CN116179650A - 一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法 - Google Patents

一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法 Download PDF

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CN116179650A CN202310080336.2A CN202310080336A CN116179650A CN 116179650 A CN116179650 A CN 116179650A CN 202310080336 A CN202310080336 A CN 202310080336A CN 116179650 A CN116179650 A CN 116179650A
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Abstract

本发明公开了一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,该方法能够在复杂临床组织样本中有效富集染色质构象捕获合并染色质免疫共沉淀步骤后的DNA,提取的DNA足以用于后续文库构建。本发明自主提出采用液氮速冻研磨预处理、组合酶法消化、交联过程中物理破碎等系列处理流程,过程中加入维持细胞活力的小分子药物,从而既能充分解离细胞、去除组织间质,同时最大限度为后续步骤保留组织中活细胞;首创用于“染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获实验”的组织处理技术。本发明不但适用于复杂组织样本,稍加改造后也适用于在体外培养的细胞系中绘制特定蛋白介导的染色质三维互作图谱,并且相比现有类似技术效率提升较大。

Description

一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获 方法
技术领域
本发明涉及复杂生物组织中染色质高级结构的检测,更具体地,涉及一种通过染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获技术对组织样本中特定蛋白介导的染色质三维互作进行高通量检测的方法。
背景技术
线性距离不相邻的染色质位点在细胞核的三维空间中可能相互接近并结合,这种现象被成为染色质三维互作。染色质的三维互作通过将基因组增强子区域与基因启动子区远程结合对基因表达起到重要调控作用,在个体发育和疾病发生过程中发挥了重要作用。多种不同类型的蛋白参与介导染色质三维互作结构的形成,例如CTCF、MED1等。原位Hi-C技术能够高通量捕获细胞中所有的染色质互作,对认识染色质的高级结构有重要价值,但这种技术无法分某个特定蛋白介导的染色质三维互作(Lieberman-Aiden, et al., 2009,Science, PMID: 19815776)。HiChIP技术(Mumbach, et al., 2016, Nature Methods,PMID: 27643841)和ChIA-PET技术(Fullwood, etal., 2009, Nature, PMID: 19890323)将特定蛋白介导的染色质免疫共沉淀技术与染色质构象捕获技术组合,能够特异性识别某个蛋白介导的染色质三维互作。
然而,由于染色质免疫共沉淀技术和染色质构象捕获技术本身就较为复杂,步骤繁多,很多中间步骤会逐步降低最终目的DNA产率,导致HiChIP技术和ChIA-PET技术对起始细胞量要求较高,只能在体外培养的细胞系中进行,无法用于捕获临床组织样本中特定蛋白介导的染色质三维互作。描绘特定蛋白在疾病发生发展过程中介导的染色质远程互作对于认识致病机制和治疗靶点发现具有重要意义,但目前尚无在临床组织样本中(例如肿瘤和癌旁组织)中实现此目的的技术被报导。由于临床样本组成细胞类型复杂,包含结缔组织以及多种类型的细胞,HiChIP或ChIA-PET技术中的限制性内切酶酶切条件、超声条件、免疫共沉淀过程、文库扩增方法等几乎所有步骤均无法适用,需要重新摸索和优化。此外,实验起始阶段组织破碎的方法对后续实验的成败至关重要,需要确定最佳方法。
发明内容
