KR100557755B1 - 키토산을 이용한 ｒｎａ의 보관 방법 및 상기 방법을이용한 제품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키토산을 이용한 RNA의 보관 방법 및 상기 방법을 이용한 제품에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 수용성 키토산과 결합한 RNA는 실온에서 안정적으로 장기간 보관이 가능하며 유전자 발현 분석에도 간편하게 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 RNA 보관 방법은 간편하고 경제적이며 이를 응용한 RNA 카드, RT-PCR 키트 및 RNA 마이크로어레이 용 칩은 다수의 RNA 샘플을 보관하고 운반하며 분석하는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

RNA보관, 수용성 키토산, RNA카드, 역전사(RT)-PCR, RNA칩

Description

키토산을 이용한 ＲＮＡ의 보관 방법 및 상기 방법을 이용한 제품{Method for storing RNA using chitosan and products using the method}

도 1은 본 발명에 따라 RNA와 수용성 키토산 결합 제품을 제조 및 분석하는 과정을 나타낸 블럭도이다.

도 2는 정상 성인의 혈구세포에서 분리한 RNA를 다양한 농도의 수용성 키토산과 다양한 비율로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 사진이다.

레인(Lane) 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100 bp)이고,

레인 2는 키토산과 결합하지 않은 RNA로, DNA의 오염이 없이 정상적인 이동(migration)을 나타내며,

레인 3은 1㎍/㎕의 RNA와 0.02% 수용성 키토산 용액을 용적비 1 : 1로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 4는 1㎍/㎕의 RNA와 0.02% 키토산 용액을 용적비 1 : 2로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 5는 1㎍/㎕의 RNA와 0.02% 키토산 용액을 용적비 1 : 3으로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 6은 1㎍/㎕의 RNA와 0.1% 키토산 용액을 용적비 1 : 1로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 7은 1㎍/㎕의 RNA와 0.1% 키토산 용액을 용적비 1 : 2로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 8은 1㎍/㎕의 RNA와 0.1% 키토산 용액을 용적비 1 : 3으로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 9는 1㎍/㎕의 RNA와 0.25% 키토산 용액을 용적비 1 : 1로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 10은 1㎍/㎕의 RNA와 0.25% 키토산 용액을 용적비 1 : 2로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이며,

레인 11은 1㎍/㎕의 RNA와 0.25% 키토산 용액을 용적비 1 : 3으로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물의 경우이다.

도 3은 키토산과 결합시킨 RNA와 키토산을 결합시키지 않은 RNA에 리보뉴클레아제(ribonuclease, RNase A)를 처리하여 1% 아가로스 겔 상에서 RNA의 분해(degradation) 정도를 비교 분석한 사진이다(리보뉴클레아제 보호기능 검사).

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 1 kb ladder)이고,

레인 2는 키토산을 결합시키지 않은 RNA로서, DNA에 의한 오염이 없이 정상적인 이동을 보여 주며,

레인 3은 RNA와 키토산 결합물에 리보뉴클레아제 처리 후 20분 경과 후의 RNA이며,

레인 4는 RNA와 키토산 결합물에 리보뉴클레아제 처리 후 40분 경과 후의 RNA이며,

레인 5는 RNA와 키토산 결합물에 리보뉴클레아제 처리 후 60분 경과 후의 RNA이며,

레인 6은 키토산과 결합하지 않은 RNA에 리보뉴클레아제 처리 후 20분 경과 후의 RNA이며,

레인 7은 키토산과 결합하지 않은 RNA에 리보뉴클레아제 처리 후 40분 경과 후의 RNA이며,

레인 8은 키토산과 결합하지 않은 RNA에 리보뉴클레아제 처리 후 60분 경과 후의 RNA이다.

도 4는 0.1% 키토산 용액과 1㎍/㎕의 RNA를 무게비 1 : 1로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물 및 키토산을 결합시키지 않은 RNA를 각각 주형으로 하여 베타-엑틴 유전자에 대한 RT-PCR을 수행하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100bp)이고,

레인 2는 음성 대조군이며,

레인 3은 양성 대조군으로, 혈액에서 분리 정제 후 바로 RT-PCR을 수행한 RNA 샘플이고,

레인 4는 키토산과 결합한 RNA 샘플이며,

레인 5는 키토산을 처리한 RNA 카드에서 분리한 RNA이다.

도 5는 0.1% 키토산 용액과 1㎍/㎕의 RNA를 무게비 1 : 1로 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물과 키토산을 결합시키지 않은 RNA를 특정 조건에서 보관한 후 이들을 각각 주형으로 하여 베타-액틴 유전자에 대해 RT-PCR을 수행하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100 bp)이고,

레인 2는 음성 대조군이며,

레인 3은 양성 대조군으로, 혈액에서 분리 정제 후 바로 RT-PCR을 수행한 RNA 샘플이고,

레인 4는 키토산과 결합시키지 않은 RNA를 -70℃에서 3개월 동안 보관한 경우이며,

레인 5는 키토산과 결합시키지 않은 RNA를 실온에서 1주일 동안 보관한 경우이고,

레인 6은 키토산과 결합시키지 않은 RNA를 실온에서 1개월 동안 보관한 것이며,

레인 7은 본 발명의 키토산 용액을 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 실온에서 3주일 동안 보관한 것이고,

레인 8은 본 발명의 키토산 용액을 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 실온에서 3개월 동안 보관한 것이며,

레인 9는 본 발명의 키토산 용액을 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 실온에서 1년 동안 보관한 것이고,

레인 10은 RNA를 본 발명의 RNA카드에 피펫으로 옮겨서 실온에서 3주일 동안 보관한 것이며,

레인 11은 RNA를 본 발명의 RNA카드에 피펫으로 옮겨서 실온에서 3개월 동안 보관한 것이다.

도 6은 키토산을 여러 종류의 블라팅(blotting) 종이에 흡착 후 건조하여 RNA카드를 만들고 여기에 정상 성인 백혈구의 RNA를 피펫으로 점적하였으며, 이후 각각의 경우의 RNA카드의 성능을 RT-PCR로 비교 분석한 결과를 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진이다.

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100 bp)이고,

레인 2는 음성 대조군이며,

레인 3은 양성 대조군(혈액에서 직접 분리 정제한 RNA사용)이며,

레인 4는 0.3mm 두께의 블라팅 종이에 0.02% 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 5는 0.9mm 블라팅 종이에 0.02% 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 6은 0.3mm 종이에 0.1% 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 7은 0.9mm 종이에 0.1% 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 8은 0.3 mm 종이에 0.25% 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 9는 0.9mm 종이에 0.25 % 키토산 용액을 처리하고 점적한 RNA를 주형으로 사용한 경우이며,

레인 10은 어떤 것으로도 처리하지 않은 0.3mm 종이를 주형으로 사용한 음성 대조군이며,

레인 11은 어떤 것으로도 처리하지 않은 0.9mm 종이를 주형으로 사용한 음성 대조군이다.

도 7은 본 발명의 방법에 따라 수용성 키토산 용액에 혼합하여 실온에서 1개월간 보관해 두었던 성인 대장조직의 RNA를 주형으로 하여 APC (adenomatous polyposis coli)유전자에 대해 RT-PCR을 수행하고, 그 산물을 클로닝 한 후 다시 자동염기서열분석법(automated sequencing analysis)으로 검색한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8은 본 발명의 방법에 따라 RNA카드에 점적하여 실온에서 3개월간 보관해 두었던 폐암조직의 RNA를 주형으로 하여 p53유전자에 대해 RT-PCR을 수행하고, 그 산물을 클로닝 한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는 키토산 용액과 RNA 혼합물로부터 SDS를 사용하여 키토산과 RNA를 분리한 결과를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100 bp)이고,

레인 2는 키토산을 결합시키지 않은 RNA로 DNA에 의한 오염이 없이 정상적인 이동을 나타내고 있으며,

레인 3은 키토산과 RNA의 결합물이며,

레인 4는 키토산과 RNA의 결합물에 0.1% SDS를 처리한 것이며,

레인 5는 키토산과 RNA의 결합물에 1% SDS를 처리한 것이며,

레인 6은 키토산과 RNA의 결합물에 5% SDS를 처리한 것이다.

도 10은 본 발명의 방법에 따라 췌장암 조직의 RNA를 키토산 용액에 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 실온에서 3개월간 보관한 후 이를 주형으로 하여 K-ras유전자에 대해 노던블라팅(Nothern blotting)을 수행한 사진이다.

레인 1은 췌장암 조직에서 얻은 RNA와 키토산 용액 결합물을 실온에서 1개월 간 보관한 것이며,

레인 2는 췌장암 조직의 RNA를 키토산과 결합시키지 않고 실온에서 1개월 간 보관한 것이며,

레인 3은 정상인의 말초혈액에서 얻은 RNA를 키토산과 결합시키지 않고 -70℃에서 1개월 간 보관한 것이다.

도 11은 본 발명의 방법을 응용하여 제작한 RT-PCR 키트를 이용하여 갑상선 암 환자에서 유두상 갑상선암(papillary thyroid carcinoma)(PTC) 유전자의 재배열(rearrangement)을 나타내는 아가로즈 겔 전기영동 사진이다.

레인 1은 사이즈 마커(Size Marker; 100 bp)이고,

레인 2는 음성 대조군(negative control)이며,

레인 3은 갑상선 유두암 환자에서 갑상선조직의 세침천자흡입세포 검사(fine needle aspitation cytology) 샘플에서 얻은 RNA를 본 발명의 RT-PCR 키트를 이용 하여 RT-PCR반응을 한 경우이다.

