JP4399164B2

JP4399164B2 - 核酸の磁気単離および精製の方法

Info

Publication number: JP4399164B2
Application number: JP2002566667A
Authority: JP
Inventors: アール．ディー．ナージェッシ
Original assignee: プロメガ・コーポレーション
Priority date: 2001-02-16
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2021-10-05
Also published as: EP2363476A1; AU2001296762B2; EP2363476B1; WO2002066993A1; JP2004523238A; CA2438066A1; EP1368629A4; EP2090655A1; EP1368629A1; ATE422542T1; DE60137652D1; EP1368629B1; EP2090655B1; ES2322841T3

Description

【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2001年2月16日に出願された米国特許出願第60/269,729号（この出願の開示は本明細書中に参照として組み入れられる）の利益を主張するものである。
【０００２】
連邦政府によって援助された研究開発に基づいてなされた発明に対する権利についての言明
適用なし。
【０００３】
発明の背景
高品質の核酸の単離および精製は、分子生物学の方法において決定的な工程である。生物学的液体（例えば、ヒトの血液、血清、培養細胞、ならびに植物、動物およびヒトの組織、ならびに他の試料）由来の一本鎖および二本鎖DNAの単離のための多くの方法が報告されてきた。多くの異なる方法が記載されてきた。例えば、以下を参照されたい：Taylor,J.I.ら、J.Chromatography A、890:159-166(2000)；Ahn, S.C.ら、BioTechniques、29:466-468(2000)；Scott Jr, D.L.ら、Lett.Appl.Microl.、31:95-99(2000)；Lin, ZおよびFloros, J.、 BioTechniques、29:460-466(2000)；Smith, C.E.およびYork, C.K.、米国特許第6,027,945号(2000)；Mrazek, F.およびPetrek, M.、Acta Univ. Palacki. Olomuc.、Fac. Med. 142:23-28(1999)；Hawkins, T.、米国特許第5,898,071号(1999)；Hawkins, T.、米国特許第5,705,628号(1998)；Davies, M.J.ら、Anal.Biochem.262:92-94(1998)；Levison, P.R.ら、J.Chromatography A、816:107-111(1998)；Rubi,K.ら、BioTechniques、22:506-511(1997)；Kotsopoulos, S.K.およびShuber, A.P.、BioTechniques、20:198-200(1996)；Boom, W.R.ら、米国特許第5,234,809号(1993)；Reeve, M.A.、国際公開公報91/12079(1991)；Sambrook, J.ら、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL 第2版、1.21-1.45(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press。これらの方法の多くは時間がかかり、単調で、かつ費用がかかる。さらに、これらの方法の多くは危険な有機溶媒の使用を含む。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明において記載される方法は、セルロース（磁化可能なセルロース）またはセルロース誘導体のようなポリマー中にカプセル化される磁気特性または常磁性特性を有する粒子を使用する。驚くべきことに、特定の化学物質および塩の存在下で結合緩衝液として調製すると、これらの粒子は核酸を吸着し得る。次いで、この粒子に結合した核酸は洗浄緩衝液で洗浄されて、いかなる望ましくない物質も除去する。次いで、結合した核酸は、溶出緩衝液または脱イオン水を添加することにより粒子から溶出される。
【０００５】
磁化可能なセルロースおよび磁化可能なセルロース誘導体は、CORTEX BIOCHEM INC.、San Leandro、CAから、マガセル（MagaCell)（商標）の商品名で提供されている。これらはまた、Pourfarzanehら、Methods Biochem.Anal. 28:267-295 (1982) によって記載された方法を用いて製造され得る。
【０００６】
結合緩衝液は、一般的に高濃度の塩および高濃度のポリアルキレングリコールを含む。得られる混合物の濃度は、磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体への核酸の結合に適切な濃度に調整される。わずかな改変を伴う記載された結合緩衝液は、洗浄緩衝液としてもまた使用され得る。
【０００７】
本発明はまた、種々の供給源（生物学的液体、組織、細胞、およびプラスミドを含有する細菌細胞溶解物などを含む）からの核酸（例えば、DNA、RNA、およびPNA）を単離する方法に関する。この方法は、結合緩衝液の存在下で、磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体に核酸を結合する工程、洗浄緩衝液を用いて、得られた結合した核酸を洗浄する工程、および溶出緩衝液または水を用いて核酸を溶出する工程を包含する。
【０００８】
本明細書中に記載される方法はまた、実質的にあらゆるサイズで、かつ広範な種々の供給源由来の、二本鎖（ds）または一本鎖（ss）の両方のポリヌクレオチド（例えば、DNA、RNA、PNA）の単離のために有用である。
【０００９】
なおさらには、本発明は、磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体、ならびに磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体への核酸の結合に適切な濃度で、適切な塩およびポリアルキレングリコールを含む結合緩衝液を含むキットを提供する。いくつかの態様において、このキットにはまた、適切な洗浄緩衝液、溶出緩衝液、および他の供給源由来の細胞、組織、または材料を溶解して核酸を遊離させるための試薬も含まれる。
