TR201606310A2 - Genomik dna izolasyon yöntemi ve kiti. - Google Patents

Abstract

Buluş, ekonomik, kaliteli ve verimli, kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen, çevreye ve araştırıcıya (uygulayıcıya) sağlık yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif ve vejetatif bitki kısımlarında ve çok sayıda bitki cins ve türlerinde etkin olarak çalışabilen genomik DNA izolasyon yöntemi, kiti ve üretim yöntemi ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME GENOMIK DNA IZOLASYON YÖNTEMI VE KITI Teknik Alan Bulus, ekonomik, kaliteli ve verimli, kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen, çevreye ve arastiriciya (uygulayiciya) saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif ve vejetatif bitki kisimlarinda ve bitki cins ve türlerinde etkin etkin olarak çalisabilen genomik DNA izolasyon yöntemi, kiti ve üretim yöntemi ile ilgilidir.

Teknigin Bilinen Durumu DNA genetik bilgiyi tasidigi nükleotidlerin sekansinda sifrelenmis olarak saklayan, fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin olusturdugu iki paralel zincirin, pürin ve pirimidin bazlarinoa çapraz olarak baglanmasi ile ortaya çikan genellikle sag yönlü sarmal bir yapiya sahip bir nwleküldür.

Moleküler biyolojive epigenetik teknikleri uygulamalarinda ön sart; yeterli miktarda, yüksek kalitede ve nükleotidlere zarar Vermeden ve nmdifikasyonlara neden olmadan farkli cins, tür, doku veya hücreden DNA izolasyonu gerçeklestirmektir. Moleküler biyoloji uygulamalarinin. yer aldigi örnegin. polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) çalismalari, DNA sekanslama çalismalari (DNA dizi analizleri), DNA. amplifikasyonu, hibridizasyon ve ileri nesil DNA sekanslama gibi islemlerden önce yüksek kalitede ve miktarda DNA'nin elde edilmesi gerekmektedir.

DNA izolasyonu hücre duvarinin parçalanmasi ve DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve aralarinda RNA'nin da bulundugu diger moleküllerden ayrilmasi olmak üzere temelde 2 asamadan olusmaktadir. Hücrenin çekirdegindeki genomik DNA'ya ulasmak için hücre duvarinin parçalanmasi gerekmektedir. Parçalama fiziksel ve kimyasal yollarla yapilabilir. Fiziksel olarak isitilan hücreler ayni zamanda kimyasal karisimlara tabi tutularak duvarin parçalanmasi saglanmaktadir. Bu kimyasal karisim içerisinde bulunan tuz, hücre duvarindan geçerek proteinleri DNA'dan ayirmaktadir. Hücre duvarinin geçirgenligini arttiran deterjan hücre içeriginin serbest kalmasini saglamaktadir.Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) magnezyumu vb. kofaktörlere baglayarak DNaz aktivitesini inhibe eder ve böylelikle DNA stabil halde kalabilmektedir. Protein parçalayici enzimler ise hücre içerigindeki proteinleri parçalayarak, sonraki asamalar açisindan homojen bir karisim olusmasini saglamaktadirlar. Hücre içinde bulunan RNA'lar tek zincir halde stabil olabildiklerinden onlarin da ortamdan uzaklastirilmasi gerekmekte ve bunun için de RNaz enzimi kullanilmaktadir.

Parçalama asamasinda kullanilan kimyasallar ve süre DNA'si elde edilmek istenen Hateryale göre degisiklik gösterebilmektedir. Örnegin, bazi bakterilerin DNA'sini elde ederken, farkli yapidaki hücre duvari için lizozim adli farkli bir enzim kullanilir` ve süre daha 'uzun tutulabilir. Yine ayni sekilde kandan DNA izolasyonu için harcanan parçalama süresi, dokudan DNA izolasyonu için harcanan süreden daha azdir.

DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve diger moleküllerden ayrilmasi yöntemi genellikle çözünme ve denatürasyona dayanmaktadir. Ancak günümüzde teknolojinin de gelisimi ile DNA'yi tutma özellikli spin kolonlari da kullanilmaya baslamistir. Denatürasyona dayali kimyasal çözülmede çogunlukla fenol ekstraksiyonu islemi kullanilir ve fenol ile proteinler ve DNA kloroform ve santrifüj gücü ile birbirinden ayrilarak uzaklasmalari saglanir. Spin kolonlarinin kullanildigi fiziksel baglanmada ise, özel solüsyonlar ile DNA'nin tüpler içine özel olarak yerlestirilen matriks tabakasina tutunmasi saglanir. Ayni asamada DNA haricindeki moleküller matrikse tutunamadigi için ortamdan santrifüj veya yerçekimi gücüyle uzaklasir. Spin kolonlar belirli solüsyonlar' ile yine DNA. harici maddelerin tamamen uzaklasmasi için “yikama" denilen isleme tabi tutulurlar. Son asamada ise DNA ile matriksi birbirinden elimine eden solüsyonlarin kullanildigi “Elüsyon” asamasi vardir ve bu asama ile birlikte DNA son halini almaktadir.

