ES2289611T3

ES2289611T3 - Adsorcion de acidos nucleicos en una fase solida.

Info

Publication number: ES2289611T3
Application number: ES05003254T
Authority: ES
Inventors: Ralf Zielenski; Klaus Dr. Geissler; Thomas Dr. Walter
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2005-02-16
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2025-02-16
Also published as: KR100692941B1; JP2005230012A; US7491495B2; ATE364694T1; EP1566437B1; JP4271663B2; BRPI0500474B1; CN1680421A; KR20060042961A; SG114738A1; CN1310938C; HK1084122A1; DK1566437T3; AU2005200670A1; DE602005001331D1; CA2497493C; BRPI0500474A; DE602005001331T2; US20050214926A1; MXPA05001815A

Abstract

Un método para la adsorción de un ácido nucleico de una muestra biológica en una fase sólida, que comprende los siguientes pasos: (a) proveerse de un tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico; (b) mezclar el tampón de lisis con la muestra biológica, de modo que la concentración del agente caotrópico en la mezcla se encuentre entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla del paso (b) o añadir a esta una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional, de modo que se incremente la concentración del agente caotrópico en la mezcla en más de 0, 5 M; (d) poner en contacto la mezcla del paso (c) con la fase sólida, de manera que se adsorba a la fase sólida el ácido nucleico contenido en la mezcla.

Description

Adsorción de ácidos nucleicos en una fase sólida.

La presente invención está dirigida a un método para la adsorción, es decir para la unión no covalente, de un ácido nucleico a una fase sólida. Además, la presente invención se refiere a un método para aislar un ácido nucleico de una muestra biológica.

Muchas substancias biológicas, especialmente los ácidos nucleicos, presentan dificultades especiales en lo que al aislamiento de su medio natural se refiere. Por un lado, se encuentran frecuentemente en concentraciones muy bajas y, por otro lado, se encuentran a menudo en presencia de muchas otras substancias sólidas y disueltas, por ejemplo, después de la lisis de las células. Este hecho hace que sean difíciles de aislar o determinar cuantitativamente, particularmente en ensayos bioespecíficos que permiten la detección de ácidos nucleicos específicos, o la detección de propiedades específicas de un ácido nucleico. Tales ensayos bioespecíficos juegan un papel importante en el campo del diagnóstico y el bioanálisis en la investigación y el desarrollo. Ejemplos de ensayos bioespecíficos son los ensayos de hibridación, inmunoanálisis y ensayos receptor-ligando. Los ensayos de hibridación utilizan el apareamiento de bases específico para la detección molecular de los analitos de ácido nucleico, por ejemplo RNA y DNA. Por consiguiente, las sondas de oligonucleótidos con una longitud de 18 a 20 nucleótidos pueden hacer posible el reconocimiento específico de una secuencia complementaria seleccionada, por ejemplo, del genoma humano. Otro ensayo que implica la unión selectiva de dos cebadores oligonucleotídicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en la patente US 4 683 195. Este método permite la amplificación selectiva de una región específica de ácido nucleico hasta niveles detectables mediante una polimerasa termoestable en presencia de desoxinucleótidos trifosfato en varios ciclos.

Como se ha descrito más arriba, antes de que los ácidos nucleicos puedan analizarse en uno de los ensayos mencionados anteriormente o sean utilizados para otros procesos, deben ser aislados o purificados de las muestras biológicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes como, por ejemplo, componentes de naturaleza proteica y componentes de naturaleza no proteica. A menudo, en las primeras fases se usan procedimientos que permiten el enriquecimiento del componente de interés, es decir de los ácidos nucleicos. Frecuentemente, éstos se encuentran en una célula bacteriana, una célula fúngica, una partícula viral o la célula de un organismo más complejo, tales como una célula sanguínea o una célula vegetal. Los ácidos nucleicos como componentes de interés pueden también denominarse "componente diana".

Para liberar el contenido de dichas células o partículas, pueden someterse a un tratamiento enzimático o químico para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes celulares y las membranas celulares de tales organismos. A este proceso se le hace referencia normalmente con el término lisis. La solución resultante que contiene este material se denomina lisado. Un problema que se encuentra habitualmente durante la lisis es la degradación del componente diana por enzimas, por ejemplo las desoxirribonucleasas o ribonucleasas que degradan ácidos nucleicos, que entran en contacto con el componente diana durante la lisis. Estas enzimas degradadoras pueden estar presentes en el exterior de las células o puede que hayan estado separadas en compartimentos celulares diferentes antes de la lisis y se pongan en contacto en ese momento con el componente diana. Otros componentes liberados durante este proceso pueden ser, por ejemplo, endotoxinas pertenecientes a la familia de los lipopolisacáridos que son tóxicas para las células y pueden causar problemas en los productos que se pretendan utilizar para el tratamiento farmacológico de humanos o
animales.

En las próximas etapas de la preparación de la muestra que sigue a la fase de lisis, los ácidos nucleicos se enriquecen más. Los ácidos nucleicos se extraen normalmente de la mezcla compleja de la lisis de forma previa a su utilización en un ensayo basado en el empleo sondas. Existen varios métodos para la extracción de los ácidos nucleicos. Los métodos dependientes de secuencia o bioespecíficos incluyen, por ejemplo, la cromatografía de afinidad o la hibridación a sondas inmovilizadas. Los métodos independientes de secuencia o métodos físico-químicos incluyen, por ejemplo: extracción líquido-líquido con fenol-cloroformo, precipitación con etanol puro o isopropanol, extracción con papel de filtro, extracción con agentes formadores de micelas como el bromuro de cetiltrimetilamonio, unión a inmovilizados, colorantes intercalables como los derivados de acridina, adsorción a sustratos tales como el gel de sílice o las tierras de diatomeas, adsorción a partículas de vidrio magnéticamente atraíbles (MGP, siglas en inglés) o partículas de organosilano en condiciones caotrópicas. La unión directa de los ácidos nucleicos a un sustrato tal como un material con superficie de sílice se prefiere entre otras razones porque los ácidos nucleicos no tienen que modificarse y pueden unirse incluso ácidos nucleicos nativos.

La adsorción de ácidos nucleicos a una superficie de vidrio es particularmente interesante para procedimientos de extracción aunque pueden utilizarse otras superficies.

Los ácidos nucleicos que se liberan, por ejemplo mediante la lisis celular y/o lisis de orgánulos celulares tales como mitocondrias, plástidos, núcleos u otros orgánulos que contengan ácido nucleico, pueden ser purificados mediante la unión a una fase sólida tal como un sustrato mineral, lavando dicho sustrato mineral con los ácidos nucleicos unidos y liberando dichos ácidos nucleicos de dicho sustrato mineral.

La adsorción de ácidos nucleicos a partículas de vidrio o partículas de sílice en presencia de sales caotrópicas son conocidas en la materia (Vogelstein, B., y Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619) y proporcionan las bases para los procesos de purificación y separación cromatográficas de los ácidos nucleicos. Los métodos para aislar y purificar RNA y DNA a partir de lisados utilizando altas concentraciones de sales caotrópicas, por ejemplo el yoduro sódico, el perclorato sódico o el tiocianato de guanidina son también conocidos en la materia (Boom, R., et al., J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503; Yamada, O., et al., J. Virol. Métodos 27 (1990) 203-209). La purificación de plásmidos de DNA de las bacterias sobre polvo de vidrio en presencia de perclorato sódico se describe en Marko, M.A., et al., Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387. En la patente alemana DE 37 24 442 se describe el aislamiento del DNA de cadena simple del fago M13 sobre filtros de fibra de vidrio mediante la precipitación de las partículas del fago utilizando ácido acético y la lisis de las partículas del fago con perclorato. Los ácidos nucleicos unidos a los filtros de fibra de vidrio se lavaron y seguidamente se eluyeron con un tampón Tris/EDTA que contenía metanol. Se describe un procedimiento similar para la purificación de DNA a partir de fagos lambda en Jakobi, R., et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. El procedimiento implica la unión selectiva de ácidos nucleicos a superficies de vidrio en soluciones de sales caotrópicas y la separación de ácidos nucleicos de contaminantes como la agarosa, proteínas o residuos celulares. Para la separación de las partículas de vidrio de los contaminantes, las partículas pueden bien centrifugarse o bien los fluidos se filtran utilizando filtros de fibra de vidrio. Esta etapa es limitante. Sin embargo, impide que el proceso se utilice para tratar cantidades grandes de
muestras.

El uso de partículas magnéticas para inmovilizar ácidos nucleicos después de la precipitación mediante la adición de sales y etanol es más útil y se describe por ejemplo en: Alderton, R.P., et al., Anal. Biochem. 201 (1992) 166-169 y WO 91/00212. En este proceso, los ácidos nucleicos se aglutinan con las partículas magnéticas. El aglutinado se separa del solvente original aplicando un campo magnético y realizando una etapa de lavado. Tras una etapa de lavado, los ácidos nucleicos se disuelven en un tampón Tris. Sin embargo, este procedimiento presenta una desventaja, que es que la precipitación no es selectiva para los ácidos nucleicos. En cierta medida, se aglutinan también una variedad de substancias sólidas y disueltas. Como consecuencia, este procedimiento no puede utilizarse para extraer cantidades significativas de ningún inhibidor de reacciones enzimáticas específicas que puedan estar presentes. El vidrio magnético y poroso se encuentra también disponible en el mercado y contiene partículas magnéticas en una matriz de vidrio particular y porosa y está recubierta con una capa que contiene estreptavidina. Este producto puede utilizarse para aislar materiales biológicos, por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos, si se modifican en una etapa de preparación del complejo de modo que se unan covalentemente a la biotina. Algunos adsorbentes magnetizables en concreto han demostrado ser muy eficientes y adecuados para la preparación automática de muestras. Los pigmentos ferrimagnéticos y ferromagnéticos así como los pigmentos superparamagnéticos se utilizan con esta finalidad. Los MGP preferidos se describen en la patente WO 01/37291.

