CN117286229B - 一种mhc区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法。该方法结合MHC 区域靶向捕获和PacBio平台的长读长染色质邻近连接测序技术，采用混合酶解的方式：第一步采用蛋白酶K酶解，第二步采用链霉素蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解方案。该方法能够有效促进DNA解交联，减少肽段的残留，进而提高PCR扩增后的产量，改善MHC区域的三维基因组捕获效率，并利用长读长测序优势，实现对MHC区域三维结构的高通量的捕获测序。
Description
技术领域
本发明涉及三维基因组研究领域，特别涉及一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法。
背景技术
主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）基因区域，位于人类6号染色体6p21.3区域，包含了一系列重要的免疫相关基因。在抗原呈递和免疫应答中发挥关键作用。然而MHC基因的精确表达调控机制还不明确，区域内基因间的三维空间组织可能影响其表达调控模式。此外，MHC区域高频率的基因重组也与三维结构相关。因此，解析MHC区域的三维染色质结构，对于理解其功能调控和进化机制意义重大。在临床转化方面，不同个体MHC等位基因多态性和变异会改变其三维基因组结构，可能影响特定药物作用位点的空间访问性，从而导致个体间药效差异。准确解析MHC三维结构，可以指导疾病机制研究和个体化治疗策略的优化。
目前由于技术的限制，对MHC区域的三维基因组结构认知还非常有限。核心的技术困难主要在于，MHC区域存在大量重复序列和高度多态性，传统的捕获Hi-C技术采用二代测序平台，短读长难以溯源。而近年PacBio和Nanopore等第三代测序平台具备更长的读长，结合染色质近邻连接的方法，建立了如MC-4C技术（A. Allahyar, C. Vermeulen, B. A. M.Bouwman, P. H. L. Krijger, Mjam Verstegen, G. Geeven, M. van Kranenburg,M.Pieterse, R. Straver, J. H. I. Haarhuis, K. Jalink, H. Teunissen, I. J.Renkens, W. P. Kloosterman, B. D. Rowland, E. de Wit, J. de Ridder&W. de LaatEnhancer hubs and loop collisions identified from single-alleletopologies.Nat Genet 50, 1151-1160 (2018).）。MC-4C方法在理论上可实现MHC区域的三维结构的靶向捕获测序检测，可是实际上基于CRISPR原理设计的靶向捕获方式成本非常高昂，而且针对重复区域是很难设计特异性强的guide RNA序列，因此现有技术还对MHC区域的三维结构进行高通量检测的。
使用Pacbio测序技术可以获得读长远超过Hi-C 二代测序连接片段的长度（50-150bp），将该技术应用到含有大量重复序列和高度多态性位点的MHC区域的测序片段比对中，能大大降低解析难度。传统高通量染色质构象捕获技术（Hi-C）方法或者是最近基于染色质互作邻近连接发展起来的长读长技术，如Pore-C，在蛋白和DNA解交联步骤中，都使用蛋白酶K进行酶解，仍然会有20-30个氨基酸肽段的残留。在全基因组的Hi-C实验中，由于对全基因组进行扩增测序，片段长度较短而且连接纯化的产物量大，这部分残留尽管会降低扩增效率，最终却并不会对PCR产物有很大影响。但是对于长片段连接捕获区域的产物，DNA片段长度增加意味着会残留更多的蛋白肽段，而且捕获产物往往仅有全基因组产物的万分之一以下，扩增效率往往会对最终产量产生较大影响。
另外，近年来还发展了一种全基因组三维结构的高阶染色质检测技术（Pore-C）（Aditya S. Deshpande, Netha Ulahannan, Matthew Pendleton, Xiaoguang Dai, LynnLy, Julie M. Behr, Stefan Schwenk, Will Liao, Michael A. Augello, CarlyTyer, Priyesh Rughani, Sarah Kudman, Huasong Tian, Hannah G. Otis, EmilyAdney, David Wilkes, Juan Miguel Mosquera, Christopher E. Barbieri, AriMelnick, David Stoddart, Daniel J. Turner, Sissel Juul, Eoghan Harrington &Marcin Imieliński Identifying synergistic high-order 3D chromatinconformations from genome-scale nanopore concatemer sequencing. NatureBiotechnology (2022).），尽管在前期我们尝试过将Pore-C技术结合DNA杂交液相捕获技术，可是也无法有效实现MHC靶向区域的捕获测序。这主要原因是染色质近邻连接的方法需要使用甲醛交联剂固定DNA和蛋白质，保持天然的基因组三维结构，在限制性酶切和邻近DNA片段连接后会通过解交联的反应，去除蛋白质和纯化DNA，但是目前的解交联方法无法完全去除DNA分子上共价结合的蛋白肽段，而蛋白肽段的残留不仅导致了DNA靶向设计探针的结合受阻，也会降低MHC基因区域靶向富集片段的扩增效率。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法。
本发明的另一目的在于提供所述MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，包括如下步骤：
（1）细胞甲醛固定和交联：
将细胞利用甲醛溶液进行交联固定，得到交联固定后的细胞；
（2）细胞裂解和DNA片段连接：
将步骤（1）中得到的交联固定后的细胞经裂解后，收集细胞核颗粒；然后利用限制性内切酶DpnII进行酶切反应，得到酶切产物；再将酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，得到DNA连接产物；
（3）混合酶解：
①在步骤（2）得到的DNA连接产物中加入十二烷基硫酸钠（SDS）溶液和蛋白酶K，然后在56～63℃孵育4～12h使染色质解交联，再加入NaCl溶液淬灭反应；待反应结束后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀后加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到DNA重悬液；
②在步骤①得到的DNA重悬液中加入复合酶溶液，30～37℃孵育4～12h，然后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀，再加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到待测DNA样本；其中，复合酶为链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶；
（4）MHC基因杂交捕获与PCR扩增：
将步骤（3）②中得到的待测DNA样本使用MHC区域靶向探针进行杂交捕获，再进行PCR扩增，得到PCR产物；
（5）Pacbio HiFi CCS文库构建和测序：
将步骤（4）中得到的PCR产物构建SMRTbell文库（PacBio文库）并进行PacBio长片段测序。
步骤（1）中所述的细胞为正常细胞或肿瘤细胞；优选为正常人类B淋巴细胞或人慢性骨髓性白血病细胞；更优选为正常人类B淋巴细胞系GM12878、正常人类B淋巴细胞系GM24385 或人慢性骨髓性白血病细胞系K562。
