CN116536308A - 测序封闭剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种封闭剂，包含所述封闭剂的试剂盒，以及使用该封闭剂构建NGS文库的方法。具体地，本发明的封闭剂包括用于封闭NGS测序中文库成员序列的接头的一种或者多种封闭核苷酸，所述封闭核苷酸具有SEQ ID NOs:1‑4中任一项所示的核苷酸序列，并且所述封闭核苷酸带有用于提高Tm值的一个或者多个修饰。
Description
技术领域
本发明属于核酸测序领域，具体地，本发明涉及核酸测序中使用的试剂。
背景技术
NGS(next generation sequencing)作为高通量测序技术(HTS)，可以实现短时间内同时检测大量核苷酸，因此以低成本、高准确度、高通量和快速检测而成为目前最常用的基因检测手段之一。在NGS测序方向，主流NGS测序涉及三种类型：全基因组测序；杂交捕获测序和扩增子测序。其中，杂交捕获测序是常用的目标基因多位点检测方案之一，该方案通过设计合成有效的特异性探针集Panel，与基因组DNA进行杂交，将目标区域序列进行捕获并富集后，再使用测序平台进行高通量测序。由于文库构建过程中引入了大量的非靶区DNA序列，如重复序列、接头和标签序列等，这些序列又具有高度的相似性，会在杂交捕获过程中，干扰探针和靶区的结合，引入大量非特异性捕获，导致捕获效率降低。所以在靶向捕获过程中，需要将非靶区DNA序列进行封闭，阻断文库之间的串联反应发生。
目前接头序列的封闭是在杂交体系中加入大量与接头序列反向互补的寡核苷酸，由于对于单端Index的干扰问题，目前更愿意使用双端Index接头来进行实验，然而，含有多个标签时最好是通用的序列来封闭标签。目前国产的双index的接头封闭剂选择种类少，封闭效果不高，且合成回收率低，成本昂贵。亟需新型的接头封闭剂，用于阻止文库接头之间的非特异性结合，从而提高捕获效率和数据利用率。
发明内容
本发明的目的在于提供用于NGS(二代测序)的文库成员序列的接头封闭剂，包含其的试剂盒，及其在文库构建以及NGS中的应用。
第一方面，本发明提供了封闭剂，所述封闭剂包括能够封闭NGS测序中文库成员序列的接头的一种或者多种封闭核苷酸，所述封闭核苷酸具有SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的核苷酸序列，并且所述封闭核苷酸带有用于提高Tm值的一个或者多个修饰。
在一些实施方案中，所述修饰包括但不限于选自如下的至少一个：
交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲基-dc)；2,6-二氨基嘌呤；锁核酸(LNA)；桥接核酸(BNA)；三环核酸；肽核酸(PNA)；C5修饰的嘧啶碱基；丙炔基嘧啶；吗啉代；亚磷酰胺；和5'-芘帽。
优选地，所述修饰为LNA修饰和/或3'末端基团修饰。
所述3'末端基团可包括例如3'-dC，2',3'-ddC，反向dT(inverted dT)，3'-间隔物C3(3'-spacer C3，在本文中简称为3SpC3)。
所述LNA(locked nucleic acid)是经化学修饰的特殊双环状核苷酸衍生物，其核酸单体核糖的2'-O位和4'-C位通过缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形。
在一些实施方案中，带有LNA修饰的C和G碱基数多于带有LNA修饰的A和T碱基数。
在一些实施方案中，带有LNA修饰的C碱基的数量高于其他碱基，LNA修饰的C碱基数越多，其稳定性越好，封闭效果越好。
在一些实施方案中，所述封闭核苷酸具有选自SEQ ID NOs:5-16任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述封闭剂包含第一封闭核苷酸和第二封闭核苷酸，所述第一封闭核苷酸封闭文库成员的5'端，所述第二封闭核苷酸封闭文库成员的3'端。
在一些实施方案中，所述封闭剂包括选自如下任一组的第一封闭核苷酸和第二封闭核苷酸：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ IDNO：14；和SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
在一些实施方案中，所述封闭剂能够封闭用于NGS测序平台的文库成员序列的接头，所述NGS测序平台为Illumina测序平台或MGI测序平台。
在一些实施方案中，所述封闭剂能够封闭Illumina接头(adaptor)序列，或MGI接头序列。
在一些实施方案中，所述接头包括通用序列区，索引区(Index)或单一分子标签(UMI)区中的至少一种。
在一些实施方案中，所述通用序列区包括通用接头部分和/或通用引物序列部分。
在一些实施例中，所述通用引物序列包括P5、P7、P5'和/或P7'。