La purificación de un ácido nucleico mediante la adsorción de éste a un sustrato, como un sustrato mineral, en presencia de elevadas concentraciones de sales se aplica también a otras mezclas complejas. Los expertos en las técnicas de biología molecular son conocedores de ejemplos de estos procesos que incluyen mezclas de reacción obtenidas tras, por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos in vitro tales como la PCR, digestiones con enzimas de restricción, reacciones de ligación, etc. En Vogelstein, B. y Gillespie, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 615-619, se propone por ejemplo un procedimiento para la unión de ácidos nucleicos procedentes de un gel de agarosa en presencia de yoduro sódico a cristal acromático pulverizado. Otra aplicación de la purificación de un ácido nucleico mediante la adsorción de éste a un sustrato, como un sustrato mineral, en presencia de una concentración elevada de sales es la extracción de contaminantes pirógenos que se hayan purificado junto con
éste.

El mecanismo mediante el que los ácidos nucleicos se unen al soporte mineral en presencia de agentes caotrópicos no se ha dilucidado completamente. Existen conjeturas que afirman que la interacción entre los ácidos nucleicos y el solvente está influenciada de tal modo que los ácidos nucleicos se adsorben a un soporte mineral y se desnaturalizan. En presencia de elevadas concentraciones de agentes caotrópicos la reacción es casi cuantitativa. Los ácido nucleicos adsorbidos pueden eluirse mediante la aplicación de tampones de baja fuerza iónica al soporte
mineral.

La patente estadounidense US 5 808 041 presenta métodos para aislar ácidos nucleicos de longitud superior a 50 bases aproximadamente a partir de ciertas muestras biológicas. Se produce un lisado acuoso que contiene iones caotrópicos a una concentración superior a 2 M aproximadamente y el material de sílice adsorbe los ácidos nucleicos del lisado (denominado también "unión"). A la muestra biológica se añade una pasta o resina compuesta de material de sílice y sales caotrópicas que dan lugar a un proceso de lisis y unión en una etapa. Los métodos para obtener el lisado de una muestra biológica que se presentan en el documento incluyen la lisis de bacterias utilizando hidróxido alcalino y SDS, la lisis de fagos M13 o fagos lambda mediante la incubación de estos en presencia de guanidina 2,8 M y la lisis de tejido fresco o congelado mediante incubación de éste en presencia de guanidina 2,8 M. Adicionalmente se utiliza el N-laurilsarcosina para facilitar el proceso de lisis.

La patente europea EP 0 389 063 y la EP 0 819 696 presentan el método de purificación de un ácido nucleico mediante la mezcla de material que contenga el ácido nucleico con una substancia caotrópica en una fase líquida con un ácido nucleico unido a una fase sólida. De este modo, los procedimientos que se muestran en los documentos representan también procesos de lisis y unión en una sola etapa. Tras la lisis y la unión, se separa la fase sólida con el ácido nucleico unido de la fase líquida. Después de una etapa de lavado el ácido nucleico se eluye de la fase sólida. Los documentos presentan un tampón de lisis que contiene tiocianato de guanidina 10 M aproximadamente, Triton-X100 2% aproximadamente, sales de Tris 0,1 M aproximadamente y alrededor de EDTA 50 \muM aproximadamente. Otro tampón de lisis contiene además un 40% en peso/volumen de sulfato de dextrano. Otro tampón de lisis contiene tiocianato de guanidina 10 M aproximadamente y EDTA 50 \muM aproximadamente. Otros tampones de lisis se presentan en los documentos que contienen como substancia caotrópica el yoduro potásico o el yoduro sódico en una concentración de 3 M aproximadamente, o potasio o yoduro sódico conjuntamente con urea 1 M o 8 M. La lisis de una muestra biológica se efectúa mediante la incubación de la muestra con un tampón de lisis, en la que 50 partes de la muestra biológica en volumen se mezclaron con 900 partes en volumen de un tampón de lisis y 40 partes en volumen de sílice en grano. Como alternativa al uso de la sílice en grano, se describen otros procedimientos en los que se utiliza un material de filtro de sílice.

La patente europea EP 0 658 164 describe métodos para la purificación cromatográfica de los ácidos nucleicos mediante purificación cromatográfica. Particularmente, se describe un procedimiento de dos etapas que comprende una primera etapa de lisis y una segunda etapa de unión. En la primera etapa (lisis), la muestra biológica se mezcla con un agente caotrópico, en la que la concentración del agente caotrópico en la mezcla oscila entre 2 M aproximadamente y 4 M aproximadamente. Opcionalmente, la mezcla además contiene fenol, cloroformo o éter. Opcionalmente, la mezcla contiene además un detergente. Se añade una proteasa y se incuba la mezcla. En la segunda etapa (unión), se añade un alcohol y la mezcla resultante se pone en contacto con la fase sólida unida al ácido nucleico.

Los métodos más vanguardistas presentan ciertas desventajas. Por lo tanto, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método alternativo de preparación de la muestra biológica que contiene un ácido nucleico y que se adsorba el ácido nucleico de la preparación a una fase sólida. Otro objetivo de la invención consiste en prescindir del alcohol durante la etapa de adsorción, ya que es una substancia inflamable y por lo tanto se pretende restringir su uso. En el presente documento se entiende que el término "un ácido nucleico" hace referencia al menos a un ácido nucleico. Además, el término "un ácido nucleico" puede indicar también una mezcla de ácidos nucleicos. Los términos "fase sólida" y "sustrato" se refieren a una substancia que es prácticamente insoluble en una solución acuosa y en la que puede adsorberse un ácido nucleico en solución acuosa de elevada fuerza iónica cuando la substancia se añade. Ejemplos de ello son partículas minerales porosas y no porosas tales como la sílice, el vidrio, el cuarzo, las zeolitas o mezclas de éstos. El término "sustrato" engloba también las partículas magnéticas recubiertas de sílice, vidrio, cuarzo o zeolitas. Además, se entiende que un sustrato en forma de material en "polvo" o "pulverizado" se refiere a material finamente dividido, que al dispersarse en una fase líquida tal como un compuesto orgánico líquido o una solución acuosa, da lugar a una suspensión. El término material en "polvo" o "pulverizado" pretende incluir los comprimidos, en los que se agrega el material pulverizado, pero que todavía genera una suspensión al mezclarse con una fase líquida tal como una solución acuosa. Además, se entiende que los términos "fuerza iónica elevada" y "concentración elevada" se refieren a la fuerza iónica o concentración de una solución acuosa obtenida al disolver sales en concentraciones iguales o superiores a 1 M aproximadamente. Se prefieren las sales caotrópicas en concentraciones de 1 a
10 M.

Los inventores descubrieron sorprendentemente que es ventajoso realizar una lisis en dos etapas y un proceso de unión, en el que la primera etapa se efectúa mezclando la muestra biológica con un tampón de lisis acuoso que contiene un agente caotrópico e incubando la mezcla; en la segunda etapa, la concentración de agente caotrópico en la mezcla aumenta y la mezcla se pone en contacto con una fase sólida capaz de unir ácidos nucleicos, en donde la fase sólida adsorbe el ácido nucleico de la fase líquida.

Por lo tanto, una primera modalidad de la invención es un método para la adsorción en una fase sólida de un ácido nucleico procedente de una muestra biológica, que comprende las fases siguientes: (a) proporcionar un tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico; (b) mezclar el tampón de lisis con la muestra biológica, en el que la concentración de agente caotrópico en la mezcla oscila entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla de la fase (b) o añadirle una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional, de tal modo que aumente la concentración de agente caotrópico en la mezcla en más de 0,5 M; (d) poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, de tal modo que la fase sólida adsorba el ácido nucleico presente en la mezcla.

Una segunda modalidad de la invención es un método para aislar un ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende las fases siguientes: (a) proporcionar tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico; (b) mezclar el tampón de lisis con la muestra biológica, por el que la concentración del agente caotrópico en la mezcla oscila entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla de la fase (b) o añadirle una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional, de tal modo que aumente la concentración de agente caotrópico en la mezcla en más de 0,5 M; (d) proporcionar una fase sólida y poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, de tal modo que la fase sólida adsorba el ácido nucleico presente en la mezcla; (e) separar la fase sólida y la fase líquida; (f) lavar opcional la fase sólida con un tampón de lavado; (g) eluir el ácido nucleico de la fase sólida aislando de este modo el ácido nucleico; (h) opcionalmente, precipitar el ácido nucleico de la fase (g) del eluido y aislar el ácido nucleico precipitado.