【００１０】
発明の詳細な説明
一般的事項
本発明の方法は、アルコール抽出もしくは洗浄を含む、遠心分離または有機溶媒の必要を除外することによって、種々の供給源からの核酸の単離を簡単にし、かつさらなる特徴付けおよび後続の処理（例えば、PCR、配列決定、またはブロッティングの手順）のために直ちに使用できる核酸を作製する。本明細書中に記載される独特の特徴のために、本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングシステムを含む自動化に容易に適用可能である。
【００１１】
さらに、本発明において磁化可能なセルロースの製造のために使用される酸化鉄、セルロース、およびセルロース誘導体は市販されており、かつ安価である。本明細書中に記載される方法はまた、Hawkins、米国特許第5,898,071号に記載されている磁気粒子の調製および修飾に含まれる、時間のかかる手順および危険な化学物質の使用を回避している。なおさらに、本発明の方法は、種々の官能基の化学合成の必要性、Hawkins、米国特許第5,898,071号に記載されている、DNAを結合するための粒子の必要条件を除外している。Hawkins、同上は、これらの方法においてセルロース／酸化鉄コアを有する微粒子はDNAを結合しないと述べている。全く驚くべきことに、磁化可能なセルロースおよび本明細書中に記載した方法は、DNAを単離するのに有効でありかつ安価であることの両方であり、Hawkinsの方法を超えるDNAの単離および精製の顕著な改善を提供する。
【００１２】
態様の説明
以下の方法において、磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体は、特定の濃度の塩およびポリアルキレングリコールの存在下で、核酸に結合することが見いだされた。従って、本発明は、1つの局面において、種々の供給源（体液、種々の溶液、細胞、植物、組織、プラスミドを含む細菌細胞溶解物などを含むがこれらに限定されない）からの核酸（例えば、DNA、RNA、およびPNA）の簡単かつ迅速な単離のための方法を提供する。本発明はまた、サイズに基づく核酸の単離についても記載していた。以下は、DNAによって例示された核酸に関する本発明の記載である。本発明はまた、同様の様式にてRNAおよびPNAの分離のためにも有用であることが理解される。小さな核酸は、磁化可能なセルロース粒子への強い結合のためにはより高い塩濃度を必要とするので、サイズに基づいて磁化可能なセルロースに結合した核酸を遊離させるために塩濃度は選択的に操作され得る。結合したDNAを有する磁化可能なセルロースは、選択的に、適切な洗浄緩衝液で洗浄され得る。その後で、結合したDNAを有する磁化可能なセルロースは、適切な溶出緩衝液と接触させ、磁化可能なセルロースからDNAを溶出および分離する。すべての単離工程の間での液体からの磁化可能なセルロースの分離は、例えば、磁場を適用して磁化可能なセルロース粒子を下方向または横方向に引き付けることによって簡単にされ得る。
【００１３】
上記を鑑みると、本発明は1つの局面において、以下の工程を包含する、磁化可能なセルロースに核酸を結合するための方法を提供する：
a）磁化可能なセルロースを、核酸を含有する溶液と混合し、それによって混合物を調製する工程、ならびに
b）混合物の塩濃度およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸が磁化可能なセルロースに結合するのに適切な濃度に調整し、それによって溶液中の核酸のすべてまたは一部が磁化可能なセルロースに結合する工程。
【００１４】
典型的には磁化可能セルロースに結合している核酸の量は、磁化可能セルロースの量に依存している。好ましくは、磁化可能セルロースは、セルロース粒子表面の飽和を回避し、溶液中少なくとも60％、より好ましくは80％、さらに好ましくは90％またはそれ以上の核酸が磁化可能セルロースに結合している。多くの例において、結合する核酸の部分は100%である。しかし、いくつかの態様において、特定のサイズの核酸の選択的結合は、試料中の全核酸含量の約5％〜約30％のみが磁化可能なセルロースに結合するような塩濃度およびポリアルキレングリコール濃度の操作によって達成され得る。
【００１５】
本発明の方法において、磁化可能なセルロースはコルテックスバイオケム（Corex Biochem Inc.）、San Leandro、CAから購入できる。または、この粒子は、Pourfarzanehら、Methods Biochem. Anal. 28、267-295 (1982)によって記載された方法を用いて製造し得る。磁化可能なセルロースまたは磁化可能なセルロース誘導体の製造のために使用される酸化鉄、セルロース、およびセルロース誘導体もまた、市販されておりかつ安価である。
【００１６】
本発明において記載されるように、磁化可能なセルロースおよびその誘導体への核酸の結合ならびに非特異的に吸着したタンパク質または他の物質の除去は、特定の濃度の塩およびポリアルキレングリコールの溶液を用いて達成され得る。本発明において有用な塩は、LiCl、BaCl₂、MgCl₂、CsCl₂、CaCl₂、NaCl、KCl、およびKIから選択される。好ましくはこの塩はNaClである。同様に、例えば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを含む種々のポリアルキレングリコールが本発明において有用である。好ましくは、このポリアルキレングリコールはポリエチレングリコールである。塩およびポリアルキレンの試薬は、セルロースコートした磁化可能な粒子およびその誘導体への核酸の結合を容易にする濃度で使用される。結合緩衝液および洗浄緩衝液中の塩濃度は、使用される塩ならびに核酸が単離および精製される環境に依存する。一般的に、この塩濃度は約0.25M〜約5.0Mである。より好ましくは、結合緩衝液および洗浄緩衝液中の塩濃度は約0.5M〜約2.5Mである。なおより好ましくは、この塩濃度は約0.5M〜約1.5Mである。最も好ましくは、結合緩衝液の塩濃度は約1.25Mであり、洗浄緩衝液の塩濃度は約0.5Mである。同様に、ポリアルキレン濃度は使用されるポリアルキレンに依存する。ポリエチレングリコールは、例えばSigma Chemical Company (St. Louis、Missouri、USA) のような供給業者から市販されており、約1,000〜約10,000の分子量、好ましくは約6,000〜約8,000の分子量で有用である。使用されるポリエチレングリコールの分子量の範囲に依存して、その濃度は調整され得る。一般的に、8,000の平均分子量を有するポリエチレングリコールが使用される方法については、結合緩衝液および洗浄緩衝液中の濃度は約5％〜約15％、好ましくは約10％に調整される。