도 12는 다수의 종양관련 유전자의 RNA들을 키토산 용액에 혼합하여 이를 현미경 용 유리슬라이드에 집적시켜 RNA 칩을 제작하는 방법의 모식도이다.

도 13은 본 발명에 따라 RNA/키토산의 결합물을 집적하여 만든 RNA 마이크로어레이 용 칩상의 RNA/키토산 스팟을 나타내는 사진이다.

본 발명은 키토산을 이용한 RNA의 보관 방법 및 상기 방법을 이용한 제품에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수용성 키토산을 RNA와 혼합한 RNA/키토산 결합물을 이용하여 RNA를 실온에서 장기간 안정된 상태로 유지시키고, 이러한 키토산/RNA 결합물을 이용하여 RNA를 분석할 수 있는 다양한 제품에 관한 것이다.

인체를 포함한 다세포생물은 수많은 세포로 이루어져 있으며, 세포 중심의 핵에는 유전정보를 보관하는 DNA가 존재한다. 유전정보의 단위를 유전자(gene)라고 하며, 이는 DNA로 구성되어 있다. 세포의 모든 생명현상과 기능은 단백질에 의해 이루어지며, 유전자는 단백질을 만들기 위한 명령체계를 지시 전달하는 광대한 정보단위이다. 하나의 유전자는 하나 또는 다수의 특정 단백질을 만드는데 필요한 특수한 암호코드를 가지고 있다.

DNA의 모양은 이중 나선구조를 이루고 있고, 각각의 나선가닥에는 염기(base)라고 불리는 수많은 화학구조단위로 구성되어 있다. DNA의 염기에는 아 데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 타이민(T)의 4가지 종류가 있는데, 이 염기의 배열된 순서, 또는 염기서열(base sequence)이 곧 그 유전정보를 결정한다. 한 생물체가 가지고 있는 모든 유전자의 총체를 게놈(genome)이라고 한다. 인간 게놈은 30억 개의 염기로 이루어지며, 약 3만개의 유전자가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 최근 인간 게놈 전체의 염기서열을 판독하는 인간게놈프로젝트가 완성되어 유전자를 이용한 난치성 질환의 진단과 치료에 획기적인 발전이 이루어지고 있으며, 소위 맞춤의학, 예측의학의 시대가 열리고 있다.

핵 내에서 철저히 보존되는 DNA의 유전정보가 세포질 내에서 단백질 생산으로 나타나기 위해서는 중간 매개물질이 필요하며, 이를 RNA라고 한다. RNA의 종류에는 라이보솜(ribosomal)RNA(rRNA), 메신저(messenger)RNA(mRNA) 및 트랜스퍼(transfer)RNA(tRNA)등이 있다. DNA의 유전정보는 일차 mRNA로 바뀌며, 이를 전사(transcription)과정이라고 한다. mRNA의 유전정보는 세포질의 리보솜에서 tRNA와 rRNA의 도움 하에 단백질로 해석(translation)된다. 3개의 염기가 하나의 아미노산을 지정하며, 이러한 3개 염기의 단위를 코돈(codon)이라고 한다. 전사과정에서 DNA중 단백질을 코딩하는 서열(coding sequence)만 남고, 나머지 부분은 잘려나간다. 유전자를 구성하는 DNA중에 RNA와 단백질로 코딩되는 핵심 부분을 엑손(exon)이라고 하며, 코딩되지 않는 부분을 인트론(intron)이라고 한다. 인간의 전체 DNA중에서 엑손 부분은 약 1%에 지나지 않는다. 각각의 유전자는 평균 35,000개의 염기와 수개-수십 개의 엑손 및 인트론으로 구성되며, 한 유전자의 단백질 지정부위는 평균 1,500개의 염기로 구성된다. 리보솜에서 1차 생산된 단백질은 해석- 후 변형(post-translational modification)을 거쳐 최종적인 활성 단백질로 만들어진다. 세포가 분열될 때 DNA는 똑같이 복제(replication)되어 자손 세포에 전달된다. mRNA에 상응하는 염기 서열을 갖는 DNA를 상보적(complementary) DNA(cDNA)라고 하며, 이렇게 RNA에서 cDNA를 만드는 과정을 역전사(reverse transcription, RT)라고 한다.

한 인간에서 모든 세포의 DNA는 모두 동일하다. 생체내 모든 세포의 형태, 구조, 기능, 건강 상태 및 발병 여부는 세포에서 발현(expression)되는 단백질의 종류와 양에 따라 결정되며, 이는 다시 어떤 유전자의 RNA가 어느 정도 전사(transcription)되느냐에 의해 결정된다. 즉, 개개 세포마다 발현되는 유전자의 종류와 양이 서로 다르기 때문에 차이가 생기는 것이다. 실제 각 세포 별로 발현되는 유전자의 백분율은 3∼5%에 지나지 않는다고 한다(Aressns J, Armstrong M, Gilissen R, Cohen N. The human genome: an introduction. Oncologist. 2001;6:100-109).

즉, 생명현상은 (1)게놈 DNA의 유전정보, (2)유전자의 전사, (3)발현되는 단백질의 3가지에 의해 결정된다. 전술한 바와 같이 한 개체의 유전자의 총체를 유전체 또는 게놈이라 하며, 이에 대해 한 개체에서 전사되는 유전자(즉 mRNA)의 총체를 전사체(transcriptome)라고 하고 발현되는 단백질의 총체를 단백질체(proteome)라고 한다. 최근 이들의 정보를 총체적으로 자동 분석하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이를 위해 특히 마이크로어레이(microarray) 또는 바이오 칩(biochip)이 도움이 되며, 대표적인 예가 DNA칩과 단백질칩이다. 그러나 RNA칩에 대한 보고 는 찾기 어렵다.

단백질이 생명현상을 최종적으로 결정하지만, 이러한 단백질의 발현을 결정하는 것은 전사체, 즉 어떤 유전자의 RNA가 전사되느냐에 의해 1차적으로 이루어진다. 따라서, 생명현상을 이해하고 분석하며 질병의 진단과 치료 방법의 개발을 위해서는 특정 유전자의 전사 및 발현 정도를 정확하게 분석하는 것이 매우 중요하다.

유전자의 전사 및 발현의 유무와 정도를 질적 및 양적으로 분석하기 위한 통상적인 방법으로는 RT-PCR, cDNA 클로닝, 라이브러리(library) 제작, 노던블라팅을 통한 하이브리디제이션(hybridization) 분석, 리보뉴클레아제 방어 분석(ribonuclease protection assay), 및 cDNA 마이크로어레이(microarray) 등이 있다(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1.-7.88).

상술한 방법들은 세포가 어떻게 기능을 발휘하며, 외부 자극이나 환경변화에 따라 어떻게 반응하는지를 이해하는 데 필수적이며, 질병의 발생기전을 연구하고 그 진단법과 치료법을 연구하는 데 매우 중요한 역할을 한다.

RNA는 유전자가 단백질로 발현되는 중간 매개물질로 유전자 발현을 분석하는 중요한 도구이며, 그 자체가 유전자의 각종 반응을 매개하는 효소로도 작용하는데 대표적인 예로 라이보자임(ribozyme)이 있다.

RNA를 이용한 유전자 연구에 있어서 가장 큰 문제점은 세포로부터 분리한 RNA가 급속하게 분해된다는 것이다. 이는 RNA 분리과정 중 파괴된 세포로부터 분비 되는 리보뉴클레아제(Ribonuclease, RNase A)나 또는 모든 환경에서 다량으로 존재하는 리보뉴클레아제에 의해 RNA는 분리 이후에도 분해가 일어나게 된다.

따라서, 유전자 연구를 위해 RNA를 안정하게 보관하는 방법이 요구된다.

현재 RNA를 보관하는 표준적인 방법으로 다음의 3가지가 있다 (Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spreing Harbor Press. 2001:7.82.-7.85).

1. RNA 침전물(precipitate)을 액상 완충용액(buffer)내에 넣고 -80℃에 보관한다. 이 때의 완충용액은 통상적으로 TE 또는 0.1mM EDTA와 SDS(0.1∼0.5%)를 함유한 DEPC를 처리한 증류수이다. 나중에 클로로포름을 처리하여 SDS는 제거해야 한다.

2. 탈이온화시킨 포름아마이드에 RNA를 넣고 -20℃에 보관한다. 포름아마이드는 RNA에 안정적인 환경을 제공하며, 동시에 리보뉴클레아제의 공격을 차단하는 기능을 한다. 이후 에탄올을 처리하면 포름아마이드는 제거된다.

3. RNA를 액상 상태로 에탄올에 넣고 -20℃에 보관한다. 이는 RNA의 손실이 크다는 단점이 있어서 사용 빈도가 낮다.

상술한 RNA의 보관 방법은 초저온 냉동고와 같은 특수한 고가장비와 액체질소 등을 필요로 하기 때문에 경제적인 면에서 부담스러울 뿐만 아니라 RNA 보관 후 분석을 위해 재사용 시 전처리 과정 및 후처리 과정이 요구되며, 반복적인 냉동 및 해동으로 RNA가 손상된다는 단점이 있다.

상기의 방법 외에 최근 일부 바이러스 RNA를 실온에서 보관하려는 용도로 아 모레드(Armored) RNA 등의 상업화된 시약이 몇 가지가 소개되고 있으나, 그 방법의 실효성에는 한계가 있으며, 실제 실온이 아니라 -15℃ 또는 -20℃에 보관할 것을 권유하고 있어서 기존의 방법에 비해 큰 장점이 없고 오히려 비용부담이 커지는 단점이 있다(Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, Winkler M, Dubois DB. Armored RNA technology for production of rinonuclease-resistant viral RNA controls and standards. J Clin Microbiol. 1998;36:3590; Walkerpeach CR, Winkler M,Dubois DB, Pasloske BL. Rinonuclease-resistant RNA controls(Armored RNA) for reverse transcriptase-PCR, branched DNA, and genotyping assay for hepatitis C virus. Clin Chem. 1999:45:2079-85).