针对现有高通量绘制特定蛋白介导的染色质三维互作图谱技术不适用于复杂临床组织样本中的缺陷,本发明提出了一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,包括以下步骤:
(1)组织液氮速冻研磨和酶解
利用液氮对组织进行速冻,随后使用酶解溶液酶解,之后使用TrypLE 酶解;接着用10mL 1%的多聚甲醛交联酶解后的细胞,最后使用Glycine溶液终止交联;
(2)组织裂解
加入染色质构象捕获裂解液,染色质构象捕获裂解液为含50 mM Hepes–KOH pH7.5、140 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5%Igepal CA-630; 0.25% Triton X-100、蛋白酶抑制剂现用现加,旋转裂解50分钟;
(3)酶切
对组织裂解物使用限制性内切酶MboI酶切;
(4)生物素标记和连接
向酶切产物中加入biontin-dATP、 dCTP、dGTP、dTTP、DNA聚合酶,37℃下标记1小时;再加入连接液,室温下连接4小时;
(5)超声
超声前一天,抗体与免疫磁珠预先结合,使用超声缓冲液重悬步骤(4)得到的连接产物,超声仪中进行超声;
(6)染色质免疫共沉淀
将步骤(5)中预处理的抗体-磁珠与超声产物混合,4℃下旋转过夜;过夜后分别用清洗缓冲液、碳酸氢铵溶液清洗磁珠;
(7)DNA提取
使用DNA洗脱液洗脱磁珠上的DNA,然后利用DNA纯化试剂盒提取DNA;
(8)生物素亲和以及转座酶切割
使用反应缓冲液重悬Streptavidin-C磁珠,并向Streptavidin-C磁珠悬液中加入第(7)步得到的DNA溶液,室温下亲和30分钟;对结合含生物素标记DNA的Streptavidin-C磁珠加入反应缓冲液和Tn5转座酶,55℃下切割10分钟,间隔震荡;
(9)文库构建
先使用Phusion高保真DNA聚合酶反应液预清洗一遍步骤(8)得到的Streptavidin-C磁珠,使用PCR扩增液,对Streptavidin-C磁珠上的DNA进行扩增,提前设定72℃预热PCR仪,保证反应液迅速升温PCR扩增程序为:72℃ 5分钟 ->98℃ 1分钟 ->98℃15秒 ->63℃ 30秒 ->72℃ 1分钟,9~12个循环,正式启动PCR扩增程序前先设定72℃预热PCR仪(由于组织来源的DNA质量不如细胞系来源的DNA,若不预热直接室温启动PCR程序进行文库扩增,很大概率无法一次扩增成功,再次扩增后的文库较一次扩增成功的文库质量相差很大);对PCR产物在Agilent TapeStation上进行文库电泳鉴定文库扩增质量;利用Pippin DNA SizeSelection系统或Ampure XP磁珠筛选200~700bp文库片段。
进一步的,所述步骤(1)中,酶解溶液为100U/ml II型胶原酶,20nM ROCK抑制剂Y-27632,1×抗菌-抗真菌剂,以上成分溶于1×Hank's平衡盐溶液;酶解条件为37℃下旋转酶解2小时;多聚甲醛交联酶解后的细胞10分钟,过程中使用组织匀浆器1档研磨3次,每次6秒。
进一步的,所述步骤(3)中,限制性内切酶MboI酶切条件为37℃酶切2小时。
进一步的,所述步骤(4)中,连接液为含300μL 10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液、250μL 10%的Triton X-100、6μL 50 mg/mL的BSA、20μL 400U/μL的T4 DNA连接酶、1320μL三次蒸馏水。
进一步的,所述步骤(5)中,抗体与免疫磁珠分别为Protein-A与Protein-G磁珠,超声缓冲液为10 mM Tris–HCl, pH 8; 100 mM NaCl;1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA;0.1% Na–Deoxycholate; 0.5%N-lauroylsarcosine;蛋白酶抑制剂现用现加;超声条件为每个循环10秒 on + 30秒 off,重复10个循环,取出超声管摇晃混匀后放回,继续10个循环。
进一步的,所述步骤(6)中,清洗缓冲液为50 mM Tris, pH 7.6;150 mM NaCl;1mM EDTA;0.1% SDS;1% Igepal CA630(或NP40);0.5% Na–Deoxycholate;蛋白酶抑制剂现用现加。