【００１７】
上記のおよび以下の実施例に記載した結合緩衝液および洗浄緩衝液の使用は、他のDNA単離方法では一般的に使用される有機溶媒（エチルアルコールを含む）を用いていない。
【００１８】
本発明において、磁化可能なセルロースは粒子の形態であり、好ましくは磁化可能なセルロースの重量比で全量の約90％までの酸化鉄含量を有する。磁化可能なセルロースの磁気成分は、酸化第一鉄または酸化ニッケルなどのような他の磁気化合物で置き換えられ得る。
【００１９】
関連する局面において、本発明は、核酸溶液中の核酸を磁化可能なセルロースに結合させることによって非核酸物質から核酸を分離する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：
a）磁化可能なセルロースを核酸および非核酸物質を含む溶液と混合して、第1の混合物を調製する工程；
b）第1の混合物の塩濃度およびポリエチレングリコール濃度を、溶液中の核酸が磁化可能なセルロースに結合するのに適切な濃度に調整し、磁化可能なセルロースに結合した核酸を含有する第2の混合物を調製する工程；
c）第2の混合物から、磁化可能なセルロースに結合した核酸を分離する工程；
d）工程c）において分離した、磁化可能なセルロースに結合した核酸を溶出緩衝液に接触させ、結合した核酸を磁化可能なセルロースから溶出緩衝液中に遊離させる工程；ならびに
e）溶出緩衝液から磁化可能なセルロースを分離させ、非核酸物質を実質的に含まない核酸を提供する工程。
【００２０】
一般的には、本発明のこの局面において使用される成分は、上記に記載したものと同様であり、塩濃度およびポリエチレングリコール濃度の好ましい範囲も、上記に提供したものと同じである。溶出緩衝液は、好ましくはEDTAを含有するトリス（Tris）緩衝液である。より好ましくは、溶出緩衝液は、約1mMのEDTAを含む約10mMのトリス、pH 8.0である。また、上記に記述したように、本発明のこの局面は種々の核酸（例えば、DNA、RNA、PNA、またはこれらの混合物）を用いて使用され得る。
【００２１】
本発明のこの局面の特に好ましい態様において、磁化可能なセルロース粒子に結合した核酸はDNAであり、DNAは磁化可能なセルロース粒子に結合したままで、磁化可能セルロースに結合した不純物を除去する洗浄緩衝液で洗浄する。より好ましくは、磁化可能なセルロース粒子に結合したDNAは、磁化可能な粒子に結合したDNAを遊離させる溶出緩衝液を用いて溶出され、DNAが単離される。
【００２２】
他の好ましい態様において、溶液中の核酸は、好ましくは、ヒト、植物、動物、ウイルスまたは細菌起源の細胞から調製された溶解物である。従って、1つの応用例において、この細胞は、動物、より好ましくはヒト由来である。別の応用例において、この細胞は植物由来である。別の応用例において、この細胞は細菌起源である。なお別の応用例において、この細胞はウイルス起源である。
【００２３】
非核酸物質（例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴ糖、リグナン、低分子の天然産物、および典型的な天然由来の他の物質）から分離された核酸は、一般的には、少なくとも80％の純度、より好ましくは少なくとも90％の純度、なおより好ましくは少なくとも95％の純度、最も好ましくは少なくとも99％またはそれ以上の純度で得られる。従って、本発明の方法は、特定の試料（例えば、細胞溶解物）中の、少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、なおより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％またはそれ以上の非核酸物質を除去するために適切である。
【００２４】
本発明のなお別の局面において、磁化可能なセルロース誘導体が使用される。従って、本発明は、以下の工程を包含する、磁化可能なセルロース誘導体に核酸を結合するための方法を提供する：
a）磁化可能なセルロース誘導体を、核酸を含有する溶液と混合し、それによって混合物を調製する工程、ならびに
b）混合物の塩濃度およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸が磁化可能なセルロース誘導体に結合するのに適切な濃度に調整し、それによって溶液中の核酸のすべてまたは一部が磁化可能なセルロース誘導体に結合する工程。
【００２５】
この場合もまた、好ましい成分および量は本質的に上記に規定したのと同様である。磁化可能なセルロース誘導体は、1つの態様の群においては、CM-セルロース、DEAE-セルロース、およびそれらの混合物から選択される。さらに、本発明のこの方法ならびに他の方法は、例えば、DNA、RNA、PNAまたはそれらの誘導体の精製において広範な応用を見いだす。
【００２６】
関連する方法において、本発明は、以下の方法を包含する、非核酸物質から核酸を分離する方法を提供する：
a）磁化可能なセルロース誘導体を、核酸および非核酸物質を含む溶液と混合して、第1の混合物を提供する工程；
b）第1の混合物の塩濃度およびポリエチレングリコール濃度を、核酸が磁化可能なセルロース誘導体に結合するのに適切な濃度に調整し、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を含有する第2の混合物を調製する工程；
c）第2の混合物から、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を分離する工程；
d）工程c）において分離した、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を溶出緩衝液に接触させ、結合した核酸を磁化可能なセルロース誘導体から溶出緩衝液中に遊離させる工程；ならびに
e）溶出緩衝液から磁化可能なセルロース誘導体を分離させ、非核酸物質を実質的に含まない核酸を提供する工程。
【００２７】
本発明のこの局面についての好ましい態様は、磁化可能なセルロースの使用について上記に記載されたものである。この場合もまた、上記と同様に、磁化可能なセルロース誘導体は、1つの態様の群において、CM-セルロース、DEAE-セルロース、およびそれらの混合物から選択される。
【００２８】
ここで本発明は以下の実施例によって例証されるが、いかなる場合においてもこれによって限定されるものではない。