따라서, RNA와 안정한 결합체를 이루어서 RNA가 리보뉴클레아제에 의해 분해되지 않도록 보호하고, 실온에서 안정된 상태로 보존될 수 있게 하며, 나아가 RNA를 이용한 각종 연구와 분석에 직접 적용이 가능한 방법을 개발하는 것이 분자유전학과 의학에 있어서 중요한 과제가 되고 있다.

키토산(chitosan)은 안정성과 생분화성 및 생체 적합성이 우수하여 의학 분야에 많이 활용되는 생체고분자 물질이다. 키토산을 산으로 처리하면 수용성의 키토산 염이 형성되는데, 이는 강한 양성 전하(positive, cationic charge)를 띠게되어 현재 약물이나 단백질 및 DNA의 유력한 전달수단으로 주목받고 있다. 특히 수용성 키토산은 음이온성 물질인 DNA와 강력한 결합체를 이루어서 DNA를 보호하기 때문에 유전자를 전달하는 매개 물질로 사용될 수 있다.

키토산은 글루코사민(glucosamine)과 N-아세틸글루코사민(N- acetylglucosamine)의 이중 중합체로서 키틴(chitin)으로 부터 얻어진다. 키틴은 게나 새우등의 갑각류에 풍부하며, 셀룰로오스 다음으로 풍부한 천연 고분자 물질이다. 키토산은 키틴을 강알칼리로 탈아세틸화한 양이온성 폴리머(cationic polymers)를 총칭한다(Errington N, Harding SE, Varum KM, Illum L. Hydrodynamic characterization of chitosan varing in molecular weight and degree of acetylation. Int J Biol Macromol. 1993:15:1123-7). 키토산은 안정성과 환경 친화성, 생분화성 및 생체 적합성이 우수하여 여러 산업과 의료용 분야에 많이 활용되고 있다.

키토산은 중성 및 알칼리성 pH에서는 용해되지 않으며, 대신 글루타민산이나 염산, 젖산 등의 산과 반응시키면 키토산염(chitosan salts) 또는 양이온성 키토산(cationic chitosan)을 형성한다. 키토산염은 물에 녹으며, 그 용해도는 탈아세틸화 정도와 pH에 비례한다. 수용성 키토산의 경우 아민군에 양자가 붙으면서 양성 전하를 띠게 된다. 수용성 키토산은 동결건조 상태로 만들 수도 있다.

수용성 키토산은 강한 양성 전하와 필름형성 능력, 겔 형성 능력을 나타낸다. 이 때문에 키토산은 오수의 정수, 중금속 정화, 음료수 정수 및 항진균제로 사용되고 있으며, 식음료, 건강식품 및 화장품의 원료로도 이용되고 있다. 한편 키토산은 제약 분야에서도 중요한 도구가 되고 있다. 예컨대, 정제생산과 방출조절 약물체계(controlled drug release system), 겔, 필름, 습윤제, 코팅제제, 미세구체(microsphere), 미세캡슐(microcapsule), 생체접착제, 점막을 통한 단백질, 펩타이드 와 약물전달 촉진 용도, 백신전달 및 DNA전달 등에 광범위하게 사용 되고 있다(Illum L. Pharmaceutical Research. 1998. 1998:15:1326-1331).

키토산은 매우 안전하고 면역촉진 부작용도 없다. 생체 내에 들어와서는 라이소자임(lysozyme)에 의해 N-아세틸글루코사민으로 분해되고, 이는 당단백질 합성에 사용된 후 이산화탄소의 형태로 배출된다(Chandy T, Sharma CP. Chitosan as a biomaterial. Biomat Art Cells Art Org. 1990:18:1-24).

본 발명과 관련하여 수용성 키토산 또는 양이온성 키토산의 중요한 특성은 음이온성 물질인 DNA와 강력한 결합체를 이루며, 이는 DNA를 보호하고 DNA를 수송하는 수단, 즉 유전자전달물질로 사용될 수 있다는 것이다. 플라즈미드 DNA를 이용한 실험에서 키토산은 DNA 분해효소인 DNase I 및 DNase II로부터 DNA가 분해되지 않고 안정적으로 유지되게 하며, 키토산과 플라즈미드 DNA 복합물을 생체 외 배양 세포에 투여했을 때 전달 유전자를 발현시킴이 보고되고 있다(Lee M, Nah J-W, Kwon Y, Koh JJ, Jo KS, Kim SW). DNA와 키토산의 결합 효율과 안정성 및 결합물의 크기는 (1)키토산의 분자량, (2)키토산과 DNA의 비, 특히 DNA의 음이온성 인 분자와 키토산의 양이온성 질소 분자의 비(nitrogen/phosphate ratio)에 의해 결정된다(Borchard G. Advanced Drug Delivery Reviews. 2001:52:145-150).

플라즈미드 DNA를 자체대로 실온에 두면 수시간 내에 분해되나, 키토산과 결합한 형태로 보관하면 3개월 이상 보존이 가능하다고 한다(Leong KW, Mao HQ, Turong-Lee VL, Roy K, Walsh SM, August JT. DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles. J Controlled Rel. 1998:53:183-193). 한편, 키토산과 플라즈미드 DNA의 결합물을 동결건조 상태로 보관할 경우 4주까지 유전자전달 효과가 지속된다는 보고도 있다(Mao HQ, Turong-Lee VL, August JT. Leong KW. DNA-chitosan nanospheres: derivatization and storage stability. Proc Intl Symp Control Rel Bioact Mater. 1997:24:671-772).

그러나, 키토산이 포유류의 거대한 게놈 DNA를 안정적으로 보관할 수 있는 지에 대한 연구는 드물다. 게다가 키토산이 RNA를 안정적으로 실온에서 장기 보관하게 해 줄 수 있는지에 대한 보고는 찾기 힘들다. 아울러 키토산과 결합된 RNA를 사용하여 유전자 발현 분석을 수행할 수 있는 가에 대해서도 보고 된 바가 없다.

이에 본 발명에서는 RNA를 실온에서 안정된 상태로 보존할 수 있는 방법을 연구한 결과, 수용성 키토산을 RNA와 혼합하면 안정된 결합물을 형성하여 리보뉴클레아제에 의한 분해로부터 RNA를 보호하고 실온에서 안정된 상태로 장기간 보존할 수 있음을 발견하였고, 본 발명은 이를 기초로 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 키토산을 이용한 RNA의 보관 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 다양한 RNA를 분석하는 방법에 사용될 수 있는 안정된 RNA와 키토산의 결합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키토산/RNA 결합물을 이용한 RT-PCR 키트(kit) 및 RNA 마이크로어레이(microarray)용 칩(chip)을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 키토산을 이용한 RNA 보관 방법은 RNA를 실온에서 장기간 보관 및 운반이 가능하게 하며, RNA 연구와 분석에 용이하고, 간편하게 응용할 수 있도록 RNA와 안정된 결합물을 형성할 수 있는 적절한 성상 및 농도의 키토산 용액으로 구성된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산과 RNA의 액상 결합물 및 다수의 RNA 샘플(sample)을 최소한의 공간 내에 보관할 수 있는 카드형 RNA/키토산 결합물(RNA 카드)을 제조하여 RT-PCR, 클로닝, 염기서열분석 및 노던블라팅 등의 유전자분석을 수행하는 방법 및 키토산과 RNA를 분리하는 방법을 포함한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산을 사용하여 한 튜브 내에서 역전사(RT)와 PCR 반응을 함께 수행할 수 있는 RT-PCR 키트를 포함하며, 다수의 RNA 샘플을 키토산과 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 마이크로어레이용 유리 슬라이드 위에 집적한 RNA 마이크로어레이용 칩을 포함한다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 키토산을 이용한 RNA의 보관 방법 및 상기 방법을 이용한 제품을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따라 RNA와 수용성 키토산 결합물을 제조 및 분석하는 과정을 나타낸 블럭도로서, 이를 참조하여 RNA와 수용성 키토산 결합물 및 이를 이용한 제품을 제조하는 과정을 살펴보면, 본 발명에서는 RNA와 안정된 결합물을 형성하며 RNA가 리보뉴클레아제에 의해 분해되는 것을 막고, 실온에서 안정된 상태로 보존하기 위하여 본 발명에서는 적절한 성상과 농도의 수용성 키토산 용액을 사용한다.

본 발명에서 사용되는 키토산은 분자량이 10 내지 500kDa인 것이 바람직하다. 10kDa 미만의 것은 RNA와 안정된 결합물을 이루는데 문제가 있으며 500kDa을 초과하면 RNA를 이용한 유전자 발현 분석에 방해가 될 수 있다. 또한, 탈아세틸화 정도가 60% 내지 99%인 키토산이 바람직하며, 탈아세틸화가 60% 미만이면 키토산의 수용성에 문제가 발생하며 RNA와 안정된 결합체를 이루기도 힘들다. 키토산의 농도는 0.02% 내지 5%가 바람직하고, RNA와 키토산은 무게비 1 : 1 이상으로 혼합하는 것이 바람직하다(도 1의 제1단계).

본 발명에 따른 RNA/키토산 결합물의 보관 온도는 -20℃ 내지 실온으로 다양하며, 바람직하게는 습하지 않은 암소에 보관한다.