En los últimos años se han propuesto muchos procedimientos para aislar los ácidos nucleicos de su medio natural utilizando la unión de éstos sustratos tales como las superficies de vidrio. El uso de agentes caotrópicos tales como, por ejemplo, el tiocianato de guanidina en condiciones de elevadas concentraciones de sales es habitual. Una concentración elevada de un agente caotrópico altera las propiedades volumétricas del agua (Cacace, M.G., et al. Quarterly Review of Biophysics (1997) 30:241-277).

Ciertos iones en agua tienden a aumentar las interacciones hidrófobas, mientras que otros producirán una disminución de estas interacciones. Las series de Hofmeister describen la tendencia de los iones a producir un efecto u otro. Las series son de la siguiente manera:

Cationes

NH_{4}{}^{+} > Rb^{+} > K^{+} > Na^{+} > Cs^{+} > Li^{+} > Mg^{2+} > Ca^{2+} > Ba^{2+} > guanidina

Aniones

PO_{4}{}^{3-} > SO_{4}{}^{2-} > HPO_{4}{}^{2-} > acetato > citrato > tartrato > Cl^{-} > Br^{-} > NO_{3}{}^{-} > ClO_{3}{}^{-} > ClO_{4}{}^{-} > I^{-} > SCN^{-}

Los iones de la izquierda se dice que son "cosmotrópicos" y aumentan la fuerza de las interacciones hidrófobas y en consecuencia precipitan o "forman sales" de proteínas a elevadas concentraciones. Los iones de la derecha son "caotrópicos" y tienden a debilitar las interacciones hidrófobas. Las series de Hofmeister explican por qué la guanidina es una proteína desnaturalizante, debilita las interacciones hidrófobas y provoca que las proteínas se desnaturalicen. Por el contrario, el (NH_{4})_{2}SO_{4} se disociará en los iones NH_{4}+ y SO4^{2-}. Estos dos iones son cosmotrópicos, y el efecto de cada uno de ellos es independiente y se suman. Esto hace que el (NH_{4})_{2}SO_{4} sea un precipitante versátil que es muy usado en procesos de purificación de proteínas. El NaCl se encuentra en una posición media de las series, es decir, no es ni cosmotrópico ni caotrópico.

Los inventores observaron que es ventajoso aplicar un método de lisis y unión en dos fases para preparar una muestra biológica que contiene un ácido nucleico y para que la fase sólida adsorba el ácido nucleico de la preparación. En la primera fase (lisis) la concentración del agente caotrópico es inferior que en la segunda fase (unión). Durante la fase de lisis, es decir, en la mezcla de la muestra biológica y el tampón de lisis la concentración de agente caotrópico preferida oscila entre 1 M y 4 M. Una primera modalidad preferida de la invención es, por lo tanto, un método para la adsorción en una fase sólida de un ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende las fases siguientes: (a) proporcionar tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico; (b) mezclar el tampón de lisis con la muestra biológica, por el que la concentración del agente caotrópico en la mezcla oscila entre 1 M y 4 M, e incubar de la mezcla; (c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla de la fase (b) o añadirle una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional, de tal modo que aumente la concentración de agente caotrópico en la mezcla en más de 0,5 M; (d) poner en contacto la mezcla de la fase (c) con la fase sólida, de tal modo que la fase sólida adsorba el ácido nucleico presente en la mezcla.

Se prefiere que el agente caotrópico sea una sal caotrópica. Se prefiere más que el agente caotrópico se seleccione del grupo formado por el clorhidrato de guanidina, el tiocianato de guanidina, el isotiocianato de guanidina, yoduros alcalinos y percloratos alcalinos. Preferiblemente, el yoduro alcalino es el KI o el NaI.

Preferiblemente, el perclorato alcalino es el NaClO_{4} o el KClO_{4}. Son posibles también las mezclas de estos compuestos, así como las mezclas de estos compuestos con urea.

Según el agente caotrópico utilizado, la concentración óptima de éstos en la mezcla de la fase (b) puede variar. Por ejemplo, para obtener un efecto caotrópico comparable utilizando clorhidrato de guanidina o tiocianato de guanidina deben seleccionarse concentraciones diferentes en un rango entre 1 M y 4 M. El principio que subyace a esta diferencia es que la sal de tiocianato de guanidina al disolverse en agua se disocia generando dos iones caotrópicos, mientras que el clorhidrato de guanidina genera un solo ión caotrópico. Por lo tanto se prefiere que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico oscile entre 1 M y 2 M. Se prefiere más que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico oscile entre 1,5 M y 2 M. Se prefiere más aún que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico sea 2 M aproximadamente. Según el agente caotrópico utilizado se prefiere también que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico oscile entre 2 M y 4 M. Se prefiere más que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico oscile entre 2,5 M y 3 M. Se prefiere más aún que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico sea 3 M aproximadamente

A este respecto, los expertos en la materia entenderán que la palabra "aproximadamente", conjuntamente con un valor cuantificado en números, significa que este valor puede estar sujeto a variaciones, por lo que el efecto técnico deseado, que se describe o define mediante el valor, permanece inalterado. Por lo general, "aproximadamente" se entiende que implica una variación del 5%. Por ejemplo, un valor de 100 aproximadamente comprende los valores que oscilan entre 95 y 105.

Los iones de guanidina y tiocianato se encuentran clasificados en las series de Hofmeister mostrando propiedades caotrópicas superiores a, por ejemplo, los cationes de potasio o sodio, o los aniones yoduro o clorato, respectivamente. En consecuencia se prefiere también que en la mezcla de la fase (b) la concentración del agente caotrópico oscile entre 2 M y 4 M.

En la segunda fase (unión) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumenta mediante la adición de agente caotrópico adicional a la mezcla de la fase (b). Como se indica para la fase c) existen varias maneras de alcanzar el aumento deseado. Es posible añadir el agente caotrópico en forma de materia sólida a la mezcla de la fase (b) y disolver el agente caotrópico. Alternativamente, se prepara una solución acuosa del agente caotrópico y se añade a la mezcla de la fase (b). Preferiblemente, la solución acuosa contiene además ingredientes tales como una sal tampón, un detergente o ambos. Un ejemplo de tal solución acuosa es el tampón de unión descrito en los Ejemplos 2, 3 y 4.

La concentración del agente caotrópico en la mezcla de la fase (c) aumenta en más de un 0,5 M. Por lo tanto, se prefiere que la fase (c) comprenda la disolución de una cantidad adicional de agente caotrópico en una solución acuosa o añadiendo una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional a la mezcla de la fase (b), como consecuencia la concentración del agente caotrópico aumenta en la mezcla hasta un valor que oscila entre 1,5 M y 10 M. Se observa que puede añadirse agente caotrópico adicional en forma de materia sólida a la mezcla de la fase (b) hasta que se alcanza la saturación en la mezcla. Por ello, se prefiere más que la fase (c) comprenda la disolución de una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla de la fase (b), saturando de tal modo la mezcla con el agente caotrópico. Se prefiere que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 6 M aproximadamente. Se prefiere más que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 4 M aproximadamente. Se prefiere más aún que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 3 M aproximadamente. Se prefiere más aún que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 2 M aproximadamente Se prefiere más aún que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 1,5 M aproximadamente Se prefiere más aún que en la fase (c) la concentración del agente caotrópico en la mezcla aumente entre un 0,5 M y un 1 M aproximadamente.

El procedimiento para la unión de al menos un ácido nucleico (denominado también ácido nucleico diana) a un sustrato tal como, por ejemplo, las partículas de sílice, fibras de sílice, filtro de vidrio o partículas de vidrio puede describirse de la siguiente manera:

De acuerdo con la invención, se realiza en presencia de sales caotrópicas en una concentración que oscila 1,5 M y 10 M, y preferiblemente entre 2 M y 6 M.

El DNA o el RNA en estas condiciones se une a un material con una superficie de vidrio, es decir, en presencia de ciertas concentraciones de un agente caotrópico. Para poner en contacto el lisado con el sustrato, es decir, el material con afinidad hacia los ácidos nucleicos, se mezclan el lisado y el sustrato y se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para que se produzca la unión. En el caso de que el sustrato sea un filtro constituido, por ejemplo, por vidrio, sílice, o fibras de cuarzo, el lisado (es decir, la mezcla de la fase (c)) puede filtrarse mediante atracción gravitatoria al aplicar una presión o succión. El ácido nucleico en la fase líquida se pone en contacto con la fase sólida al pasar a través del filtro y se adsorbe en éste. Los expertos están familiarizados con el tiempo de incubación de la fase líquida y la fase sólida. La incubación puede optimizarse mediante la determinación cuantitativa de la cantidad de material biológico inmovilizado en la superficie en diferentes intervalos de tiempo. Los periodos de incubación que pueden ser apropiados para los ácidos nucleicos oscilan entre 10 segundos y 30 minutos.