DNA izolasyonu için kullanilan çok sayida farkli metot ve kit U58729252 numarali basvurularda DNA izolasyon yöntemleri basvurularda DNA izolasyonu için kullanilan kitlerden bahsedilmektedir.

Ek olarak, mRNA kullanarak sentezlenen cDNA'da bir diger DNA kaynagidir. Bazi durumlarda DNA'nin, PZR veya hibridizasyon çalismalarinda izole edilmeleri (%2 gerekmektedir. Kaynagi ne olursa olsun DNA molekülleri degredasyona karsi dayanikli polimerler olup, uygun saklama sartlarinda uzun yillar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanilabilmektedir. Ancak, büyük parçalar kirilmaya ve zarar görmeye, küçük parçalardan daha çok meyilli oldugundan büyük parçalar halinde izole edilmek istenen DNA moleküllerini dikkatli bir sekilde islemek gerekmektedir.

Büyük. DNA. parçalarini izole ederken farkli metotlarin uygulanmasi gerekmektedir.

Saflastirilmak istenen DNA genomik veya genomik olmayan PZR veya hibridizasyon ürünleri olabildigi gibi Hdtokondri (mtDNA) ve kloroplast (cthNA) DNA'si. veya. bakterilerden. plazmid. DNA'si seklinde de olabilmektedir. Artan test sayisi ve çesitliligi moleküler tani laboratuvarlarinda otomatik DNA izolasyonu ihtiyacini gündeme getirmis ve bu amaçla otomatize Cihazlar gelistirilmistir. DNA izolasyon kitleri, genomik ve genomik olmayan DNA moleküllerini izole etmemizi saglayan standartlastirilmis paketlerdir. Günümüzde çesitli amaçlar için tasarlanmis olan DNA izolasyon kitleri bulunmaktadir. Bazi tip izolasyon kitleri, agaroz jellerinden ve PZR sonrasi istenilen DNA'nin digerlerinden ayristirilmasina olanak saglamaktadir. Bu tip izolasyon kitleri, DNA'nin baglanmasina olanak saglayan membran, kolon, kapiler gibi platformlardan olusmaktadir. DNA izolasyon kitleri deney asamalarini kisaltmakla birlikte, daha etkili ve daha kolay bir sekilde DNA izolasyonu yapilabilmesini saglayan araçlardir.

Otomatik DNA izolasyonu sistemlerinde doku parçalanmasi islemi genellikle manyetik bilye teknolojisi kullanilmaktadir. Ancak bu manyetik partiküller elüsyon basamaginda ortamdan uzaklastirilamazsa PZR amplifikasyon reaksiyonunu etkileyebilmekte ve gerçek olmayan negatif veya pozitif PZR sonuçlarina yol açabilmektedir.

Teknigin bilinen durumunda son yillarda DNA izolasyonu için kati fazin silika oldugu ve silika partiküllerinin nano düzeyde özel filtrelere islenmesiyle olusturulan DNA kartusu olarak da adlandirilan DNA baglanma kolonlari gelistirilmektedir.

DNA izolasyonu için gelistirilen kitler genellikle sinirli sayida bitki çinsinde yeterli miktarda ve kalitede genomik DNA izolasyon yapabilmektedir. Genellikle yüksek maliyetli olan bu kitler ayrica teknik bilgi ve altyapi da gerektirmektedir. Ek olarak, bazi genomik DNA izolasyon kitlerinde kullanilan beta merkapto etanol, fenol, kloroform benzeri kimyasallar insan ve çevre sagligina olumsuz etki potansiyeline sahiptir.

Yukarida yapilan açiklamalar ve çalismalar sonucunda karsilasilan dezavantajlar göz önüne alinarak, bulus konusu ekonomik ve saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan yüksek, kalitede ve miktarda, genOmikr DNA, izolasyon, kiti elde edilmistir.

Bulusun Çözümünü Amaçladigi Problemler Bulusun amaci ekonomik, kaliteli ve verimli, kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen, çevreye ve arastiriçiya (uygulayiçiya) saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif` ve vejetatif› bitki kisimlarinda ve bitki cins ve türlerinde etkin olarak çalisabilen genomik DNA izolasyon yöntemi, kiti ve üretim yönteminin gelistirilmesidir.

Bulusun bir diger amaci, DNA izolasyonunun canli bitkilerden elde edilebilecegi gibi kurutulmus bitki aksamlari ile un ve pirincin (embriyosuz çeltik) de içinde bulundugu cansiz bitki kisimlarindan da elde edilmesinin saglanmasidir.