본 발명에 있어서, 키토산과 혼합하여 저장할 수 있는 RNA는 인간, 동물 또는 식물의 RNA가 모두 포함되며, 바람직하게는 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA 또는 라이보자임을 포함한다. 키토산과 혼합하여 저장 가능한 RNA의 크기는 수백 염기에서 수천만 염기까지 다양하다.

한편, 본 발명의 방법에 따른 수용성 키토산과 결합된 형태로 보관된 RNA는 리보뉴클레아제에 의한 분해에도 안정되게 유지되어 유전자 분석에 사용될 수 있다(도 1의 제2단계). 예를 들어, 상기 RNA와 키토산 결합물을 장기간 실온에서 보관한 후 RT-PCR, 클로닝 및 염기서열분석을 실시하여 본 발명의 RNA 보관 방법의 유용성을 용이하게 확인할 수 있다(도 1의 제3단계).

본 발명에 따르면, 상술한 적정 키토산 용액을 블라팅(blotting)용 종이에 흡착시킨 후 건조하여 RNA 보관용 카드를 제조할 수 있다. 상기 카드를 이용하여 실온에서 최소한의 공간 내에 다량의 RNA의 장기 보관과 운반이 가능하다. 상기 RNA 보관용 카드의 제조에 사용되는 블라팅용 종이는 상업적으로 이용 가능한 다양한 블라팅용 종이를 사용할 수 있으며, 그 두께는 약 0.3mm 내지 0.9mm가 바람직하다. 상기 RNA 보관용 카드의 보관온도는 -20℃ 내지 실온에서 6개월 이상 보관이 가능하다(도 1의 제4 및 5단계).

본 발명에 있어서, RT-PCR 수행시, RNA와 키토산 결합물이 액상인 경우 결합물 자체를 그대로 주형(template)으로 사용하며, 카드형태인 경우는 카드 조각을 잘라서 주형으로 사용하여 통상적인 RT-PCR 방법으로 cDNA를 합성하고 클로닝과 염기서열분석을 수행할 수 있다. 그 결과 본 발명의 방법에 따라 보관된 RNA를 사용하여 유전자 분석 방법을 수행할 수 있을 정도로 충분히 RNA가 안정하게 유지됨을 확인할 수 있다(도 1의 제6단계).

아울러 노던블라팅 수행을 위해서는 아가로스 겔상에서 RNA가 이동 가능하도록 RNA와 키토산 결합물을 분리하여 사용해야 하므로, 황산염(sulfate) 계열의 양이온성 염을 사용하여 RNA의 손상이나 노던블라팅의 결과에 영향을 주지 않고 분리하였다. 상기 황산염 계열의 양이온성 염으로는 SDS(sodium dodecyl sulfate), SOS(sodium octyl sulfate) 또는 CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)를 사용할 수 있다(도 1의 제7단계).

한편, 본 발명에서는 본 발명의 RNA 보관 방법을 사용하여 한 튜브 내에서 역전사(RT)와 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 함께 수행할 수 있는 RT-PCR 키트를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 RT-PCR 키트는 RT에 일반적으로 필요한 올리고 d(T) 프라이머(primer), 역전사효소(reverse transcriptase) 및 Taq 중합효소(polymerase)의 혼합효소, 반응용액, dNTP, 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor)를 키토산과 혼합하고 여기에 RNA 샘플 또는 혈청을 증폭하고자 하는 유전자에 대한 특이적 프라이머와 함께 넣으면 RNA와 키토산 결합물을 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하게 되어 원하는 특정 유전자를 기존 방법보다 간편하게 증폭할 수 있다(도 1의 제8단계). 그 원리는 다음과 같다.

본 발명의 RT-PCR 키트의 기본 원리는 첫째, 역전사효소와 PCR 중합효소의 혼합물이 함께 활성을 갖도록 본 발명자들이 개발한 GG one step RT-PCR 완충용액^™을 사용하였고, 둘째, cDNA 합성 시에 먼저 42 내지 50℃에서 역전사 효소만이 활성을 나타내고, 이 온도에서는 활성을 갖지 않는 중합효소를 적정 비율로 혼합하였으며, 셋째, 키토산이 RNA와 프라이머 등의 핵산을 안전하게 보존할 수 있도록 하는 것이다. 반응의 첫번째 과정은 cDNA 합성이며, 뒤이어 바로 특정 유전자의 프라이머가 동일 튜브 내에서 만들어진 cDNA를 주형으로 증폭되도록 95℃에서 활성을 나타내는 핫스타트(hot start) 형의 중합효소에 의해 표적 유전자의 원하는 부분이 증폭된다.

또한, 본 발명은 다수의 RNA 샘플을 수용성 키토산과 혼합한 결합물 형태로 제조하여 아미노프로필트리메톡시실란(aminopropyltrimethoxysilane)과 페닐렌다이아이소싸이오시아네이트(phenylenediisothiocyanate) 및 그 외의 아미노실란(aminosilane) 계열로 코팅된 유리슬라이드 위에 한 스팟(spot) 당 0.015mm직경으로 100 내지 300ng의 농도로 집적(spotting)한 RNA 마이크로어레이용 칩을 제조하였다. 표적 유전자 및 대조유전자(housekeeping gene)의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브(probe)를 각각 다른 형광(fluorescence)으로 표지(labeling)하여 상기 칩상의 RNA 샘플들과 하이브리디제이션 반응(hybridization reaction)을 일으킨 후, 하이브리디제이션 반응이 일어난 대조유전자에 대한 표적유전자의 각 RNA 샘플 스팟의 형광신호(fluorescence signal)의 강도 비를 형광스캐너로 분석하였다. 그 결과 상기 RNA와 키토산 결합물을 사용한 칩을 사용하여 다수의 샘플에서 표적 유전자의 발현을 동시에 정확하고 신속하게 자동 검색할 수 있으며, 나아가 적절한 통계 분석까지 가능함을 확인할 수 있다(도 1의 제9단계).

이와 같은 RNA 칩은 분석하고자 하는 다수의 정상 내지 병적 조직과 세포에서 유전자 발현과 그 정도를 동시에 신속하게 자동 분석할 수 있다는 장점이 있고, 여러 분야에 이용이 가능하다. 예컨대, 기존의 cDNA 칩이나 단백질 칩을 통해 대단위 검색 후 소수의 특정 유전자의 발현 변화가 특정 생명현상이나 질병의 발생 및 진행에 중요한 역할을 한다고 할 때, 그 다음 단계는 이를 다수의 대상 조직 및 세포에서 확인하는 것이므로, 이를 동시에 신속하게 자동 분석하는 데 본 발명의 RNA 칩은 매우 유용하다.

본 발명의 RNA 칩은 전혀 새로운 개념의 칩이며, 기존의 cDNA 칩과는 현저한 차이가 있다.

첫째, cDNA 칩의 경우 cDNA를 칩위에 집적하는데 반해, RNA 칩의 경우 키토 산과 결합된 RNA가 집적된다.

둘째, cDNA 칩의 경우 RNA 샘플을 표지하는 데 반해, RNA 칩은 표적 유전자와 대조 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 표지한다. 즉, RNA 칩의 경우 하이브리디제이션 방식이 기존의 노던블라팅과 유사하다.

셋째, 하이브리디제이션은 표적 유전자와 대조 유전자에 대해 동일한 조건으로 이루어지기 때문에 적정 반응조건, 특히 결합 온도(annealing temperature)를 정하기가 용이하며, 이는 곧 이후 형광판독이 용이해지는 중요한 근거가 된다. cDNA 칩의 경우 다수의 서로 다른 유전자에 대해 동시에 하이브리디제이션을 수행하기 때문에 동일한 적정 반응조건-예컨대, 동일한 결합 온도를 확립하기가 어려워 형광판독에 장애를 가져오고, 통계분석을 하기 어렵게 만든다.

넷째, cDNA 칩은 하나의 샘플에 대해 다수 유전자의 발현 정도를 분석하나, RNA 칩은 미리 준비된 다수의 샘플에 대해 소수의 특정 유전자의 발현을 분석할 수 있다는 차이가 있다. RNA 칩은 각각의 샘플을 따로 준비할 필요가 없으며, 분석도 용이하다는 장점이 있다. 아울러 대단위 임상연구에 직접 적용이 용이하며, 비용, 시간 및 인력을 현저히 절감할 수 있다는 것이 장점이다.

다섯째, cDNA 칩의 분석은 각 스팟의 형광 신호강도를 배경의 신호강도와 비교하여, 그 정도가 2배 이상일 때 의미를 두는 다분히 임의적이고 비 통계적인 방법을 사용하기 때문에 결과분석에 논란이 많고 재현성이 낮다. 이에 비해 본 발명의 RNA 칩은 하우스키핑(housekeeping) 유전자를 대조군으로 대조유전자의 형광 감도에 대한 표적 유전자의 형광 감도를 분석하므로 통계분석이 정확하며 오류가 적 고, 재현성이 높다.

본 실험에서는 현미경용 유리 슬라이드를 사용하였으나, 그 외에도 나일론 멤브레인(nylon membrane) 또는 실리콘조각 등 다양한 물질 위에 RNA/키토산의 결합물을 집적하여 RNA 마이크로어레이 용 칩을 만들 수 있다.

이하 하기 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

RNA와 키토산의 결합 분석 시험: 아가로스 겔 전기영동을 통한 RNA와 키토산 결합물의 이동성 분석(mobility shift assay)

RNA와 혼합 시 안정된 결합물을 이룰 수 있는 적정 키토산의 성상과 농도 및 혼합조건을 수립하기 위해 정상 성인의 백혈구에서 분리한 전체 RNA에 다양한 농도의 수용성 키토산을 다양한 비율로 혼합한 후 아가로스 겔 전기영동을 통해 키토산과 결합한 RNA의 이동성을 분석(mobility shift assay)하였다. 그 방법과 결과는 다음과 같다.