Además es preferido usar una enzima con actividad proteolítica para lisar una muestra biológica y liberar así los ácidos nucleicos en los procesos de unión del ácido nucleico a una fase sólida o para aislar un ácido nucleico de una muestra biológica. El término "enzima con actividad proteolítica" se entiende que engloba una proteasa o una mezcla de proteasas que degrada rápidamente las enzimas degradadoras de ácidos nucleicos u otras proteínas no deseadas en la muestra biológica. En el presente contexto el término "proteasa" pretende aludir a cualquier hidrolasa, peptidasa, proteinasa o enzima que posea una actividad proteolítica (es decir, hidrolasas a nivel de los enlaces peptídicos) como se describe en la EC 3.4-3.11 y cualquier modificación de éstas, que mantenga la actividad de la enzima. La enzima con actividad proteolítica puede aislarse de tejido animal, tejido vegetal, microorganismos o puede obtenerse mediante métodos de recombinación. Por lo tanto, es preferido que el tampón de lisis de la fase (a) contenga una enzima con actividad proteolítica. Se prefiere más que la enzima con actividad proteolítica se seleccione de las proteasas comprendidas en la EC 3.4-3.11. Se prefiere más aún que la enzima con actividad proteolítica se seleccione del grupo formado por achromopeptidasa, aminopeptidasa, ancrod, enzima de conversión de la angiotensina, bromelaína, calpaína, calpaína I, calpaína II, carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B, carboxipeptidasa G, carboxipeptidasa P, carboxipeptidasa W, carboxipeptidasa Y, caspasa, caspasa 1, caspasa 2, caspasa 3, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9, caspasa 10, caspasa 13, catepsina B, catepsina C, catepsina D, catepsina G, catepsina H, catepsina L, quimopapaína, quimasa, alfa-quimotripsina, clostripaína, colagenasa, complemento Clr, complemento Cls, factor del complemento D, factor del complemento I, cucumisina, dipeptidil-peptidasa IV, elastasa leucocitaria, elastasa pancreática, endoproteinasa Arg-C, endoproteinasa Asp-N, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Lys-C, enterocinasa, factor Xa, ficina, furina, granzima A, granzima B, proteasa VIH, IGasa, calicreína tisular, leucina aminopeptidasa, leucina aminopeptidasa citosólica, leucina aminopeptidasa microsómica, metaloproteasa de matriz, metionina aminopeptidasa, neutrasa, papaína, pepsina, plasmina, prolidasa, pronasa E, antígeno prostático específico, proteasa alcalofílica procedente de Streptomyces griseus, proteasa procedente de Aspergillus, proteasa procedente del Aspergillus saitoi, proteasa procedente de Aspergillus sojae, proteasa alcalina procedente de B. licheniformis, alcalasa procedente de B. licheniformis, proteasa procedente de Bacillus polymyxa, proteasa procedente del Bacillus sp, proteasa procedente de Bacillus sp (esperasa), proteasa procedente de Rhizopus sp., proteasa S, proteasomas, proteinasa procedente de Aspergillus oryzae, proteinasa 3, proteinasa A, proteinasa K, proteína C, piroglutamato aminopeptidasa, renina, estreptocinasa, subtilisina, termolisina, trombina, activador tisular del plasminógeno, tripsina, triptasa y urocinasa. Se prefiere aún más que la enzima con actividad proteolítica se seleccione del grupo formado por la caspasa, la proteinasa K, la pronasa E, la proteasa procedente de Bacillus sp (Esperasa), y la subtilisina. Se prefiere también una mezcla de al menos dos proteasas diferentes como se describe en EC 3.4-3.11. Con respecto a la selección de una proteasa los expertos están familiarizados normalmente con la optimización de tampones de lisis. Como se describe en el Ejemplo 1, los expertos artesanos comprobarán la actividad proteolítica de la proteasa seleccionada en un tampón que contiene un agente caotrópico en concentraciones diferentes. Preferiblemente se seleccionará una proteasa activa en las condiciones caotrópicas de una mezcla de acuerdo con la fase (b). Los expertos pueden realizar la optimización de la duración de la incubación con la proteasa, así como la optimización de la temperatura de incubación. Como parámetro, los expertos artesanos determinarán la cantidad de ácido nucleico(s) liberados de la muestra biológica en la fase líquida y con capacidad de unión al substrato.

Se prefiere sumamente que el tampón de lisis de la fase (a) contenga proteinasa K. Preferiblemente, que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la fase (b) oscile entre 0,1 U/ml y 10 U/ml. Se prefiere más que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la fase (b) oscile entre 1 U/ml y 6 U/ml. Es más preferido aún que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la fase (b) oscile entre 2 U/ml y 4 U/ml. Es más preferido aún que la actividad de la proteinasa K en la mezcla de la fase (b) sea 3 U/ml aproximadamente. A este respecto se entiende que los valores de actividad de la proteinasa K citados reflejan valores de actividad determinados como se describe en el Ejemplo 1.

Al realizar la lisis de una muestra biológica para liberar los ácido nucleicos o al unir el ácido nucleico a la fase sólida se prefiere utilizar además un detergente en el proceso, es decir, un detergente aniónico, catiónico, zwitteriónico o no iónico. Tales detergentes son bien conocidos por los expertos en la materia. Generalmente, un "detergente" agente tensioactivo, conocido también como surfactante. Un detergente es capaz de reducir la tensión superficial del medio en el que está disuelto, y/o la tensión interfacial con otras fases y, por consiguiente, es sin duda adsorbido en las interfaces líquido/vapor y/o en otras interfaces. Por tanto, los detergentes son moléculas anfipáticas con dominios polares (hidrosolubles) y apolares (hidrófobos). Son capaces de unirse a moléculas o dominios moleculares hidrófobos y conferir hidrosolubilidad. Según sus características iónicas, un detergente puede distinguirse en categorías como un detergente iónico, un detergente no iónico, o un detergente zwitteriónico. Los detergentes iónicos pueden clasificarse además en detergentes catiónicos tales como el SDS (dodecilsulfato sódico), LiDS (dodecilsulfato de litio), o Bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), o detergentes aniónicos tales como el ácido desoxicólico o la lauril-sarcosina sódica. Normalmente estos son altamente desnaturalizantes para las proteínas. Los detergentes no iónicos tienen unas propiedades desnaturalizantes de proteínas más débiles. Este hecho se cumple también en los detergentes zwitteriónicos, tales como CHAPS o sulfobetaína 14. Los compuestos zwitteriónicos, conocidos también como zwitteriones, sales inertes o iones dipolares son compuestos neutros que presentan unidades formales de cargas eléctricas de signos opuestos.

Por lo tanto, se prefiere que el tampón de lisis de la fase (a) contiene un detergente. Es más preferido que el tampón de lisis de la fase (a) contenga un detergente aniónico, catiónico, zwitteriónico o detergente no iónico. Es más preferido aún que el detergente en el tampón de lisis de la fase (a) se seleccione del grupo formado por dodecilsulfato sódico, dodecilsulfato de litio, bromuro de cetiltrimetilamonio, ácido desoxicólico, lauril-sarcosina sódica, Triton-X100, Tween 20, octil beta-D-glucósido, Nonidet P40, CHAPS o sulfobetaína 14. Sin embargo, pueden utilizarse otros detergentes. Generalmente, al utilizar la combinación de un agente caotrópico, un detergente y una proteasa para lisar una muestra biológica, los expertos en la materia escogerán el detergente y su concentración en la mezcla de la fase (b) basándose en que la actividad proteolítica se preserve.

Preferiblemente, la fase sólida comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo formado por el gel de sílice, las fibras de vidrio, fibras de cuarzo, y zeolitas. Se prefiere también, que la fase sólida esté constituida por un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo formado por los óxidos metálicos y/o óxidos metálico mezclados, alúmina, dióxido de titanio, dióxido de circonio y materiales formados predominantemente por vidrio. Se prefiere también que la fase sólida comprenda un sustrato mineral con un tamaño de partícula de 0,1 \mum a 1,000 \mum. Se prefiere también que la fase sólida comprenda un soporte mineral de material poroso con un tamaño de poro que oscila entre 2 nm y 1,000 nm. Se prefiere más que los materiales de soporte poroso o no poroso, especialmente las zeolitas, estén en forma de paquetes sueltos. Se prefiere aún más que la fase sólida consista en láminas de filtro en forma de vidrio, cuarzo o láminas de filtro de cerámica, y/o una membrana que contenga gel de sílice y/o partículas o fibras de soportes minerales y estructuras de cuarzo o lana de vidrio. Se prefiere también que la fase sólida comprenda partículas atraíbles magnéticamente. Se prefiere más que las partículas atraíbles magnéticamente estén recubiertas con una sustrato mineral seleccionado del grupo constituido por el gel de sílice, vidrio, cuarzo, y zeolitas. Se prefiere incluso más que el sustrato comprenda partículas de vidrio
magnetizadas.

Otra modalidad de la invención es un método para aislar un ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende las fases de (a) proveer un tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico; (b) mezclado del tampón de lisis con la muestra biológica, en el que la concentración de agente caotrópico en la mezcla oscila entre 1 M y 4 M, e incubación de la mezcla; (c) disolución de una cantidad adicional de agente caotrópico en/o añadiendo una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional a la mezcla de la fase (b), de tal modo que aumenta la concentración de agente caotrópico en la mezcla en más de 0,5 M; (d) proporcionar una fase sólida y poner en contacto la mezcla de la etapa (c) con la fase sólida, de tal modo que la fase sólida adsorbe el ácido nucleico presente en la mezcla.; (e) separación de la fase sólida y la fase líquida; (f) lavado opcional de la fase sólida con un tampón de lavado; (g) elución del ácido nucleico de la fase sólida aislando de este modo el ácido nucleico; (h) opcionalmente, precipitación del ácido nucleico de la fase (g) del eluido y aislar el ácido nucleico precipitado.

