈청에 의해 결정되는 바와같은 서브클라스 IgG2a에 속하는 쥐 복수액 시료 2ml를 15,600 X 중력으로 5분간 원심분리하였다.
다음의 상징액을 10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.73,의 2 1-리터 변화에 대하여 하룻밤 투석시킴으로써 10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.73으로 평형이 되게 하였다. 스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼, 25cm X 0.46mm,을 실시예 1에서 얻은 PEI-실리카겔 생성물 3.8g으로 충전하고 0.01M 인산칼륨 완충액, pH 6.73,으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 20분간 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평혀이 되게하였다.
쥐 복수액의 평형화된 시료 0.25ml를 폴리에틸렌이민-결합된 실리카겔 컬럼에 적용하여 0.01M 인산칼륨, pH 6.73, 내지 0.25M 인산칼륨, pH 6.8,의 60분 선형기울기를 사용하면서 기울기 용리에 의하여 단백질 분리를 성취하였다.
단백질 용리는 280nm에서 UV 흡광도를 사용하면서 0.64 흡광도 단위로 전면적인 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다.
지연시간에 있어서 약 3 분 내지 약 25분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 16분에서의 단백질 피이크는 상기에 개설한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료로 상호-크로마토그라피 함에 의하여 항미오신 모노클로날 항체로서 확인되었다.
약 16분에서 용리하는 단백질 피이크는 실시예 2에 제시된 두 가지 기준에 의하여 90% 이상의 순도임이 평가되었다.
[실시예 4]
특이성 미지의 IgG 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액의 시료 2ml를 15,600 X중력으로 5분간 원심 분리하였다.
다음에 상징액을 10mM 인산칼륨 완충액, pH 6.73,의 2 1-리터 변화에 대하여 하룻밤 투석함으로써 10mM 인산칼륨, pH 6.73에 평형이 되게 하였다.
스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼 25cm X 0.46mm를 실시예 1의 폴리에틸렌이민 실리카겔 제품 3.8g으로 충전하고, 0.01M 인산칼륨 완충액, pH 6.73으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 20분간 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
쥐 복수액의 평형화된 시료 0.25ml을 폴리에틸렌이민-실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01 인산칼륨, pH 6.73,으로부터 0.25M 인산칼륨, pH 6.8까지의 60분 선형기울기를 사용함으로써 기울기 용리에 의하여 분리를 성취하였다.
280nm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.64흡광도 단위로 전면적인 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다. 지연시간이 약 3분 내지 약 25분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 16분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함에 의하여 모노클로날 항체로서 확인되었다.
약 16분에서 용리하는 단백질 피이크는 가브리엘(O. Gabriel)에 의해 "효소학의 방법(Methods in En-zymology)" (edited by W.B. Jakaby, Vol. 22, p.565-578, publ. by Academic Press, 1971)에 기재된바와 같이 수행된 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 순도 95% 이상인 것으로 평가되었는데 이것은 단일 코오마시 블루우띠를 나타내었다.
이띠의 변동성은 표준 모노클로날 항체에 대해 관찰한 것에 해당한다.
[실시예 5]
스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼, 25cm X 4.6mm,을 실시예 1의 폴리에틸렌이민 결합된 실리카겔 3.8g으로 충전하고 0.01M 인산칼륨, pH 6.73,으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 20분간 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
실시예 2에 이용된 같은 쥐 복수액의 평형화된 시료 6μl를 PEI-실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01M 인산칼, pH 6.73, 륨으로부터 0.25M 인산칼륨, qH 6.8까지 1ml/분의 유속으로 120분 선형기울기를 사용하면서 기울기 용리에 의하여 분리를 성취하였다.
지연시간이 약 3 분 내지 약 50분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 28분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함에 의하여 항리포풀삭카라이드 모노클로날 항체로서 확인되었다.
[실시예 6]
스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼, 25cm X 4.6mm,을 실시예 1의 폴리에틸렌이민 결합된 실리카겔 3.8g으로 충전하고 0.01M 인산탈륨으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
실시예 2에서 이용된 샅은 쥐 복수액의 평형화된 시료 6μl를 PEI-실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01M 인산칼륨, pH 8.3으로부터 0.25M 인산칼륨, pH 8.3가지 1ml/분의 유속으로 60분 선형기울기를 사용하면서 기울기 용리에 의하여 분리를 성취하였다.
280nm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.01 흡광도 단위로 전면적인 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다. 지연시간 약 3 분 내지 약 50분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 12분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함으로써 항 리포폴리삭카라이드 모노클로날 항체로서 확인되었다.
[실시예 7]
스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼, 25cm X 4.6mm,을 실시예 1의 폴리에틸렌이민 결합된 실리카륨 3.8g으로 충전하고 0.01M 인산칼륨, pH 6.0,으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
실시예 2에서 이용된 같은 쥐 복수액의 평형화된 시료 6μl를 PEI-실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01M 인산칼륨, pH 6.0으로부터 0.25M 인산칼륨, pH 660까지 1ml/분의 유속으로 60분 선형기울기를 사용하면서 기울기 용리를 성취하였다.
280nm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.01 흡광도 단위로 전면적인 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다. 지연시간에 있어서, 약 3 분 내지 약 14분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 12분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함으로써 항 리포폴리삭카라이드로서 확인되었다.