步骤（1）中所述的细胞甲醛固定和交联采用本领域常规方法进行，优选为通过如下步骤实现：将甲醛溶液加入到细胞悬浮液中，在室温下孵育固定细胞染色质，然后加入甘氨酸溶液终止反应，经室温下再次孵育和冰上孵育后，离心，清洗，得到甲醛交联固定后的细胞。
所述的甲醛溶液的浓度为质量百分比37%。
所述的甲醛的用量为按其在反应体系的终浓度为体积百分比1～3%添加计算。
所述的细胞悬浮液的浓度为0.3×106～1.5×106cell/mL；优选为1.5×106cell/mL。
所述的室温下孵育的时间为8～12分钟；优选为10分钟。
所述的甘氨酸溶液的浓度为2～3 mol/L；优选为2.5mol/L。
所述的甘氨酸溶液的用量为按其在反应体系的终浓度为0.125 mol/L添加计算。
所述的室温下再次孵育的时间为4～6分钟；优选为5 分钟。
所述的冰上孵育的时间为8～12分钟；优选为10分钟。
所述的离心的条件为：4℃、1000g离心5分钟。
所述的清洗为采用PBS缓冲液进行清洗。
步骤（2）中所述的细胞裂解和DNA片段连接优选为通过如下方法实现：
将步骤（1）中交联固定后的细胞用冰Hi-C裂解缓冲液重悬，4℃旋转孵育后离心去上清，清洗，得到细胞核颗粒；然后将细胞核颗粒用十二烷基硫酸钠（SDS）溶液重悬，在50～62℃条件孵育后加入Triton X-100溶液和水淬灭十二烷基硫酸钠；再利用限制性内切酶DpnII进行酶切反应，并将获得的酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，得到DNA连接产物。
所述的Hi-C裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl pH 7.5，10mM NaCl，0.2%（v/v）乙基苯基聚乙二醇（NP-40），1×Roche protease inhibitors（罗氏蛋白酶抑制剂）。
所述的离心的条件为：4℃、1000g离心5分钟。
所述的Hi-C裂解缓冲液的用量为按每3×106cells配比0.8～1.2 mL Hi-C裂解缓冲液计算；优选为按每3×106cells配比1mL Hi-C裂解缓冲液计算。
所述的清洗为采用冰Hi-C裂解缓冲进行清洗。
所述的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液的浓度为质量百分比0.5%。
所述的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为质量百分比0.5%添加计算（如3×106cells约加入50µL 0.5%的SDS）。
所述的孵育的温度优选为62℃。
所述的孵育的时间为8～12分钟；优选为10分钟。
所述的Triton X-100溶液的浓度为体积百分比10%。
所述的Triton X-100溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为体积百分比1～2%添加计算。
所述的淬灭十二烷基硫酸钠的条件为：在37℃下旋转15分钟。
所述的限制性内切酶DpnII的浓度为10 U/µL。
所述的连接所用的反应体系为750µL连接预混反应液（ligation master mix），其组分为：100µL 10×NEB T4 DNA连接酶缓冲液，10mM ATP，75µL 10%（v/v）Triton X-100，3µL 50mg/mL牛血清白蛋白（BSA），10µL 400 U/μL T4 DNA连接酶，562 µL水。
所述的酶切反应的条件为：37 ℃酶切4小时。
所述的T4 DNA连接酶的连接条件为：先在16℃下反应4小时，再在室温下反应1小时。
步骤①中所述的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液的浓度为质量百分比10%。
步骤①中所述的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为质量百分比0.5～1%添加计算。
步骤①中所述的蛋白酶K的用量为按其在孵育体系的终浓度为0.1～1mg/ml添加计算；优选为按其在孵育体系的终浓度为1mg/ml添加计算。
步骤①中所述的染色质解交联的温度优选为63℃。
步骤①中所述的染色质解交联的时间优选为4小时。
步骤①中所述的NaCl溶液的浓度优选为5mol/L。
步骤①中所述的NaCl溶液的加入量为占孵育体系体积的5～10%。
步骤①中所述的淬灭反应的条件为：在68℃下孵育2小时。
步骤①和②中所述的混合溶剂中的苯酚、氯仿和异戊的体积比25：24：1。
步骤①和②中所述的GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇的体积比为1:100:850。
步骤①和②中所述的醋酸钠溶液的浓度为3mol/L（pH 5.2）。
步骤①中所述的在-80±5℃条件下孵育的时间优选为1小时。
步骤①中所述的异丙醇的加入量为占原溶液体积（即反应体系总体积）的75～85%；优选为80%左右。
步骤①和②中所述的离心的条件为：4℃、17000g离心30分钟。
步骤①中所述的乙醇溶液为浓度为体积百分比75%。
步骤①和②中所述的清洗的次数为2次以上。
步骤②中所述的复合酶溶液中链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶的质量浓度比为2：1：1。
步骤②中所述的孵育的条件优选为：37℃孵育4h。
步骤②中所述的异丙醇的加入量为原溶液（即反应体系总体积）体积的40%左右。
步骤（4）中所述的杂交的条件为：95 ℃孵育10 min。
步骤（4）中所述的捕获采用Streptavidin 磁珠进行捕获。
步骤（4）中所述的PCR扩增的反应体系为：25μL 2X KAPA HiFi Hot Start ReadyMix（高保真DNA聚合酶预混液）、2.5μL 10μM Illumina P5 Primer、2.5μL 10μM IlluminaP7 Primer、20μL 捕获DNA的Streptavidin 磁珠混合成总体积50μL的溶液；其中，
Illumina P5 Primer和 Illumina P7 Primer的核苷酸序列如下：
Illumina P5 Primer：5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′
Illumina P7 Primer：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′。
步骤（4）中所述的PCR扩增的程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，15个循环；72℃延伸1min；4℃储存。
所述的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，在步骤（4）之后，步骤（5）之前还包括将步骤（4）中得到的PCR产物用AMPure XP 纯化磁珠进行纯化的步骤。
所述的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，在步骤（5）之后，还包括根据步骤（4）中获得的测序结果进一步进行MHC区域三维基因组结构生物信息学分析的步骤。
步骤（5）中所述的PacBio长片段测序为采用PacBio第三代单分子实时测序平台进行测序；优选为采用PacBio Sequel II测序平台进行测序。
所述的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法在研究或分析MHC基因三维结构中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的内容是结合了MHC 区域靶向捕获和PacBio平台的长读长染色质邻近连接测序技术，概要步骤如下：（1）细胞甲醛固定和交联；（2）细胞裂解，染色质酶切和片段连接；（3）DNA解交联（使用混合酶解方案）和纯化；（4）MHC基因杂交捕获与PCR扩增 （5）Pacbio 文库构建和测序。通过实验发现，混合酶解方案能有效促进DNA解交联，减少肽段的残留，能够提高PCR扩增后的产量，并利用长读长测序优势，实现对MHC区域三维结构的高通量的捕获测序。