【００２９】
一般的方法論
以下の実施例において使用される磁化可能な粒子は、コルテックスバイオケム（Cortex Biochem Inc.）、San Leandro、CA製のマガセル粒子（MagaCell Particle）もしくはその誘導体であるか、またはPourfarzanehら、Methods Biochem. Anal. 28:267-295 (1982) によって記載された方法によって作製された。これらの粒子は、0.02%アジ化ナトリウムを含む脱イオン水中に、50mg/mLの濃度で保存された。すべてのアガロースゲル電気泳動は、インビトロゲン（Invitrogen）、Carlsbad、CA製のE-ゲルシステム（E-Gel System)（0.8%アガロースゲル）を使用して行った。
【００３０】
実施例1
磁化可能なセルロースを使用するDNA単離
対照として使用した仔ウシ胸腺DNA調製物（Sigma、St. Louis、MO、カタログ番号D1501）は、結合緩衝液の存在下でマガセル(商標)（磁化可能なセルロース）粒子に可逆的に結合した。磁化可能なセルロース粒子に結合したDNAは、所望でない物質から分離され、洗浄された。次いで、DNAは粒子から溶出された。以下の手順を用いた。
1．TE緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）中の50μgDNA溶液（1mg/mlを50μl）を含む2ml容量の微量遠心チューブ中に、430μlの結合緩衝液（10% PEG 8000 MW、1.25M NaCl）および1mg（50mg/ml懸濁液 20μl）のマガセル粒子（Cortex Biochem、CA）を添加する。
2．上下方向に転倒させる回転機を用いてチューブの内容物を室温で10分間混合する。
3．磁気ラックを用いてマガセル粒子に結合したDNAを沈殿させる。
4．洗浄緩衝液（10% PEG 8000 MW、2.5M NaCl）で粒子を洗浄する。洗浄工程をさらに1回繰り返す。
5．溶出緩衝液（脱イオン水またはTE緩衝液［10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA］）を用いてマガセル粒子からDNAを溶出させる。
【００３１】
溶出したDNAのアガロースゲル電気泳動は、分解していない単一の高分子量DNAバンドを示した（図1）。
【００３２】
実施例2
磁化可能なセルロース誘導体を使用するDNA単離
上記の実施例1を磁化可能なセルロース誘導体を用いて反復した。磁化可能なセルロース誘導体には、マガセル(商標)-CMおよびマガセル(商標)-DEAE（両方ともCortex Biochem、San Leandro、CAより入手）が含まれた。
【００３３】
マガセル(商標)誘導体を用いて得られた結果は、マガセル(商標)によって得られた結果と比較し得るものであった。
【００３４】
実施例3
磁化可能なセルロースを使用する全血からのDNA単離
ヒト全血試料由来のDNAをプロテイナーゼKおよび特別に調製した溶解緩衝液を用いて遊離させた。次いで、そのDNAを結合緩衝液の存在下でマガセル粒子に吸着させた。次いで、マガセル粒子に結合したDNAを、他の夾雑物から分離および洗浄した。このDNAを粒子から溶出した。以下の手順を使用した。
1．10mM トリス-HCl、1mM 塩化カルシウム、50% グリセロール、pH 7.5中のプロテイナーゼK溶液20μl（プロテイナーゼK 400μg）をピペットで2ml容量の微量遠心チューブに入れる。
2．全血（ヘパリン、クエン酸、またはEDTAで処理したもの）200μlを添加する。
3．溶解緩衝液（50mM トリス-HCl、50mM EDTA、6M 塩酸グアニジン、6M 尿素、10mM 塩化カルシウム、10% ツィーン(Tween)-20、pH 6.3）200μlを添加する。
4．15秒間断続的にボルテックス（pulse-vortexing）してチューブの内容物を混合する。
5．チューブの内容物を56℃で10分間インキュベートする。
6．チューブを56℃から移し、結合緩衝液（10% PEG 8000 MW、1.25M 塩化ナトリウム）560μlを添加し、続いて十分に混合したマガセル懸濁液（脱イオン水中で50mg/ml、0.02%アジ化ナトリウムを含有する）を添加する。
7．上下方向に転倒させる回転機で混合しながら、室温で10分間、チューブの内容物をインキュベートする。
8．磁気ラックを使用して、マガセルに結合したDNAの粒子を沈殿させる。
9．上清を吸引除去し、洗浄緩衝液（10% PEG 8000 MW、2.5M 塩化ナトリウム）1mlを添加し、十分に混合し、上清を吸引除去することによって粒子を洗浄する。洗浄工程を1回繰り返す。
10．溶出緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）または脱イオン水500μlを添加する。工程7と同様に10分間混合する。
11．粒子を沈殿させ、精製したDNAを含有する上清を注意深く回収する。
12．この時点で精製したDNAはさらなる分析のために使用可能である。
【００３５】
本発明の方法によって全血試料から単離されたDNAのアガロースゲル電気泳動は、分解していない単一の高分子量DNAバンドを示した（図1）。
【００３６】
本発明の方法によって全血試料から単離されたDNAの、後続の処理は、PCRへの適用についてこの単離されたDNAが適切であることを示した（表1および2）。
【００３７】
（表１）マガセル(商標)またはキアゲンキアアンプDNAミニキット（QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit）を使用した、全血からのDNAの収量）

^＊1回のみ溶出
【００３８】
（表２）マガセル(商標)またはキアゲンキアアンプDNAミニキットを使用した、全血からのDNAの収量

^＊1回のみ溶出
【００３９】
本明細書中に記載される方法は、単純、迅速、経済的であり、かつ高収量の精製DNAを生成し、DNA単離製品の代表的な供給業者（Qiagen、Valencia、CA）を使うことによって開発された方法と比較し得るか、またはそれらに勝る方法である。
【００４０】
実施例4
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用するDNA単離
仔ウシ胸腺DNA（Sigma、St. Louis、MO、カタログ番号：D1501）を処理し、分析を行った。処理および分析は、マガセルに結合したDNA粒子の洗浄（工程4）について、洗浄緩衝液が10% PEG 8000 MWおよび0.25M 塩化ナトリウムを含有するように改変されていること以外は、実施例1と同様に行った。