进一步的,所述步骤(7)中,洗脱步骤:室温下旋转10分钟, 37℃热台震荡3分钟,将上清转移到新管加入蛋白酶K,55℃热台震荡45分钟;67℃热台震荡3.5小时。
进一步的,所述步骤(8)中,反应缓冲液为20 mM Tris-HCl pH 7.5;10 mM MgCl2;20% Dimethylformamide。
进一步的,所述步骤(9)中,PCR扩增液为含25μL 2X Phusion高保真DNA聚合酶反应液、1μL 12.5μM的通用扩增引物、1μL 12.5μM的barcode特异性扩增引物、23μL三次蒸馏水;PCR扩增程序为:72℃ 5分钟 ->98℃ 1分钟 ->98℃ 15秒 ->63℃ 30秒 ->72℃ 1分钟,9~12个循环。
本发明将步骤(1)、(2)用简化的裂解细胞过程替换,后续步骤完全一致,能够将其应用于在体外培养的细胞系中绘制特定蛋白介导的染色质三维互作图谱。
本发明与现有技术相比,有益效果为:
(1)本发明能够在复杂临床组织样本中有效富集染色质构象捕获合并染色质免疫共沉淀步骤后的DNA,即在第(7)步提取DNA后一般20~50mg组织可获得200~500ng DNA,足以用于后续文库构建,而现有技术无法从组织中经过类似步骤得到DNA。
(2)自主提出采用液氮速冻研磨预处理、组合酶法消化、交联过程中物理破碎等系列处理流程,过程中加入维持细胞活力的小分子药物ROCK抑制剂Y-27632,从而既能充分解离细胞、去除组织间质,同时最大限度为后续步骤保留组织中活细胞;本发明首创用于“染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获实验”的组织处理技术,目前未见文献中有其它组织处理技术应用于“染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获实验”。
(3)本发明第(3)-(4)步采用我们自主提出的染色质构象捕获裂解液提取细胞核,并对酶切和连接条件进行优化,能够使染色质复合物中的空间临近DNA得到充分切割和随机连接;本发明第(5)步的超声条件和第(6)步免疫共沉淀方法都是从实验原理层面进行的步骤创新,相比已有步骤使用含Triton X-100的超声/免疫共沉淀缓冲液,我们使用含脱氧胆酸钠和N-月桂酰肌氨酸的超声/免疫共沉淀缓冲液,既充分通透细胞核核膜,又能充分溶解细胞核内蛋白-染色质复合体,同时为抗原-抗体结合提供适合的缓冲条件,这是本发明能够提高DNA得率的关键之一。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明TapeStation 4200 文库电泳图;
图2为本发明hicup软件对测序原始数据的质控图;
图3为本发明CTCF介导的染色质环APA分析图;
图4为本发明CTCF介导的染色质三维互作图谱(chr8)。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
本发明所包含得各个步骤和每个步骤的核心方案如下:
(1)组织液氮速冻研磨和酶解:首先利用液氮对组织进行速冻,随后使用酶解溶液(100U/ml II型胶原酶; 20nM ROCK抑制剂Y-27632; 1×抗菌-抗真菌剂;以上成分溶于1×Hank's平衡盐溶液)37℃下旋转酶解2小时,之后使用0.25% TrypLE 酶解5分钟;用10mL 1%的多聚甲醛交联酶解后的细胞10分钟,过程中使用组织匀浆器(Bio-Gen PRO200)1档研磨3次,每次6秒;使用Glycine溶液终止交联。
(2)组织裂解:先加入1mL 染色质构象捕获裂解液(含50 mM Hepes–KOH pH 7.5、140 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% IgepalCA-630; 0.25% Triton X-100、10% 甘油、蛋白酶抑制剂现用现加),旋转裂解50分钟。
(3)酶切:对组织裂解物使用1125U的限制性内切酶MboI(NEB-R0147)37℃酶切2小时。
(4)生物素标记和连接:向酶切产物中加入75μL 0.4mM的biontin-dATP(Thermo19524016)、3μL 10mM的dCTP、3μL 10mM的dGTP、3μL 10mM的dTTP、20μL 5U/μL的DNA聚合酶Ⅰ(NEB-M0210),37℃下标记1小时;加入1896μL配置好的连接液(含300μL 10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液(NEB-B0202)、250μL 10%的Triton X-100、6μL 50 mg/mL的BSA、20μL 400U/μL的T4 DNA连接酶(NEB-M0202)、1320μL三次蒸馏水),室温下连接4小时。