2、本发明建立了一种新的蛋白酶解方案，第一步采用蛋白酶K酶解，第二步再进行复合蛋白酶（链霉素蛋白酶、 嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶）酶解的方案，即混合蛋白酶酶解方案：（1）链霉素蛋白酶是一种广谱非特异的蛋白酶，由链霉菌产生，主要包含以下两类成分:内切蛋白酶可以水解蛋白质内部肽键，起到降解蛋白质的作用，能在Ca2+存在下发挥活性，广泛应用于组织样品的消化；外切蛋白酶这类蛋白酶作用于蛋白质末端；可以切除氨基酸残基，具有羧基肽酶活性，能切除蛋白质羧基端的氨基酸；（2）嗜热菌蛋白酶是一种热稳定的金属蛋白酶，能够消化疏水氨基酸亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸和蛋氨酸的氨基端，明显改善耐水解蛋白肽段的消化；（3）胰蛋白酶是一种丝氨酸内肽酶，可在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基侧对肽键进行特异性的断裂，是一种特异性酶解高效的蛋白酶。本发明根据3种蛋白酶的反应特性，将其进行组合，复合蛋白酶不仅具有广泛的特异性酶切位，而且具有酶切活性和稳定性强的特点，能够极大提高残留肽段降解效率，在解交连过程中，可以充分裂解DNA连接产物上所有的蛋白质和氨基酸残留肽段，能够极大改善MHC区域的三维基因组捕获效率和提高交联后DNA的可扩增性。
3、本发明建立了一种高通量MHC靶向捕获三维基因组方法，其连接片段较长，能够比对上MHC，可以解决针对MHC区域捕获的染色质互作无法实现高通量长读长测序的问题（解决蛋白肽段影响捕获和PCR的效率问题），为高分辨率、高完整度观察MHC区域三维基因组空间特征提供可靠的实验技术和数据来源。
附图说明
图1是本发明技术方案的流程图。
图2是不同蛋白酶以及不同酶解方案对对底物蛋白质的水解效果图（每组实验重复三次，N=3；bar图显示平均值±Std）；其中，A为不同蛋白酶及其在不同工作浓度条件下的底物蛋白质水解度效果图；B为不同酶解方案对底物蛋白质的水解效果图。
图3是不同酶解方案(常规酶解，二轮酶解，三轮酶解和混合酶解)去除DNA-蛋白质交联体系肽段的效果图（鉴定肽段的数量反映样本中残留蛋白肽段的相对含量，数量越少表明肽段去除效果越好）。
图4是比较不同酶解方案中MHC区域捕获产物的PCR扩增效果图；其中，A为GM12878细胞系样品PCR产物的电泳图（图中，从左到右依次为：泳道1: DNA Marker（mark1）；2:DNA Marker（mark2）；泳道3: 混合酶解（rep1）；泳道4: 混合酶解（rep2）；泳道5: 三轮酶解（rep1）；泳道6: 三轮酶解（rep2）；泳道7: 二轮酶解（rep1）；泳道8: 二轮酶解（rep2）；泳道9: 常规酶解（rep1）；泳道10: 常规酶解（rep2））；B为三种细胞系PCR产物DNA产量的比较结果（N=4, 生物学重复）（使用ANOVA test比较多组的平均值，然后使用Dunnet’s T检验混和酶酶解与其他组之间的差异显著性；ns p≥0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p <0.001.）。
图5是混合酶解方案捕获MHC区域测序覆盖度图（图中显示探针在整个5M区域内捕获效果良好，在HLA I类基因区域(下方子图左边划线区域)、HLA III类基因区域(下方子图中间划线区域)和HLA II类基因区域（下方子图右边划线区域）均能很好捕获测序）。
图6是混合酶解方案技术绘制MHC区域三维基因组结构图谱；其中，A为GM12878、GM24384和K562细胞MHC/HLA I 类基因基因组区域互作热图；B为MHC/HLA I 类基因的拓扑结构域（TAD）绝缘系数（浅灰色线代表GM12878、深灰色线代表GM24384、黑色线代表K562）；C为MHC/HLA I 类基因的基因位置和染色体区域位置；D为GM12878、GM24384和K562细胞MHC/HLA II 和 III基因区域互作热图；E为MHC/HLA II 和 III基因的拓扑结构域（TAD）绝缘系数（浅灰色线代表GM12878、深灰色线代表GM24384、黑色线代表K562）；F为MHC/HLA II 和III基因的基因位置和染色体区域位置。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
1. 蛋白质酶解方案的比较
细胞染色质经过甲醛固定后，DNA与蛋白质会共价交联，常规的解交联时通过蛋白酶K降解蛋白质，但是我们前期实验发现蛋白酶K无法把蛋白质降解至氨基酸残基，会残留大分子肽段，会影响后续长片段靶向DNA区域的捕获和PCR扩增。为了实现本方案的目的，需要探索最高效的蛋白酶酶解条件。在本方案中，由于DNA-蛋白交联复合物中，酶解后的蛋白肽段含量是微量的，难以直接定量测定，因此在本实施例中，使用牛血清白蛋白(BSA,Solarbio P0060)作为底物蛋白，先初步确定最优的蛋白酶解方案，然后再进一步通过后续实施例试验确定最终改进效果。在本实施例中，还使用了ProteoExtract®蛋白沉淀试剂盒(Calbiochem, #539180)沉淀和重融未水解的底物蛋白质，以及使用BCA蛋白定量试剂盒（TIANGEN,PA115）定量未水解的底物蛋白质含量。蛋白沉淀试剂盒能够回收未酶解的蛋白质和肽段大分子，通过不同酶解方案中初始蛋白含量和回收的蛋白含量计算蛋白质水解度，从而获得本方案最佳的酶解条件，计算公式具体如下：
蛋白质水解度(%)=100*(初始蛋白总量-回收蛋白总量）/初始蛋白总量 公式1
1.1 底物蛋白水解度检测实验方法
下述实施例中，涉及的蛋白质水解度的检测方法如下：
（1）根据ProteoExtract®蛋白沉淀试剂盒步骤操作说明书，准备蛋白沉淀溶液和蛋白质溶解溶液，以及将150mL无水乙醇加入到试剂盒中的清洗溶液中，均预冷至-20℃备用。
（2）分别将200μl酶解反应前与酶解反应后的样本与800μl步骤（1）中准备的冷却的蛋白沉淀溶液加入到1.5mL离心管中混合，震荡混匀后，在-20℃孵育60min。孵育后的样本在室温离心5min（10000g），并小心分离上清液，保留沉淀物。
（3）在步骤（2）保留的沉淀物中加入500μl步骤（1）中准备的冷却清洗液到样本中，震荡混匀，然后在室温离心5min（10000g），小心分离上清液，保留沉淀物。重复一次清洗步骤。
（4）打开离心管盖子，室温晾干5min，然后在样本中加入200μl步骤（1）中准备的蛋白质溶解溶液，震荡使沉淀蛋白样本充分溶解。
（5）根据BCA蛋白定量试剂盒步骤操作说明书配制BSA标准品，浓度分别为0、20、125、250、500、1000、1500和2000μg/mL；然后将该试剂盒中的试剂A和试剂B按照体积比50:1混合均匀，配制BCA工作液。
（6）分别取酶解前、后的待测样本和50μl 步骤（5）中配制的BSA标准品到1.5mL离心管中，再加入1mL 步骤（5）中配制的BCA工作液，震荡混合均匀，并在37℃孵育30min。酶解前、酶解后的待测样本分别重复3次取样，以计算平均值。
（7）吸取步骤（6）中得到的反应液到标准比色杯中，使用紫外分光光度计在562nm波段检测其吸光度。
（8）根据标准曲线计算出待测样本蛋白质浓度和总蛋白含量，然后根据公式1计算蛋白质水解度。
1.2 蛋白酶K以及其他蛋白酶酶解效果的比较
本方案中使用到的蛋白酶试剂包括蛋白酶K(Thermo Scientific EO0491)、链霉素蛋白酶(Millipore, CAS#9036-06-0)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich, CAS#9002-07-7)，嗜热菌蛋白酶(Promega，V4001 )，按照试剂说明书，将各种酶分别配制为20mg/mL的工作储液。另外取底物蛋白牛血清白蛋白(BSA,Solarbio P0060)1g 和ddH2O制备成20mg/mL的BSA工作储液。每个酶解反应测试都取500μl BSA工作储液，即10mg BSA作为蛋白质底物（反应方案见表1）。
表1. 蛋白酶K以及其他蛋白酶酶解实验方案