가. RNA 분리 및 준비

정상 성인의 백혈구로부터 하기의 통상적인 방법으로 세포의 전체 RNA를 분리하였다. 본 실험과 이하 기술하는 모든 실험에서 별도의 기술이 없는 한 RNA분해효소의 오염을 막기 위해 DEPC로 처리한 3차 증류수를 사용하는 공지의 방법(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1.-7.88)에 따라 실험을 수행하였다.

각각 15㎖ 코니칼 튜브(conical tube)에 3.5㎖씩 폴리수크로즈(polysucrose)인 히스토파크(Histopaque)-1077(시그마 사, 카탈로그 번호 1077-1, 미국)을 넣는다. 동량의 전혈을 피펫(pipette)을 사용하여 샘플들이 혼합되지 않도록 각 튜브에 넣었으며, 이 때 혈액이 폴리수크로즈층의 아래로 내려가지 않도록 하였다. 1,800rpm에서 30분간 원심분리한다. 새 15㎖ 코니칼 튜브에 10㎖의 1×PBS(DEPC 처리한 3차 증류수로 만듬)를 분주한다. 담황갈색 코트(buffy coat) 층만을 피펫으로 회수하여 10㎖ PBS와 섞고 4℃에서 3,000 rpm으로 30분간 윈심분리한다. 피펫으로 펠렛(pellet)만을 남기고 상층액은 제거한 후, 500㎕의 1×PBS(DEPC처리한 3차증류수로 만듬)를 분주한다. 4℃에서 다시 10,000rpm으로 1분간 윈심분리한다. 상층액을 버리고 탭핑(tapping)으로 혼합한 후, 트리졸(TRIZOL)(시그마 사, 카탈로그 번호 T3934, 미국) 1㎖을 넣고 살짝 진탕 혼합(vortex mix)하였다. 이 때 전혈인 경우 보통 혈액 300㎕에 트리졸 750㎕을 넣고 5초간 진탕 혼합하였다. 이후 클로로포름 200㎕를 넣고 위 아래로 흔든 후 실온에서 5분간 방치하였다가 4℃에서 13,000rpm으로 15분간 원심분리한다. 상층액을 취해서 2-아이소프로필 알콜(2-isopropyl alcohol;IPA) 동량을 넣고, -20℃에서 밤새 보관해 두었다가 4℃에서 13,000rpm으로 15분간 원심분리하여 침전물을 농축시킨다. 상층액을 버린 후 염을 제거하기 위해 70% 에탄올 500㎕로 펠렛을 세척하고 13,000rpm으로 10분간 원심분리 후 다시 상층액을 버리고 진공에서 5∼10분간 건조시켜 20∼50㎕의 DEPC처리 증류수로 녹여서, 실험하기 전까지 -70℃에 보관한다. 보통 전혈 1㎖과 백혈구 1㎖에서 각각 15∼20㎍과 60∼70㎍의 전체 RNA가 얻어지며, 이 때 RNA의 순도(purity)는 분광광도계(spectrophotometer) 측정에서 A_260/280가 1.6 내지 1.8이 나오도록 한다.

나. 키토산의 준비

수용성의 키토산으로 탈아세틸화 정도가 60% 내지 99%이고, 분자량이 10kDa내지 500kDa에 해당되는 제품이면 본 발명의 용도, 즉 RNA와 안정된 결합체를 이루는 데 사용이 가능하다. 이에 해당되는 수용성 키토산 제품은 다수가 시판되고 있다. 그 중 본 발명에서는 평균 탈아세틸화율(deacetylation rate)이 90.1%, 평균 분자량이 약 300kDa인 수용성 키토산 제품을 주식회사 자광(안성시, 대한민국)으로부터 구입한 후, DEPC처리 증류수에 용해하여 주로 사용하였다. 이는 구입이 편리하며, 가격이 저렴하다는 이유 때문에 선택되었고, 본 키토산 외에도 유사한 성상의 다른 수용성 키토산을 사용해도 무방하다.

다. 키토산과 RNA 결합물의 제조방법

수용성 키토산을 DEPC 처리한 증류수에 용해하여 무게 대 부피 비의 농도(w/v)로 제조하였다. 본 실험에서는 무게 대 부피 비 농도가 0.02%에서부터 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5% 및 1%까지로 다양하게 조성하여 검사하였다. 이하 실시예에 있어서 RNA는 DEPC처리 증류수로 희석하여 1㎍/㎕의 농도로 조성하여 사용하였다.

1.5㎖ 원심분리 튜브에 1㎍/㎕ 농도의 RNA와 전술한 다양한 농도의 키토산 용액을 1 : 1 또는 1 : 2 등 다양한 용적비로 혼합한 후, 15분간 실온에서 방치하여 결합물을 이루도록 유도하였다.

라. 아가로스 겔 전기영동을 통한 RNA와 키토산 결합물의 이동성 분석

상술한 방법에 따라 혼합하여 15분간 실온에서 방치한 RNA와 키토산의 결합 용액을 0.8% 아가로스 겔에 넣고(loading), 100V에서 전기영동을 실시하였다. 그 결과 키토산을 혼합하지 않은 RNA만을 전기영동한 경우는 RNA가 정상적으로 이동하여 18s 및 28s rRNA의 밴드(band)가 관찰되는 반면, 각각 0.02%, 0.1% 또는 0.25%의 키토산 용액과 용적비 1 : 1 또는 1 : 2 또는 그 이상으로 RNA와 혼합한 경우는 RNA가 키토산과 완전히 결합되어 아가로스 겔 상에서 전혀 이동하지 않음을 보여주었다. 이러한 결과는 RNA와 0.02% 이상의 수용성 키토산 용액을 무게비로 1 : 0.2 또는 그 이상의 비로 혼합할 때 키토산과 RNA가 완전히 결합함을 나타낸다(도 2 참조). 따라서, 이후의 실험에서 키토산과 RNA 결합물의 조성은 0.1% 키토산 용액을 RNA와 무게비 1 : 1로 혼합하는 것을 표준으로 하였다. 그러나 이는 하나의 조성 예일 뿐, 상술한 바와 같이, 0.02%이상의 적정 수용성 키토산과 RNA를 1 : 0.2 또는 그 이상의 비로 제조하는 것이 가능하나, 사용한 키토산 제품의 성상에 따라 적정 조성은 다소 달라질 수 있다.

실시예 2

키토산의 리보뉴클레아제 방어 효과 분석(ribonuclease protection assay)

수용성 키토산이 리보뉴클레아제(ribonuclease, RNase)로부터 RNA를 보호할 수 있는 가를 확인하고, 그 적정 조건을 수립하기 위해 키토산 용액을 처리한 RNA와 처리하지 않은 RNA를 각각 리보뉴클레아제로 처리하고 아가로스 겔 전기영동을 통해 그 효과를 관찰하였다.

그 방법은 다음과 같다.

2군으로 나누어서 하나의 군에는 미세 원심분리튜브(microcentrifugation tube, 1.5㎖)에 DEPC처리 증류수에 녹인 키토산(20㎍)과 RNA(10㎍)를 2 : 1로 혼합한 결합물을 제조하고 다른 한 군의 튜브에는 RNA(10㎍)만을 넣는다. 각각의 튜브에 10㎎/㎖의 농도로 녹인 0.1㎕의 리보뉴클레아제를 넣어 최종 부피 100㎕가 되도록 한 후, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 0분, 30분 또는 60분간 각각 반응 시켰다. 반응이 끝나자마자 33.3㎕씩을 취하여, 미리 0.1% DEPC 증류수 6.7㎕를 넣고 표지(label)를 한 각각의 1.5㎖ 튜브에 넣어 섞은 후, 페놀(phenol)/클로로포름(chloroform) 150㎕를 넣어 1분간 진탕 혼합을 하여 추출(extraction)하고, 300㎕의 무수에탄올(absolute EtOH)과 3㎕의 3mM NH₄OAC를 넣어 4℃에서 10,000×g로 15분간 원심분리하였다. 이후 상층액은 흡인(aspiration)해 버리고, 펠렛은 다시 75%의 냉각(ice cold) 에탄올로 씻어서 건조하고 RNase가 제거된 증류수 20㎕에 녹인다. 이렇게 얻어진 총 6개의 튜브에서 각각 10㎕(약 1㎍)씩의 RNA를 취하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다.

그 결과 키토산을 처리하지 않은 RNA의 경우에는 RNaseA를 처리한지 20분 후 완전히 분해된 반면, 키토산으로 처리한 RNA는 리보뉴클레아제를 처리한지 60분이 지난 후에도 분해되지 않고 웰(well)에 남아 있는 것을 확인할 수 있다(도 3 참조). 이러한 결과는 본 발명의 방법에 따라 수용성 키토산을 RNA와 2 : 1 비로 혼합하면 리보뉴클레아제에 의해 RNA가 분해되는 것을 유효하게 차단함을 나타내는 것이며, 본 발명에 따른 방법이 RNA의 보관에 효과적임을 보여주는 것이다.

실시예 3

실온에서 보관된 RNA와 키토산 결합물에 대한 유전자 증폭 가능성 조사

실시예 1에 따라 조성한 수용성 키토산과 RNA의 액상 결합물을 사용하여 역전사(reverse transcription, RT)와 PCR을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 가를 확인함으로서 본 발명의 RNA 보관 방법이 유전자 분석에 장애를 미치지 않음을 확인하고, 본 발명에 따른 RNA 보관 방법을 통해 보관한 RNA를 RT-PCR에 사용하는 적정 조건을 수립하였다. 그 방법과 결과는 다음과 같다.