(5)超声:超声前一天,抗体与免疫磁珠预先结合,即40μL Protein-A与40μLProtein-G磁珠(Thermofisher)混合,与7.5μg相应抗体4℃下旋转过夜;使用超声缓冲液(10 mM Tris–HCl, pH 8; 100 mM NaCl;1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA;0.1% Na–Deoxycholate; 0.5%N-lauroylsarcosine;蛋白酶抑制剂现用现加)重悬第(4)步得到的连接产物,Bioruptor® Pico超声仪中进行超声,每个循环10秒 on + 30秒 off,重复10个循环,取出超声管摇晃混匀后放回,继续10个循环。
(6)染色质免疫共沉淀:将第(5)步中预处理的抗体-磁珠与超声产物混合,4℃下旋转过夜;过夜后用清洗缓冲液(50 mM Tris, pH 7.6; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0.1%SDS;1%Igepal CA630(或NP40);0.5% Na–Deoxycholate;蛋白酶抑制剂现用现加)清洗10遍磁珠;用100mM的碳酸氢铵溶液清洗一遍磁珠。
值得注意的是本发明第(5)步的超声条件和第(6)步免疫共沉淀方法都是从实验原理层面进行的步骤创新,相比已有步骤使用含Triton X-100的超声/免疫共沉淀缓冲液,我们使用含脱氧胆酸钠和N-月桂酰肌氨酸的超声/免疫共沉淀缓冲液,既充分通透细胞核核膜,又能充分溶解细胞核内蛋白-染色质复合体,同时为抗原-抗体结合提供适合的缓冲条件,这是本发明能够提高DNA得率的关键之一。
(7)DNA提取:使用DNA洗脱液(新鲜配制:0.1% SDS;50 mM NaHCO3)洗脱磁珠上的DNA(洗脱步骤:室温下旋转10分钟, 37℃热台震荡3分钟,将上清转移到新管加入蛋白酶K,55℃热台震荡45分钟;67℃热台震荡3.5小时),利用DNA纯化试剂盒(Zymo)提取DNA。
(8)生物素亲和以及转座酶切割:使用反应缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.5;10mM MgCl2;20% Dimethylformamide)重悬Streptavidin-C磁珠,并向Streptavidin-C磁珠悬液中加入第(7)步得到的DNA溶液,室温下亲和30分钟;对结合含生物素标记DNA的Streptavidin-C磁珠加入反应缓冲液和适量Tn5转座酶(例如第(7)步提取DNA量为25ng条件下加0.8μL Tn5),55℃下切割10分钟,间隔震荡。其中,Tn5转座酶用量经过摸索,参照25ng DNA使用0.8μL Tn5的比例可使切割后DNA片段集中分布于200~700bp范围内。
(9)文库构建:先使用Phusion高保真DNA聚合酶反应液(NEB m0531s)预清洗一遍第(8)步得到的Streptavidin-C磁珠,使用PCR扩增液(含25μL 2X Phusion高保真DNA聚合酶反应液、1μL 12.5μM的通用扩增引物、1μL 12.5μM的barcode特异性扩增引物、23μL三次蒸馏水)对Streptavidin-C磁珠上的DNA进行扩增,提前设定72℃预热PCR仪,之后进行PCR扩增程序:72℃ 5分钟 ->98℃ 1分钟 ->(98℃ 15秒 ->63℃ 30秒 ->72℃ 1分钟)9~12个循环;对PCR产物在Agilent TapeStation上进行文库电泳鉴定文库扩增质量;利用PippinDNA Size Selection系统或Ampure XP磁珠筛选200~700bp文库片段。
本步骤中,对PCR扩增前处理进行了优化,保证了组织样本来源的最终DNA模板在第一次扩增后即可达到最佳效果。如果不经本发明的前处理步骤直接PCR扩增,组织来源DNA很可能无法以此扩增成功,而反复多次扩增则会导致文库质量下降严重,即PCR重复片段比率升高。
实施例2