结果如图2中的A所示，从图中可以看到，蛋白酶K在1000µg/mL浓度下，蛋白质水解效率最高，其余蛋白酶在从100µg/mL到1000µg/mL提高工作浓度时，蛋白水解程度提升显著，但是从500µg/mL到1000µg/mL蛋白质水解程度提升不明显。
1.3 多轮酶解方案的蛋白质酶解效果
根据上述结果可以看到，虽然常规方案（蛋白酶K）蛋白质的水解效率高于其他蛋白酶，但也无法实现蛋白质的完全水解。因此在本实施例中，尝试两次和三次多轮使用蛋白酶K进行酶解测试。各蛋白酶工作储液和BSA工作储液的配制方法同1.2。由于蛋白酶K自身也是蛋白质，为了避免蛋白酶K对初始总蛋白量的影响，在本实施例中，反应体取1000μlBSA工作储液作为蛋白质底物。在多步酶解反应中，需要计算每个步骤反应的蛋白水解度，然后通过如下公式计算方案整体反应的总蛋白质水解度，具体公式如下：
总蛋白质水解度(%)=常规酶解蛋白水解度*(100+新步骤蛋白水解度）/100 公式2
每个反应重复三次，计算结果的平均值。反应体系和蛋白质水解度如表2所示。
表2.多轮酶解方案的蛋白质酶解效果
从表2的结果可以看到，增加蛋白质K酶解的反应次数，能够明显增加蛋白质的水解度，到第三轮酶解时候，底物蛋白质总计水解度已经达到95.2%。
1.4 复合酶酶解方案
在以上实施例结果中，尽管多轮蛋白酶K水解效率能够获得明显提高，但也无法达到完全水解至单氨基酸残基的程度，仍然有部分蛋白质或者肽段残留。链霉素蛋白酶对蛋白质水解程度与蛋白酶K相当，其他蛋白酶的水解能力较上述两种酶弱，但是由于反应温度和反应条件兼容，不同蛋白酶作用的位点有很大差别，因此我们可以将链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶进行混合，使用复合酶强化酶解的效果。在本实施例中，利用正交试验确定复合酶体系中各组分的最佳浓度组合, 获得最优的酶解效果。根据L9(33)正交表配制反应组分，每个试验同样都取500μl BSA工作储液作为底物蛋白，37℃下孵育4小时，分别取酶解前和酶解后各浓度的反应液按1.1实验方法检测底物蛋白水解度。正交反应配制条件（均为体系终浓度）及其底物蛋白的水解度检测结果如表3所示。
表3. 复合酶酶解反应体系和检测结果
表4.复合酶体系各因素不同水平的影响值K结果
根据正交表格蛋白酶各水平的影响值K计算（表4）可得复合酶体系最优组合为：链霉蛋白酶1000 μg/mL，嗜热菌蛋白酶 500 μg/mL，胰蛋白酶 500 μg/mL，即链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶浓度配比为2：1：1。
1.5混合酶酶解方案
从上述实验结果可以看到，使用蛋白酶K进行多轮酶解酶解效果较好，蛋白水解度提升12~17%（见1.3实验、表2），而复合酶酶解的蛋白水解度为80~87%（见1.4实验、表3），为了进一步提升酶解效率，本方案尝试一种混合酶解方案，即第一步使用常规酶解（蛋白酶K），第二步分别尝试单蛋白酶和复合蛋白酶酶解。复合蛋白酶有分为两组分蛋白酶复合和三组分蛋白酶复合，两组分蛋白酶按照1000μg/mL:1000μg/mL浓度组成复合酶反应体系，三组分蛋白酶按照上述1.4正交实验1000μg/mL:500μg/mL:500μg/mL浓度组成复合酶反应体系。同上述1.3实验，在本实验中反应体取1000μl BSA工作储液作为蛋白质底物。另外本方案第一步的常规酶解反应体系存在SDS去垢剂，会影响第二步反应体系链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶或胰蛋酶的活性。因此本实验需要在第一步常规酶解后，使用HiPPR去污剂去除离心柱试剂盒（Thermo Fisher Scientific, 88306）去除SDS成分和回收蛋白质和肽段产物，然后在分别加入单一的蛋白酶、两组分的复合酶和三组分的复合酶工作液进行反应，按照1.1实验检测反应蛋白水解度，并按照上述1.3实验公式2计算总蛋白水解度。每个反应重复三次，计算平均值。反应体系和蛋白质水解度检测结果如下表所示。
表5.混合酶解方案的蛋白质酶解效果
结果如图2中的B和表5所示，可以看到蛋白酶K和单独任一种蛋白酶（链霉蛋白酶、胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶）最高效果能达到91.6%蛋白水解度，与两轮酶解的效果相似。而蛋白酶K与二组分复合酶（链霉蛋白酶：嗜热菌蛋白酶 1:1）最高效果能达到94.3%蛋白水解度，与三轮酶解方案的效果相似。蛋白酶K与三组分复合酶（链霉蛋白酶：嗜热菌蛋白酶：胰蛋白酶 2:1:1）最高效果能达到99.6%蛋白水解度。由于多轮酶解+复合酶解操作会更加耗时耗力，而且测试的混合酶解方案已经达到几乎完全的蛋白酶解效果，因此无需再测试多轮酶解+复合酶解的方案。本实验结果表明，单独蛋白酶K或者联合单一蛋白酶均无法实现充分的蛋白质和肽段水解效果，而蛋白酶K与三种蛋白酶的联合反应，能够发挥协同的酶切能力，实现将蛋白质彻底水解到氨基酸水平。在后续实验中，混合酶解采用三组分复合酶酶解方案。
2. 细胞培养
本发明实施例中使用到了正常人类B淋巴细胞系GM12878、GM24385 (均购自Coriell Institue公司)和人慢性骨髓性白血病细胞系K562（ATCC），细胞均使用1×RPMI1640培养基培养，其中GM12878细胞系添加15%（v/v）的胎牛血清，K562细胞系添加10%（v/v）的胎牛血清，放置于37℃，5%CO2培养。
3. 细胞染色质甲醛交联固定
每个反应分别使用1500万个细胞（GM12878/GM24385/K562），先离心收集，使用10毫升新鲜培养基重新悬浮。加入278μl 37%甲醛溶液（质量分数），在室温下孵育10分钟固定细胞染色质。接着加入894μl 2.5M甘氨酸溶液终止反应。细胞悬液在室温下孵育5分钟，然后在冰上孵育10分钟。在4℃下以1000×g离心5分钟，用5mL冷的1×PBS缓冲液（4℃）轻轻地洗两次固定的细胞，把交联固定后的细胞储存在-80℃，留作后续操作。
4. 细胞裂解和空间近邻DNA片段连接
（1）将约300万个交联的细胞使用1000μL冰冷（4℃）的Hi-C裂解缓冲液（10mMTris-HCl pH 7.5，10mM NaCl，0.2%（v/v）NP-40（乙基苯基聚乙二醇），1×Roche proteaseinhibitors（罗氏蛋白酶抑制剂，货号11697498001））重新悬浮，在4℃下旋转孵育30分钟。
（2）在4℃下以1000×g速度离心5分钟将细胞核分离沉淀下来，将上清液丢弃。
（3）用500μL冰冷的Hi-C裂解缓冲液清洗一次细胞核，再次去除上清液。
（4）将细胞核颗粒使用50µL 0.5%（质量分数）的SDS溶液重新悬浮，在62℃孵育10分钟。
（5）加入145µL水和50µL 10% Triton X-100（曲拉通X-100），在37℃下旋转样品15分钟，淬灭SDS。
（6）加入25 µL NEB Buffer 3.1和10 µL 10 U/µL DpnII限制性内切酶（DpnIIrestriction enzyme，购自NEB，货号R0543T），在37℃下旋转样品孵育4小时，然后在62℃条件下20分钟热灭活DpnII酶反应。
（7）加入750µL连接预混反应液（ligation master mix）：100µL 10×NEB T4 DNA连接酶缓冲液，含10mM ATP（NEB，B0202），75µL 10% Triton X-100，3µL 50mg/mL BSA（Thermo Fisher，AM2616），10µL 400 U/μL T4 DNA连接酶（NEB，M0202）和562 µL水。然后将反应物在16℃下旋转4小时，室温下旋转1小时孵育反应，获得连接产物。
5. DNA解交联和纯化
取上步骤4的连接产物进行如下DNA-蛋白质交联产物酶解和DNA纯化实验。酶解方案如下：
5.1 方案一（常规酶解）：
（a）在步骤4中获得的连接产物中加入45µL 10%（质量分数）的SDS溶液和55µL20mg/ml的蛋白酶K用于染色质解交联。在63℃下孵育至少4小时（建议过夜）；然后加入65µL5M NaCl溶液，在68℃下孵育2小时淬灭反应。