실시예 1 및 실시예 2에서 기술한 대로 조성한 0.1% 수용성 키토산과 RNA의 액상 결합물을 주형으로 하여 공지의 방법으로 역전사 효소(reverse transriptase)를 사용하여 cDNA를 합성하였다(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001:7.1.-7.88).

RT-PCR 방법은 다음과 같다.

먼저 RT를 위해 키토산/RNA 결합물 1㎍에 올리고(Oligo) dT 1㎕를 넣고, DEPC 처리 증류수를 추가하여 최종 부피 10㎕가 되게 만든 후, 94℃에서 2분간 변성(denaturation)시켰고, 여기에 5×RT 반응용액(250mM Tris-Cl(pH 8.3), 250mM KCl, 50mM MgCl₂, 2.5mM Supermidine, 50mM DTT) 4㎕, 10mM dNTP 0.3㎕, AMV 역전사효소(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 M5101, 미국) 0.5㎕, RNasin 0.3㎕를 넣고 최종 20㎕가 되게 한 후 42℃에서 90분, 95℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성하였 다.

이후 PCR은 상기 cDNA 20ng을 주형으로 하여 베타-액틴(β-actin)유전자의 순방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 각각 10pmol씩 넣고, 다시 2.5mM dNTP, 1 unit의 Taq 중합효소(polymerase), 10×중합효소 완충용액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl, 15mM MgCl₂, 0.1% 젤라틴)을 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 진앰프 2700 열 순환기(GeneAmp 2700 thermal cycler)(퍼킨 엘머 바이오시스템사, 미국)를 사용하여 먼저 95℃에서 5분을 수행한 후에 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 과정을 40회 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분을 수행하여 PCR 산물을 얻었다.

실험 결과 0.1% 키토산 용액과 RNA를 무게비 1 : 1로 혼합하여 조성한 RNA 샘플과 키토산을 혼합하지 않은 RNA를 각각 주형으로 하여 베타-액틴 유전자에 대해 RT-PCR을 수행하여 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동한 결과, 양자 모두 동일한 정도로 661bp 크기의 베타-액틴 유전자 DNA 밴드가 강하게 나타났다(도 4 참조). 이는 본 발명의 키토산 혼합 매개물이 RT와 PCR에 악영향을 미치지 않으며, 유전자발현 검색에 유용하게 사용될 수 있음을 입증한다.

실시예 4

실온에서 RNA와 키토산 결합물의 장기간 보관 실험

앞에서 수용성 키토산과 RNA가 거의 완전하게 결합하며, 리보뉴클레아제의 공격으로부터 RNA를 안정적으로 보존함을 확인하였다. 본 실시예에서는 수용성 키 토산과 RNA의 결합물 형태로 실온에서 장기간 보관하였을 때 보관된 RNA가 분해되지 않고 유지되어서 유전자 발현분석이 가능한 가를 RT-PCR분석을 통해 다음과 같이 확인하였다.

0.1% 수용성 키토산 용액(w/v) 1㎕와 정상 성인백혈구의 RNA (500ng/㎕) 1 ㎕를 혼합하여 결합물을 형성하고 DEPC처리 증류수를 이용하여 최종 부피를 10㎕로 조정한 24개의 시료를 원심분리 튜브 내에 준비하여 실온에 보관하였다. 동일한 백혈구 RNA 1㎕에 공지의 방법대로 (Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001:7.1.-7.88) DEPC로 처리한 증류수로 최종 부피를 10㎕로 맞추어서 9개의 시료를 준비하고, 이 중 3개는 -70℃에 보관하였으며 나머지 6개의 시료는 실온에 보관하였다. 수용성 키토산과 혼합하여 실온에서 튜브 내에 보관한 RNA는 1주, 2주, 3주, 4주, 3개월, 6개월, 9개월 및 1년 시점에 각각 3개의 RNA 샘플을 실시예 3의 방법을 따라 RT-PCR 반응을 수행하여 표적 유전자들이 적절하게 증폭되는 지를 확인하였다. 키토산과 혼합하지 않은 RNA 샘플중 -70℃에 보관한 샘플 3개는 3개월 후에 RT와 PCR을 수행하였으며, 실온에서 보관한 RNA 샘플은 각각 3개씩 1주와 1개월 후에 RT와 PCR을 각각 수행하였다.

RT-PCR 실험 결과 실온에서 1주와 1개월간 키토산과 결합시키지 않은 RNA상태로 원심분리 튜브 내에 보관하였던 경우는 하우스키핑(housekeeping)유전자인 베타-액틴이 전혀 발현되지 않았다. 이에 반해 1주 내지 1년동안 키토산과 결합하여 튜브에 넣어 실온에서 보관하였던 RNA 샘플은 베타-액틴 유전자가 뚜렷하게 발현되었다. 기존의 방법대로 키토산과 결합시키지 않고 -70℃에서 보관한 RNA 샘플은 본 발명의 방법에 따라 키토산과 결합된 상태로 실온에서 보관한 RNA 샘플과 비교하여 증폭된 베타-액틴의 양이 적거나 유사함을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

이와 같은 결과는 본 발명의 방법에 따른 RNA를 수용성 키토산과 결합시켜 액상으로 보관하는 방법이 최소 1년 이상 RNA를 안정적으로 유지시킬 수 있고, 보관된 RNA를 RT-PCR분석에 사용하는데도 문제가 없으며 기존의 초저온 냉동고 보관법과 비교하여 더욱 우수하거나 유사하게 RNA를 안정적으로 보관할 수 있음을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 방법에 의한 보관 방법이 기존의 초저온 냉동고 보관법보다 간편하고 비용이 매우 저렴하다는 점에서 매우 가치는 높다고 할 수 있다.

본 실시예에서의 보관 온도는 -20℃ 내지 실온으로 다양하며, 바람직하게는 습하지 않은 암소에 보관한다.

실시예 5

키토산을 종이에 흡착시켜 만든 RNA보관용 카드 제작 및 이의 유전자 증폭 가능성 조사

다수의 샘플 RNA를 실온에서 최소한의 공간 내에 보관하며 운반하고 자동 분석에 도움이 될 수 있게 하기 위해 적정 종이에 키토산을 침지하여 카드를 개발하였고, 이를 RNA 카드라고 명명하였다.

가장 효과적인 수용성 키토산 용액의 농도와 적당한 두께의 종이를 선택하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

다양한 종류의 블라팅 용 종이를 0.02 %, 0.1 % 또는 0.25 % (w/v) 농도의 수용성 키토산 용액에 충분한 시간동안 침지시킨 후 건조하여 RNA 카드 제조에 사 용하였다. 이 때의 종이로는 와트만(Whatman)사(영국) 또는 Schleicher & Schuell사(독일) 등 여러 회사에서 판매되고 있는 블라팅 용 종이 중 적정 두께의 종이를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서는 0.3mm 및 0.9mm 두께의 블라팅 용 종이를 와트만사로부터 구입하여 사용하였다. 키토산을 사용한 RNA 보관용 RNA카드의 종류와 크기는 용도에 따라 다양하게 제작할 수 있는데, 키토산이 흡착된 블라팅 종이의 크기는 일반적으로 널리 사용되는 96-웰 및 384-웰 플레이트(plate)(직경 8.1cm ×2.3cm)와 동일한 크기로 자르고, 종이 위에 상기 플레이트의 웰과 칸을 인쇄하여 표시하였으며, 각각의 웰내에 RNA 샘플을 피펫으로 점적하고 1주 내지 1년 이상 실온에서 보관하였다. 따라서 1장의 RNA의 카드에는 96개 내지 384개의 RNA 샘플을 보관할 수 있다.

보관된 RNA 카드로 부터 펀치(punch)등을 이용하여 약 1mm 내지 2mm직경의 카드 조각을 취하여 PCR을 수행하기 위한 튜브에 넣고 이 카드의 조각을 주형으로 하여 실시예 3에 제시된 방법으로 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 이 cDNA를 이용하여 베타-액틴 유전자에 대한 PCR을 수행하였다.

실험 결과 0.1% 키토산 용액에 침지하여 만든 RNA카드 모두에서 베타-액틴 유전자가 강력하게 발현되었으며, 종이 두께가 0.9mm인 경우 더 많은 PCR 산물이 생성됨을 발견 할 수 있었다. 또한, 본 발명의 RNA카드에 흡착시킨 상태로 보관 시, 실온에서 3개월에서 6개월이란 장기간이 지난 후에도 RT-PCR시 -70℃에 보관하였을 때와 마찬가지로 베타-액틴 유전자가 강하게 발현됨을 보였다. 이와 같은 결과는 본 발명에 따른 RNA카드에 보관 시, 다수의 RNA 샘플을 실온에서도 장기간 안 정되게 보존할 수 있으며, 장기간 이후에도 분석이 가능함을 입증한다(도 6 참조). 따라서 RNA카드는 다수의 RNA 샘플을 간편하게 실온에서 장기 보관하고 운반하는 데 유용하며, 나아가 하기 실시예에서 보듯이 자동분석에도 유용함을 알 수 있다.

실시예 6

장기 보관된 RNA와 키토산 결합물에 대한 표적 유전자의 클로닝 및 염기서열분석 가능성 조사

실시예 4에 따라 액상으로 실온에서 장기 보관된 키토산 : RNA 결합물에 대해 RT-PCR을 수행하고 얻은 산물을 클로닝(cloning)하여 자동염기서열분석(automated sequencing analysis)을 통해 본 발명의 방법에 따라 보관된 RNA가 보관 이후 안정되게 유지되어 사용될 수 있는가를 확인하였다.