【００４１】
実施例5
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用する全血からのDNA単離
全血試料由来のDNAを、マガセルに結合したDNA粒子の洗浄（工程9）について、洗浄緩衝液が10% PEG 8000 MWおよび0.25M 塩化ナトリウムを含有するように改変されていること以外は、実施例3と同様に単離および分析を行った。
【００４２】
実施例6
磁化可能なセルロースを使用するバフィーコートからのDNA単離
200μlのバフィーコート試料（全血の白血球に富む画分、Fred Hutchinson Cancer Research Center、Seattle、WAより入手）からのDNAを、実施例3と同様に単離および分析した。
【００４３】
実施例7
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用するバフィーコートからのDNA単離
200μlのバフィーコート試料（全血の白血球に富む画分、Fred Hutchinson Cancer Research Center、Seattle、WAより入手）からのDNAを、実施例5と同様に単離および分析した。
【００４４】
実施例8
磁化可能なセルロースを使用する培養細胞からのDNA単離）
200μlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁した培養細胞（最大2.5×10⁷細胞）からのDNAを、実施例3と同様に単離および分析した。
【００４５】
実施例9
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用する培養細胞からのDNA単離
200μlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁した培養細胞（最大2.5×10⁷細胞）からのDNAを、実施例5と同様に単離および分析した。
【００４６】
実施例10
磁化可能なセルロースを使用する植物組織からのDNA単離
シロイヌナズナ植物体の葉（Department of Plant Biology、University of Davis、Davis、CAより入手）由来のDNAを、プロテイナーゼK（PK）および溶解緩衝液を用いて遊離させた。次いで、そのDNAを結合緩衝液の存在下でマガセル粒子に結合させた。次いで、マガセル粒子に結合したDNAを、他の夾雑物から分離および洗浄した。このDNAを粒子から溶出した。以下の手順を用いた。
1．2ml容量の微量遠心チューブの底に、健康な地上（well-ground）植物組織25〜100mgを置く。
2．溶解緩衝液A（Buffer ATL、Qiagen、Valencia、CA、カタログ番号：19076）200μlを添加し、続いてPK溶液20μlを添加する。断続的なボルテックスによって穏やかに混合する。注記：RNAを含まないDNA調製物が必要である場合には、植物溶解緩衝液の添加前に40mg/mlのRNエース（RNase) A保存溶液10μlを添加する。
3．65℃で15分間インキュベートする。
4．チューブを65℃から移す。
5．微量遠心分離機中で、最大速度で5分間遠心分離する。
6．上清を2ml容量の清浄な微量遠心チューブに穏やかに移す。
7．結合緩衝液（10% PEG 8000 MW、1.25M 塩化ナトリウム）500μlを添加し、続いて十分に混合した（粒子は均一に懸濁している）マガセル粒子20μlを添加する。
8．（上下方向に転倒させる回転機を用いるか、または手動の混合で）混合しながら、チューブを穏やかに混合し、室温で10分間インキュベートする。
9．磁気ラックを使用して、マガセルに結合したDNAの粒子を沈殿させる。上清を吸引除去し、工程10に記載のように粒子を洗浄する。
10．洗浄緩衝液（10% PEG 8000 MW、1M 塩化ナトリウム）1mlを工程9のチューブに添加する。十分に混合し、磁気ラック上で粒子を沈殿させ、上清を吸引除去する。
11．工程10に従って洗浄をさらに1回繰り返す。
12．溶出緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）または脱イオン水200μlを添加し、工程8と同様に10分間混合する。
13．粒子を沈殿させ、単離したDNAを含有する上清を注意深く清浄なチューブに移す。この物質はさらなる分析のために使用可能である。この試料が同じ日に試験される予定がない場合には、分析の時まで-20℃で冷凍する。
【００４７】
実施例11
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用する植物組織からのDNA単離
シロイヌナズナ植物体の葉（Department of Plant Biology、University of Davis、Davis、CAより入手）のDNAを、遊離および分析した。遊離および分析は、DNAが結合したMaga Cell Particleの洗浄（工程10）について、洗浄緩衝液が10% PEG 8000 MWおよび0.25M 塩化ナトリウムを含有するように改変されていること以外は、実施例10と同様に行った。
【００４８】
実施例12
磁化可能なセルロースを使用する魚類のひれ組織からのDNA単離
魚類のひれ組織（Bodega Marine Lab、University of Davis、Davis、CAより入手）のDNAを、プロテイナーゼK（PK）および2種の異なる溶解緩衝液を用いて遊離させた。次いで、そのDNAを結合緩衝液の存在下でマガセル粒子に吸着させた。次いで、マガセル粒子に結合したDNAを、他の夾雑物から分離および洗浄した。このDNAを粒子から溶出した。以下の手順を用いた。
1．2ml容量の微量遠心チューブの底に、約5mgの魚類のひれ組織を入れる。
2．溶解緩衝液A（Buffer ATL、Qiagen、Valencia、CA、カタログ番号：19076）200μlを添加し、続いてPK溶液20μlを添加する。断続的なボルテックスによって穏やかに混合する。注記：RNAを含まないDNA調製物が必要である場合には、溶解緩衝液Aの添加前に40mg/mlのRNエース A保存溶液10μlを添加する。
3．時折混合しながら56℃で1時間インキュベートする。
4．チューブを56℃から移す。
5．溶解緩衝液B（50mM トリス-HCl、50mM EDTA、6M 塩酸グアニジン、6M 尿素、10mM 塩化カルシウム、10% ツィーン-20、pH 6.3）200μlを添加する。
6．70℃で10分間インキュベートし、次いでチューブを70℃から移す。
