CN112626189A - 基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系 - Google Patents
基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供的一种基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系,短接头包括两条部分互补的接头寡核苷酸链:接头寡核苷酸链1,由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T;接头寡核苷酸链2,由5’端到3’端依次包括反义分子标签、反义接头互补区和index1引物结合区。使用上述短接头构建的双index文库体系的片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有的双index文库体系。
Description
技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域,具体涉及一种基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系以及应用。
背景技术
二代测序技术(NGS)的发展,大大提高了测序速度和测序通量。华大智造推出的DNBSEQ-T7,单日数据产量可达6Tb,是十年前Genome Analyzer的6000倍。如此巨大通量的提升,使得更多的样本可以在同一个Run 中同时测序。目前解决样本混合测序的策略,是在不同样本的DNA片段上引入样本特异的条形码序列(index)。通过识别index序列信息,实现单样本数据的拆分。2017年Illumina发布白皮书指出,在大规模混合测序中,排他性扩增、index测序错误以及残留的引物、接头在多文库混合杂交后PCR 中引入的嵌合体文库是导致标签跳跃(index hopping)的主要原因。推荐使用双index策略减少因上述原因造成的标签识别错误。
Gene+Seq2000平台在测序芯片外通过滚环扩增(RCA)进行文库信号放大,使其从原理上避免了排他性扩增带来的index hopping,降低了样本间串扰,从而提高了低频变异检测灵敏度和特异性。通过增加index间的编辑距离,消除了index测序错误导致的index交叉污染。目前现有的单index文库体系已被证实存在index hopping的风险。基于此,本公司进行了接头引物优化,独创性的对该文库结构进行优化。对比实验结果显示,优化后的吉因加特异双端index文库体系片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有双index文库体系。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的双端index接头建库体系存在片段转化效率低,index组合间扩增效率均一性差、捕获效率均一性差以及测序数据产量不稳定的缺陷。从而提供一种短接头、双index 接头引物、双index建库体系以及应用。
为此,本发明提供了如下的技术方案:
第一方面,本发明提供了一种短接头,包括两条部分互补的接头寡核苷酸链:
接头寡核苷酸链1,由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T;所述index2引物结合区的长度为15-42bp,所述正义接头互补区长度为8bp,所述正义分子标签的长度为2-10bp;所述正义接头互补区全部或部分与index2引物结合区的3’末端序列重合;
接头寡核苷酸链2,由5’端到3’端依次包括与接头寡核苷酸链1中的正义分子标签反向互补的反义分子标签、与接头寡核苷酸链1正义接头互补区反向互补的反义接头互补区和index1引物结合区;所述反义分子标签长度为2-10bp,所述反义接头互补区长度为8bp,所述index1引物结合区长度为15-30bp;所述反义接头互补区全部或部分与index1引物结合区的5’末端序列重合。
在所述的短接头中,接头寡核苷酸链2的5’端磷酸化修饰;优选的,所述短接头为Y型短接头。
第二方面,本发明提供了一种双index接头引物,包括正向接头引物和反向接头引物;
正向接头引物,由5’端到3’端依次包括GF引物序列、index2序列和 index2引物结合区序列;
反向接头引物,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、 index1引物结合区反向互补序列。
在所述双index接头引物中,所述index1序列和index2序列的长度均为8-10bp;所述index1序列和index2序列相同或不同;优选的,所述index1 序列和index2序列选自表1;
表1index1和index2序列信息
第三方面,本发明提供了一种双index接头封阻序列,包括正向接头封阻序列和反向接头封阻序列;
正向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括正义接头互补区反向互补序列、index2引物结合区反向互补序列、index2序列反向互补序列和GF引物序列反向互补序列;正义接头互补区反向互补序列全部或部分与index2 引物结合区反向互补序列5’末端序列重合;
反向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列和反义接头互补区反向互补序列;所述反义接头互补区反向互补序列全部或部分与index1引物结合区反向互补序列3’末端序列重合。
在所述的双index接头封阻序列中,所述index1序列和index2序列反向互补序列的长度均为8-10bp;所述index1序列和index2反向互补序列相同或不同;优选的,所述index1序列和index2反向互补序列选自表1。
在所述的双index接头封阻序列中,正向接头封阻序列的3’端磷酸化修饰;反向接头封阻序列的3’端磷酸化修饰。
第四方面,本发明提供了一种双index文库结构,包括利用所述的短接头和/或所述的双index接头引物制备而成。
第五方面,本发明提供了一种双index建库体系,包括所述的短接头、所述的双index接头引物和/或所述的双index接头封阻序列。