在一些实施例中，所述通用引物序列包括MGI平台双索引区(Index)扩增引物：
primer-1(Index2)：/5Phos/CTCTCAGTACGTCAGCAGTTXXXXXXXXXXCAACTCCTTGGCTCACAG AAC；
primer-2(Index1)：GCATGGCGACCTTATCAGXXXXXXXXXXTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG(反向互补序列：CCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA)。
在一些实施方案中，位于MGI平台的文库成员序列中靶序列以5’-3’方向左侧的接头部分为：
/5Phos/CTCTCAGTACGTCAGCAGTTXXXXXXXXXXCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT(共计72mer)(下划线是通用引物部分51mer，没有下划线的是通用接头部分21mer)；
在一些实施方案中，位于MGI平台的文库成员序列中靶序列以5’-3’方向右侧的接头部分为：
AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGATAAGGTCGCCATGC(共计60mer)(下划线是通用引物部分50mer，没有下划线的是通用接头部分9+1＝10mer，其中1是在末端修饰中添加的A)。
所述XXXXXXXXXX为Index区。
在一些实施方案中，位于文库成员序列中靶序列以5’-3’方向左侧的接头部分为：
/5Phos/CTCTCAGTACGTCAGCAGTTXXXXXXXXXXCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTYYYYYY(共计78mer)(下划线是通用引物部分51mer，没有下划线的是通用接头部分21mer，XXXXXXXXXX为Index区，YYYYYY为UMI区)；
在一些实施方案中，位于文库成员序列中靶序列以5’-3’方向右侧的接头部分为：
YYYYYYAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGATAAGGTCGCCATGC(共计68mer)(下划线是通用引物部分50mer，没有下划线的是通用接头部分9+1＝10mer，其中1是在末端修饰中添加的A，XXXXXXXXXX为Index区，YYYYYY为UMI区)。
在一些实施方案中，所述MGI双端Index的接头的文库成员具有如下序列：
5-phos-CTCTCAGTACGTCAGCAGTTXXXXXXXXXXCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATC CGACTT-insertDNA-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGATAAGGTCGCCATG C，其中，XXXXXXXXXX为双端index区；
在一些实施方案中，所述MGI双端Index的接头的文库成员具有如下序列：
5-phos-CTCTCAGTACGTCAGCAGTTXXXXXXXXXXCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATC CGACTTYYYYYY-insertDNA-YYYYYYAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGAT AAGGTCGCCATGC，其中，XXXXXXXXXX为双端index区,YYYYYY为UMI序列。
在一些实施方案中，所述封闭剂还包括Human Cot DNA或Salmon Sperm DNA。
第二方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含第一方面的封闭剂。
第三方面，本发明提供了一种用于NGS的文库构建方法，所述方法包括将第一方面的封闭剂与第一方面中的文库成员结合的步骤。
第四方面，本发明提供了用于NGS的文库富集方法，所述方法包括将利用第二方面的文库构建方法构建的文库与探针进行混合，捕获杂交探针，并且获得富集的文库成员的步骤。
第五方面，本发明提供了NGS测序方法，所述方法包括第三方面的文库构建步骤以及第四方面的文库富集步骤。
第六方面，本发明提供了第一方面的封闭剂，第二方面的试剂盒，第三方面的方法构建的文库，以及第四方面的方法富集的文库成员在文库构建或NGS测序中的应用。
在本发明中，还发现低于1μg的封闭核苷酸的封闭效果较差，而且封闭核苷酸与文库的量高于1：1的比例时，封闭效果达到最佳，再投入封闭序列也达到饱和状态，因此从成本和效果综合考虑，封闭序列的投入量与文库的量为1：1的比例最佳。