本发明不但适用于复杂组织样本,稍加改造后(将组织破碎裂解过程用简化的裂解细胞过程替换即可,后续步骤完全一致)也适用于在体外培养的细胞系中绘制特定蛋白介导的染色质三维互作图谱,并且相比现有类似技术效率提升较大,例如使用200万细胞即可在第(7)步得到150ng 左右DNA产物。
实施例3
(1)组织液氮速冻研磨和酶解
1.1取~50mg人类前列腺癌组织或~50mg癌旁组织放入研钵,加入2~3mL液氮进行速冻,使用研杵对速冻的组织块进行研磨;以下操作如无特殊说明,均是针对每个样本的用量;
1.2 将研磨后的组织转移到15mL酶解溶液(100U/ml II型胶原酶; 20nM ROCK抑制剂Y-27632; 1×抗菌-抗真菌剂;以上成分溶于1×Hank's平衡盐溶液)中,37℃下旋转酶解2小时;
1.3 1000g离心5分钟,用Hank's平衡盐溶液洗两遍;
1.4 弃上清,加入3mL 0.25% TrypLE,37℃下旋转酶解4分钟;
1.5 加入12mL含10%FBS的DMEM培养基终止酶解,1000g离心5分钟。
(2)交联和裂解
2.1 1000g离心5分钟,用PBS缓冲液洗一遍, 1000g离心5分钟,弃上清;
2.2 加入10mL终浓度为1%的多聚甲醛,交联10分钟,过程中使用组织匀浆器(Bio-Gen PRO200)1档研磨3次,每次6秒;
1.3 加入500μL浓度为2.5M的Glycine溶液(工作浓度125mM)静置5分钟,终止交联;
1.4 4℃下1000g离心5分钟,用冰上预冷的PBS缓冲液洗一遍,4℃下1000g离心5分钟,弃上清;
1.5 加入预冷的1mL 染色质构象捕获裂解液(含50 mM Hepes–KOH pH 7.5、140mMNaCl、1 mM EDTA、0.5% Igepal CA-630; 0.25% Triton X-100、蛋白酶抑制剂现用现加),充分混匀,4℃下旋转裂解50分钟。
(3)酶切
3.1 2500g离心5分钟,弃上清,用的10mL 染色质构象捕获裂解液重悬,2500g离心5分钟,弃上清;
3.2 室温下用200μL 0.5%的SDS溶液重悬;
3.3 62℃孵育15分钟;
3.4 加入570μL三次蒸馏水和100μL10%Triton X-100,混匀;
3.5 37℃孵育15分钟;
3.6 加入101.5μL 10 X NEB buffer 2和45μL (1125U)的限制性内切酶MboI(NEB-R0147);
3.7 37℃酶切2小时;
3.10 70℃孵育15分钟灭活MboI。
(4)标记和连接
4.1 加入75μL 0.4mM的biontin-dATP(Thermo 19524016)、3μL 10mM的dCTP、3μL10mM的dGTP、3μL 10mM的dTTP、20μL 5U/μL的DNA聚合酶Ⅰ(NEB-M0210),混匀;
4.2 37℃孵育1小时;
4.3 加入1896μL配置好的连接液(含300μL 10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液(NEB-B0202)、250μL 10%的Triton X-100、6μL 50 mg/mL的BSA、20μL 400U/μL的T4 DNA连接酶(NEB-M0202)、1320μL三次蒸馏水);
4.4 室温旋转混匀4小时;
4.5 2500g离心5分钟,弃上清。
(5)超声
5.1 超声前一天,取40μL Protein-A与40μLProtein-G磁珠混合(Thermofisher,10002D),在冰上用0.5% BSA溶液(PBS稀释)洗两遍,用600μL 0.5% BSA溶液重悬磁珠,并加入7.5μg CTCF抗体(CST,3418S),4℃下旋转过夜;
5.2 向(4.5)中的连接产物加入880μL超声缓冲液(10 mM Tris–HCl, pH 8; 50mM NaCl;1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA;0.1% Na–Deoxycholate; 0.5%N-lauroylsarcosine;蛋白酶抑制剂现用现加),重悬混匀后总体积约900μL,均分分到3个1.5mL超声管中;
5.3 在预先冷却好的Bioruptor® Pico超声仪中进行超声,每个循环条件为10秒on + 30秒 off,重复10个循环,取出超声管摇晃混匀后放回,继续10个循环;