Bulusun diger bir amaci, DNA izolasyonu yapilan kitlerden daha kisa bir sürede, yüksek maliyetle altyapi gerektirmeyen ve düsük maliyetli DNA izolasyonunun yapilmasinin saglanmasidir.

Bulusun bir diger amaci, DNA baglanma kolonunun olusturulmasi ve kullanilmis DNA baglanma kolonu parçalarindan yeniden olusturulmasinin saglanmasidir.

Bulusun bir diger amaci ise, DNA izolasyon kiti ile kullan-at malzeme sayisinin azaltilmasi ve DNA baglanma kolonu ve kit için kullanilan plastik malzemelerin yeniden kullanim olanaginin saglanmasidir.

Sekillerin Açiklanmasi Sekil 1: DNA Baglanma Kolonu Sekil 2: Agaroz Jel Elektröforez Analiz Görüntüsü Sekil 3: Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analiz Görüntüsü Sekillerdeki Referanslarin Açiklanmasi Sekillerdeki parçalar numaralandirilmis olup, açiklamalari asagida verilmistir: 1 : DNA Baglanma Kolonu Bulusun Açiklanmasi Bulus, ekonomik, kaliteli ve verimli, kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen, çevreye ve arastiriciya (uygulayiciya) saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif ve vejetatif bitki kisimlarinda ve çok sayida bitki cins ve türlerinde etkin olarak çalisabilen genomik DNA izolasyon yöntemi, kiti ve üretim yöntemi ile ilgilidir.

DNA izolasyonu için öncelikle DNA baglanma kolonu (l) Olusturulmasi, doku lezyon çözeltisi, DNA baglanma çözeltisi ve DNA yikama ve silikadan ayirma çözeltileri hazirlanmasi gerekmektedir.

DNA BAGLANMA KOLONU OLUSTURULMASI Bulus konusu çok sayida canli ve cansiz bitki türünden gelistirilen DNA izolasyon kitinde üç farkli tipte DNA baglanma kolonu (l) olusturulmustur. Bunlardan ilki, yeni olan 1. DNA baglanma kolonudur (1) ve Sekil 1'de gösterilmektedir. 1. DNA BAGLANMA KOLONU l. DNA baglanma kolonu (1) için kolonlarin daha uzun süre saklanabilirligini saglayan, daha fazla miktarda ve kalitede DNA moleküllerinin silikaya baglanmasini tesvik etmek amaciyla kullanilan kolon denge solüsyonu (KDS) için gerekli olan kimyasallar O,2-l,2 M 3-morfolino propan-l-sülfonik asit (MOPS, pH 6,5-7,5), 2,4-5,6 M sodyum klorür (NaCl), stok Triton-X-lOO ve Stok izopropanoldür. Örnek olarak 30 mL KDS hazirlamak için Triton-X-lOO ve 2,5-6,5 mL izopropanol sirayla eklenerek hazirlanmaktadir. l. DNA baglanma kolonu (1); o Filtre kagitlarinin steril bir pens ve yükleme çubugu ile tüpün içerisine yerlestirilmesi ve üzerine 15-67 mg silika eklenmesi, o Silika yüzeyi dengelendikten sonra üzerine en az 1 adet filtre kagidinin üzerine O-halkanin yükleme çubugu ile bastirilmasi, o Kolona O,20-O,75 mL kolon denge solüsyonunun (KDS) eklenmesi, c› Karisimin 1-3 saat boyunca 22-26OC'de bekletilmesi, santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermektedir. 2. DNA BAGLANMÄ KOLONU DNA izolasyon kiti için hazirlanan 2. DNA baglanma kolonu (1) daha Önce kullanilan tüm silika tabanli DNA baglanma kolonundan (l) elde edilmektedir. Kullanilmis DNA baglanma kolonundan (l) 2. DNA baglanma kolonu (1); o Kullanilmis DNA baglanma kolonunun (l) dis tup, iç tüp, silika, destek katmanlari ve O-halka kisimlarina komponent cinsine göre ayrilmasi, o Komponentlerin hacim olarak en az 13 kati stokiyometrik oraninda (3/1) 0,0l-O,7 N hidroklorik asit (HCl) içerisinde 25-36 saat bekletilmesi, 0 Komponentlerin en az 3 kez distile su ile durulanmasi ve otoklavlanmasi, i Kolonlara. O,5-O,75 mL 0,0l-O,7 N HCl'nin. 2-5 kez arka arkaya eklenmesi, - Karisimin 6000-lZOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi, i DNA baglanma kolonunun (1) bos olarak 6000-l2000xg hizinda 1-2 dakika boyunca santrifuj islemine tabi tutulmasi, o Kolonlara O,5-O,75 mL KDS eklenmesi ve 1-3 saat boyunca 22-260C'de bekletilmesi, O Karisimin 6000-lZOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarindan olusmaktadir. 3. DNA BAGLANMÄ KOLONU DNA izolasyon kiti için hazirlanan 3. DNA baglanma kolonu (1) ise piyasada yer alan DNA baglanma kolonlarinda (l) bulus konusu gelistirilen DNA, izolasyon kitinde kullanilan DNA solüsyonlarinin ve metodolojisinin uyumlu olup olmadiginin kontrolü için yapilmistir. Elde edilen sonuçlarda solüsyonlarin ve metodolojinin her türlü silika tabanli DNA baglanma kolonuna (1) uygun oldugu belirlenmistir.