Se prefiere que la fase sólida comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo formado por el gel de sílice, las fibras de vidrio, fibras de cuarzo, y zeolitas. Se prefiere también, que la fase sólida esté constituida por partículas de vidrio magnéticas.

Se prefiere mucho más que el agente caotrópico sea una sal caotrópica. Se prefiere más que el agente caotrópico se seleccione del grupo formado por el clorhidrato de guanidina, el tiocianato de guanidina, el isotiocianato de guanidina, los yoduros alcalinos y los percloratos alcalinos

Se prefiere también que el tampón de lisis de la fase (a) contenga una enzima con actividad proteolítica y un detergente. Se prefiere mucho más que el tampón de lisis de la fase (a) contenga una enzima con actividad proteolítica. Se prefiere más que la enzima con actividad proteolítica se seleccione de las proteasas comprendidas en la EC 3.4-3.11. Se prefiere aún más que la enzima con actividad proteolítica se seleccione del grupo formado por la caspasa, la proteinasa K, la pronasa E, la proteasa procedente de Bacillus sp (esperasa) y la subtilisina. Se prefiere también una mezcla de al menos dos proteasas diferentes como se describe en EC 3.4-3.11. Se prefiere también mucho más que el tampón de lisis de la fase (a) contenga un detergente aniónico, catiónico, zwitteriónico o no iónico. Se prefiere aún más que el detergente en el tampón de lisis de la fase (a) se seleccione del grupo formado por el dodecilsulfato sódico, el dodecilsulfato de litio, el bromuro de cetiltrimetilamonio, el ácido desoxicólico, el lauril-sarcosina sódica, Triton-X100, Tween 20, Octil beta-D-glucósido, Nonidet P40, CHAPS o sulfobetaína 14.

Se prefiere que el valor de pH de la mezcla de la fase (b) oscile entre 8,5 y 4. Se prefiere más que el valor de pH de la mezcla de la fase (b) oscile entre 7,5 y 5. Se prefiere aún más que el valor de pH de la mezcla de la fase (b) oscile entre 7 y 6. Se prefiere aún más que el valor del pH de la mezcla de la fase (b) sea 6 aproximadamente.

Se prefiere mucho más que la mezcla de la fase (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de guanidina en una concentración que oscile entre 1,5 M y 3 M, sal de Tris en una concentración que oscile entre 20 mM y 40 mM, Triton-X100 en una concentración que oscile entre el 5% y el 20% en volumen por volumen, y proteinasa K, en la que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla oscila entre 1 U/ml y 5 U/ml, y por lo que el pH de la mezcla oscila entre 8,5 y 6,0. A este respecto se entiende que la actividad de la proteinasa K se determina como se describe en el Ejemplo 1.

Se prefiere sumamente que la mezcla de la fase (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de guanidina en una concentración que oscile entre 1,5 M y 2,5 M, sal de Tris en una concentración que oscile entre 20 mM y 30 mM, Triton-X100 en una concentración que oscile entre el 5% y el 15% en volumen por volumen, y proteinasa K, en la que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla oscila entre 2 U/ml y 4 U/ml, y por lo que el pH de la mezcla oscila entre 8,5 y 6,0.

Se prefiere sumamente la mezcla de la fase (b) contenga la muestra biológica, tiocianato de guanidina en una concentración de 2 M aproximadamente, sal de Tris en una concentración de 25 mM aproximadamente, Triton-X100 en una concentración del 10% aproximadamente en volumen por volumen, y proteinasa K, en la que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla es de 3 U/ml aproximadamente, y por lo que el pH de la mezcla es aproximadamente 6,0. Se prefiere más aún un pH igual a 6. Un ejemplo de esto es la mezcla de lisis (es decir la mezcla de según la fase (b)) utilizada en el Experimento 4 del Ejemplo 2.

Se prefiere también sumamente que la mezcla de la fase (b) contenga la muestra biológica, clorhidrato de guanidina en una concentración de 2,7 M aproximadamente, urea en una concentración de 5 mM aproximadamente, sal de Tris en una concentración de 5 mM aproximadamente, Triton-X100 en una concentración de 9% volumen por volumen aproximadamente, y proteinasa K, en la que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla sea 3 U/ml aproximadamente, y por lo que el pH de la mezcla oscila entre 4,4 y 6,5.

Se prefiere también sumamente que la mezcla de la fase (b) contenga la muestra biológica, clorhidrato de guanidina en una concentración de 2,4 M aproximadamente, urea en una concentración de 1,6 mM aproximadamente, sal de Tris en una concentración de 85 mM aproximadamente, EDTA en una concentración de 88 mM aproximadamente, NaCl en una concentración de 8 mM aproximadamente, Triton-X100 en una concentración de 9% volumen por volumen aproximadamente, y proteinasa K, en la que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla sea 3 U/ml aproximadamente, y por lo que el pH de la mezcla oscila entre 4,4 y 6,5.

Se prefiere además que la mezcla de la fase (b) que incluye una proteasa se incube durante un tiempo a temperatura ambiente que permita la actividad proteolítica. Se prefiere que la mezcla de la fase (b) se incube entre 10 min y 30 min a una temperatura que oscila entre 20ºC y 75ºC, y la mezcla se agita. La agitación preferida se refiere a la que se realiza en un agitador rotatorio o agitador térmico. Los términos "agitación" y "agitar" se entienden como el movimiento del test de ensayo que contiene la mezcla de la fase (b) invirtiéndolo una vez por segundo. Los términos incluyen también los movimientos que tengan un efecto equivalente para causar una turbulencia en la mezcla de la fase (b). El grado de agitación puede verse influido por el tamaño del ácido nucleico(s) que se aísla. Un exceso de agitación puede resultar en una restricción del tamaño de las moléculas de ácido nucleico en la mezcla debido a la creación de fuerzas de cizallamiento. Por lo tanto, los expertos seleccionarán posiblemente una agitación más lenta.

Se prefiere más que la mezcla de la fase (b) sea incubada durante 30 min a temperatura ambiente, y la mezcla se agite utilizando un agitador rotatorio. Se prefiere aún más que la mezcla de la fase (b) se incube de 10 a 20 min aproximadamente a una temperatura que oscile entre 50ºC y 75ºC, y la mezcla se agite usando un agitador térmico. Se prefiere aún más que la mezcla de la fase (b) se incube de 10 min a 20 min a 56ºC aproximadamente, y la mezcla se agite con un agitador rotatorio o un agitador térmico. Se prefiere aún más que la mezcla de la fase (b) se incube durante 15 min a 56ºC, y la mezcla se agite utilizando un mezclador de rodillo o un agitador térmico. Se prefiere también mucho más que la mezcla de la fase (b) se incube de 10 min a 20 min a 72ºC aproximadamente, y la mezcla se agite con un agitador rotatorio o un agitador térmico. Se prefiere aún más que la mezcla de la fase (b) se incube durante 10 min a 72ºC, y la mezcla se agite con un agitador rotatorio o un agitador térmico.

Después de la adsorción en la fase sólida del ácido nucleico(s) de la mezcla de la fase (c), el ácido nucleico(s) unido se separa de la fase líquida. Generalmente, esto puede conseguirse mediante la fuerza de gravedad o en el caso de ácidos nucleicos unidos a partículas de vidrio magnetizadas mediante la separación del material unido a las partículas magnéticas aplicando un campo magnético. Por ejemplo, las partículas magnéticas pueden ser atraídas a la pared del recipiente en el que se practica la incubación. El líquido que alberga el contenido de la muestra que no se haya unido a las partículas magnéticas puede eliminarse. El proceso de eliminación utilizado depende del tipo de recipiente en el que se realice la incubación. El pipeteado o aspiración son fases adecuadas para eliminar el
líquido.

En el caso de que la fase sólida sea un filtro (como un filtro que contenga fibras de cuarzo o vidrio) la mezcla de la fase (c) se pasa a través del filtro preferiblemente. La separación de la fase líquida y la fase sólida se efectúa mediante atracción gravitatoria, mediante la aplicación de presión o succión.

La fase sólida con el DNA o el RNA unido puede lavarse. Esta fase es opcional, dependiendo de la naturaleza y la cantidad de material no deseado en la muestra biológica, así como de la pureza deseada del ácido nucleico que se aísle. Si se desea una fase de lavado, se prefiere que la fase sólida se lave al menos una vez, por ejemplo con una mezcla de 1-90% en volumen por volumen de un alcohol como el alcohol isopropílico o el etanol. Ejemplos de soluciones de lavado son el "tampón de eliminación de inhibidores" y el "tampón de lavado" descrito en el Ejemplo 2 (A). Generalmente, una solución de lavado se utiliza y no causa la liberación del ácido nucleico(s) de la superficie de la fase sólida, pero arrastra los contaminantes no deseados tan a fondo como sea posible. Esta fase de lavado tiene lugar preferiblemente mediante incubación del material con el acido nucleico(s) unido con la solución de lavado. La fase sólida preferiblemente se resuspende durante esta fase. En el caso de que la fase sólida sea un filtro se prefiere que la solución de lavado pase a través del filtro. La solución de lavado contaminada se retira preferiblemente como en la fase descrita más arriba para la unión de los ácidos nucleicos. Se prefiere aún más realizar dos fases de lavado consecutivas, de manera que el primer lavado se realiza utilizando tampón de eliminación de inhibidores y la segunda fase de lavado se lleva a cabo con un tampón de lavado. Un tampón de eliminación de inhibidores se caracteriza porque contiene un agente caotrópico. El lavado con tampón de eliminación de inhibidores elimina substancias tóxicas o inhibidores que pueden interferir con las reacciones enzimáticas, como por ejemplo, reacciones en las que actúan las enzimas de restricción o las polimerasas. El lavado con un tampón de lavado retira agentes caotrópicos residuales de los ácidos nucleicos unidos. Después de la última fase de lavado, el material puede secarse brevemente al vacío, o el fluido puede dejarse evaporar al aire. Puede realizarse también un tratamiento previo con
acetona.