第六方面,本发明提供了一种双index探针杂交捕获体系,包括所述的双index接头封阻序列。进一步的,还包括GF引物和GR引物。
第七方面,本发明提供了一种文库构建方法,包括利用所述的短接头、所述的双index接头引物和/或所述的双index接头封阻序列。
第八方面,本发明提供了一种测序方法,包括利用所述的文库结构。
所述的测序方法,测序平台为Gene+Seq 2000、Gene+Seq200和 DNBSEQ-T7。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的一种短接头,包括两条部分互补的接头寡核苷酸链:
接头寡核苷酸链1,由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T;所述index2引物结合区的长度为15-42bp,所述正义接头互补区长度为8bp,所述正义分子标签的长度为2-10bp;所述正义接头互补区全部或部分与index2引物结合区的3’末端序列重合;接头寡核苷酸链2,由5’端到3’端依次包括与接头寡核苷酸链1中的正义分子标签反向互补的反义分子标签、与接头寡核苷酸链1 正义接头互补区反向互补的反义接头互补区和index1引物结合区;所述反义分子标签长度为2-10bp,所述反义接头互补区长度为8bp,所述index1 引物结合区长度为15-30bp;所述反义接头互补区全部或部分与index1引物结合区的5’末端序列重合。使用上述短接头构建的双index文库体系的片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有的双index文库体系。
2.本发明提供的一种双index接头引物,包括正向接头引物和反向接头引物;正向接头引物,由5’端到3’端依次包括GF引物序列、index2序列和index2引物结合区序列;反向接头引物,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列;使用上述双index 接头引物构建的双index文库体系的片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有的双 index文库体系。
3.本发明提供的一种双index接头封阻序列,包括正向接头封阻序列和反向接头封阻序列;正向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括正义接头互补区反向互补序列、index2引物结合区反向互补序列、index2序列反向互补序列和GF引物序列反向互补序列;正义接头互补区反向互补序列全部或部分与index2引物结合区反向互补序列5’末端序列重合;反向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列和反义接头互补区反向互补序列;所述反义接头互补区反向互补序列全部或部分与index1引物结合区反向互补序列3’末端序列重合;上述双index接头封阻序列在液态探针杂交的文库接头封闭过程中封闭效率高,减少由于接头序列杂交导致的非特异性文库片段捕获,提高了目标文库片段的捕获效率。
4.本发明提供的一种双index建库体系,包括所述的短接头和/或所述的双index接头引物和/或所述的双index接头封阻序列;上述双index建库体系所构建的双index文库体系的片段转化效率、index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均显著优于现有的双index 文库体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明中短接头和双index接头引物的结构示意图;
图2是本发明实验例1中index组合筛选前各index组合文库产量数据;
图3是本发明实验例1中index组合筛选后各index组合文库浓度数据;
图4是本发明实验例1中,index组合筛选后各index组合Q30数据;
图5是本发明实验例2中,不同文库结构和不同index组合方案捕获效率数据;图(a)为方案1、图(b)为方案2、图(c)为方案3和图(d) 为方案4。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂、细胞或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1短接头
短接头,如图1所示:所述接头寡核苷酸链1由5’端到3’端依次包括 index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T,所述正义接头互补区全部或部分与index2引物结合区的3’末端序列重合,其核苷酸序列如下所示;所述接头寡核苷酸链2由5’端到3’端依次包括与接头寡核苷酸链1中的正义分子标签反向互补的反义分子标签、与接头寡核苷酸链1正义接头互补区反向互补的反义接头互补区和index1引物结合区,所述反义接头互补区全部或部分与index1引物结合区的5’末端序列重合,其核苷酸序列如下所示;具体如下:
接头寡核苷酸链1(正向接头序列)5’-3’:
GAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNT;
接头寡核苷酸链2(反向接头序列)5’-3’:
/5phos/NNNNNAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGAC;
上述序列中(参见序列表SEQ ID NO.1-2所示),“/5phos/”表示5’端磷酸化修饰,“N”表示A\T\G\C四种碱基中的任一种碱基;“NNNNN”表示正义分子标签和与正义分子标签互补的反义分子标签。
按照上述短接头设计原则设计包含各分子标签的Adapter 1~Adapter 16,具体如下表2所示(参见序列表中SEQ ID NO.3-34所示):
表2短接头Adapter 1~Adapter 16
上述表2中的接头序列按照以下步骤制备:
(1)根据接头寡核苷酸链1及接头寡核苷酸链2的合成总量(X nmol),分别加入相应体积的接头退火缓冲液,经充分混匀、短暂离心以及室温静置溶解10min,制备成摩尔浓度为100μM的接头寡核苷酸链退火工作液;