DOKU LEZYON ÇÖZELTILERI HAZIRLANMASI Doku lezyon çözeltileri hazirlanmasinda Tris(hidroksimetil)aminometan (Tris), ethilendiamintetraasetik asit (EDTA), sodyum dodekil sülfat (SDS), sodyum lauril sülfat (SLS), Sodyum deoksi kolat (SDC), polivinil polipirolidon (PVPP) ile sodyum azid (NaNg) kullanilmistir. Belirtilen kimyasallari içeren solüsyon Miolarak adlandirilmaktadir. SDS, SLS ve SDC kimyasallari anyonik karakterde olduklari için DNA molekülleri ile DNA baglanma kolonundaki (l) silika partiküllerine yarismaci baglanma göstergelerini önlemek amaciyla M% ve Mw solüsyonlari olusturulmustur. Bu solüsyonlarin bitki cinsine ve yas, kuru, polisakkarit ve yag içerikleri gibi Örneklerin durumuna göre kullanilmasi gerekmektedir. Lezyon çözeltisi esliginde proteinaz K ile muamele edilerek proteinler parçalanirken hücresel RNA molekülleri (rRNA, mRNA, tRNA ve diger RNA tipleri) RNaz enzimiyle yikilmaktadir.

Ah solüsyonu hazirlanmasi; karistirilmasi, - Distile su üzerine Tris-EDTA karisiminin eklenmesi, o Karisimin otoklavlanarak sterilize edilmesi, eklenmesi, - Solüsyonun filtre edilerek sterilize edilmesi islem adimlarini içermektedir.

Misolüsyonu içerisine eksojen olarak eklenen RNaz ve Proteinaz K enzimlerinin aktiviteye sahip oldugu spektrofotometrik ve elektroforetik (agaroz jel) yöntemler` kullanilarak test edilmistir. Sekil 2'de gösterilen agaroz jel elektroforez analiz görüntüsünde RNA kalintisi ve protein/polisakkarit kalintilarinin olmadigi görülmektedir. Ayrica, Sekil 3'te verilen polimeraz zincir reaksiyonu analiz görüntüsünde ise izole edilen örneklerde proteinaz K aktivitesi olmadigi ve DNA polimeraz aktivitesini engelleyecek hiçbir kalintinin olmadigi görülmektedir. Ek olarak, Tablo 1'de degisik bitki kisimlarindan elde edilen DNA örneklerinin spektrofotometre okuma degerleri verilmistir.

Tablo 1. Degisik bitki kisimlarindan elde edilen DNA örneklerinin spektrofotometre okuma degerleri kisimlari A260/A280 oraninin 1,6 degerinin üzerinde olmasi kullanilir DNA oldugunu, 1,7-2,1 arasinda olmasi ise çok kaliteli DNA oldugunu göstermektedir. Ayrica, A260/A280 orani 2,2 degerinin üzerinde ise DNA ile bir miktar RNA molekülleri birlikte bulunmaktadir. oldugunu, bu oranin 3'ün üzerinde olmasi bazi kalintilarin (DNA ile birlikte izole edilen veya daha sonra eklenen bazi maddelerin) absorbansi etkiledigini ortaya koymaktadir.

Spektrofotometrik ve agaroz jel elektroforez analizleri M1 solüsyonu içerisine eksojen olarak eklenen RNaz ve Proteinaz K enzimlerinin aktiviteye sahip oldugunu açikça ortaya koymaktadir. Misolusyonu eksojen proteinaz K ve RNaz enzimleri ile birlikte kullanildiginda hücre duvari ve hücresel membranlar ve DNA moleküllerine bagli proteinler uzaklastirilmaktadir. RNaz enzimi RNA tipi nükleik asitleri yikarak DNA izolasyonu sirasinda DNA ile birlikte izole edilmelerini önlemek amaciyla kullanilmaktadir. Ayrica, NaNgiçermesi nedeni ile de bir yil oda sicakliginda mikroorganizma faaliyeti içermedigi spektrofotometrik analizler ile teyit edilmistir. thsolusyonu hazirlanmasi; o 60-80 mL distile suda çözülmesi, - Solüsyona 23-30 mL 12-14 M glasiyel asetik asit eklenmesi, o Karisimin karistirilmasi, o Karisima 65-85 mL distile su eklenmesi islem adimlardan olusmaktadir.