本发明提供了用于封闭平台NGS测序平台双端Index文库接头的通用封闭核苷酸，所述通用封闭核苷酸对包含双端Index、及添加了UMI序列的接头都能完全封闭，显著降低了非特异捕获干扰，增强了捕获效果。
使用本发明中的通用封闭核苷酸和40M、2M、600K、200K不同大小Panel进行MGI文库靶向捕获测序，经数据分析，捕获效率均优于市场上现有的封闭剂；而且，封闭核苷酸适用于各种大小的panel，其捕获率优于市场上现有的封闭剂。
具体实施方式
以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
NGS(next generation sequencing)称作下一代测序，也称作二代测序，由于通量高，一次测序能读取成千上万个短DNA片段(相比于Sanger测序一次只能测一条DNA片段)，又被称为高通量测序。NGS可以对基因组的成百上千个基因、甚至全部人类基因进行大规模的平行测序，同时对产生的数十万至数百万的数据进行同时读取。
杂交捕获的原理是人工设计探针(DNA探针或者RNA探针)，探针可以和目标区段部分或者全部互补。该方案通过设计合成有效的特异性探针集Panel，与基因组DNA进行杂交，将目标区域序列进行捕获并富集后，使用主流的测序平台进行高通量测序。探针通常被设计为与靶基因组内的目的区域杂交，通常长度为60至200个碱基。
Index为索引，标志，也可以称作Barcode，用来识别测序得到的数据属于哪个样本。高通量测序仪相对于一代测序或者PCR的实验方法，有个明显的特点就是通量高，能在一个反应内完成数百万甚至数亿的测序反应，这么大的数据量往往是几十甚至几百个样本混合在一起产生的数据，Index的作用就是把每条测序数据(Reads)属于某一样本进行还原分类。Index通常作为接头的一个组成部分，因此，不存在称作Index的独立试剂组分。不同测序平台Index的位置，常用长度，数量都不完全相同。华大智造(MGI)MGI平台使用较多的是双端Index，长度一般10bp。
Human Cot DNA是从人胎盘中提取的基因组DNA，为人基因组中长约50至300bp的高度重复序列，能够方便、有效地对探针或待检测样品的核酸序列中的重复序列进行封闭，屏蔽重复序列，从而避免核酸杂交过程中非特异性杂交信号的干扰，以便增强核酸杂交的效果，最终实现对待检测核酸样本中的核酸序列的有效捕获，起到“封闭(block)”的作用。具体而言，Human Cot-1 DNA可用于封闭人基因组高拷贝区域/低序列复杂度区域。
Salmon Sperm DNA能够有效地对探针或待检测其他物种的样品的核酸序列中的重复序列进行封闭，屏蔽重复序列。
UMI(Unique molecular identifier)，单一分子标签，是一段序列已知的随机合成序列，可以设计为完全随机的核苷酸链、部分简并核苷酸链或者固定核苷酸链，长度通常为10nt(单端UMI)或5-8nt(双端UMI)。其作用是冻结DNA片段扩增前的状态，每个DNA分子对应一个UMI，因此生信分析时可以区分不同来源的DNA模板，分辨哪些是PCR扩增及测序过程中的随机错误造成的假阳性突变，例如，哪些是患者真正携带的突变，从而过滤掉背景噪音，实现低频和极低频突变的准确检测，对不同DNA分子进行绝对定量等。UMI可用于低频突变检测，尤其是在肿瘤的研究领域中。
序列：
NNNNNNAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNAACTGCTGACGTACTGAGAG(SEQ ID NO:1)；
NNNNNNAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAANNNNNNNNNNCTGATAAGGTCGCCAT GC(SEQ ID NO:2)；
CTCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNT(SEQ ID NO:3)；
GCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTNNNNNT(SEQ ID NO:4)；
NNNNNNA+AGTC+GGAT+CGTAGC+CATGT+CGTT+CTGTGA+GCCAA+GGA+GTT+GNNNNNNNNNNAA+CTGCT+GACG+TACT+GAGAG/3SpC3/(SEQ ID NO:5)(A1)；
NNNNNNAA+GTC+GGAGG+CCA+AGCG+GTCTTA+GGA+AGA+CAANNNNNNNNNNCT+GATA+AGGT+CGC+CAT+GC/3SpC3/(SEQ ID NO:6)(A2)；