[실시예 8]
스테인레스 스틸 크로마토그라피 컬럼, 25cm X 4.6mm,을 실시예 1의 폴리에틸렌이민 결합된 실리카겔 3.8g으로 충전하고 0.01M 암모늄 아세테이트, pH 6.79로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
실시예 2에서 이용된 같은 쥐 복수액의 평형화된 시료 6μl를 PEI-실리카겔 컬럼에 적용하고 0.01M 암모늄 아세테이트, pH 6.79로부터 1.0M 암모늄 아세테이트, pH 6.79까지 1ml분의 유속으로 30분 성형기울기를 사용하면서 기울기 용리에 의하여 분리를 성취하였다.
280nm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.01 흡광도 단위로 전면적으로 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다.
지연시간에 있어서 약 3분 내지 약 25분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 12분분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함으로써 항 리포폴리 삭카라이드 모노클로날 항체로서 확인되었다.
[실시예 9]
신크롬 사((SynChrom, Inc.)의 SnyChropak AX300 크로마토그라피 컬럼(25cm×4.1mm)을 0.01M 인산칼륨, Ph 6.73으로 이 완충액을 1ml/분의 유속으로 20분간 컬럼을 통하여 펌핑함으로써 평형이 되게 하였다.
실시예 2의 같은 쥐 복수액의 평형화된 시료 6μl을 컬럼에 적용하고 0.01M 인산칼륨, pH 6.73으로부터 0.25M 인산칼륨, pH 6.8까지 1ml/분의 유속으로 60분 선형기울기를 사용하면서 분리를 성취하였다.
280nm에서의 UV 흡광도를 사용하면서 0.01 흡광도 단위로 전면적인 흡광도 세트로 단백질 용리를 검출하였다. 지연시간에 있어서 약 3분 내지 약 30분에 이르는 일련의 280nm 흡수피이크를 검출하였다.
약 20분에서의 단백질 피이크는 상기에 개략한바와 같은 기울기 프로화일을 사용하면서 같은 모노클로날 항체의 균일한 시료와 상호-크로마토그라피 함으로써 항 리포폴리삭카라이드 모노클로날 항체로서 확인되었다.

Claims (5)

  1. 크로마토그라피 충전은 폴리에틸렌이민 기능이 비-가교 공유 결합형태로, 또는 흡착된 가교결합 형태로 결합된 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 ,내지 약 1000옹스트롬 단위인 입상 실리카겔로 필수적으로 구성되는 액체크로마토그라피 방법을 시용함으로써 시료로부터 모노클로날 항체를 분리시키고 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 필수적으로 균일한 모노클로날 항체 IgG 형을 이 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액 시료로부터 얻는 방법.
  2. 크로마토그라피 충전은 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위인 입상 실리카겔의, 평균분자량이 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸엔이미노프로필 트리메톡시실란과의 반응생성물로 필수적으로 구성되는 액체크로마토그라피방법을 사용함으로써 시료로부터 모노클로날 항체를 분리시키고 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 필수적으로 균일한 모노클로날 항체 IgG형을 상기 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액 시료로부터 얻는 방법.
  3. a. 잇다른 크로마토그라피 분리에서 기울기 용리에 사용된 낮은 이온강도 완충액의 이온강도와 같거나 보다 낮은 이온강도, 그리고 특수한 모노클로날 항체의 pI 보다 더 큰 pH로 무-입자 쥐 복수액의 시료를 평형화시키는 단계와, b. 크로마토그라피 충전은 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 1000옹스트롬단위인 입상 실리카겔의, 평균 분자량이 약 400 내지 약 1800인 폴리에틸렌이미 노프로필 트리메톡시 실란과의 반응생성물로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 방법을 사용함으로써 시료로부터 모노클로날 항체 IgG 형을 분리시키고 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 필수적으로 정제된 모노클로날 항체 IgG 형을 상기 모노클로날 항체를 포함하는 무-입자 쥐 복수액의 시료료부터 얻는 방법.
  4. 크로마토그라피 충전은 폴리에틸렌이민 기능이 흡착된 가교결합 형태로 결합된 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 약 1000옹스트롬 단위인 입상 실리카겔로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 방법을 사용함으로써 시료로부터 모노클로날 항체를 분리시키고 회수하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 필수적으로 균일한 모노클로날 항체 IgG 형을 이 모노클로날 항체를 포함하는 쥐 복수액 시료로부터 얻는 방법.
  5. a. 잇다른 크로마토그라피 분리와 회수단계에서 기울기 용리에 사용된 낮은 이온강도 완충액의 이온강도와 같거나 보다 낮은 이온강도, 그리고 특수한 모노클로날 항체의 pI 보다 더 큰 pH로 무-입자 쥐복수액의 시료를 평형화시키는 단계와, b. 크로마토그라피 충전은 폴리에틸렌이민 기능이 흡착된 가교결합 형태로 결합된 평균입경이 약 3 내지 약 40미크론이고 평균 기공크기가 약 50 내지 약 1000 옹스트롬 단위인 입상 실리카겔로 필수적으로 구성되는 액체 크로마토그라피 방법을 사용함으로써 시료로부터 모노클로날 항체 IgG형을 분리시키고 회수하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 필수적으로 정제된 모노클로날 항체 IgG형을 이 모노클로날 항체를 포함하는 무-입자 쥐 복수액의 시료로부터 얻는 방법.
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