Mw solüsyonu hazirlanmasi; karistirilmasi, - Solüsyon hacmi l00 mL olana kadar distile su eklenmesi islem adimlarindan olusmaktadir.

DNA BAGLANMA ÇÖZELTILERI HAZIRLANMASI DNA'nin silika kolonuna baglanmasini saglayan solüsyonlar Mgve M4 olarak adlandirilmakta ve bu solüsyonlarin hazirlanmasinda bazi deterjan, kaotropik ajan ve tuzlar kullanilmistir. 1% solüsyonu hazirlanmasi, distile su eklenmesi islem adimlarini içermektedir. ß& solüsyonu hazirlanmasi, o Karisinumi hacini olarak 200-250 mL'ye tamamlanmasi için, karisima etil alkol eklenmesi islem adimlarini içermektedir.

DNA YIKAMA VE SILIKADAN AYIRMA ÇÖZELTILERI HAZIRLANMASI DNA'nin silika partiküllerine bagli kalmasini ve diger moleküllerin silika partiküllerinden ayrilmasini saglayan solüsyonlar Msve Msolarak adlandirilmakta ve bu solüsyonlar bazi deterjanlar, kaotropik ajan ve alkolden olusmaktadir. Ek olarak, 1% olarak adlandirilan solüsyon da DNA yikama ve silikadan ayirma çözeltisi olarak kullanilmaktadir. karistirilmasi, - Karisima NaN3 eklenmesi, alkol eklenmesi islem adimlarindan olusmaktadir.

Masolüsyonu hazirlanmasi, karistirilmasi, eklenmesi, alkol eklenmesi islem adimlarindan olusmaktadir.

M7solüsyonn hazirlanmasi, distile suyun karistirilmasi islem adimini içermektedir.

DNA izolasyon kitinde kullanilan DNA solüsyonlarinin hazirlanmasi ile DNA izolasyonu baslatilabilecektir. DNA izolasyonu; A. Doku parçalanmasi, hücrelerin açiga çikartilmasi ve hücre lezyonu, B. DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi, C. DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi, D. DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi olmak üzere dört asamadan olusmaktadir.

A. Doku Parçalanmasi, Hücrelerin Açiga Çikartilmasi ve Hücre Lezyonu; Bitki Cinsi ve doku tipine göre degisen doku parçalama islemi kuru ve yas bitki kisimlari ve bitki tohumlari için farklilik göstermektedir. Doku parçalanmasi, hücrelerin açiga çikartilmasi ve hücre lezyonu; - Dogal kurumus veya yapay olarak kurutulmus bitki kisimlari, bitki tohumlari ve lifolize edilmis örneklerin mikro degirmenlerde, yas bitki kisimlarinin ise sivi azot içerisinde parçalanmasi, 0 Kuru bitki kisimlarindan 0,03-0,08 g, yas doku kisimlarindan O,1-0,3 g, bitki tohumlarindan ise O,1-0,15 g alinarak 1,5-2,0 mL'lik tüplere konulmasi, mg/mL Proteinaz K enzimi eklenmesi, o Elde edilen solüsyonlarin 30-90 saniye karistirilmasi, o Karisimlarin 50-7OOC'de 10-20 dakika bekletilmesi ve her 5 dakikada bir karisimlarin 30-45 saniye karistirilmasi islem adimlarini içermektedir.

B. DNA Moleküllerinin Açiga Çikarilmasi Doku parçalanmasi ve hücre lezyonu isleminin son basamagindaki inkübasyon sonrasinda gerçeklestirilen DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi; o Karisimlarin üzerine M1 solüsyonunun hacim, olarak yari stokiyometrik oraninda (1/2) Mm veya MR solüsyonunun eklenmesi, o Elde edilen karisimin 30-60 saniye boyunca karistirilmasi, o Karisimin 10-20 dakika 50-7W@'de bekletilmesi ve her 5 dakikada bir karisimin 15-45 saniye boyunca karistirilmasi, dakika boyunca 24-26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermektedir.