（b）加入500µL混合溶剂（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，体积比），然后将混合物转移到2毫升离心管中（无核酸酶）中，分离水相。
（c）加入1µL GlycoBlue核酸共沉淀剂，100µL 3M醋酸钠溶液（pH 5.2）和850µL异丙醇，将混合物在-80℃下孵育1小时。
（d）将混合物在4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟，并除去上清液；然后，用冰冷的75%（体积分数）的乙醇清洗沉淀物两次，最后用170µL的EB缓冲液（Cat.#19086, QIAGEN）重新悬浮干燥的沉淀物，得到反应产物（常规酶解DNA样本）。
5.2 方案二（二轮酶解）：
（1）将方案一中获取的反应产物中加入20µL 10%（质量分数）的SDS和10µL 20mg/ml的蛋白酶K，然后在63℃下孵育2小时以消化剩余的蛋白质，再加入100µL混合溶剂（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，体积比），混合均匀，4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟。
（2）收集水相，然后加入20µL 3M醋酸钠溶液（pH 5.2）和150µL异丙醇，将该混合物在-80℃下孵育1小时。
（3）将混合物在4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟，并除去上清液；然后用冰冷的75%（体积分数）的乙醇清洗DNA沉淀两次，再用170μl的EB缓冲液重新悬浮DNA样本，得到反应产物（二轮酶解DNA样本）。
5.3 方案三（三轮酶解）：
1）在方案二中获取的反应产物中加入20µL 10%（质量分数）的SDS和10µL 20mg/ml的蛋白酶K，然后在63℃下孵育2小时以消化剩余的蛋白质，再加入100µL混合溶剂（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，体积比），混合均匀，4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟。
2) 收集水相，然后加入20µL 3M醋酸钠（pH 5.2）和150µL异丙醇，将该混合物在-80°C下孵育1小时。
3) 将混合物在4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟，并除去上清液。然后，用冰冷的75%（体积分数）的乙醇清洗DNA沉淀两次，再用170μl的EB缓冲液重新悬浮DNA样本，得到反应产物（三轮酶解DNA样本）。
5.4 方案四 （混合酶解）：
a) 分别取链霉素蛋白酶(Millipore, CAS#9036-06-0)，胰蛋白酶(Sigma-Aldrich, CAS#9002-07-7)，嗜热菌蛋白酶(Promega，V4001 ) ，按照2：1：1浓度比例制备复合酶工作液。为了更好清除DNA上残留的多肽，将方案一获取的反应产物加入混合酶工作液和ddH2O，使得反应体系中链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶工作浓度分别为1000、500、500 μg/mL。混合均与后，在37℃下孵育反应4小时。
b) 加入500µL混合溶剂（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1，体积比），混合均匀，然后将混合物转移到1毫升离心管中（无核酸酶）中，分离水相。
c) 加入1µL GlycoBlue核酸共沉淀剂，45µL 3M醋酸钠溶液（pH5.2）和400µL异丙醇，将混合物在-80℃下孵育1小时。
d) 将混合物在4℃下以最大速度（离心力为17000g）离心30分钟，并除去上清液。然后，用冰冷的75%（体积分数）的乙醇清洗沉淀物两次，最后用100µL的EB缓冲液重新悬浮干燥的沉淀物，得到反应产物（混合酶解DNA样本）。
6.解交连DNA残留肽段检测
为了检测酶解解交连后，DNA样本中残留的肽段含量，需要使用更高灵敏度的质谱检测方法。肽段残留量越大，在等量DNA样本中能够被识别的肽段数量越多。对照样本使用无蛋白共价结合的DNA样本，使用无甲醛交联的3株细胞，每个样本取5x106细胞量，通过细胞DNA提取试剂盒（DP304, 天根）提取DNA作为背景对照样本（control DNA）。然后取上述5实验中常规酶解、二轮酶解、三轮酶解和混合酶解方案解交连纯化后的DNA，以及对照DNA样本，每个样本取5µg DNA，并用溶液（10mM Tris-HCI(pH=7.5 )、10 mM CaCl2、10 mM MgCl2）补充至100µL。在每个DNA样本中分别加入2µL DNAse I溶液（Thermo Scientific，Cat.90083），37℃孵育30min降解DNA核酸分子。然后加入4µL 2.5%（v/v）三氟乙酸（TFA,Thermo Scientific, Cat.28904）使样品溶液含0.1%（v/v）TFA。按照Pierce C18 离心吸头(Thermo Scientific，Cat.87782)说明书活化C18离心吸头，将样本溶液缓慢吸入C18离心吸头中，然后将溶液推出洗头，循环吸和推出10次样本溶液，达到最高肽段吸附效率。接着使用含0.1%（v/v）TFA, 5%（v/v）乙腈(ACN, Thermo Scientific,Cat.51101)溶液100μL循环吸入和推出C18离心吸头，重复该过程2次，充分去除核酸分子和脱盐。最后使用50 µL含50%（v/v）乙腈、0.1%（v/v）甲酸(Thermo Scientific,Cat.28905)的肽段洗脱液缓慢吸入C18离心吸头，静置1min后保留溶液，获得纯化的肽段样本。
在本方案中，我们委托北京百泰派克生物科技有限公司对肽段样本进行LC/MS/MS定量检测。该检测使用到液相色谱仪（Easy-nLC1200, ThermoScientifi）和质谱仪( QExactive HybridQuadrupole-Orbitrap , ThermoScientifi)仪器，按照文献公开的Orbitrap分析操作流程（Kelstrup CD, Young C, Lavallee R, Nielsen ML, Olsen JV.Optimized fast and sensitive acquisition methods for shotgun proteomics onaquadrupole orbitrap mass spectrometer. J. Proteome Res. 2012;11:3487–3497.doi: 10.1021/pr3000249.）对待测样品进行分析。质谱采集到的原始谱图数据后，通过MaxQuant 软件(version 1.5.10)进行比对解析，鉴定样本的肽段序列信息。最后比较分析每个样本中鉴定的肽段数量。
结果如图3所示，从图3的结果可以看到，混合酶解方案解交连纯化的DNA残留肽段检出平均量是常规酶解方案1.0%，而二轮和三轮酶解分别是常规酶解方案的35.7%和9.5%，混合酶解方案肽段残留量几乎完全去除。
7.MHC基因杂交捕获与PCR扩增
分别对上述步骤5中4种不同酶解方案获得的DNA样本进行定量后，分别取等量的DNA进行以下步骤：