(2)对应分子标签的接头寡核苷酸链1和接头寡核苷酸链2退火工作液,各取25μL至新的PCR管中,震荡混匀后,置于PCR仪中按照表3程序进行梯度降温退火,得到包含各分子标签的Adapter 1~Adapter 16接头母液(50μM)。使用Agilent DNA 1000芯片对各接头母液进行质控。
表3接头退火PCR程序
(3)质控合格的接头母液,按等比例进行混合,得到混合接头母液 (50μM)。使用时使用TE缓冲液根据需要进行稀释并分装保存在-20±5℃中。
实施例2双index接头引物
双index接头引物,包括正向接头引物和反向接头引物;
正向接头引物,由5’端到3’端依次包括GF引物序列、index2序列和 index2引物结合区序列;
反向接头引物,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、 index1引物结合区反向互补序列;
如图1所示:所述正向接头引物的核苷酸序列如下所示;所述反向接头引物的核苷酸序列如下所示;具体如下:
正向接头引物5’-3’:
TCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCA CAGAACGACATGGCTACGATCC;
反向接头引物5’-3’:
上述序列(参见序列表SEQ ID NO.35-36)中,正向接头引物中的“NNNNNNNNNN”表示样本标签index2序列,单下划线部分的序列为GF 引物序列,双下划线部分的序列为index2引物结合区序列;反向接头引物中的“NNNNNNNNNN”表示样本标签index1序列,单下划线部分的序列为 GR引物序列,双下划线部分的序列为index1引物结合区反向互补序列;样本标签index1序列和样本标签index2序列可相同或不相同。进一步的,所述index1序列和index2序列选自表1。
按照上述双index接头引物设计原则设计实施例1中表2中的Adapter 1~Adapter16的双index接头引物。
实施例3双index接头封阻序列
双index接头封阻序列:包括正向接头封阻序列和反向接头封阻序列;
正向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括正义接头互补区反向互补序列、index2引物结合区反向互补序列、index2序列反向互补序列和GF引物序列反向互补序列;正义接头互补区反向互补序列全部或部分与index2 引物结合区反向互补序列5’末端序列重合;
反向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列和反义接头互补区反向互补序列;所述反义接头互补区反向互补序列全部或部分与index1引物结合区反向互补序列3’末端序列重合;
如所述正向接头封阻序列的核苷酸序列如下所示;所述反向接头封阻序列的核苷酸序列如下所示;具体如下:
正向接头封阻序列5’-3’:
反向接头封阻序列5’-3’:
上述序列(参见序列表SEQ ID NO.37-38所示)中,“/3phos/”表示3’端磷酸化修饰;正向接头封阻序列中“NNNNNNNNNN”表示样本标签 index2序列的反向互补序列,由5’端到3’端依次包括正义接头互补区反向互补序列、index2引物结合区反向互补序列、index2序列反向互补序列和 GF引物序列反向互补序列,波浪线的序列为正义接头互补区反向互补序列,单下划线部分的序列表示index2引物结合区的反向互补序列,正义接头互补区反向互补序列部分与index2引物结合区反向互补序列5’末端序列重合,双下划线部分的序列为GF引物序列反向互补序列;反向接头封阻序列中“NNNNNNNNNN”表示样本标签index1序列,由5’端到3’端依次包括 GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列和反义接头互补区反向互补序列;所述反义接头互补区反向互补序列全部或部分与index1引物结合区反向互补序列3’末端序列重合,双下划线部分的序列为GR引物序列,单下划线部分的序列表示index1引物结合区反向互补序列,波浪线部分的序列表示反义接头互补区反向互补序列;正向接头封阻序列和反向接头封阻序列的样本标签index可相同或不相同。进一步的,所述index1 序列和index2序列的选自表1。
按照上述双index接头封阻序列设计原则设计实施例1中的Adapter 1~Adapter16的双index接头封阻序列。
实施例4双index目标区域捕获建库流程
双index目标区域捕获建库流程包括实施例1的短接头和实施例2的双 index接头引物以及实施例3的双index接头封阻序列。
进一步的,还包括GF和GR引物序列。
实施例5文库构建
本实施例提供了一种利用双index建库体系构建文库的方法,包括如下步骤:
(1)末端修复及加“A”
提前将NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer和NEBNext Ultra II EndPrep Enzyme Mix置于冰盒,待试剂溶解后振荡混匀并离心。按照表4 配制末端修复及加“A”反应mix(Mix1),振荡混匀并离心。
表4 Mix1配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer | 7 |
NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix | 3 |
总体积 | 10 |
**注:Mix1置于冰盒上配制。
配置后的Mix1按照每个反应10μL,依次分装至50μL DNA样本中,振荡混匀并离心。按照表5反应条件在恒温混匀仪或PCR仪上孵育。孵育完成后,降至室温,高速离心机短暂离心,将蒸发起的液滴收集入管内。
表5末端修复及加“A”反应程序
(2)接头连接
将溶解后的NEBNext Ultra II Ligation Master Mix、NEBNext LigationEnhancer及实施例1的接头振荡混匀并离心。向样本中单独加入2μL接头工作液并吹打混匀。按照表6配制接头连接反应mix(Mix 2),充分振荡混匀并离心后按照每个反应31μL于冰上分装至各反应管,振荡混匀并离心后将反应管置于恒温混匀仪20℃,孵育15min。
表6 Mix2配制表
**注:Mix2置于冰盒上配制。
(3)连接反应后纯化