7．結合緩衝液（10% PEG 8000 MW、1.25M 塩化ナトリウム）500μlを添加し、続いて十分に混合した（粒子は均一に懸濁している）マガセル粒子 20μlを添加する。
8．チューブを穏やかに混合し、混合しながら（上下方向に転倒させる回転機を用いるか、または手動の混合で）、室温で10分間、チューブをインキュベートする。
9．磁気ラックを使用して、マガセルに結合したDNAの粒子を沈殿させる。上清を吸引除去し、工程10に記載するように粒子を洗浄する。
10．洗浄緩衝液（10% PEG 8000 MW、0.5M 塩化ナトリウム）1mlを工程9のチューブに添加する。十分に混合し、磁気ラック上で粒子を沈殿させ、上清を吸引除去する。
11．工程10に従って洗浄をさらに1回繰り返す。
12．溶出緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）または脱イオン水200μlを添加し、工程8と同様に10分間混合する。
13．粒子を沈殿させ、単離したDNAを含有する上清を清浄なチューブに注意深く移す。この物質はさらなる分析のために使用可能である。この試料が同じ日に試験される予定がない場合には、分析の時まで-20℃で冷凍する。
【００４９】
実施例13
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用する魚類のひれ組織からのDNA単離
魚類のひれ組織（Bodega Marine Lab、University of Davis、Davis、CAより入手）由来のDNAを、単離および分析した。単離および分析は、DNAが結合したMaga Cell Particleの洗浄（工程10）について、洗浄緩衝液が10% PEG 8000 MWおよび0.25M 塩化ナトリウムを含有するように改変されていること以外は、実施例12と同様に行った。
【００５０】
実施例14
磁化可能なセルロースを使用する細菌細胞からのプラスミドDNA単離
プラスミドDNA（PBA8およびPBA117、Prozyme、San Leandro、CAより入手）を、改変アルカリ溶解法を用いて細菌細胞培養物（大腸菌: XL1-Blue）から遊離した。手短に述べると、細菌細胞を微量遠心チューブ中で遠心分離によってペレット化した。このペレットを再懸濁緩衝液中で再懸濁した。次いで、SDSを含有する水酸化ナトリウム溶液によって細胞を溶解させ、続いて酢酸カリウムで中性にした。次いで、細胞溶解物を遠心分離によって清澄化し、上清を本発明によるプラスミドDNA単離のために使用した。次いで、上清中のこのプラスミドDNAを、特別に調製した結合緩衝液の存在下でマガセル粒子に結合させた。次いで、マガセル粒子に結合したDNAを、他の夾雑物から分離および洗浄した。このDNAを粒子から溶出した。以下の手順を用いた。
1．再懸濁緩衝液（100μg/ml RNエース A、Sigma、St. Louis、MO、カタログ番号：R4642を含む50mM トリス-HCl、10mM EDTA、pH 8.0）150μl中に、ペレット化した細菌細胞を再懸濁し、清浄な2ml容量の微量遠心チューブに移す。
2．溶液A（0.2M 水酸化ナトリウム、1% SDS）150μlを添加する。溶液が粘稠性を示し、かつわずかに清澄化するまで、チューブを4〜6回穏やかにひっくり返して混合する。
3．溶液B（3M 酢酸カリウム、pH 5.5）150μlを添加する。直ちにしかし穏やかに、溶液が濁るまでチューブを4〜6回ひっくり返して混合する。
4．高速で10分間遠心分離する。
5．注意深く上清を回収し、2ml容量の清浄な微小遠心チューブに移す。
6．結合緩衝液（10% PEG 8000 MW、1.25M 塩化ナトリウム）500μlを添加し、続いて十分に混合した（粒子は均一に懸濁している）マガセル粒子20μlを添加する。
7．チューブを穏やかに混合し、（上下方向に転倒させる回転機を用いるか、または手動の混合で）混合しながら、室温で10分間、チューブをインキュベートする。
8．磁気ラックを使用して、マガセルに結合したDNAの粒子を沈殿させる。上清を吸引除去し、工程9に記載するように粒子を洗浄する。
9．洗浄緩衝液（10% PEG 8000 MW、1M 塩化ナトリウム）1mlを工程8のチューブに添加する。十分に混合し、磁気ラック上で粒子を沈殿させ、上清を吸引除去する。
10．工程9に従って洗浄をさらに1回繰り返す。
11．溶出緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）または脱イオン水200μlを添加し、工程7と同様に10分間混合する。
12．粒子を沈殿させ、単離したDNAを含有する上清を清浄なチューブに注意深く移す。この物質はさらなる分析のために使用可能である。この試料が同じ日に試験される予定がない場合には、分析の時まで-20℃で冷凍する。
【００５１】
本発明の方法を用いて細菌細胞溶解物から単離された2つの異なるプラスミドDNA試料のアガロースゲル電気泳動は、キアプレップミニプレップ（QIAprep Miniprep）（Qiagen、Valencia、CA）（プラスミドDNA単離キットの代表的な供給業者）によって得られる結果と比較し得る結果を示した（図2）。
【００５２】
実施例15
磁化可能なセルロースおよび改変洗浄緩衝液を使用する細菌細胞からのプラスミドDNA単離
プラスミドDNA（PBA8およびPBA117、Prozyme、San Leandro、CAより入手）を、細菌細胞培養物（大腸菌: XL1-Blue）から遊離し、高純度まで単離し、分析した。遊離、単離および分析は、DNAが結合したマガセル粒子の洗浄（工程9）について、洗浄緩衝液が10% PEG 8000 MWおよび0.25M 塩化ナトリウムを含有するように改変されていること以外は、実施例14と同様に行った。
【００５３】
実施例16
磁化可能なセルロースを使用する血清からのRNA単離
MS2ウイルスRNA（1×10⁷−1×10⁸コピー）を3つの異なる血清試料に感染（spike）させた。次いで、各試料中のRNAを、実施例3と同様に単離した。次いで、精製したRNAを、以下の鋳型を使用してMS2 RT-PCRアッセイ法によって定量した。

^＊全体の反応容量が25μlである限りは、水とMS2 RNA鋳型のいかなる組み合わせも使用され得る。
【００５４】
以下の条件を用いてスマートサイクラー（Smart Cycler）（Cepheid、Sunnyvale、CA）中で反応混合物をサイクルに供した：60℃で30分間、次に95℃で120秒間および95℃で15秒間、60℃で30秒間の45サイクル（光学機器をオンにする）。
【００５５】