CTC+TCAG+TACGT+CAGC+AGT+TNNNNNNNNNNC+AAC+TCCT+TGGCT+CACAGA+ACGACA T+GGCTACGA+TCCGACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:7)(B1)；
GC+ATG+GCGAC+CTTA+TCA+GNNNNNNNNNNT+TGT+CTTC+CTAAG+ACCGCT+TGGC+CTC CG+ACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:8)(B2)；
CTCTC+AGT+ACGTC+AGC+AGTTNNNNNNNNNNC+A+ACTCCTTGGCTC+AC+AG+A+ACG+AC+ATGGCT+ACG+ATCCG+ACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:9)(B3)；
GC+ATGGCG+ACCTT+ATC+AGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCT+A+AG+ACCGCTTGGCCTCCG+ACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:10)(B4)；
C+TC+TCAG+TACG+TCAGCAG+T+TNNNNNNNNNNCAAC+TCC+T+TGGC+TCACAGAACGACA+TGGC+TACGA+TCCGAC+T+TNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:11)(B5)；
GCA+TGGCGACC+T+TA+TCAGNNNNNNNNNN+T+TG+TC+T+TCC+TAAGACCGC+T+TGGCC+TCCGAC+T+TNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:12)(B6)；
+CT+CT+CAGTA+CGT+CAG+CAGTTNNNNNNNNNN+CAA+CT+C+CTTGG+CT+CA+CAGAA+CGA+CATGG+CTA+CGAT+C+CGA+CTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:13)(B7)；
G+CATGG+CGA+C+CTTAT+CAGNNNNNNNNNNTTGT+CTT+C+CTAAGA+C+CG+CTTGG+C+CT+C+CGA+CTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:14)(B8)；
CTCTCA+GTAC+GTCA+GCA+GTTNNNNNNNNNNCAACTCCTT+G+GCTCACA+GAAC+GACAT+G+GCTAC+GATCC+GACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:15)(B9)；
+GCAT+G+GC+GACCTTATCA+GNNNNNNNNNNTT+GTCTTCCTAA+GACC+GCTT+G+GCCTCC+GACTTNNNNNT/3SpC3/(SEQ ID NO:16)(B10)；
其中，+表示LNA修饰，N表示简并碱基N(A/T/C/G)，/3SpC3/为3’端的封闭修饰。
实施例
实施例中所用的竞品为：
艾吉泰康，产品名称:TargetSeq Blocking Oligo(for MGI DI)，货号C80521。
实施例1：本实例通过对A组、B组设计的序列进行测试，用竞品作为对照。目的是验证设计的封闭效果。
1.预文库构建：采用DNA建库试剂盒(VAHTS Universal DNA Library Prep Kitfor MGI)以及自设计的带UMI的接头，对正常人的gDNA构建本实施例所用的文库；
2.杂交捕获：
将通用封闭序列A1和A2进行1：1混合，记为A组。
将通用封闭序列B1和B2进行1：1混合，记为B组。
将构建好的文库真空浓缩后进行捕获杂交，具体的杂交文库混合步骤如下表1：
表1：
| 组分 | 总量 |
| 文库 | 6μg |
| Human Cot DNA | 5μl |
| 通用封闭序列 | 6μg |
通用的封闭序列：
A1:
A2:
B1:
B2:
其中+表示LNA修饰，N表示简并碱基N，/3SpC3/为3’端的封闭修饰。
杂交时，分别设定考察条件，参见下表2：
表2：
具体杂交操作如下：
提前开启PCR仪杂交程序，核对杂交程序：(95℃，30s；65℃，4-16h；热盖温度100℃)；
1.探针置于4℃溶解后轻弹管身混匀离心，纳昂达Hybridization Buffer置于室温溶解，振荡离心后置于冰盒上备用；
2.杂交前，按照下表配制杂交mix，振荡混匀后分装至蒸干的杂交混合物中，充分振荡混匀并离心，置于PCR仪中进行杂交；
杂交Buffer配制量参见下表3：
表3：
| 组分 | 单管反应体积(μL) |