向每个反应管中加入87μL AMPure XP磁珠,振荡混匀后,室温孵育 10min。孵育结束,将离心管短暂离心并置于磁力架上至澄清,弃上清。保持离心管于磁力架上,向各离心管中依次加入400μL体积分数为80%乙醇溶液,关紧管盖颠倒漂洗3次,弃上清,重复漂洗一次。第二次漂洗弃上清后,将离心管短暂离心,用20μL移液器吸去离心管中残余液体。将离心管打开盖子置于磁力架上晾干至磁珠表面哑光。从磁力架上取下离心管,加入22μL TE缓冲液(pH 8.0),用移液器将磁珠与TE吹打混匀,室温下孵育5min。孵育结束,将离心管短暂离心,置于磁力架上至完全澄清。将上清纯化产物转移到新的1.5mL离心管中备用。
(4)捕获前PCR(Non-C-PCR)
提前将实施例2的双index接头引物工作液及2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix置于室温解冻,解冻后试剂振荡混匀并离心。按照表7,依次向 PCR管中添加对应反应组分并混匀离心。将样本置于PCR仪中,按照表8 程序进行PCR扩增。
表7 Non-C-PCR Mix配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
正向接头引物工作液(10μM) | 2.5 |
反向接头引物工作液(10μM) | 2.5 |
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
Adapter-Ligated library | 20 |
总体积 | 50 |
表8 Non-C-PCR反应程序
(5)Non-C-PCR产物纯化
使用45μL AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化,最终溶解在31μL TE (pH 8.0)中(操作流程同步骤(3))。将纯化产物转移至全新的1.5mL离心管中用于文库质控、杂交或置于-20℃保存。
(6)蒸干Mix配制
将实施例3的双index接头封阻序列工作液、Cot-1 DNA和待杂交文库置于4℃解冻。融化后震荡混匀并离心,按照表9加入1.5mL离心管中,震荡混匀并离心。
表9蒸干Mix配制表
蒸干Mix管盖扎洞,置于真空浓缩仪中60℃浓缩蒸干,蒸干后使用封口膜封闭管盖上的孔。蒸干过程中将待杂交探针置于4℃解冻。将xGen 2X Hybridization Buffer、xGenHybridization Buffer Enhancer置于室温溶解,并振荡离心;
(7)按照表10配制变性Mix,振荡混匀后分装至蒸干的混合物中,充分振荡混匀并离心,置于恒温混匀仪上95℃变性10min;
表10变性Mix配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
xGen 2X Hybridization Buffer | 8.5 |
xGen Hybridization Buffer Enhancer | 2.7 |
Nuclease-Free Water | 1.8 |
总体积 | 13 |
样本文库变性完成前2-3分钟,将溶解的探针分装至0.2mLPCR管中,每个反应探针用量4μL;变性完成后,将样本文库用高速离心机全速离心 1min,后快速转移至PCR管中,振荡离心;
(8)将PCR管置于PCR仪上65℃杂交过夜(热盖温度75℃);
(9)过夜孵育后进行洗脱实验。洗脱实验前提前至少30分钟从-20℃冰箱中取出Wash BufferⅡ、Ⅲ、Stringent Wash Buffer和Bead Wash Buffer 原液,室温解冻,按照表11中单反应用量配制浓度为1×的洗脱工作液并置于对应温度环境下提前预热。将M-270磁珠和AMPure XP磁珠置于室温平衡;
表11 1×洗脱工作液配制量
组分 | 单反应使用量(μL) |
xGen 10×Stringent Wash Buffer | 400(65℃) |
xGen 10×Wash BufferⅠ | 100(65℃)+200(RT) |
xGen 10×Wash BufferⅡ | 200 |
xGen 10×Wash BufferⅢ | 200 |
xGen 2×Bead Wash Buffer | 500 |
(10)平衡至室温的M-270磁珠充分振荡混匀后,吸取20μL到新的1.5mL离心管中,上磁力架吸弃上清。从磁力架上取下,使用200μL 1×Bead Wash Buffer漂洗磁珠3次,最后一次吸弃上清后加100μL 1×Bead Wash Buffer重悬磁珠并转移至新的0.2mL PCR管中备用;
(11)将装有磁珠的PCR管上磁力架吸弃上清,将过夜孵育的杂交体系转移至磁珠管中震荡混匀并置于65℃ PCR仪(热盖75℃)中孵育45分钟。孵育期间每隔15分钟取出反应管快速震荡混匀1次;
(12)按照表12试剂顺序、用量和次数进行磁珠漂洗;
表12磁珠漂洗顺序及方法
组分 | 单管反应体积(μL) |
1×Wash Buffer Ⅰ(65℃) | 加100μL,吹打混匀,转1.5离心管,弃上清 |
1×Stringent Wash Buffer(65℃) | 加200μL,振荡混匀后65℃孵育5min,弃上清;洗涤两次; |
1×Wash Buffer Ⅰ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育2min,弃上清; |
1×Wash Buffer Ⅱ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育1min,弃上清; |
1×Wash Buffer Ⅲ(RT) | 加200μL,RT振荡孵育30s,弃上清; |
Nuclease-Free Water | 21μL重悬磁珠 |
(13)提前将2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和杂交后PCR引物(GF Primer:/5phos/TCTCAGTACGTCAGCAGTT;GR Primer: GGCATGGCGACCTTATCAG;)置于4℃解冻,并充分振荡混匀离心。按照表13配制杂交后PCR Mix备用;
表13杂交后PCR Mix配制表
组分 | 单反应体积(μL) |