a. 探针准备：参考文献（Norman PJ, Norberg SJ, Guethlein LA, Nemat-Gorgani N, Royce T, Wroblewski EE, Dunn T, Mann T, Alicata C, Hollenbach JA,Chang W,Shults Won M, Gunderson KL, Abi-Rached L, Ronaghi M, Parham P.Sequences of 95 human MHC haplotypes reveal extreme coding variation in genesother than highly polymorphic HLA class I and II. Genome Res. 2017 May;27(5):813-823. doi: 10.1101/gr.213538.116. Epub 2017 Mar30.）中的方法设计MHC区域(GRCh38/hg38) Chr6:28510120-33532223的靶向探针池（捕获探针池已在Github上公开：https://github.com/hucong3/pt-mhc/tree/main/MHC_capture_probes）。然后通过xGen定制杂交捕获探针组（IDT）服务合成探针。探针组合成后，加入探针组试剂盒提供的溶解液(IDT)，制备探针工作液，每个生物素标记捕获探针浓度为50pM。杂交探针溶液使用前低速离心 1 min，探针工作液使用量为4 μL / rxn（注：rxn是Reaction的英文缩写，表示每个反应使用4 μL探针工作液）。
b. 预文库的制备和封闭：（1）分别取常规酶解、二轮酶解、三轮酶解和混合酶解方案纯化后的DNA产物500ng，采用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit试剂盒(Vazyme,ND610)按照说明书标准流程对酶解纯化后DNA进行预文库的构建，以进行后续的捕获和PCR扩增。 MHC靶向捕获步骤按照靶向捕获试剂盒xGene Hybridization and Wash v2 Kit(IDT, Cat.1080584)操作说明书进行（xGenTMhybridization capture of DNA librariesprotocol, IDT）。将500ng制备好的预文库和xGene Hybridization and Wash v2 Kit 试剂5μg Human Cot-1 DNA、1nmol i5 Blocker和1nmol i7 Blocker(均购自IDT公司)加入到1.5ml低吸附离心管中。（2）使用真空浓缩仪（温度不高于70℃）将离心管中的溶液蒸干备用。
c. 探针与文库杂交：1）将杂交捕获试剂从冰箱中取出恢复到室温（时间约30min，可加热融化（≤65℃））。2）将8.5μL 2X Hybridization Buffer（IDT）、2.7μLHybridization Enhancer（IDT）、1.8μL 无酶无菌水加入到上述步骤 b（2）中的离心管中，室温孵育10 min。同时设置两个PCR程序待用（95℃和65℃）。3）使用移液器轻柔吹吸10次混匀，将液体转移到0.2 mL低吸附离心管中。4）使用PCR仪95 ℃孵育10 min。5）结束后，将离心管转移至65℃ PCR仪，立即加入 4 μL 探针 Pool。6）涡旋混匀，瞬时离心。7）65℃孵育 4h。
d. Streptavidin 磁珠准备：1）将Streptavidin磁珠（链霉亲和素磁珠，xGenHybridizarion and Wash v2 Kit, IDT）从冰箱中（4℃）取出恢复到室温（约30 min）。2）涡旋混匀15 sec。3）取100 μL Streptavidin磁珠加入到新的1.5 mL低吸附离心管中。4）将离心管放到磁力架上，直到溶液澄清。5）吸弃上清，切勿扰动磁珠。6）按以下步骤对Streptavidin磁珠进行清洗：①将离心管从磁力架上取下，加入200 μL 1X Beads WashBuffer（xGen Hybridizarion and Wash v2 Kit,IDT），涡旋振荡10 sec。②将离心管瞬时离心，放到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清，切勿扰动磁珠。7）重复上述步骤6）。8）将离心管从磁力架上取下，加入100 μL 1X Beads Wash Buffer。9）将离心管中的100 μL磁珠重悬液转移到新的0.2 mL低吸附离心管中待用。10）将离心管放到磁力架上，直到溶液澄清。11）吸弃上清，切勿扰动磁珠，立即进行后续实验步骤。
e. Streptavidin 磁珠捕获：1）将杂交混合物（步骤 c.7）加入到含Streptavidin 磁珠（步骤 d.11）的 0.2 mL 低吸附离心管中。2）使用移液器轻柔吹吸 10次混匀。3）使用 PCR 仪（热盖温度设置为 75°C）65 ℃孵育 45 min。4）每 12 min 涡旋混匀 3 sec，确保磁珠处于悬浮状态。
f. 捕获后清洗：1）65 ℃清洗：①将 100 μL 65℃预热的 1X Wash Buffer I（xGen Hybridizarion and Wash v2 Kit,IDT）加入到含有杂交混合物的 0.2 mL 低吸附离心管中（步骤 e.4）。 ②吹吸混匀后，将含有 Streptavidin 磁珠的反应液转移到新的1.5 mL 低吸附离心管中。 ③将离心管放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。 ④继续按以下步骤进行清洗： a) 加入 200 μL 65℃预热的 1X Wash Buffer S（xGenHybridizarion and Wash v2 Kit,IDT），吹吸或涡旋混匀后，在 65 ℃条件下孵育 5 min。b) 瞬时离心，将离心管放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。⑤重复上述步骤④进行清洗。2）室温清洗：①加入 200 μL 1X Wash Buffer I，涡旋混匀 2 min。②将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。③加入 200 μL 1X Wash Buffer II，涡旋混匀 1 min。 ④将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。⑤加入 200 μL 1X Wash Buffer III，涡旋混匀 30 sec。⑥将离心管瞬时离心，放置到磁力架上，直到溶液澄清，吸弃上清。3）磁珠重悬：①立即加入 20 μL 无酶无菌水。 ②使用移液器吹吸 10 次，重悬磁珠，进入后续实验步骤。
g. PCR 扩增：1）配置PCR反应体系：将25μL 2X KAPA HiFi Hot Start Ready Mix（高保真DNA聚合酶预混液，Kapa）、2.5μL 10μM Illumina P5 Primer (5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′)、2.5μL 10μM Illumina P7 Primer (5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′)、20μL 捕获DNA的Streptavidin 磁珠（步骤f.3）混合成总体积50μL的溶液。2）吹吸或低速涡旋混匀使磁珠保持悬浮状态，立即进入下一步骤。 3）使用PCR 仪（热盖温度 105 ℃）按以下程序运行：①温度为98℃、时间为45sec，进行一个循环。②温度为98℃、时间为15sec，后温度为60℃、时间为30sec，后温度为72℃、时间为30sec为一个循环，进行15个循环 。 ③温度为72℃、时间为1min，进行一个循环。④温度为4℃、时间为∞，进行一个循环。
h. PCR 产物纯化：1）每个PCR 管中加入 75 μL Agencourt AMPure XP 纯化磁珠（Beckman Coulter,Cat. A63882）。 2）按照 AMPure XP 操作手册纯化 PCR 产物。 3）使用22 μL Tris-HCl（10 mM，pH 8.5）进行洗脱。 4）转移 20 μL 包含捕获文库的洗脱液到新的 1.5 mL 低吸附离心管中。
i. 使用 Qubit 荧光计测量DNA文库浓度，进行预文库的质控。
8.检测不同酶解方案中MHC区域的捕获和PCR扩增的效果