본 발명의 방법에 따라 0.1% 수용성 키토산과 혼합하여 실온에서 3개월간 보관해 두었던 성인 대장조직의 RNA 샘플을 주형으로 하여 아데노마터스 폴리포시스 콜리(adenomatous polyposis coli)(APC) 유전자에 대해 RT-PCR을 수행하고, 그 산물을 플라즈미드 벡터에 클로닝한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색하였다. 그 방법은 다음과 같다.

유전자의 PCR 산물을 서열분석(sequencing) 반응의 주형으로 이용하기 위해, 적합한 농도로 맞추는 것이 중요한 바, 본 발명에서는 APC유전자 10ng을 이용하였다. PCR 튜브에 APC유전자의 각 엑손 별 PCR 산물과 순방향 또는 역방향 프라이머 가운데 하나를 3.2pmol, 반응 혼합물(Terminator ready reaction mix) 8㎕를 넣고 최종 20㎕가 되도록 멸균 증류수를 넣어 잘 혼합한다. 상기 혼합물을 96℃에서 10 초, 50℃에서 5초 및 60℃에서 6분간 25회, 진앰프 2700 열 순환기를 사용하여 사이클(cycle) 서열분석 반응을 수행하였다. 얻어진 반응 산물을 에탄올로 침전시키고 원심분리하여 유리 프라이머(free primer)와 반응혼합물(terminator ready reaction mix)내의 형광부착 디디옥시뉴클레오티드 (dideoxynucleotide) (fluorescence labeled ddNTPs)를 제거하고 건조시켰다. 이렇게 얻어진 DNA는 포름아마이드: 25mM EDTA (pH 8.0): 블루 덱스트란(blue dextran) 혼합물과 로딩(loading) 완충용액 10㎕를 혼합하여, 끓는 물에서 5분간 변성(denaturation)시킨 후, 샘플을 얼음에 놓고 미리 5.5% 롱 레인저 겔(long ranger gel)(BMA, 카탈로그 번호, 미국)로 캐스팅(casting)한 플레이트의 각 웰에 변성 DNA 샘플을 넣고 2 내지 4시간동안 전기영동을 수행하여 ABI 프리즘(Prism) 377 자동서열분석기(automatic sequencer)(퍼킨-엘머 바이오시스템, 미국)의 소프트웨어를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

APC 유전자의 자동염기서열분석결과는 도 7에 도시하였다.

서열 분석 결과 정상 APC유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였고, 따라서 본 발명의 방법에 따른 RNA와 키토산의 액상 결합물은 실온에서 장기간 보관 후에도 클로닝과 염기서열분석이 가능할 정도로 RNA가 안정되게 보존됨을 확인하였으며, 이는 나아가 유전자돌연변이 검사와 암 검색에도 유용함을 나타내는 것이다(도 7 참조).

실시예 7

RNA카드에 장기 보관한 RNA에 대한 유전자의 클로닝 및 염기서열분석 가능성 조사

RNA카드에 흡착시켜서 실온에서 장기 보관된 RNA 샘플에 대해 RT-PCR로 얻은 산물의 클로닝과 자동염기서열분석이 적절하게 이루어질 수 있는 가를 확인하였다.

실시예 5에 따라 제작한 RNA카드에 점적하여 3개월 간 보관해 두었던 인체 폐암조직의 RNA 샘플을 주형으로 하여 돌연변이형 p53유전자에 대해 RT-PCR을 수행하고, 그 산물을 플라즈미드 벡터에 클로닝한 후 다시 자동염기서열분석법으로 검색하였다. 그 방법은 실시예 6과 동일하다.

그 결과 돌연변이형의 p53유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였으며(도 8), 본 발명의 방법에 따라 제작한 RNA카드를 이용하여 RNA를 보관할 경우 장기간이 지난 후에도 클로닝과 자동염기서열분석이 가능할 정도로 RNA가 보존되어, 나아가 유전자돌연변이 검사와 암 검색에도 유용함을 확인하였다(도 8 참조).

실시예 8

RNA/키토산 결합물을 주형으로 한 노던블라팅 방법

본 발명의 방법에 따라 보관된 RNA와 키토산 결합물을 이용하여 노던블라팅 등의 방법으로 유전자 발현을 분석하고자 할 때 키토산과 결합된 RNA는 아가로스 겔 전기영동에서 이동하지 않아 노던블라팅 분석이 곤란하다는 문제가 있다. 따라서, 노던블라팅 분석을 위해서는 키토산을 제거하여 RNA 샘플을 사용해야 한다. 그러므로, 본 발명에서는 키토산과 결합된 RNA에서 RNA의 손상없이 키토산만을 제거하기 위한 방법을 수립하였다.

상술한 바와 같이, 수용성 키토산은 양이온성 염이므로 RNA와 결합을 하게 되는 것으로, 황산염(sulfate)계열인 SDS(sodium dodecyl sulfate, SOS(sodium octyl sulfate), CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)와 같은 강력한 양이온성 염을 처리하여 키토산을 RNA로부터 분리가 할 수 있다. 이 경우의 상기 양이온성 염은 가격이 저렴하고 RNA에 손상없이 노던블라팅 분석에 영향을 주지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에서는 가격이 저렴하며 RNA와 프로브간의 하이브리디제이션 반응에도 영향을 주지 않는 SDS(시그마사, 미국)를 사용하였다.

본 발명의 방법에 따른 키토산 용액과 췌장암 조직의 RNA를 혼합하여 얻은 RNA/키토산 결합물을 실온에서 3개월간 보관한 후 5 내지 10㎍의 RNA/키토산 결합물에 5%(w/v) SDS를 섞어 노던블라팅용 아가로스 겔에 전기영동을 하고 K-ras유전자에 대해 공지의 방법(Sambrook J & Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2001:7.1.-7.88)으로 노던블라팅을 수행하였다.

그 결과 5% SDS를 함께 전기영동한 경우 RNA와 키토산이 분리되어 RNA가 겔상에서 이동함을 확인하였다(도 9참조).

또한, 노던블라팅 결과 키토산과 결합하지 않고 -70℃에서 보관하였던 RNA와 키토산/RNA 형태로 3개월간 보관한 RNA 모두에서 K-ras유전자가 강하게 발현됨을 보여 주었다(도 10 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 따른 RNA 보관 방법으로 장기간 보관한 RNA를 사용하여 노던블라팅을 수행하는 방법을 확립하였으며, 아울러 본 발명의 방법으로 보관한 RNA가 유전자 발현 정도 분석에 유용함을 확인하였다.

실시예 9

키토산을 함유한 RT-PCR 키트의 개발

본 발명의 키토산을 사용한 RNA 보관 방법을 응용하여 하나의 튜브 내에 역전사 효소, 중합효소, 프라이머, dNTP 및 완충용액등과 키토산을 함께 넣고(all in one tube) 상기 튜브에 RNA 또는 혈청등의 샘플을 넣어 RT와 PCR 반응이 함께 일어날 수 있는 RT-PCR 키트를 제조하였다.

본 실시예에서는 유두상 갑상선암(papillary thyroid carcinoma) 환자에서 갑상선 조직의 세침전자흡입 세포 검사(fine needle aspiration cytology) 검체에서 얻은 RNA를 사용하여 RET유전자의 재배열이상(PTC rearrangement)을 본 발명의 RT-PCR 키트로 검색하였으며, 이는 Bcr/Abl 유전자재배열이나 APC, p53 및 K-ras등의 암 관련 유전자, C형 바이러스 간염 또는 HIV감염에서의 RNA바이러스 진단에도 모두 적용이 가능하다.

본 키트의 사용방법은 다음과 같다.

5×GG one step RT-PCR 완충용액^™ 10㎕와 역전사효소, 핫스타트(hot start)형의 Taq 중합효소(AmpliTaq Gold, 퍼킨엘머사, 미국), 10mM dNTP 혼합물 2.0㎕, 표적 유전자인 PTC의 순방향 프라이머와 역방향 프라이머(5pmole)가 각각 1.0㎕ 씩, GG one step RT-PCR 효소 혼합물^™ 2.0㎕, RNase 억제제 0.7㎖ 및 0.1.% 농도의 키토산이 들어 있는 올-인-원 튜브에 RNA 주형을 1 내지 3㎍ 넣고 총 50㎕가 되도록 키트에 제공된 RNase를 제거한 증류수를 채워서 잘 섞어 준 후 RT-PCR을 수행하였다. 먼저 50℃에서 30분간 역전사 반응을 수행하고, 이어서 PCR 증폭은 95℃에서 15분 변성한 후 94℃에서 1분, 53℃에서 40초, 72℃에서 1분간 총 25 내지 40 사이클후 72℃에서 10분간 반응하여 종료하였다. 그 결과 본 발명의 RT-PCR 키트를 사용하여 제 1형(type 1)의 PTC 유전자 재배열을 확인하였다(도 11 참조).

실시예 10

키토산을 이용한 RNA 마이크로어레이용 칩의 개발

본 발명의 키토산 이용법을 응용하여 다수의 RNA 샘플을 수용성 키토산 용액과 혼합하여 현미경 용 유리슬라이드에 집적(spotting)하여 RNA 마이크로어레이(microarray)용 칩을 개발하였다. 현재까지 DNA 칩과 단백질 칩은 널리 보고되고 상용화되어 있으나 RNA 칩에 관한 보고를 찾기 힘들다. 본 발명의 방법에 따라 제작한 칩상에 표적 유전자 및 하우스키핑 유전자의 cDNA 프로브 또는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 다른 형광 물질로 표지(labeling)하여 하이브리디제이션 반응을 수행한 후, 각 RNA 샘플 스팟에 대한 형광 신호(fluorescence signal)를 형광스캐너로 분석하였다. 그 결과 본 발명의 방법에 따른 RNA 칩을 사용하여 다수의 RNA 샘플에서 특정 유전자의 발현을 동시에 정확하게 자동 검색하고 통계 분석할 수 있음을 확인하였다. 본 방법에 따른 RNA 칩의 제조 방법의 일 실시예는 다음과 같으며 도 12에 그 과정을 도시하였다.