C. DNA Moleküllerinin Silika Partiküllerine Baglanmasi Santrifüje tabi tutulan süpernatanttan 0,5 mL alinarak baslatilan DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi; O Süpernatantin üzerine 0,25-O,5 mL Mgsolüsyonu ve O,25-O,5 mL etanol veya izopropanol eklenmesi, i Karisimlarin 30-60 saniye boyunca karistirilmasi, - DNA baglanma kolonuna (l) O,5-O,7 mL olarak transfer edilmesi, - DNA baglanma kolonunun (l) 6000-lIOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca 24-26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve dis tüpte toplanan solüsyonun dökülmesi, - DNA baglanma kolonuna (l) solüsyondan O,5-O,7 mL transfer isleminin tekrarlanmasi ile DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi, o DNA moleküllerinin silika partiküllerine seçici baglanmasi ve pigmentlerin uzaklastirilmasi amaciyla DNA. baglanma kolonunun (l) iç haznesine O,25-O,5 mL M4 solüsyonu eklenmesi, - Karisimin 6000-llOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca 24- 260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve dis tüpte toplanan solüsyonun dökülmesi islem adimlarini içermektedir.

D. DNA Molekülünün Yikanmasi ve Silikadan Ayristirilmasi DNA moleküllerine ve silika yüzeyine protein, lipit, polisakkarit. ve pigment kalintilarinin tutunmus olmalarindan dolayi gereken DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi; o DNA baglanma kolonuna (1) 500-750 uL Mssolüsyonu eklenmesi, - Karisimin 6000-lIOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca 24- 26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve alt haznenin bosaltilmasi, o Karisima 500-750 uL Masolüsyonu eklenmesi, 26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve alt haznenin bosaltilmasi, o DNA baglanma kolonunun (l) dis hazneden ayrilmasi ve tüp içerisine transfer edilmesi, O Silika. kolonunun Inerkezine 50-700C'de bekletilmekte olan -200 uL M7 solüsyonu eklenmesi, o Karisimin 50-700C'de 5-10 dakika inkübe edilmesi, 26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermektedir.

Bulus konusu gelistirilen DNA izolasyon kitinde, tür ve dokulara göre DNA. izolasyonu için. M1 ve M2 solüsyonlarinin inkübasyon süreleri uzatilabilmektedir. Doku parçalanmasi ve hücre lezyonu asamasinda M1 solüsyonunun inkübasyon süresi 10-30 dakika, DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda Mmr ve M& solüsyonlarinin inkübasyon süresi 20-40 dakika olabilmektedir.

DNA izolasyon kitinde, mikrolitresinde O,5-1,0 mikrograni DNA alinmasinin gerekli oldugu durumlarda DNA Hmleküllerinin yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda M7 solüsyon hacmi 0,03 mL'ye kadar azaltilabilmektedir.

DNA izolasyon kitinde, DNA moleküllerinin yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda Origanum, Thymus, kenevir, çemen gibi bitki türleri için ayrismanin etkin olmasi için sicaklik 70- 850C'ye çikartilabilmektedir.

DNA izolasyon kitinde, DNA. moleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda perikarp, petal, plesanta, sepal gibi pigmentçe ve polisakkaritlerce zengin dokularda Mzeklenmesinden sonra hacimce ayni stokiyometrik oranlarda (l/l) kloroform eklenebilmektedir.

Ayrica bu dokular için santrifüj isleminin ardindan DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi; 0 0,5 mL süpernatant üzerine hacimce 0,l stokiyometrik oraninda (l/O,l) 2,4-5,6 M NaCl ve hacimce 0,9 stokiyometrik oraninda (1/0,9) izopropanol eklenmesi, 260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi, o Elde edilen pelletin 0,25-0,39 mL M7solüsyonunda çözülmesi islem adimlarini içermektedir. Bu islem adimlarindan sonra DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi asamasi ayni sekilde devam ettirilebilir.

DNA baglanma kolonlarinda (l) DNA solüsyonlari kullanilarak özellikle bugday, arpa, yulaf, çeltik, tritikale, misir, stolonlu tavuz otu gibi Poaceae familyasi üyelerinin tohum, kökçük, sapçik kisimlarindan; patlican, patates, domates, biber gibi Solanaceae familyasi üyelerinin ovül, tohum, mikro yumru, sapçik, kök, yaprak, perikarp, plesanta, tüber, stolon kisimlarindan; pamuk türlerinin (Gossypium hirsutwn L. ve G. barbadense L.) yaprak, ovül, tohum, kök, sepal, petal, polen kisimlarindan; mercimek, bezelye, börülce, korunga gibi Leguminosae familyasi üyelerinin tohumlari ile defne, rezene, ada çayi, kekik gibi tibbi aromatik bitkilerin yapraklarindan DNA izolasyonu gerçeklestirilmistir. Izole edilen DNA örneklerinin kalite ve miktarlari spektrofotometrik Ölçumlerle belirlenmistir. Ek olarak, agaroz jel elektroforez teknigine tabi tutulmus ve etidyum bromür boyama teknigi ile tespit edilmistir.