将上述步骤7中的获得的PCR产物，使用凝胶电泳比较不同方案的捕获MHC区域的PCR扩增的效果，方法如下：配制琼脂糖凝胶溶液，称取2.5 g琼脂糖粉末(SIGMA)，加到100ml 0.5x TBE缓冲液(Thermo Fisher)中，加热溶解，按照1:10000（体积比）稀释加入核酸凝胶染料SYBR Green I (Thermo Fisher) 充分混合制胶。取5 μl PCR产物，混合1 μl 6XDNA上样缓冲液(TAKARA)， 加入2 μl DNA Marker (碧云天公司) 作为分子量指标。120 V电压电泳30～40 分钟后，放置到凝胶成像系统观察结果。同时根据上述步骤7的结果，比较不同方案PCR产物DNA产量。
结果如图4所示：从图4中的A可以看到混合酶解捕获产物的PCR有很明显的条带，而三轮和二轮酶解的PCR效果较弱，而常规酶解方法的PCR产物基本没有条带，无法正常扩增。从图4中的B可以看到三种细胞系样本混合酶解的PCR产物产量均显著高于其余三种方案，相比常规酶解方案处理，二轮酶解可以提高PCR扩增产物5～10倍，而三轮酶解可以提高PCR扩增产物量6～15倍，而混合蛋白酶处理增可以提高10～27倍。上述实验结果表明了，在不同的细胞系样本中，本方案混合酶解方法对DNA-蛋白交联产物都能够获得最彻底的解交联，因此能够获得最优的靶向捕获效率和PCR扩增效果。
9.Pacbio HiFi CCS文库构建和测序
文库制备和测序（Sequel II HiFI CCS）：PacBio SMRTbell文库的制备委托北京希望组公司生物科技有限公司根据HiFi Express Template Prep Kit 2.0试剂盒操作说明书(Pacific Biosciences, CA)执行。每个样本使用500ng上述步骤7中的获得的PCR产物制备MHC靶向区域捕获的SMRTbell文库以及进行PacBio长片段测序。其中文库制备的主要步骤如下：
(1)PCR DNA产物通过Qubit 1X dsDNA HS assay kit试剂盒（ThermoFisherScientific）和Qubit fluorometer仪器(ThermoFisher Scientific)，按照试剂说明书操作流程进行定量；
(2)DNA损伤修复，末端修复和3’末端加A尾反应按照HiFi Express TemplatePrep Kit 2.0（Pacific Biosciences）操作说明书进行；
(3)与SMRTbell发夹接头连接步骤同样如HiFi Express Template Prep Kit 2.0（Pacific Biosciences）操作说明书进行，获得SMRTbel文库；
(4) 使用Agencourt AMPure PB磁珠（Beckman Coulter）纯化SMRTbel文库，使用生物芯片分析系统Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent technologies, USA)检测文库片段的大小和产量；
(5)文库制备后，委托北京希望组公司生物科技有限公司使用Sequencing PrimerV4(Pacific Biosciences, Cat.101-359-000)和Sequel II Binding Kit 2.0(PacificBiosciences, Cat.101-789-500 2)测序试剂盒，按照说明书标准操作流程，使用PacBioSequel II仪器对文库进测序。
10.MHC三维基因组捕获技术基因变异位点分析和三维结构分析
10.1 MHC三维基因组捕获技术测序深度和测序质量评估
使用上述步骤9中获得的各细胞系的MHC区域PacBio HiFi CCS测序数据(混合酶解GM24385)，通过FastQC软件对原始的测序数据进行质控分析，然后通过minimap2软件将测序数据比对到人类hg38参考基因组上，比对后生成的sam文件通过samtools软件生成bam文件，然后使用bamdst软件分析数据在MHC区域的分布和测序覆盖情况。可以看到，相对常规酶解方案，混合酶解方案测序序列平均读长（Mean read length）达到5.0～5.4k，多轮酶解测序的2.3～3.8kb，混合酶解方案是是常规酶解方案测序长度（1.1～1.5kb）的400%，而多轮酶解是常规方案的170～290%，表明了混合酶解能够更大大程度解决了DNA肽段残留问题，促进了长片段PCR扩增的效率（表6）。除此外，混合酶解方案获得了最高的MHC区域捕获特异性（Fraction of target reads, 表6），比常规方案提高了约16倍，而多轮酶解方案提高了约6倍。使用deeptools软件将bam文件转为Bigwig文件，后将其输入IGV软件以Hg38参考基因组区域的fasta和GFF文件作为参考，即可得到评估MHC区域测序深度的图5。可以看到，使用本方案混合酶解获得了均一的MHC区域测序覆盖度。进一步，我们可以看到混合酶解方案10x和100x覆盖度都明显高于其他方案（Coverage, 表6）。实验结果表明了，混合酶解方案的MHC靶向区域长读长三代测序数据质量最优。
表6. 捕获MHC区域测序数据和覆盖度的效果
10.2 在GM24385 MHC区域三维基因组捕获数据SNV变异位点验证
GM24385 MHC区域的变异位点benchmark标准集在Genome in a Bottle（GIAB）数据库（https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/giab/ftp/release/AshkenazimTrio/HG002_NA24385_son/NISTv4.2.1/GRCh38/HG002_GRCh38_1_22_v4.2.1_benchmark.vcf.gz）。将上述步骤10.1步骤获得GM24385细胞系测序数据的比对bam文件输入Deepvariant软件使用默认参数进行SNV（single nucleotide variants）变异位点检测，生成vcf文件（GM24385MHC）。然后在GIAB下载GM24385细胞系10x-genomics的二代Illumina平台全基因组测序数据的vcf文件（10x-Genomics）作为对照组。使用RTG-tools软件以默认参数分别将GM24385-MHC和GM24385（10x Genomics）变异位点与GIAB 变异位点benchmark标准集进行比较，得到真阳性（TP）、假阳性（FP）、假阴性位点，并计算准确性(Precision)和召回率(Recall）以及F-measure分数指标（表7）。可以看到，对比二代传统测序方法，使用本案获得的测序数据的SNV变异检测精确度达到0.99，召回率达到0.98（表7中斜体字体部分）。实验表明了本案方法能够获得高精度和高准确性的MHC区域捕获数据，测序的数据质量优于传统的二代测序平台。
表7. 捕获GM24385 MHC区域基因变异位点的检测效果
10.3 MHC三维基因组捕获技术高阶三维结构分析
利用上述步骤9中GM12878、GM24385和K562 细胞系的MHC区域三维基因组捕获数据(混合酶解方案)。本案使用了自编分析流程（https://github.com/zhengdafangyuan/HiPore-C）进行高阶互作数据的比对和过滤处理，生成两两互作矩阵数据。通过coolerv0.8.6.post0的默认参数对矩阵数据进行归一化处理。使用cooltools insulation工具在25kb分辨率下，以5 bins作为滑动窗口，计算TAD的绝缘系数（insulation scores）。使用HiGlass工具对互作矩阵各层级的空间结构进行可视化（图6）。从实验结果中，可以观察到各细胞在MHC区域的高分辨率染色质空间互作图谱，发现正常的B淋巴细胞系GM12878和GM24385细胞在HLA I，II和III类基因区域的染色质互作和结构相似度高，而它们与白血病淋巴母细胞K562细胞的具有较明显差别，结果符合预期猜想。以上实验表明，本发明能够实现高通量高精度的MHC区域捕获三维基因组结构的分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种非疾病诊断和治疗目的的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）细胞甲醛固定和交联：
将细胞利用甲醛溶液进行交联固定，得到交联固定后的细胞；
（2）细胞裂解和DNA片段连接：