5.4 将超声后液体集中到一个EP管中,加入90μL 10% Triton X-100混匀;
5.5 4℃下16000g离心15分钟;
5.6 将上清液平均分到两个EP管中,每管加入400μL超声缓冲液。
(6)染色质免疫共沉淀
6.1 将(5.1)中预处理的抗体-磁珠在冰上用0.5% BSA溶液(PBS稀释)洗一遍,并平均分到两个EP管中,用磁力架沉淀磁珠,弃上清;
6.2 每管磁珠中加入400μL(5.6)步产物,4℃下旋转过夜;
6.3 在冰上用磁力架吸附磁珠,弃上清,并用1mL 清洗缓冲液-1(50 mM Tris, pH7.6; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0.1%SDS;1% Igepal CA630;蛋白酶抑制剂现用现加)重悬,重复清洗10次,最后一次清洗的时候把同一样本磁珠集中到一个管中;
6.4 用100mM的碳酸氢铵溶液快速清洗一次,用磁力架吸附磁珠并弃上清。
(7)DNA提取
7.1 加入150μL DNA洗脱液(新鲜配制:0.1% SDS;50 mM NaHCO3)混匀;
7.2 室温下旋转10分钟;
7.3 37℃热台震荡3分钟;
7.4 利用磁力架将上清转移到新管;
7.5 加入15μL蛋白酶K(20mg/mL);
7.6 55℃热台震荡45分钟;
7.7 67℃热台震荡3.5小时;
7.8 DNA纯化试剂盒(Zymo)提取DNA,最后一步加入17μL三次蒸馏水洗脱DNA,重复洗脱一次;
7.8 取1μLDNA,利用Qubit测定浓度,所得DNA产量为:
癌旁: 2.84 ng/μL × 16 μL = 45.44 ng
肿瘤: 4.78 ng/μL × 16 μL = 76.48 ng
分别各取40 ng DNA用于后续实验。
(8)生物素亲和以及转座酶切割
8.1 取7.5μLStreptavidin-C磁珠,使用清洗缓冲液-2(5 mM Tris-HCl pH 7.5;0.5 nM EDTA;1M NaCl;0.05% Tween-20)清洗一遍;
8.2 向(8.1)步沉淀加入15μL 2X生物素结合缓冲液(20 mM Tris-HCl pH 7.5;10mM MgCl2;20% Dimethylformamide)重悬;
8.3 向(8.2)步磁珠悬液中加入15μL稀释到合适浓度的(7.8)步得到的DNA;
8.4 室温下旋转或震荡30分钟;
8.5 磁力架吸附磁珠,弃上清;
8.6 500μL 清洗缓冲液-2清洗磁珠2次,每次在55℃下震荡孵育2分钟;
8.7 使用100μL 1X TD缓冲液清洗磁珠一次;
8.8 加入25μL 2X TD缓冲液,和1.3μL Tn5转座酶,使用三次蒸馏水将体系补足50μL;
8.9 55℃下孵育10分钟,间隔震荡;
8.10 弃上清,加入500μL 50mM EDTA,混匀后50℃下间隔震荡30分钟;
8.11 500μL 50mM EDTA洗两次,每次50℃下间隔震荡3分钟;
8.12 500μL 清洗缓冲液-2清洗2次,每次55℃下间隔震荡2分钟;
8.13 500μL 10mM Tris缓冲液室温下清洗一次,弃上清。
(9)文库构建:
9.1 先用50μL 1X Phusion高保真DNA聚合酶反应液(NEBm0531s)重悬(8.13)步得到的磁珠;
9.2 利用磁力架弃上清,用50μL PCR扩增液(含25μL 2X Phusion高保真DNA聚合酶反应液、1μL 12.5μM的通用扩增引物、1μL 12.5μM的barcode特异性扩增引物、23μL三次蒸馏水)重悬磁珠;
9.3 提前设定72℃预热PCR仪,之后进行PCR扩增程序:72℃ 5分钟 ->98℃ 1分钟->(98℃ 15秒 ->63℃ 30秒 ->72℃ 1分钟)10个循环;
9.4利用磁力架将上清液转移至新的EP管中,剩余磁珠可在-20℃暂存,如果9.3步第一次扩增不成功,可重新扩增;
9.5 取1μL PCR产物在Agilent TapeStation上进行文库电泳鉴定文库扩增质量,DNA片段绝大部分分布在200~700bp范围,且峰值均在400bp左右,说明文库构建成功(见图1);
9.6 利用Pippin DNA Size Selection系统筛选200~700bp文库片段;
9.7 利用NovaSeq(Illumina)平台进行150bp双端测序,测序深度为150Gb;