2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix | 25 |
GF Primer(10μM) | 2.5 |
GR Primer(10μM) | 2.5 |
总体积 | 30 |
(14)将20μL漂洗后重悬磁珠转移至杂交后PCR Mix中,移液器吹打混匀后置于PCR仪中,运行表14程序进行杂交后PCR;
表14杂交后PCR反应程序
(15)使用60μL AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化,最终溶解在 31μLTE(pH 8.0)中(操作流程同步骤3)。纯化后的文库用于文库质控、测序或置于-20℃保存。
对比例1
本实施例提供了一种利用现有的双index接头引物体系构建文库的方法,包括如下步骤:
1)双index接头引物体系由现有提供,短接头具体如下:
接头寡核苷酸链1(正向接头序列)5’-3’:
接头寡核苷酸链2(反向接头序列)5’-3’:
正向接头引物5’-3’:
TCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCA CAGAACGACATG;
反向接头引物5’-3’:
GGCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGAC CGCTTGGCC;
上述序列(参见序列表SEQ ID NO.39-42所示)中,双下划线处的序列为分子标签,“/5phos/”表示5’端磷酸化修饰;正向接头引物的“NNNNNNNNNN”表示样本标签index2,反向接头引物的“NNNNNNNNNN”表示样本标签index1,正向接头引物和反向接头引物的样本标签index可相同或不相同。所述index序列选自表1。
按照上述短接头设计原则设计包含各分子标签的短接头Adapter 1~Adapter16,所述分子标签与实施例1中的表2中的分子标签序列相同。同时根据上述接头引物设计短接头Adapter 1~Adapter 16设计包含GF引物序列和GR引物序列的双index接头引物。根据设计的双index接头引物设计双index接头封阻序列,正向接头封阻序列与正向接头引物反向互补,反向接头封阻序列与反向接头引物的序列相同。
2)文库构建方法
文库构建方法与实施例5相同。
实验例1index组合筛选确认
双index建库体系:方案1:包括实施例1的短接头和实施例2的双index 接头引物以及实施例3的双index接头封阻序列,正向接头引物和反向接头引物的样本标签index相同,index1序列=index2序列选自MGI测序平台 V2版(128个),序列组合信息如表15所示;
表15 index1=index2序列组合信息
使用上述方案1的双index建库体系对现有的MGI测序平台V2版(128 个)index序列进行筛选,实验方法:50ng打断后gDNA使用上述方案1 的双index建库体系建库,详细建库方法参考实施例5步骤(1)~步骤(5),取部分的步骤(5)中纯化后的中间文库等质量混合进行WGS测序。其余文库使用2种商品化液态捕获探针(IDT生产)进行目标区域捕获(即实施例5步骤(6)~步骤(15)获得的文库)并上机测序(测序平台为Gene+Seq 2000)。评估指标为:文库产量均一性:cv<15%;测序数据量产出均一性: cv<15%。
筛选前128对特异双端index组合,文库产量cv为9.3%,文库浓度如图2所示;WGS测序数据产出cv为26.13%,2种商品化液态捕获探针捕获后,数据产量cv分别为25.25%和26.13%。
筛选后得到96对特异双端index组合,文库产量cv为8.08%,文库浓度如图3所示;WGS测序数据产出cv为14.12%,2种商品化液态捕获探针捕获后,数据产量cv分别为10.74%和13.57%;Q30>85%,检测结果如图4所示,图中(R1代表Read1即正向测序reads,R2代表Read2即反向测序reads)。
实验例2
本实验对本发明的双index建库体系和现有的双index建库体系进行评估
一、双index建库体系
方案1、同实验例1中;
方案2、包括实施例1的短接头和实施例2的双index接头引物以及实施例3的双index接头封阻序列,正向接头引物和反向接头引物的样本标签 index不同,index1序列≠index2序列,其中index1序列和index2序列为选自MGI测序平台V2版(128个),序列组合信息如表15;
方案3、包括对比例1中的双index建库体系,正向接头引物和反向接头引物的样本标签index相同,index1序列=index2序列选自MGI测序平台V2版(128个),序列组合信息如表15;
方案4、包括对比例1中的双index建库体系,正向接头引物和反向接头引物的样本标签index不同,index1序列≠index2序列,index1序列和 index2序列选自MGI测序平台V2版(128个),序列组合信息如表15;
二、不同文库体系和index组合策略数据质量稳定性评估
(1)实验方法:50ng打断后gDNA分别使用上述方案1-4的双index 建库体系建库,详细建库方法参考实施例5步骤(1)~步骤(5),取部分的步骤(5)中纯化后的中间文库等质量混合进行WGS测序。其余文库使用2种商品化液态捕获探针(IDT生产)进行目标区域捕获(即实施例5 步骤(6)~步骤(15)获得的文库)并上机测序(测序平台为Gene+Seq 2000)。
(2)评估指标:建库指标:包括文库浓度、文库产量cv;WGS测序指标:包括环化效率、拆分率、数据产出cv;捕获测序指标:包括捕获效率均一性。
文库浓度使用Life technology Qubit 3.0荧光定量仪搭配QubitTM dsDNA HSAssay Kit进行定量获得;
文库产量cv计算方法为各index组合文库产量标准差除以各index组合文库产量平均值;
环化效率计算方法为环化后DNA总量除以环化前DNA投入总量;
拆分率计算方法为能够按照index列表进行分辨的数据量除以测序总数据量;
数据产出cv计算方法为各index组合文库数据产量标准差除以各index 组合文库产量平均值;
捕获效率均一性使用吉因加生信流程对panel捕获效率进行计算,比较方案间各index组合文库捕获效率波动性进行评估;
(3)测试结果