Bulusun Sanayiye Uygulanma Biçimi: Bulus konusu, ekonomik, kaliteli ve verimli DNA izolasyon yöntemi, kiti ve üretim yöntemi; kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen ve çevreye ve arastiriciya (uygulayiçiya) saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif ve vejetatif bitki kisimlarinda ve bitki cins ve türlerinde etkin olarak çalisabilen, diger DNA izolasyon kit ve yöntemlerine göre üstün özellik gösterebilecek niteliktedir.

Claims (2)

ISTEMLER

1. Bulus, genomik DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, ekonomik, kaliteli ve verimli, kanserojenik ve mutajenik ajanlar içermeyen ve Çevreye ve arastiriciya (uygulayiciya) saglik yönünden olumsuz bir etkiye sahip olmayan, generatif ve vejetatif bitki kisimlarinda ve bitki cins ve türlerinde etkin olarak çalisabilecek DNA baglanma kolonu (1) elde edilmesi ile DNA izolasyon yöntemi; A. Doku parçalanmasi, hücrelerin açiga çikartilmasi ve hücre lezyonu, 0 Dogal kurumus veya yapay olarak kurutulmus bitki kisimlari, bitki tohumlari ve lifolize edilmis örneklerin mikro degirmenlerde, yas bitki kisimlarinin ise sivi azot içerisinde parçalanmasi, 0 Kuru bitki kisimlarindan 0,03-0,08 g, yas doku kisimlarindan 0,1-0,3 g, bitki tohumlarindan ise 0,1- 0,15 g alinarak l,5-2,0 mL'lik tüplere konulmasi, 20 mg/mL Proteinaz K enzimi eklenmesi, o Elde edilen solüsyonlarin 30-90 saniye karistirilmasi, o Karisimlarin 50-70°C'de 10-20 dakika bekletilmesi ve her 5 dakikada bir karisimlarin 30-45 saniye karistirilmasi islem adimlarini içermesi, B. DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi, o Karisimlarin üzerine Misolüsyonunun hacim olarak yari stokiyometrik oraninda (1/2) MM veya MB solüsyonunun eklenmesi, o Elde edilen karisimin 30-60 saniye boyunca karistirilmasi, Karisimin 10-20 dakika 50-700C'de bekletilmesi ve her 5 dakikada bir karisimin 15-45 saniye boyunca karistirilmasi, Inkübasyonun ardindan solüsyonun 6000-12000xg hizinda 10-20 dakika boyunca 24-26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermesi, C. DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi, Süpernatantin üzerine 0,25-0,5 mL Mgsolüsyonu ve 0,25- 0,5 mL etanol veya izopropanol eklenmesi, Karisimlarin 30-60 saniye boyunca karistirilmasi, DNA baglanma kolonuna (l) 0,5-0,7 mL olarak transfer edilmesi, dakika boyunca 24-260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve dis tüpte toplanan solüsyonun dökülmesi, DNA baglanma kolonuna (l) solüsyondan 0,5-0,7 mL transfer isleminin tekrarlanmasi ile DNA moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi, DNA Hmleküllerinin silika partiküllerine seçici baglanmasi ve pigmentlerin uzaklastirilmasi amaciyla DNA baglanma kolonunun (l) iç haznesine 0,25-0,5 mL M4 solüsyonu eklenmesi, 26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve dis tüpte toplanan solüsyonun dökülmesi islem adimlarini içermesi, D. DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi, DNA baglanma kolonuna (1) 500-750 uL M5 solüsyonu eklenmesi, 26OC'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve alt haznenin bosaltilmasi, o Karisima 500-750 uL Mgsolüsyonu eklenmesi, 260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi ve alt haznenin bosaltilmasi, hizinda 24-26OC'de santrifüj edilmesi, o DNA baglanma kolonunun (l) dis hazneden ayrilmasi ve tüp içerisine transfer edilmesi, O Silika kolonunun merkezine 50-700C'de bekletilmekte olan 30-200 uL M7 solüsyonu eklenmesi, o Karisimin 50-7OOC'de 5-10 dakika inkübe edilmesi, 260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilen dört asamadan olusmasi ile karakterize edilmesidir. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, l. DNA baglanma kolonu (l) elde edilmesi yöntemi; Filtre kagitlarinin steril bir pens ve yükleme çubugu ile tüpün içerisine yerlestirilmesi ve üzerine 15-67 mg silika eklenmesi, Silika yüzeyi dengelendikten sonra üzerine en az 1 adet filtre kagidinin üzerine O-halkanin yükleme çubugu ile bastirilmasi, Ayri bir tüpte, 3 mL O,2-1,2 M 3- morfolino propan-l- Triton-X-lOO ve 2,5-6,5 mL izopropanolün karistirilarak kolon denge solüsyonunun (KDS) elde edilmesi, Kolona O,20-O,75 mL kolon denge solüsyonunun (KDS) eklenmesi, Karisimin l-3 saat boyunca 22-26OC'de bekletilmesi, Karisimin GOOO-lZOOOXg hizinda l-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir. Istem l'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, kullanilmis DNA baglanma kolonundan (l)