9.8 对测序数据进行质控和初步分析,使用hicup软件进行将reads回帖到人类基因组上,hicup结果质控图显示两个样本有效reads均在85%以上,数据质量较高(见图2);使用juicer软件和R软件得到染色质三维互作环(loop)进行APA可视化分析,显示得到的CTCF介导的染色质环强度较高(R值越高说明环质量越好),且能够分辨出癌旁和肿瘤特异性染色质环(见图3);对得到的CTCF介导的染色质互作矩阵进行可视化,显示了典型的染色质三维互作特征;以上结果说明本次试验在临床样本中成功的获得了CTCF介导的染色质三维互作图谱(见图4)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)组织液氮速冻研磨和酶解
利用液氮对组织进行速冻,随后使用酶解溶液酶解,之后使用TrypLE 酶解;接着用10mL 1%的多聚甲醛交联酶解后的细胞,最后使用Glycine溶液终止交联;
(2)组织裂解
加入染色质构象捕获裂解液,染色质构象捕获裂解液为含50 mM Hepes–KOH pH 7.5、140 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% Igepal CA-630; 0.25% Triton X-100、蛋白酶抑制剂现用现加,旋转裂解50分钟;
(3)酶切
对组织裂解物使用限制性内切酶MboI酶切;
(4)生物素标记和连接
向酶切产物中加入biontin-dATP、 dCTP、dGTP、dTTP、DNA聚合酶,37℃下标记1小时;再加入连接液,室温下连接4小时;
(5)超声
超声前一天,抗体与免疫磁珠预先结合,使用超声缓冲液重悬步骤(4)得到的连接产物,超声仪中进行超声;
(6)染色质免疫共沉淀
将步骤(5)中预处理的抗体-磁珠与超声产物混合,4℃下旋转过夜;过夜后分别用清洗缓冲液、碳酸氢铵溶液清洗磁珠;
(7)DNA提取
使用DNA洗脱液洗脱磁珠上的DNA,然后利用DNA纯化试剂盒提取DNA;
(8)生物素亲和以及转座酶切割
使用反应缓冲液重悬Streptavidin-C磁珠,并向Streptavidin-C磁珠悬液中加入第(7)步得到的DNA溶液,室温下亲和30分钟;对结合含生物素标记DNA的Streptavidin-C磁珠加入反应缓冲液和Tn5转座酶,55℃下切割10分钟,间隔震荡;
(9)文库构建
先使用Phusion高保真DNA聚合酶反应液预清洗一遍步骤(8)得到的Streptavidin-C磁珠,使用PCR扩增液,对Streptavidin-C磁珠上的DNA进行扩增,提前设定72℃预热PCR仪,保证反应液迅速升温,PCR扩增程序为:72℃ 5分钟 -> 98℃ 1分钟 ->98℃ 15秒 -> 63℃30秒 -> 72℃ 1分钟,9~12个循环;对PCR产物在Agilent TapeStation上进行文库电泳鉴定文库扩增质量;利用Pippin DNA Size Selection系统或Ampure XP磁珠筛选200~700bp文库片段。
2.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(1)中,酶解溶液为100U/ml II型胶原酶,20nM ROCK抑制剂Y-27632,1×抗菌-抗真菌剂,以上成分溶于1×Hank's平衡盐溶液;酶解条件为37℃下旋转酶解2小时;多聚甲醛交联酶解后的细胞10分钟,过程中使用组织匀浆器1档研磨3次,每次6秒。
3.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(3)中,限制性内切酶MboI酶切条件为37℃酶切2小时。
4.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(4)中,连接液为含300μL 10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液、250μL 10%的Triton X-100、6μL 50 mg/mL的BSA、20μL 400U/μL的T4 DNA连接酶、1320μL三次蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(5)中,抗体与免疫磁珠分别为Protein-A与Protein-G磁珠,超声缓冲液为10 mM Tris–HCl, pH 8; 100 mM NaCl;1 mM EDTA; 0.5 mM EGTA;0.1% Na–Deoxycholate; 0.5% N-lauroylsarcosine;蛋白酶抑制剂现用现加;超声条件为每个循环10秒 on + 30秒 off,重复10个循环,取出超声管摇晃混匀后放回,继续10个循环。