1)建库指标:4种方案文库体系建库质控数据统计结果如表16所示,本发明两种文库体系文库浓度和文库产量cv均显著优于对比例的两种文库体系。表明,吉因加文库体系片段转化率优于现有文库体系,且index间性能更稳定。
表16不同文库体系建库质控指标
由表16可知,利用本发明的短接头和双index接头引物构建的文库产量高,扩增效率高,扩增产量较均一,cv值较小,两种index组合方式的文库产量无差异。
2)WGS测序指标:4种文库体系方案的文库分别混合进行WGS测序,测序质控数据统计结果如表17所示,环化效率:17%~20%,整体测序质量:Q30>85%,拆分率>90%,未表现出测序质量问题。本发明接头引物体系数据量产出较官方体系更均一。
表17 WGS测序指标汇总
由表17所示,对比例与本发明的两种index组合方式的建库的环化效率在17-20%之间,文库环化效率相当。在index测序质量方面,Q30>85%,拆分率>90%。index测序质量无明显差异。数据产出均一性方面,本发明的建立的文库数据量产出cv值较小,表明其不同index间数据产量更均一, index偏好性更小。
3)捕获测序指标:4种方案的文库体系均分别使用吉因加临床检测panel 进行捕获测序,捕获效率数据如图5所示,图(a)为方案1、图(b)为方案2、图(c)为方案3和图(d)为方案4。本发明的文库体系两种index 组合策略整体捕获效率及均一性均优于对比例的文库体系。
(4)测试结论
综上比较,两种文库体系的两种index组合策略,测序质量无显著差异。本发明的文库体系从index组合间扩增效率均一性、捕获效率均一性以及数据产量稳定性方面均优于对比例的文库体系。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京吉因加医学检验实验室有限公司
苏州吉因加生物医学工程有限公司
<120> 基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系
<130> HA201903823
<160> 42
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
gaacgacatg gctacgatcc gacttnnnnn t 31
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
nnnnnaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-1)
<400> 3
gaacgacatg gctacgatcc gacttcaata t 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-2)
<400> 4
gaacgacatg gctacgatcc gacttccact t 31
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<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-3)
<400> 5
gaacgacatg gctacgatcc gacttttagg t 31
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<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-4)
<400> 6
gaacgacatg gctacgatcc gacttcagac t 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-5)
<400> 7
gaacgacatg gctacgatcc gacttatcga t 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-6)
<400> 8
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-7)
<400> 9
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<212> DNA
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-9)
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<212> DNA
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<400> 12
gaacgacatg gctacgatcc gacttactat t 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-11)
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-12)
<400> 14
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<212> DNA
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<400> 15
gaacgacatg gctacgatcc gacttaacta t 31
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<211> 31
<212> DNA
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gaacgacatg gctacgatcc gacttcccat t 31
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<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-15)
<400> 17
gaacgacatg gctacgatcc gacttcttag t 31
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-1-16)