MS2ウイルスRNAは、ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、Indianapolis、IN（カタログ番号：165948およびMS2）から入手した。プライマーおよびプローブは、Oswel、Souhhampton、U.K.から入手した。ジェンアンプEZ rTth RNA PCRキット（GenAmp EZ rTth RNA PCR KIT）（部品番号：N808-0179）はパーキンエルマー（Perkin Elmer）から、スーパーアーゼ・イン（SUPERase・In）（RNエース阻害剤）はアンビオン（Ambion）、Austin、Txから入手した。RNイージーミニキット（RNeasy Mini Kit)（Qiagen、Valencia、CA）を参照方法として使用した。
【００５６】
本発明の方法によって単離されたMS2ウイルスRNAのリアルタイムRT-PCR定量は、図3に示す。
【００５７】
本明細書中に引用されるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各々個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として組み入れられることが示されるように、参照として本明細書中に組み入れられる。前述の発明は、理解を明確にする目的のために図面および実施例によっていくぶん詳細に記載されるが、特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることは、本発明の開示に鑑みて、当業者には容易に理解される。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Cortex Biochem, Inc.
<120> Magnetic Isolation and Purification of Nucleic Acids
<130> TO-A0314
<140> JP 2002-566667
<141> 2001-10-05
<150> US 60/269,729
<151> 2001-02-16
<160> 3
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:MS2 RT-PCR
Primer 1029F
<400> 1
ggagagacag ggcactgcta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:MS2 RT-PCR
Primer 1096R
<400> 2
ttggccatac ggattgtacc 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:MS2 Probe 1052T
<400> 3
cccaaatctc agccatgcat cgag 24
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】マガセル(商標)またはキアゲンキアアンプDNAミニキットを用いて、全血から単離されたDNAを示すアガロースゲル電気泳動であり、両方の技術によって単離された分解していない高分子量のDNAを示す。レーン1は1kbのDNAラダー；レーン2は仔ウシ胸腺DNA対照；レーン3、5、7、9および11は本発明の方法によって単離されたDNA；ならびにレーン4、6、8、10、および12はキアアンプによって単離されたDNAである。
【図２】マガセル(商標)またはキアゲンキアプレップミニプレップ用キット（キアゲンキアプレップミニプレップキット）を用いて細菌細胞溶解物から単離されたプラスミドDNAのアガロースゲル電気泳動であり、2つの異なるサイズの高品質のプラスミドDNAが両方の技術によって単離されたことを示す。レーン1および12は1kbのDNAラダー；レーン2はプラスミドDNA PBA117対照；レーン3、4、6、および7はマガセル(商標)によって単離されたプラスミドDNA PBA117；レーン5および8はキアプレップミニプレップによって単離されたプラスミドDNA PBA117；レーン9および10はマガセル(商標)によって単離されたプラスミドDNA PBA8；ならびにレーン11はキアプレップミニプレップによって単離されたプラスミドDNA PBA8である。
【図３】マガセル(商標)またはRNイージーキット（RNeasy Kit）によって単離されたMS2ウイルスRNAのリアルタイムRT-PCR定量を図示するグラフである。

Claims

磁化可能なセルロースに核酸を結合させる方法であって、
a) 磁化可能なセルロースを、核酸を含有する溶液と混合し、それによって混合物を調製する工程、ならびに
b) 混合物の塩濃度およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸が磁化可能なセルロースに結合するのに適切な濃度に調整し、それによって溶液中の核酸のすべてまたは一部が磁化可能なセルロースに結合する工程であって、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度である工程
を包含する、方法。
核酸がDNAであり、ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項1に記載の方法。
ポリエチレングリコールが分子量8000であり、塩が塩化ナトリウムである、請求項2に記載の方法。
ポリエチレングリコールの濃度が10％に調整され、塩化ナトリウムの濃度が0.25〜5.0Mに調整されている、請求項3に記載の方法。
核酸がRNAであり、ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項1に記載の方法。
磁化可能なセルロースが粒子の形状であり、選択的に重量比で90％までの磁気酸化鉄を含有する、請求項1に記載の方法。
磁化可能なセルロースが酸化鉄、酸化第一鉄または酸化ニッケルを含む、請求項1に記載の方法。
核酸溶液中の非核酸物質から核酸を分離する方法であって、
a) 磁化可能なセルロースを、核酸および非核酸物質を含む溶液と混合して、第1の混合物を調製する工程；
b) 第1の混合物の塩濃度およびポリエチレングリコール濃度を、溶液中の核酸が磁化可能なセルロースに結合するのに適切な濃度に調整し、磁化可能なセルロースに結合した核酸を含有する第2の混合物を調製する工程であって、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度である工程；
c) 第2の混合物から、磁化可能なセルロースに結合した核酸を分離する工程；