2. DNA baglanma kolonu (l) elde edilmesi yöntemi; Kullanilmis DNA baglanma kolonunun (l) dis tup, iç tüp, silika, destek katmanlari ve O-halka kisimlarina komponent cinsine göre ayrilmasi, Komponentlerin hacim olarak en az SB kati stokiyometrik oraninda (3/1) 0,0l-O,7 N hidroklorik asit (HCl) içerisinde 25-36 saat bekletilmesi, Komponentlerin en az 3 kez distile su ile durulanmasi ve otoklavlanmasi, Kolonlara O,5-O,7E$ mL 0.0l-O,7 DJ HCl'nin 2-5 kez arka arkaya eklenmesi, Karisimin 6000-lZOOOxg' hizinda, 1-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi, DNA baglanma kolonunun (1) bos olarak 6000-lZOOOxg hizinda 1-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi, Kolonlara O,5-O,75 mL KDS eklenmesi ve l-3 saat boyunca 22-26OC'de bekletilmesi, Karisimin 6000-lZOOOxg' hizinda, 1-2 dakika boyunca santrifüj islemine tabi tutulmasi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

4. Istem l'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup Özelligi, doku parçalanmasi ve hücre lezyonu asamasinda kullanilan M1 solüsyonunun; karistirilmasi, i Distile su üzerine Tris-EDTA karisiminin eklenmesi, o Karisimin otoklavlanarak sterilize edilmesi, eklenmesi, - Solüsyonun filtre edilerek sterilize edilmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

5. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA nmleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda kullanilan MM solüsyonunun; o 60-80 mL distile suda çözülmesi, o Solüsyona 23-30 mL 12-14 M glasiyel asetik asit eklenmesi, O Karisimin karistirilmasi, 0 Karisima 65-85 mL distile su eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

6. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup Özelligi, DNA Hmleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda kullanilan MB solüsyonunun; karistirilmasi, - Solüsyon hacmi 100 mL olana kadar distile su eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

7. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA [noleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi asamasinda kullanilan M3 solüsyonunun; distile su eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

8. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup Özelligi, DNA, moleküllerinin silika partiküllerine baglanmasi asamasinda kullanilan M4 solüsyonunun; - Karisimin hacini olarak 200-250 mL'ye tamamlanmasi için, karisima etil alkol eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

9. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda kullanilan M5 solüsyonunun; karistirilmasi, - Karisima NaN3 eklenmesi, alkol eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

10. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup Özelligi, DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda kullanilan M6 solüsyonunun; karistirilmasi, eklenmesi, alkol eklenmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.

11. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup Özelligi, DNA molekülünün yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda kullanilan M7 solüsyonunun; distile suyun karistirilmasi isleni adimini içermesi ile karakterize edilmesidir.

12. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, kullanilan tur ve dokulara göre DNA izolasyonu için doku parçalanmasi ve hücre lezyonu asamasinda M1 solüsyonunun inkübasyon süresinin 10-30 dakika, DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda Max ve MEB solüsyonlarinin inkübasyon süresinin 20-40 dakika olabilmesi ile karakterize edilmesidir.

13. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, mikrolitresinde O,5-1,0 mikrogram DNA alinmasinin gerekli oldugu durumlarda DNA moleküllerinin yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda D& solüsyon hacminin 0,03 mL'ye kadar azaltilabilmesi ile karakterize edilmesidir.

14. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA moleküllerinin yikanmasi ve silikadan ayristirilmasi asamasinda Origanum, Thymus, kenevir, çemen cinsi bitki türlerinde ayrismanin etkin olmasi için sicaklik 70-850C'ye çikartilabilmesi ile karakterize edilmesidir.

15. Istem 1'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda perikarp, petal, plesanta, sepal gibi pigmentçe ve polisakkaritlerce zengin dokularda Mgeklenmesinden sonra hacimce ayni stokiyometrik oranlarda (l/l) kloroform eklenebilmesi ile karakterize edilmesidir.

16. Istem 15'de bahsi geçen DNA izolasyon yöntemi ve kiti olup özelligi, DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi asamasinda santrifüj isleminin ardindan DNA moleküllerinin açiga çikarilmasi; 0 0,5 mL süpernatant üzerine hacimce O,l stokiyometrik oraninda (l/O,l) 2,4-5,6 M NaCl ve hacimce 0,9 stokiyometrik oraninda (l/O,9) izopropanol eklenmesi, 260C'de santrifüj islemine tabi tutulmasi, o Elde edilen pelletin 0,25-0,39 mL M7solüsyonunda çözülmesi islem adimlarini içermesi ile karakterize edilmesidir.