Posteriormente, las condiciones pueden invertirse, por ejemplo, la concentración de sales se reduce para la elución del DNA o el RNA unido al material. Los tampones de elución se conocen a partir de DE 37 24 442 y Jakobi, R., et al., Anal. Biochem. 175 (1988) 196-201. Los tampones de elución con un contenido de sal bajo, son en concreto tampones con un contenido inferior a 0,2 M. Preferiblemente, el tampón de elución contiene la substancia Tris con esta finalidad. Se prefiere mucho más que el tampón de elución sea una solución acuosa que contenga una sal de Tris, siendo 50 mM la concentración de sal de Tris. Se prefiere más una solución acuosa que contenga una sal de Tris, siendo 50 mM la concentración de la sal de Tris con un pH que oscila entre 6,5 y 8,5. Se prefiere aún más un pH de 7,5. El tampón de elución también se prefiere en aguas desmineralizadas. La solución que contiene DNA o RNA purificado puede utilizarse para otras reacciones. Opcionalmente, el ácido nucleico(s) puede precipitarse a partir de la solución utilizando, por ejemplo, etanol o isopropanol. El precipitado puede someterse a más fases de lavado. Los expertos en la material son conocedores de este tipo de métodos y están descritos en detalle en Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, CSHL Press,
2001.

El ácido nucleico(s) diana puede detectarse y determinarse. El método de purificación descrito más arriba es el preferido seguido de una fase de determinación o detección, o métodos de purificación seguidos de una amplificación y determinación o fase de detección. El ácido nucleico diana o los ácidos nucleicos de interés pueden hallarse en una matriz de ácidos nucleicos que no son diana, e incluso puede que se trate de un componente minoritario de dicha mezcla de ácido nucleicos específicos. Los expertos en la material son conocedores de métodos adecuados para la detección del DNA y se encuentran descritos en libros de texto estándar como Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, CSHL Press, 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley y Sons, NY, 1987.

Pueden realizarse también otras fases de purificación previamente a la fase de detección del DNA, como por ejemplo, una fase de precipitación. Los métodos de detección, aunque no están limitados solo a éstos, incluyen la unión o intercalado de colorantes específicos como el bromuro de etidio que se intercala en las cadenas de DNA bicatenario cambiando de este modo su fluorescencia. El DNA purificado puede separarse también mediante métodos electroforéticos, opcionalmente tras una digestión con enzimas de restricción, y después puede visualizarse. Existen también ensayos basados en sondas que explotan la hibridación de oligonucleótidos a secuencias específicas y la detección posterior del híbrido. Los expertos en la materia conocen la posibilidad de secuenciar el DNA después de varias fases. Otros métodos aplican una diversidad de secuencias de DNA a un chip de silicio al que se han unido sondas específicas y que genera una señal al unirse a secuencias complementarias.

La invención engloba también la mezcla de componentes de naturaleza proteica o de naturaleza no proteica que comprenden ácidos nucleicos y los ácido nucleicos comprenden el DNA o el RNA o ambos.

La invención también hace referencia a muestras biológicas, de las cuales se purifican los ácidos nucleicos, y comprenden los virus o células bacterianas, así como células aisladas de organismos multicelulares, como por ejemplo, las células humanas y animales como los leucocitos, y compuestos químicos inmunológicamente activos de bajo y alto peso molecular, tales como, los haptenos, los antígenos, los anticuerpos y los ácidos nucleicos, el plasma sanguíneo, el líquido cefalorraquídeo, el esputo, las heces, las muestras de biopsia, la médula espinal, un enjuagado bucal, el suero sanguíneo, los tejidos, la orina o las mezclas de éstos. La presente invención también engloba muestras biológicas como los fluidos del cuerpo humano o animal; preferiblemente la muestra biológica es la sangre, el plasma sanguíneo, el suero sanguíneo o la orina. La muestra de sangre preferiblemente será sangre en EDTA, sangre en heparina o sangre en citrato. El plasma sanguíneo se recoge preferiblemente en EDTA, en heparina o en citrato. En una modalidad de la invención la muestra biológica comprende las células bacterianas, células eucarióticas, virus o mezclas de
éstos.

Se prefiere también que la mezcla de los ácidos nucleicos y material de naturaleza proteica conste del ácido desoxirribonucleico (DNA) o del ácido ribonucleico (RNA) o de ambos, preferiblemente el DNA o el RNA o ambos derivan de un virus o un microorganismo (al menos uno). El virus puede ser el virus de la hepatitis A (VHA), el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (VPH) o el parvovirus B19.

Se prefiere también que el componente de ácido nucleico diana y los demás ácidos nucleicos se purifiquen básicamente como se describe más arriba. Entonces, el componente de ácido nucleico diana continua con el proceso de manipulación y detección, es decir, se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa que amplifica específicamente secuencias diana hasta obtener cantidades detectables. Otras reacciones de amplificación posibles son la Reacción en cadena de la ligasa (LCR; Wu, D.Y. y Wallace, R.B., Genomics 4 (1989) 560-569, y Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 189-193); Reacción en cadena de la polimerasa-ligasa (Barany, F., PCR Methods and Applic. 1 (1991) 5-16); Gap-LCR (WO 90/01069); RCR (EP 0 439 182), 3SR (Kwoh, D.Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 1173-1177; Guatelli, J.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874-1878; WO 92/08800) y NASBA (US 5,130,238). Además, existe la amplificación de desplazamiento de la cadena (SDA), amplificación mediada por la transcripción (TMA), y la Q-beta-amplificación (para revisión véase, por ejemplo, Whelen, A.C., y Persing, D.H., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996) 349-373; Abramson, R.D., y Myers, T.W., Curr. Opin. Biotechnol. 4 (1993) 41-47). Particularmente preferido es el método de detección TaqMan® presentado en la WO 92/02638 y las correspondientes patentes US 5 210 015; US 5 804 375; US 5 487 972. Este método utiliza la actividad exonucleasa de una polimerasa para generar una señal. Detalladamente, el componente de ácido nucleico diana se detecta mediante un proceso que consta de las siguientes fases: puesta en contacto de la muestra con un oligonucleótido que contiene una secuencia complementaria a una región del componente de ácido nucleico diana y un oligonucleótido marcado que contiene una secuencia complementaria a una segunda región de secuencia de cadena del mismo componente de ácido nucleico diana, pero que no incluye la secuencia de ácido nucleico definida mediante el primer oligonucleótido, para crear una mezcla de cadenas dobles durante las condiciones de hibridación, en donde las cadenas dobles están formados por el ácido nucleico diana anidado con el primer oligonucleótido y al oligonucleótido marcado, de tal modo que el extremo 3' del primer oligonucleótido es adyacente al extremo 5' del oligonucleótido marcado. Esta mezcla entonces se trata con una polimerasa de ácido nucleico dependiente del molde que posee una actividad nucleasa 5' a 3' en condiciones suficientes para permitir que la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa escinda el oligonucleótido anidado marcado y libere los fragmentos marcados. La señal generada por la hidrólisis del oligonucleótido marcado se detecta y/o se determina. La tecnología TaqMan® elimina la necesidad de la formación de la reacción del complejo de unión de la fase sólida y su detección. En términos más generales, se presenta un procedimiento para la purificación de un componente de ácido nucleico diana seguido de una fase de detección, en el que la amplificación y/o la reacción de detección reacción es una fase de solución homogénea.

Los siguientes ejemplos, referencias y datos numéricos se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se establece más adelante en las reivindicaciones adjuntas. Se entiende que pueden realizarse modificaciones en los procedimientos que se muestran más adelante sin desviarse del sentido de la invención.

Descripción de las Figuras

Figura 1 Actividad de la proteinasa K en el t = 0 min en relación con concentraciones variables de tiocianato de guanidina (valores de 0 min). El eje de abscisas (x) indica la concentración molar de tiocianato de guanidina y el eje de ordenadas (y) indica la actividad de la proteinasa K en [%].

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Figura 2 Actividad de la proteinasa K en el t = 15 min en relación con concentraciones variables de tiocianato de guanidina (valores de 15 min). El eje de abscisas (x) indica la concentración molar de tiocianato de guanidina y el eje de ordenadas (y) indica la actividad de la proteinasa K en [%].

Figura 3 Producción de DNA en \mug por ml de sangre, de acuerdo con el Ejemplo 2 y la Tabla 3. El eje de abscisas indica la producción de DNA en \mug por ml de sangre. También se indican las desviaciones estándar.

Figura 4 Producción de DNA en \mug por ml de sangre, de acuerdo con el Ejemplo 3 y la Tabla 5. El eje de abscisas indica el experimento respectivo, el eje de ordenadas indica la producción de DNA en \mug por ml de sangre. También se indican las desviaciones estándar.