| Hybridization Buffer1 | 8.5 |
| Hybridization Buffer2 | 2.7 |
| Nuclease-Free Water | 1.8 |
| Ed3b探针 | 4 |
| 总体积 | 17 |
3.提前至少半小时将M-270磁珠室温平衡，洗脱试剂，可提前一晚从-20℃冰箱中取出Wash Buffer1、2、3、4和Bead Wash Buffer原液，置于4℃解冻；
按照下表4配制磁珠重悬液：
表4磁珠重悬液配制：
| 组分 | 单管反应体积(μL) |
| Hybridization Buffer1 | 8.5 |
| Hybridization Buffer2 | 2.7 |
| Nuclease-Free Water | 5.8 |
4.将PCR管加入10μl磁珠和100μL Bead Wash Buffer，上下吹打15-20下混匀，使管壁无残留，置于磁力架上，约15s澄清后，弃去上清；
5.向管中加入100μL Bead Wash Buffer，上下吹打15-20下混匀，使管壁无残留；将管置于磁力架上，待完全澄清后，弃去上清；重复上一步骤2次，完成两次磁珠洗涤；
6.向管中加入17μL磁珠重悬液，上下吹打15-20下混匀，此时磁珠重悬完成，可进行后续操作；
7.用移液器使用带滤芯枪头将杂交产物转移到带磁珠的PCR中，轻轻混匀。65℃孵育45min，热盖温度设置为70℃；
8.洗涤磁珠与靶序列结合物孵育完成后，按照下表顺序及用量洗涤，热洗脱时注意使用合适量程的排枪及带滤芯枪头：
洗涤顺序及用量见下表5：
表5：
| 组分 | 单管反应体积(μL) |
| Wash Buffer 1(65℃) | 加100μL，吹打混匀，弃上清 |
| Wash Buffer 2(65℃) | 加150μL，65℃孵育5min，弃上清 |
| Wash Buffer 2(65℃) | 加150μL，65℃孵育5min，弃上清 |
| Wash Buffer 1(RT) | 加150μL，振荡2min，弃上清 |
| Wash Buffer 3(RT) | 加150μL，振荡2min，弃上清 |
| Wash Buffer 4(RT) | 加150μL，振荡2min，弃上清 |
| Nuclease-Free Water | 22.5μL回溶后振荡混匀后置于冰盒上备用 |
9.按照下表6配制PCR反应PCR反应液：
表6：PCR反应液配制量：
10.向回溶后的22.5μL带磁珠的洗脱产物中加入PCR反应液，充分振荡混匀；
11.按照下表7的PCR运行程序进行PCR：
表7：PCR运行程序
12.将样本离心后置于板式磁力架上，取上清加入60μLAxygen/VAHTS磁珠中，震荡混匀后，室温下孵育5-10min(AxyGen磁珠孵育5min，VAHTS磁珠孵育10min)，使磁珠与DNA片段充分结合，孵育期间配制80％乙醇(10mL超纯水+40mL无水乙醇)；
13.将EP管离心后置于磁力架上至澄清，弃上清；向每个EP管中加入200μL80％乙醇洗涤，旋转一周后弃上清，加入200μL80％乙醇洗涤，重复以上步骤一次；
14.乙醇洗涤完成后弃尽上清，常温干燥磁珠，磁珠表面无水光出现轻微裂痕后加入30μL low TE回溶，震荡混匀，室温下孵育5min，使DNA片段充分溶解入low TE中。实验结果如表8所示：
表8：
| 组别 | A组 | B组 | 竞品 |
| 捕获率 | 78.40％ | 75.43％ | 64.25％ |
实验证明，本发明设计的两款通用封闭序列均优于竞品。
实施例2：本实施例，通过对不同投入量的封闭序列进行测试，来探索其使用范围和最佳用量。
用A组序列进行测试，采用实施例1的方法进行文库构建及捕获测试。条件设定见下表9：
表9：
通用的封闭序列：
A1:
NNNNNNA+AGTC+GGAT+CGTAGC+CATGT+CGTT+CTGTGA+GCCAA+GGA+GTT+GNNNNNNNNNNAA+CTGCT+GACG+TACT+GAGAG/3SpC3/(SEQ ID NO:5)
A2:
NNNNNNAA+GTC+GGAGG+CCA+AGCG+GTCTTA+GGA+AGA+CAANNNNNNNNNNCT+GATA+AGGT+CGC+CAT+GC/3SpC3/(SEQ ID NO:6)
实验结果见下表10：
表10：
| 组别 | 200ng | 500ng | 1μg | 3μg | 6μg |
| 捕获率 | 53.60％ | 57.87％ | 7.69％ | 74.44％ | 73.72％ |
实验证明，封闭序列低于1μg的封闭序列，封闭效果较差。高于1：1的比例时，封闭效果达到最佳，再投入封闭序列也达到饱和状态，因此从成本和效果综合考虑，封闭序列的投入量与文库1：1最佳。