6.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(6)中,清洗缓冲液为50 mM Tris, pH 7.6;150 mM NaCl;1 mMEDTA;0.1% SDS;1% Igepal CA630(或NP40);0.5% Na–Deoxycholate;蛋白酶抑制剂现用现加。
7.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(7)中,洗脱步骤:室温下旋转10分钟, 37℃热台震荡3分钟,将上清转移到新管加入蛋白酶K,55℃热台震荡45分钟;67℃热台震荡3.5小时。
8.根据权利要求1所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(9)中,PCR扩增液为含25μL 2X Phusion高保真DNA聚合酶反应液、1μL 12.5μM的通用扩增引物、1μL 12.5μM的barcode特异性扩增引物、23μL三次蒸馏水。
9.根据根据权利要求1-9任意一项所述的一种高通量组织样本染色质免疫共沉淀合并染色质构象捕获方法,其特征在于:所述步骤(1)、(2)用简化的裂解细胞过程替换,后续步骤完全一致;能够将其应用于在体外培养的细胞系中绘制特定蛋白介导的染色质三维互作图谱。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117286229A (zh) * 2023-11-23 2023-12-26 中山大学中山眼科中心 一种mhc区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300767A (zh) * 2017-10-27 2018-07-20 清华大学 一种核酸复合体中核酸区段相互作用的分析方法
US20190203203A1 (en) * 2016-09-02 2019-07-04 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Genome-wide identification of chromatin interactions
US20200123590A1 (en) * 2017-06-16 2020-04-23 The Jackson Laboratory Single nucleus and single molecule chromatin interaction assays

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190203203A1 (en) * 2016-09-02 2019-07-04 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Genome-wide identification of chromatin interactions
US20200123590A1 (en) * 2017-06-16 2020-04-23 The Jackson Laboratory Single nucleus and single molecule chromatin interaction assays
CN108300767A (zh) * 2017-10-27 2018-07-20 清华大学 一种核酸复合体中核酸区段相互作用的分析方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117286229A (zh) * 2023-11-23 2023-12-26 中山大学中山眼科中心 一种mhc区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法
CN117286229B (zh) * 2023-11-23 2024-05-03 中山大学中山眼科中心 一种mhc区域三维基因组结构的高通量长读长测序方法

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