<400> 18
gaacgacatg gctacgatcc gacttatctc t 31
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-1)
<400> 19
tattgaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<212> DNA
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agtggaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-3)
<400> 21
cctaaaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-4)
<400> 22
gtctgaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-5)
<400> 23
tcgataagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
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<400> 24
atctaaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<212> DNA
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<400> 25
cttagaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 35
<212> DNA
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<400> 26
gagacaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-9)
<400> 27
ttcggaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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ctggaaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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gagctaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<212> DNA
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tagttaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-14)
<400> 32
atgggaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(AD-2-15)
<400> 33
ctaagaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
<210> 34
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gagataagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<211> 66
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<213> 人工合成(正向接头引物)
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<223> n is a, c, g, or t
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tctcagtacg tcagcagttn nnnnnnnnnc aactccttgg ctcacagaac gacatggcta 60
cgatcc 66
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<212> DNA
<213> 人工合成(反向接头引物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
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ggcatggcga ccttatcagn nnnnnnnnnt tgtcttccta agaccgctt 49
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<212> DNA
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aagtcggatc gtagccatgt cgttctgtga gccaaggagt tgnnnnnnnn nnaactgctg 60
acgtactgag a 71
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<212> DNA
<213> 人工合成(反向接头封阻序列)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 38
ggcatggcga ccttatcagn nnnnnnnnnt tgtcttccta agaccgcttg gcctccgact 60
t 61
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<213> 人工合成(接头寡核苷酸链1)
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<223> n is a, c, g, or t
<400> 39
caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac ttnnnnnt 48
<210> 40
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成(接头寡核苷酸链2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 40
nnnnnaagtc ggaggccaag cggtcttagg aagac 35
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<212> DNA
<213> 人工合成(正向接头引物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
tctcagtacg tcagcagttn nnnnnnnnnc aactccttgg ctcacagaac gacatg 56
<210> 42
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工合成(反向接头引物)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(29)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
ggcatggcga ccttatcagn nnnnnnnnnt tgtcttccta agaccgcttg gcc 53
Claims (13)
1.一种短接头,其特征在于,包括两条部分互补的接头寡核苷酸链:
接头寡核苷酸链1,由5’端到3’端依次包括index2引物结合区、正义接头互补区、正义分子标签和1个突出的碱基T;所述index2引物结合区的长度为15-42bp,所述正义接头互补区长度为8bp,所述正义分子标签的长度为2-10bp;所述正义接头互补区全部或部分与index2引物结合区的3’末端序列重合;
接头寡核苷酸链2,由5’端到3’端依次包括与接头寡核苷酸链1中的正义分子标签反向互补的反义分子标签、与接头寡核苷酸链1正义接头互补区反向互补的反义接头互补区和index1引物结合区;所述反义分子标签长度为2-10bp,所述反义接头互补区长度为8bp,所述index1引物结合区长度为15-30bp;所述反义接头互补区全部或部分与index1引物结合区的5’末端序列重合。
2.根据权利要求1所述的短接头,其特征在于,接头寡核苷酸链2的5’端磷酸化修饰;优选的,所述短接头为Y型短接头。
3.一种双index接头引物,其特征在于,包括正向接头引物和反向接头引物;
正向接头引物,由5’端到3’端依次包括GF引物序列、index2序列和index2引物结合区序列;
反向接头引物,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列。
4.根据权利要求3所述的双index接头引物,其特征在于,所述index1序列和index2序列的长度均为8-10bp;所述index1序列和index2序列相同或不同;优选的,所述index1序列和index2序列选自表1。
5.一种双index接头封阻序列,其特征在于,包括正向接头封阻序列和反向接头封阻序列;
正向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括正义接头互补区反向互补序列、index2引物结合区反向互补序列、index2序列反向互补序列和GF引物序列反向互补序列;正义接头互补区反向互补序列全部或部分与index2引物结合区反向互补序列5’末端序列重合;
反向接头封阻序列,由5’端到3’端依次包括GR引物序列、index1序列、index1引物结合区反向互补序列和反义接头互补区反向互补序列;所述反义接头互补区反向互补序列全部或部分与index1引物结合区反向互补序列5’末端序列重合。
6.根据权利要求5所述的双index接头封阻序列,其特征在于,所述index1序列和index2序列反向互补序列的长度均为8-10bp;所述index1序列和index2序列反向互补序列相同或不同。
7.根据权利要求5或6所述的双index接头封阻序列,其特征在于,正向接头封阻序列的3’端磷酸化修饰;反向接头封阻序列的3’端磷酸化修饰。
8.一种双index文库结构,其特征在于,包括利用权利要求1或2所述的短接头和/或权利要求3或4所述的双index接头引物制备而成。
9.一种双index建库体系,其特征在于,包括权利要求1或2所述的短接头、权利要求3或4所述的双index接头引物和/或权利要求5-7任一项所述的双index接头封阻序列。
10.一种双index探针杂交捕获体系,其特征在于,包括权利要求5-7任一项所述的双index接头封阻序列。
11.一种文库构建方法,其特征在于,包括利用权利要求1或2所述的短接头、权利要求3或4所述的双index接头引物和/或权利要求5-7任一项所述的双index接头封阻序列。
12.一种测序方法,其特征在于,包括利用权利要求8所述的文库结构。
13.根据权利要求12所述的测序方法,其特征在于,测序平台为Gene+Seq 2000、Gene+Seq200或DNBSEQ-T7。
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Applications Claiming Priority (1)
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CN202010334969.8A CN112626189A (zh) | 2020-04-24 | 2020-04-24 | 基因测序仪的短接头、双index接头引物和双index建库体系 |
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CN112626189A true CN112626189A (zh) | 2021-04-09 |
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ID=75299987
Family Applications (1)
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