将步骤（1）中得到的交联固定后的细胞经裂解后，收集细胞核颗粒；然后利用限制性内切酶DpnII进行酶切反应，得到酶切产物；再将酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，得到DNA连接产物；
（3）混合酶解：
①在步骤（2）得到的DNA连接产物中加入十二烷基硫酸钠溶液和蛋白酶K，然后在56～63℃孵育4～12h使染色质解交联，再加入NaCl溶液淬灭反应；待反应结束后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀后加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到DNA重悬液；
②在步骤①得到的DNA重悬液中加入复合酶溶液，30～37℃孵育4～12h，然后加入由苯酚、氯仿和异戊醇组成的混合溶剂，混合均匀，再加入GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇，在-80±5℃条件下孵育后离心、取沉淀，冰乙醇溶液清洗后用EB缓冲液重悬，得到待测DNA样本；其中，复合酶为链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和胰蛋白酶；
（4）MHC基因杂交捕获与PCR扩增：
将步骤（3）②中得到的待测DNA样本使用MHC区域靶向探针进行杂交捕获，再进行PCR扩增，得到PCR产物；
（5）Pacbio HiFi CCS文库构建和测序：
将步骤（4）中得到的PCR产物构建SMRTbell文库并进行PacBio长片段测序；
步骤①中所述的蛋白酶K的用量为按其在孵育体系的终浓度为1mg/ml添加计算；
步骤②中所述的复合酶溶液中链霉蛋白酶的浓度为1000 μg/mL，嗜热菌蛋白酶的浓度为500 μg/mL，胰蛋白酶的浓度为 500 μg/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤①中所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为质量百分比10%；
步骤①中所述的十二烷基硫酸钠溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为质量百分比0.5～1%添加计算；
步骤①中所述的NaCl溶液的浓度为5mol/L；
步骤①中所述的NaCl溶液的加入量为占孵育体系体积的5～10%；
步骤①中所述的淬灭反应的条件为：在68℃下孵育2小时；
步骤①和②中所述的混合溶剂中的苯酚、氯仿和异戊醇的体积比25：24：1；
步骤①和②中所述的GlycoBlue核酸共沉淀剂、醋酸钠溶液和异丙醇的体积比为1:100:850；
步骤①和②中所述的醋酸钠溶液的浓度为3mol/L；
步骤①中所述的异丙醇的加入量为占反应体系总体积的75～85%；
步骤①中所述的在-80±5℃条件下孵育的时间为1小时；
步骤①中所述的乙醇溶液为浓度为体积百分比75%；
步骤②中所述的异丙醇的加入量为反应体系总体积的40%；
步骤①和②中所述的离心的条件为：4℃、17000g离心30分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的杂交的条件为：95 ℃孵育10 min；
步骤（4）中所述的捕获采用Streptavidin 磁珠进行捕获；
步骤（4）中所述的PCR扩增的反应体系为：25μL 2× KAPA HiFi Hot Start ReadyMix、2.5μL 10μM Illumina P5 Primer、2.5μL 10μM Illumina P7 Primer、20μL 捕获DNA的Streptavidin 磁珠混合成总体积50μL的溶液；其中，
Illumina P5 Primer和 Illumina P7 Primer的核苷酸序列如下：
Illumina P5 Primer：5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′
Illumina P7 Primer：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′；
步骤（4）中所述的PCR扩增的程序为：98℃预变性45s；98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，15个循环；72℃延伸1min；4℃储存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的细胞裂解和DNA片段连接通过如下方法实现：
将步骤（1）中交联固定后的细胞用冰Hi-C裂解缓冲液重悬，4℃旋转孵育后离心去上清，清洗，得到细胞核颗粒；然后将细胞核颗粒用十二烷基硫酸钠溶液重悬，在50～62℃条件孵育后加入Triton X-100溶液和水淬灭十二烷基硫酸钠；再利用限制性内切酶DpnII进行酶切反应，并将获得的酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，得到DNA连接产物；
所述的Hi-C裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl pH 7.5，10mM NaCl，体积百分比0.2%的乙基苯基聚乙二醇，1×Roche protease inhibitors；
所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为质量百分比0.5%；
所述的十二烷基硫酸钠溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为质量百分比0.5%添加计算；
所述的Triton X-100溶液的浓度为体积百分比10%；
所述的Triton X-100溶液的用量为按其在孵育体系的终浓度为体积百分比1～2%添加计算；
所述的连接所用的反应体系为750µL连接预混反应液，其组分为：100µL 10×NEB T4DNA连接酶缓冲液，10mM ATP，75µL体积百分比10%的Triton X-100，3µL 50mg/mL牛血清白蛋白，10µL 400 U/μL T4 DNA连接酶，562 µL水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述的离心的条件为：4℃、1000g离心5分钟；
所述的清洗为采用冰Hi-C裂解缓冲进行清洗；
所述的孵育的时间为8～12分钟；
所述的淬灭十二烷基硫酸钠的条件为：在37℃下旋转15分钟；
所述的酶切反应的条件为：37 ℃酶切4小时；
所述的T4 DNA连接酶的连接条件为：先在16℃下反应4小时，再在室温下反应1小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的细胞甲醛固定和交联通过如下步骤实现：将甲醛溶液加入到细胞悬浮液中，在室温下孵育固定细胞染色质，然后加入甘氨酸溶液终止反应，经室温下再次孵育和冰上孵育后，离心，清洗，得到甲醛交联固定后的细胞；
所述的甲醛溶液的浓度为质量百分比37%；
所述的甲醛的用量为按其在反应体系的终浓度为体积百分比1～3%添加计算；
所述的细胞悬浮液的浓度为0.3×106～1.5×106cell/mL；
所述的室温下孵育的时间为8～12分钟；
所述的甘氨酸溶液的浓度为2～3 mol/L；
所述的室温下再次孵育的时间为4～6分钟；
所述的冰上孵育的时间为8～12分钟；
所述的离心的条件为：4℃、1000g离心5分钟；
所述的清洗为采用PBS缓冲液进行清洗。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的细胞为正常细胞或肿瘤细胞；
步骤（5）中所述的PacBio长片段测序为采用PacBio第三代单分子实时测序平台进行测序。
8.权利要求1～7任一项所述的MHC区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法在非疾病诊断和治疗目的的分析MHC基因三维结构中的应用。
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