1. 직경 75mm ×25mm이고, 두께가 1mm인 현미경용 유리슬라이드를 메리엔펠드(MARIENFELD)(독일)사로부터 구입하여 공지의 방법대로 아미노프로필트리메톡시실란(aminopropyltrimethoxysilane)과 페닐렌다이아이소싸이오시아네이트 (phenylenediisothiocyanate) 및 그 외의 아미노실란(aminosilane) 계열을 코팅하였다(www.asperbio.com). 또는 수퍼아민(superamine)으로 코팅된 슬라이드(텔레켐 인터내셔널사, 미국)를 사용할 수도 있다.

2. 각 단계의 방광 암 및 정상 방광 세포의 신선동결 조직으로부터 실시예 1의 방법에 따라 각각 10 내지 20㎍씩의 전체 RNA를 분리하여 1㎍/㎕의 RNA를 0.1% 키토산 용액과 1 : 1의 무게비로 혼합한 후 점적하고자 하는 순서대로 각각의 RNA 샘플을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 여기에서 RNA 샘플은 (1) 정상 방광 (2) 방광이행상피 이형성(transitional cell dysplasia), (3) Ta병기의 표재성 방광이행 상피암(superficial bladder transitional cell carcinoma), (4) T1병기의 표재성 방광이행상피암, (5) T2병기의 침윤성 방광이행상피암(invasive bladder cancer), (6) T3병기의 침윤성 방광이행상피암, (7) T4 N+병기의 전이성 방광이행상피암(metastatic bladder cancer)의 7단계 및 (8) 방광암 세포주 T24와 RT4(ATCC, USA)로 나누어서 준비하였으며, 각 단계별로 샘플의 수는 15 내지 30개, 전체 샘플 수는 180개이며, 각 샘플 당 스팟수는 2개, 전체 스팟수는 384개였다.

3. 도 12에 나타낸 것과 같은 순서대로 각 집적(직경 0.015mm)별로 0.1㎕ (100∼300ng)의 RNA와 키토산 결합액을 점적하였고, 반응하기 전까지 실온에 보관을 하였다. 이렇게 만들어진 것이 방광암의 RNA 칩이다. 이러한 RNA 칩에 집적하는 RNA 스팟의 수는 수천-수만개까지 다양하게 준비할 수 있다. 물론 이러한 원리의 RNA 칩은 다른 종류의 암이나 표적 질환에서의 대단위 유전자발현 검색에도 적용이 가능하다.

4. 검사하고자 하는 표적 유전자(E-cadherin, E-cad)와 대조 유전자(베타-엑틴)의 cDNA를 포함하는 플라즈미드 벡터를 주형으로 하여 각각을 Cy3-dUTP와 Cy5- dUTP를 이용하여 형광을 표지하여 cDNA 프로브를 준비하였다. 이 때의 표지 방법은 PCR시에 Cy3-dUTP와 Cy5-dUTP를 PCR 생성물내에 표지시켜 이용하였다. 그 외에 말단에 형광염기를 표지한 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 사용하여 PCR하는 방법도 있다. 구체적 방법은 다음과 같다.

우선, PCR 튜브에 다음과 같은 내용물을 준비하였다.

10×반응용액 2.0㎕

10×NTP 혼합물 2.0㎕

1mM Cy3 또는 Cy5-dUTP 0.7㎕

10pmole E-CAD 프라이머 세트

(또는 베타-액틴 프라이머 세트) 1㎕

주형 (cDNA 또는 플라즈미드 DNA) 100ng

Taq 중합효소 1U/1㎕

여기에 RNase를 제거한 증류수를 첨가하여 전체 부피를 20㎕으로 준비하였다. 이렇게 준비한 혼합물을 각 유전자의 프라이머 조건에 맞는 결합 온도(annealing temperature)로 PCR 반응을 수행하면서 형광물질을 표지하며, 이후 미니크로매토그라피형 칼럼에 처리하여 정제를 한 후, 사용하기 전까지 -20℃에 보관을 하였다.

5. 앞에서 만들어진 방광암 RNA 칩에 실시예 10에서 기술한 방법에 따라 프리하이브리디제이션(prehybridization) 완충용액을 넣어 42℃에서 한 시간 정도 프리하이브리디제이션을 수행하였다.

6. 상기 4에서 만들어진 표적 유전자와 대조 유전자의 cDNA 프로브를 70℃에 서 5분간 끓여서 얼음에 정치하여 준비하였다.

7. 프리하이브리디제이션이 끝난 5의 칩에 실시예 8의 노던블라팅 용 하이브리디제이션 완충용액과 6에서 준비한 유전자의 표지된 프로브를 넣어 42℃에서 4시간에서 12시간 정도로 하이브리디제이션을 수행하였다.

8. 반응이 끝난 칩은 다시 2×SSC를 넣고 실온에서 15분간 세척하였고, 다시 여기에 2×SSC 및 0.1% SDS를 넣고 65℃에서 10∼30분간 세척하였다. 여기에 다시 0.1×SSC 및 0.1×SDS를 넣고 65℃에서 5-10분간 세척하였다.

9. 세척이 끝난 칩은 GMS-428 형광스캐너(어피메트릭스사, 미국)로 분석하고, 이매진(ImaGene) 소프트웨어(어피메트릭스사, 미국)나 이와 동일한 원리의, 본 발명자들이 독자 개발한 소프트웨어를 사용하여 각 RNA 스팟의 Cy3/Cy5 형광 비를 검색하였고, 이를 각 샘플 별로 분석하였다. 그 결과 정상 방광조직에 비해 방광암조직에서 베타-액틴 대비 E-cad 유전자의 발현이 약 1/10로 현저하게 감소하며, 방광암 중에서도 전이암 및 침윤성 암에서 표재성 암에 비해 월등히 더 저하되어 있음을 보여 주었다. 이러한 차이는 통계적으로 유의성이 있는(p<0.01) 차이로 나타났다.

이상의 RNA 마이크로어레이 분석을 통해 방광암의 진행에 따라 E-cad의 발현이 유의하게 감소하며, 따라서 E-cad의 발현 소실이 방광암 진행에 중요한 역할을 함을 통계분석을 통해 객관적으로 증명할 수 있었다.

결론적으로 본 발명에 따른 수용성 키토산을 이용한 RNA보관 방법은 RNA의 보관효능이 우수하며, 여타 방법과 달리 실온에서 안정적으로 장기 보관이 가능하다. 본 방법으로 보관된 RNA는 역전사(RT)와 PCR, 자동염기서열분석(automated sequencing analysis), 클로닝, 노던블라팅 등의 유전자 발현 분석에 모두 유용하다. 아울러 이는 RT-PCR 키트나 RNA칩 등에도 광범위하게 이용될 수 있다.

본 방법은 간편하고 경제적이다. 특히 본 방법대로 생산한 RNA카드는 다수의 RNA 샘플을 실온에서 장기 보관하며 이송하는 데 매우 유용하다. 아울러 본 방법대로 생산된 RNA 마이크로어레이용 칩은 다수 샘플에서 표적 유전자의 발현을 동시에 정확하게 신속하게 자동 검색할 수 있다는 장점이 있다.

Claims (12)

1. RNA 보관방법에 있어서, RNA와 키토산의 액상 혼합물 형태로 -20℃ 내지 실온에서 보관하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 키토산은 수용성 키토산이며, 탈아세틸화 정도는 60% 에서 99%이고, 분자량은 10kDa 에서 500kDa인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA 또는 라이보자임을 모두 포함하며, 그 크기는 수백 염기 내지 수천만 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 키토산의 농도는 0.02 내지 5%(w/v)이며, RNA와 상기 키토산의 혼합비는 무게비로 1 : 0.2이상인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 보관된 RNA를 유전자 분석에 이용하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 유전자 분석이 노던 블롯인 경우에는 황산염 계열 양이온성 염을 사용하여 RNA와 키토산의 액상 혼합물로부터 RNA를 분리하여 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 황산염 계열 양이온성 염은 SDS(sodium dodecyl sulfate, SOS(sodium octyl sulfate) 또는 CTAB(cetyltrimethyl-ammonium bromide)인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 올리고 d(T) 프라이머(primer), 역전사효소(reverse transcriptase), Taq 중합효소, 반응용액, dNTP, 리보뉴클레아제 저해제(ribonuclease inhibitor) 및 키토산을 한 튜브 내에 함유하는 튜브(올인원 튜브)를 포함하는 RT-PCR 키트.
9. i) 제8항의 올인원 튜브에 RNA 샘플과 증폭하려는 유전자의 프라이머 쌍을 첨가하는 단계;

   ii) 단계 i)의 튜브를 50℃에서 30분간 반응시키는 단계;

   iii) 단계 ii)의 튜브를 95℃에서 15분, 94℃에서 1분, 53℃에서 40초, 72℃에서 1분간 총 25 내지 40 회 반복하여 반응시키는 단계;

   iv) 단계 iii)의 튜브를 72℃에서 10분간 반응시키는 단계를 포함하는 RT-PCR 방법.
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