Figura 5 Producción de DNA en \mug por ml de sangre, de acuerdo con el Ejemplo 4 y la Tabla 7. El eje de abscisas indica el experimento respectivo, el eje de ordenadas indica la producción de DNA en \mug por ml de sangre. También se indican las desviaciones estándar.

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Ejemplo 1

(A) Incubación de la proteinasa K en presencia de un agente caotrópico

Se mezclaron 10 \mul de una solución madre a 20 mg/ml de proteinasa K (Roche Diagnostics GmbH, Mannheimm, núm. de catálogo. 745723; 90 mg disueltos en 4,5 ml de agua con un tampón caotrópico que contenía Tris-HCl 50 mM pH 6,0, DTT al 1%, Triton-X100 al 20% y tiocianato de guanidina x M (x = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6). Directamente después de este paso, la actividad de la proteinasa K se midió en una primera alícuota (10 \mul) de la mezcla empleando el ensayo descrito a continuación (valor de actividad a los 0 min). Transcurridos 15 min después del mezclado se midió la actividad de la proteinasa K en una segunda alícuota (10 \mul) de la mezcla siguiendo también el método que se describe seguidamente (valor de actividad a los 15 min).

(B) Ensayo de determinación de la actividad de la proteinasa K

Se mezclaron 10 \mul de la proteinasa K en tampón caotrópico (véase el paso anterior, (A)) con tampón de ensayo, es decir: 980 \mul de Trietanolamina 0,2 M, PEG 6000 0,05% (peso por volumen), cloruro de calcio 0,1 M y 10 \mul de una solución sustrato 200 mM. El sustrato era Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilida. El tampón de ensayo se proporcionó en una cubeta. Inmediatamente después del mezclado se colocó la cubeta en un fotómetro.

Se realizaron mediciones (absorción) durante 15 min a 25ºC. La actividad de proteinasa K en el tampón de ensayo se calculó mediante la cinética indicada por un cambio en la absorción a 405 nm.

La Tabla 1 contiene los valores de la actividad de la proteinasa K a los 0 min en presencia de tiocianato de guanidina a diferentes concentraciones dadas en (A). La Tabla 2 es un listado de los valores de la actividad de la proteinasa K a los 15 min en presencia de tiocianato de guanidina a diferentes concentraciones dadas en (A) así como el valor control (sin presencia de agente caotrópico). Los valores se expresan en relación con el valor de actividad a los 0 min de proteinasa K en el tampón control carente de agente caotrópico (véase (A)), que corresponde a 0,5 U/ml; este valor se estableció como el 100%. Los datos de las Tablas 1 y 2 están representados gráficamente en las Figuras 1 y 2.

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TABLA 1

1

2

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TABLA 2

3

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Ejemplo 2

(A) Reactivos

a) Solución madre de proteinasa K: proteinasa K recombinante, PCR Grade, 50 U/ml

b) Tampón de lisis: tiocianato de guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0

c) Tampón de unión: tiocianato de guanidina 4 M, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0

d) Tampón de eliminación de inhibidor: clorhidrato de guanidina 5 M, Tris-HCl 20 mM, etanol 38%, pH 6,6

e) Tampón de lavado: NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol 80%, pH 7,5

f) Tampón de elución: Tris-HCl 50 mM, pH 8,2

g) Etanol (100%)

Necesarios adicionalmente: columnas de centrifugado (spin columns) comerciales que contienen membrana de sílice, p. ej. NucleoSpin Blood L, distribuido por Machery & Nagel.

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(B) Experimento 1: procedimiento en un paso sin tratamiento de proteinasa K

1. Pipetear 1.000 \mul de sangre en EDTA en un tubo Falcon de 15 ml

2. Añadir 1.000 \mul de tampón de lisis, agitar suavemente con un vórtex

3. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en un agitador rotatorio, agitar

4. Colocar una columna de centrifugado en un tubo Falcon nuevo

5. Transferir la mezcla de los pasos 1.-2. (unos 2.000 \mul) a la columna de centrifugado

6. Centrifugar durante 3 min a 1.900 x g.

7. Añadir 1.000 \mul Tampón de eliminación de inhibidor

8. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

9. Añadir 2.000 \mul de Tampón de lavado

10. Centrifugar durante 10 min a 4.500 x g.

11. Descartar la fase móvil y colocar una columna con filtro en un tubo Falcon nuevo

12. Eluir con 300 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC)

13. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente

14. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

15. Medición de la absorbancia (DO) del eluato a 260, 280 y 320 nm

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(C) Experimento 2: procedimiento en un paso con tratamiento de proteinasa K

1. Pipetear 125 \mul de proteinasa K en un tubo Falcon de 15 ml

2. Añadir 1.000 \mul de sangre en EDTA, agitar suavemente en vórtex

3. Añadir 1.000 \mul de tampón de lisis, agitar suavemente en vórtex

4. Incubar y agitar a 56ºC durante 15 min (p. ej. utilizando un agitador térmico)

5. Colocar una columna de centrifugado en un tubo Falcon nuevo

6. Transferir la mezcla de los pasos 1.-3. (unos 2.125 \mul) a la columna de centrifugado

7. Centrifugar durante 3 min a 1.900 x g

8. Añadir 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor

9. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g

10. Añadir 2.000 \mul de tampón de lavado

11. Centrifugar durante 10 min a 4.500 x g.

12. Descartar la fase móvil y colocar una columna con filtro en un tubo Falcon nuevo

13. Eluir con 300 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC)

14. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente

15. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

16. Medición de la absorbancia (DO) del eluato a 260, 280 y 320 nm

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(D) Experimento 3: procedimiento en dos pasos con etanol

1. Pipetear 125 \mul de proteinasa K en un tubo Falcon de 15 ml

2. Añadir 1.000 \mul de sangre en EDTA, agitar suavemente en vórtex

3. Añadir 1.000 \mul de tampón de lisis, agitar suavemente en vórtex

4. Incubar y agitar a 56ºC durante 15 min (p. ej. empleando una agitador térmico), agitar

5. Añadir 1.000 \mul de etanol, agitar suavemente en vórtex

6. Colocar una columna de centrifugado

7. Transferir la mezcla de los pasos 1.-5. (unos 3.125 \mul) a la columna de centrifugado

8. Centrifugar durante 3 min a 1.900 x g.

9. Añadir 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor

10. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g

11. Añadir 2.000 \mul Tampón de lavado

12. Centrifugar durante 10 min a 4.500 x g

13. Descartar la fase móvil y colocar una columna con filtro en un tubo Falcon nuevo

14. Eluir con 300 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC)

15. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente

16. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

17. Medición de la absorbancia (DO) del eluato a 260, 280 y 320 nm

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(E) Experimento 4: procedimiento en dos pasos con tampón de unión

1. Pipetear 125 \mul de proteinasa K en un tubo Falcon de 15 ml

2. Añadir 1.000 \mul de sangre en EDTA, agitar suavemente en vórtex

3. Añadir 1.000 \mul de tampón de lisis, agitar suavemente en vórtex

4. Incubar y agitar a 56ºC durante 15 min (p. ej. empleando un agitador térmico)

5. Añadir 1.000 \mul de tampón de unión, agitar suavemente en vórtex

6. Colocar una columna de centrifugado en un tubo Falcon nuevo

8. Centrifugar durante 3 min a 1.900 x g

9. Añadir 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor

10. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

11. Añadir 2.000 \mul de tampón de lavado

12. Centrifugar durante 10 min a 4.500 x g.

14. Eluir con 300 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC)

15. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente

16. Centrifugar durante 2 min a 4.500 x g.

17. Medición de la absorbancia (DO) del eluato a 260, 280 y 320 nm

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TABLA 3

4

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TABLA 4

5

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En relación con la pureza del DNA, una proporción (con la corrección de 320 nm incluida) de 1,8 \pm 0,1 se considera aceptable. Los datos muestran que el método de acuerdo con la invención, es decir, el método del experimento 4, produce una pureza equivalente (si no superior) que el método del experimento 3.

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Ejemplo 3

(A) Reactivos

a) Tampón de lisis/tampón de unión, caotrópico (tiocianato de guanidina [tampón de lisis] 7 M/[tampón de unión] 4 M, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0)

b) Tampón de eliminación de inhibidor (guanidinio HCl 5 M, Tris-HCl 20 mM, etanol 38%, pH 6,6)

c) Tampón de lavado (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol 80%, pH 7,5)

d) tampón de elución (Tris 50 mM, pH 8,1)

e) etanol (absoluto)

Necesario adicionalmente: columnas de filtro de fibra de vidrio con membrana de sílice, p. ej. NucleoSpin Blood L, comercializado por Macherey-Nagel)

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(B) Experimento 5, procedimiento en un paso: Tampón de lisis: 7 M, sin tampón de unión

Se pipetearon 1.000 \mul de sangre en EDTA en un tubo Falcon de 15 ml, se añadieron 1.000 \mul de tampón de lisis (7 M) y se agitó el tubo en un vórtex. La mezcla se incubó durante 15 min a 56ºC en un agitador térmico. Seguidamente se transfirió la preparación completa de la muestra (unos 2.000 \mul; concentración de agente caotrópico 3,5 M) a un tubo Falcon nuevo con una columna de filtro de fibra de vidrio. Tras la centrifugación a 1.900 x g durante 3 min, se transfirieron 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor a la columna, seguido de otro paso de centrifugación a 4.200 x g durante 2 min. A continuación, se transfirieron 2.000 \mul de tampón de lavado a la columna, seguido de centrifugación a 4.200 x g durante 10 min. Se descartó la fase móvil y la columna con filtro se colocó en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos unidos se eluyeron empleando 500 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC). El tampón de elución se transfirió a la columna y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Tras la centrifugación a 4.200 x g durante 2 min se analizó la fase móvil por medición de la absorbancia a 230, 260, 280 y
320 nm.