实施例3：本实例与实施例1的步骤相同，唯一不同之处的在于，通用封闭序列为B组，同时其修饰碱基位置不同。该例探索封闭序列碱基修饰位置。将B1、B2分别设计LNA修饰A碱基、T碱基、C碱基、G碱基，序列如下：
B3:
B4:
B5:
B6:
B7:
B8:
B9:
B10:
条件设定见下表11：
表11：
实验结果件下表12：
表12：
| 组别 | B3+B4 | B5+B6 | B7+B8 | B9+B10 |
| 捕获率 | 53.60％ | 57.87％ | 76.9％ | 74.44％ |
实验证明，LNA修饰不同的碱基，其封闭效果是不同。修饰C、G碱基效果会优于A、T碱基，这可能与它的化学键更稳定有关。同时修饰C碱基的修饰数量高于其他碱基，因此封闭效果也受影响，修饰数越高，其稳定性越好，因此封闭效果越好。
实施例4.该实施例是探索封闭序列在不同大小panel上的表现。
与实施例1的步骤相同，只是捕获中使用的panel不同，本例考察了封闭序列约40M、2M、600K、200K不同大小panel的性能。
通用的封闭序列：
A1:
A2:
实验结果见下表13：
表13：
| 组别 | 40M | 2M | 600K | 200K | 20K |
| 捕获率 | 70.60％ | 71.51％ | 73.44％ | 70.44％ | 72.15％ |
实验证明，封闭序列适用于各种大小的panel，其捕获率优于竞品。
Claims (12)
1.封闭剂，所述封闭剂包括用于封闭NGS测序中文库成员序列的接头的一种或者多种封闭核苷酸，所述封闭核苷酸具有SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的核苷酸序列，并且所述封闭核苷酸带有用于提高Tm值的一个或者多个修饰。
2.根据权利要求1所述的封闭剂，所述修饰包括选自如下的至少一个：
交联的寡核苷酸；经修饰的5-甲基脱氧胞苷(5-甲基-dc)；2,6-二氨基嘌呤；锁核酸(LNA)；桥接核酸(BNA)；三环核酸；肽核酸(PNA)；C5修饰的嘧啶碱基；丙炔基嘧啶；吗啉代；亚磷酰胺；和5'-芘帽，
优选地，所述修饰为LNA修饰和/或3'末端基团修饰，
优选地，所述3'末端基团选自3'-dC，2',3'-ddC，反向dT(inverted dT)和3SpC3。
3.根据权利要求1所述的封闭剂，所述封闭核苷酸带有LNA修饰的C和G碱基数多于带有LNA修饰的A和T碱基数，
优选地，带有LNA修饰的C碱基的数量多于其他碱基。
4.根据权利要求1所述的封闭剂，所述封闭核苷酸具有选自SEQ ID NOs:5-16任一项所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的封闭剂，所述封闭剂包含选自如下任一组的第一封闭核苷酸和第二封闭核苷酸：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；和
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
6.根据权利要求1所述的封闭剂，所述封闭剂封闭MGI测序平台的文库成员序列的接头，所述接头5’-3’方向左侧的接头部分为：
并且
所述接头5’-3’方向右侧的接头部分为：
AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGATAAGGTCGCCATGC，
其中，XXXXXXXXXX为Index区。
7.根据权利要求6所述的封闭剂，所述封闭剂封闭MGI测序平台的文库成员序列的接头，所述接头5’-3’方向左侧的接头部分为：
所述接头以5’-3’方向右侧的接头部分为：
YYYYYYAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAXXXXXXXXXXCTGATAAGGTCGCCATGC，
其中，XXXXXXXXXX为Index区，YYYYYY为UMI区。
8.根据权利要求1所述的封闭剂，所述封闭剂还包括Human Cot DNA或Salmon SpermDNA。
9.试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-8任一项的封闭剂。
10.用于NGS的文库构建方法，所述方法包括将权利要求1-8任一项的封闭剂与权利要求1-8任一项中的文库成员结合的步骤。
11.用于NGS的文库富集方法，所述方法包括将利用权利要求10的文库构建方法构建的文库与探针进行混合，捕获杂交探针，并且获得富集的文库成员的步骤。
12.权利要求1-8任一项的封闭剂，权利要求9的试剂盒，权利要求10的方法构建的文库，以及权利要求11的方法富集的文库成员在文库构建或NGS测序中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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