d) 工程c)において分離した磁化可能なセルロースに結合した核酸を溶出緩衝液に接触させ、結合した核酸を磁化可能なセルロースから溶出緩衝液中に遊離させる工程；ならびに
e) 溶出緩衝液から磁化可能なセルロースを分離させ、非核酸物質を実質的に含まない核酸を提供する工程、
を包含する、方法。
磁化可能なセルロースが粒子の形状であり、そして工程c)およびe)における磁化可能なセルロース粒子の分離が磁力的に実行される、請求項8に記載の方法。
請求項9に記載の方法であって、磁化可能なセルロース粒子に結合した核酸がDNAであり、洗浄緩衝液を用いて洗浄し、ここで洗浄緩衝液が磁化可能なセルロース粒子に結合した不純物を除去する一方、磁化可能なセルロース粒子に結合したDNAを結合した状態のままにする、方法。
磁化可能なセルロース粒子に結合したDNAが、磁化可能なセルロース粒子に結合したDNAを遊離させる溶出緩衝液を用いて溶出される、請求項10に記載の方法。
溶出緩衝液によって遊離したDNAが単離されている、請求項11に記載の方法。
ポリエチレングリコールが分子量8000であり、塩が塩化ナトリウムである、請求項8に記載の方法。
ポリエチレングリコールの濃度が10％であり、塩化ナトリウムの濃度が0.25〜5.0Mである、請求項13に記載の方法。
核酸および非核酸物質が細胞溶解物から得られたものである、請求項8に記載の方法。
細胞溶解物がヒト、動物、植物、ウイルス、または細菌を起源とする細胞から調製されたものである、請求項15記載の方法。
磁化可能なセルロースが酸化鉄、酸化第一鉄または酸化ニッケルを含む、請求項8に記載の方法。
種々の供給源から核酸を単離するための、磁化可能なセルロースおよび適切な濃度の試薬を含む、核酸の単離および精製のためのキットであって、該試薬がポリアルキレングリコールおよび塩を含み、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度であるキット。
磁化可能なセルロース誘導体に核酸を結合させる方法であって、
a) 磁化可能なセルロース誘導体を、核酸を含有する溶液と混合し、それによって混合物を調製する工程、ならびに
b) 混合物の塩濃度およびポリアルキレングリコールの濃度を、核酸が磁化可能なセルロース誘導体に結合するのに適切な濃度に調整し、それによって溶液中の核酸のすべてまたは一部が磁化可能なセルロース誘導体に結合する工程であって、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度である工程、
を包含する方法。
セルロース誘導体が、CM-セルロース、DEAE-セルロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
核酸がDNAであり、ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項19に記載の方法。
核酸がRNAであり、ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項19に記載の方法。
ポリエチレングリコールの平均分子量が8000であり、塩が塩化ナトリウムである、請求項21に記載の方法。
ポリエチレングリコールの濃度が10％に調整され、塩化ナトリウムの濃度が0.25〜5.0Mに調整されている、請求項23に記載の方法。
磁化可能なセルロース誘導体が粒子の形状であり、選択的に重量比で90％までの量の磁気酸化鉄を含有する、請求項19に記載の方法。
磁化可能なセルロースが酸化鉄、酸化第一鉄または酸化ニッケルを含む、請求項19に記載の方法。
非核酸物質から核酸を分離する方法であって、
a) 磁化可能なセルロース誘導体を核酸および非核酸物質を含む溶液と混合して、第1の混合物を提供する工程；
b) 第1の混合物の塩濃度およびポリエチレングリコール濃度を、核酸が磁化可能なセルロース誘導体に結合するのに適切な濃度に調整し、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を含有する第2の混合物を調製する工程であって、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度である工程；
c) 第2の混合物から、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を分離する工程；
d) 工程c)において分離した磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を溶出緩衝液に接触させ、結合した核酸を磁化可能なセルロース誘導体から溶出緩衝液中に遊離させる工程；ならびに
e) 溶出緩衝液から磁化可能なセルロース誘導体を分離させ、非核酸物質を実質的に含まない核酸を提供する工程、
を包含する、方法。
工程c)およびe)における磁化可能なセルロース誘導体の分離が磁力的に実行される、請求項27に記載の方法。
請求項27に記載の方法であって、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸が洗浄緩衝液を用いて洗浄され、ここで洗浄緩衝液が磁化可能なセルロース誘導体に結合した不純物を除去する一方、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸を結合した状態のままにする、方法。
請求項29に記載の方法であって、磁化可能なセルロース誘導体に結合した核酸がDNAであり、溶出緩衝液を用いて溶出され、ここで溶出緩衝液が磁化可能なセルロース誘導体に結合したDNAを遊離させる、方法。
溶出緩衝液によって遊離したDNAが単離される、請求項30記載の方法。
ポリエチレングリコールの平均分子量が8000であり、塩が塩化ナトリウムである、請求項27記載の方法。
ポリエチレングリコールの濃度が10％であり、塩濃度が0.25〜5.0Mである、請求項32記載の方法。
核酸および非核酸物質が細胞溶解物から得られたものである、請求項27記載の方法。
細胞溶解物がヒト、動物、植物、ウイルス、または細菌を起源とする細胞から調製されたものである、請求項34記載の方法。
磁化可能なセルロースが酸化鉄、酸化第一鉄または酸化ニッケルを含む、請求項27に記載の方法。
種々の供給源から核酸を単離するための、磁化可能なセルロース誘導体および適切な濃度の試薬を含む、核酸の単離および精製のためのキットであって、該試薬がポリアルキレングリコールおよび塩を含み、塩の適切な濃度が0.25Mから5.0Mであり、且つ、ポリアルキレングリコールの適切な濃度が5％から15％のポリエチレングリコール濃度に等しい濃度であるキット。