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(C) Experimento 6, procedimiento en dos pasos: Tampón de lisis: 7 M, Tampón de unión: 4 M

Se pipetearon 1.000 \mul de sangre en EDTA en un tubo Falcon de 15 ml, se añadieron 1,000 \mul de tampón de lisis (7 M) y se agitó el tubo en un vórtex. La mezcla se incubó durante 15 min a 56ºC en un agitador térmico. Se añadieron 500 \mul de tampón de unión (4 M) mezclado en vórtex. Seguidamente se transfirió la preparación completa de la muestra (unos 2.500 \mul; concentración de agente caotrópico 4,5 M) a un tubo Falcon nuevo con una columna de filtro de fibra de vidrio. Tras la centrifugación a 1.900 x g durante 3 min, se transfirieron 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor a la columna, seguido de otro paso de centrifugación a 4.200 x g durante 2 min. A continuación, se transfirieron 2.000 \mul de tampón de lavado a la columna, seguido de centrifugación a 4.200 x g durante 10 min. Se descartó la fase móvil y la columna con filtro se colocó en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos unidos se eluyeron empleando 500 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC). El tampón de elución se transfirió a la columna y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Tras la centrifugación a 4.200 x g durante 2 min se analizó la fase móvil por medición de la absorbancia a 230, 260, 280 y 320 nm.

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TABLA 5

6

TABLA 6

7

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Ejemplo 4

(A) Reactivos

a) Tampón de lisis/tampón de unión, caotrópico (tiocianato de guanidina [tampón de lisis] 7 M/[tampón de lisis] 5 M/[tampón de unión] 4 M, Tris-HCl 50 mM, Triton-X100 20%, pH 6,0)

c) tampón de lavado (NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, etanol 80%, pH 7,5)

d) tampón de elución (Tris 50 mM, pH 8,1)

e) etanol (absoluto)

Necesario adicionalmente: columnas de filtro de fibra de vidrio (con membrana de sílice, p. ej. NucleoSpin Blood L, comercializado por Macherey-Nagel)

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(B) Experimento 7, procedimiento en un paso: Tampón de lisis: 7 M, sin tampón de unión

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(C) Experimento 8, procedimiento en dos pasos: Tampón de lisis: 5 M, Tampón de unión: 4 M

Se pipetearon 1.000 \mul de sangre en EDTA en un tubo Falcon de 15 ml, se añadieron 1,000 \mul de tampón de lisis (5 M) y se agitó el tubo en un vórtex. La mezcla se incubó durante 15 min a 56ºC en un agitador térmico. Se añadieron 500 \mul de tampón de unión (4 M) mezclado en vórtex. Seguidamente se transfirió la preparación completa de la muestra (unos 2.500 \mul; concentración de agente caotrópico 3,5 M) a un tubo Falcon nuevo con una columna de filtro de fibra de vidrio. Tras la centrifugación a 1.900 x g durante 3 min, se transfirieron 1.000 \mul de tampón de eliminación de inhibidor a la columna, seguido de otro paso de centrifugación a 4.200 x g durante 2 min. A continuación, se transfirieron 2.000 \mul de tampón de lavado a la columna, seguido de centrifugación a 4.200 x g durante 10 min. Se descartó la fase móvil y la columna con filtro se colocó en un nuevo tubo Falcon. Los ácidos nucleicos unidos se eluyeron empleando 500 \mul de tampón de elución precalentado (70ºC). El tampón de elución se transfirió a la columna y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Tras la centrifugación a 4.200 x g durante 2 min se analizó la fase móvil por medición de la absorbancia a 230, 260, 280 y 320 nm.

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TABLA 7

8

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TABLA 8

9

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Lista de referencias

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Claims

1. Un método para la adsorción de un ácido nucleico de una muestra biológica en una fase sólida, que comprende los siguientes pasos:

(a) proveerse de un tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico;

(b) mezclar el tampón de lisis con la muestra biológica, de modo que la concentración del agente caotrópico en la mezcla se encuentre entre 1 M y 4 M, e incubar la mezcla;

(c) disolver una cantidad adicional de agente caotrópico en la mezcla del paso (b) o añadir a esta una solución acuosa que contenga agente caotrópico adicional, de modo que se incremente la concentración del agente caotrópico en la mezcla en más de 0,5 M;

(d) poner en contacto la mezcla del paso (c) con la fase sólida, de manera que se adsorba a la fase sólida el ácido nucleico contenido en la mezcla.

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el agente caotrópico se selecciona del grupo formado por clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, un yoduro alcalino y un perclorato alcalino.

3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el tampón de lisis del paso (a) contiene una enzima con actividad proteolítica.

4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la enzima con actividad proteolítica se selecciona del grupo formado por: caspasa, proteinasa K, pronasa E, proteasa de Bacillus sp (esperasa) y subtilisina.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque el tampón de lisis del paso (a) contiene un detergente.

6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque el detergente del tampón de lisis del paso (a) se selecciona del grupo formado por dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio, bromuro de cetiltrimetilamonio, ácido desoxicólico, lauril sarcosina sódica, Triton-X100, Tween 20, Octil beta-D-glucósido, Nonidet P40, CHAPS o Sulfobetaína 14.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque la fase sólida comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo formado por gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo y zeolitas.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6, caracterizado porque la fase sólida comprende partículas de vidrio magnéticas.

9. Un método para aislar un ácido nucleico de una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:

(a) proveerse de un tampón de lisis acuoso que contenga un agente caotrópico;

(d) disponer de una fase sólida y poner en contacto la mezcla del paso (c) con la fase sólida, de manera que se adsorba a la fase sólida el ácido nucleico contenido en la mezcla.

(e) separar la fase sólida de la fase líquida;

(f) lavar de forma opcional la fase sólida del paso (e) con un tampón de lavado;

(g) eluir el ácido nucleico de la fase sólida para así aislarlo;

(h) precipitar opcionalmente el ácido nucleico del paso (g) a partir del eluato y aislar el ácido nucleico precipitado.

10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el agente caotrópico se selecciona del grupo formado por clorhidrato de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, un yoduro alcalino y un perclorato alcalino.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque el tampón de lisis del paso (a) contiene una enzima con actividad proteolítica y un detergente.

12. El método según la reivindicación 11, caracterizado porque la enzima con actividad proteolítica se selecciona del grupo formado por: Caspasa, proteinasa K, Pronasa E, Proteasa de Bacillus sp (Esperasa) y Subtilisina, y el detergente se selecciona del grupo formado por dodecilsulfato sódico, dodecilsulfato de litio, bromuro de cetiltrimetilamonio, ácido desoxicólico, lauril sarcosina sódica, Triton-X100, Tween 20, Octil beta-D-glucósido, Nonidet P40, CHAPS o Sulfobetaína 14.

13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la mezcla del paso (b) contiene la muestra biológica, tiocianato de guanidina a una concentración aproximada de 2 M, sal Tris a una concentración aproximada de 25 mM, Triton-X100 a una concentración aproximada del 10% en volumen por volumen y proteinasa K, de modo que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla sea de unas 3 U/ml y el pH de la mezcla esté alrededor de 6.

14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la mezcla del paso (b) contiene la muestra biológica, clorhidrato de guanidina a una concentración aproximada de 2,7 M, urea a una concentración aproximada de 5 mM, sal Tris a una concentración aproximada de 5 mM, Triton-X100 a una concentración aproximada del 9% en volumen por volumen y proteinasa K, de modo que la actividad proteolítica de la en la mezcla se de unas 3 U/ml y el pH de la mezcla se encuentre entre 4,4 y 6,5.

15. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la mezcla del paso (b) contiene la muestra biológica, clorhidrato de guanidina a una concentración aproximada de 2,4 M, urea a una concentración aproximada de 1,6 mM, sal Tris a una concentración aproximada de 85 mM, EDTA a una concentración aproximada de 88 mM, NaCl a una concentración aproximada de 8 mM, Triton-X100 a una concentración aproximada del 9% en volumen por volumen y proteinasa K, de manera que la actividad proteolítica de la proteinasa K en la mezcla sea de unas 3 U/ml y el pH de la mezcla se encuentre entre 4,4 y 6,5.

16. El método según la reivindicación 13, caracterizado porque la mezcla del paso (b) se incuba durante un periodo de 10 min a 30 min a una temperatura entre unos 20 y unos 75ºC, durante el cual la mezcla es agitada.

17. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 16, caracterizado porque la fase sólida comprende un sustrato mineral poroso o no poroso seleccionado del grupo formado por gel de sílice, fibras de vidrio, fibras de cuarzo y zeolitas.

18. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 16, caracterizado porque la fase sólida comprende partículas de vidrio magnéticas.

19. El método según cualquiera de las reivindicaciones de la 9 a la 18, caracterizado porque la muestra biológica comprende células bacterianas, células eucariotas, virus o mezclas de ellos.