JP5014980B2 - 核酸精製のための固相支持体として修飾された表面 - Google Patents
核酸精製のための固相支持体として修飾された表面 Download PDFInfo
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Description
本願は、全体の内容が参照として本明細書に具体的に組み入れられる、2004年3月18日提出の米国仮出願第60/554,278号および2004年9月30日提出の米国正式出願第10/955,974号の恩典を主張する。
1. 発明の分野
本発明は、一般に、核酸を精製する分野に関する。特に、本発明は、ポリマー修飾表面および/または樹脂系表面を使用する、核酸、例えば、RNA、DNAおよび/またはPNAの精製に関する。
逆転写、クローニング、制限分析および配列決定などの多数の分子生物学技法は生体物質の処理または分析に関係する。これに関して最も普通に分析される物質は、RNAおよびDNAなどのポリヌクレオチドである。これらの技法は、一般に、このような物質がこのような処理または分析手法を妨害する可能性のある夾雑物を実質的に含まないことを必要とする。このような夾雑物には、一般に、化学反応(例えば、核酸またはタンパク質のハイブリダイゼーション、酵素触媒反応および分子生物学技法に使用される他の種類の反応)を遮断もしくは阻害する物質、関心対象の核酸もしくは他の生体物質の分解または脱重合を触媒する物質、または核酸が実際に試料中に存在しない場合に、関心対象のある量の標的生体物質の試料における存在を示す「バックグラウンド」を提供する物質が含まれる。夾雑物には、関心対象の核酸物質が単離されるインビボまたはインビトロ媒体由来の高分子物質、酵素、他の種類のタンパク質、多糖またはポリヌクレオチドなどの高分子物質および脂質、低分子量酵素阻害剤またはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドなどの低分子量物質も含まれる。夾雑物は、他の物質から物質を単離するために使用される化学物質または他の物質から標的生体物質に導入されることもある。この最後の種類の一般的な夾雑物には、微量金属、色素および有機溶媒が含まれる。
本発明は、一般に、核酸を精製する分野に関する。特に、本発明は、ポリマー修飾表面および/または樹脂系表面を使用する核酸、例えば、RNA、DNAおよび/またはPNAの精製に関する。
ポリヌクレオチドは、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールまたはポリマーポリオールコーティング表面などの種々のポリマーおよび/または樹脂コーティング固体表面に可逆的に結合する。この結合を使用して、ポリヌクレオチドならびにタンパク質、単糖、多糖、脂質、遊離ヌクレオチドおよびRNAなどの他の生体分子を含む溶液および入手可能な細胞膜などの細胞成分からDNA、RNAおよび/またはPNAなどのポリヌクレオチドを簡便かつ迅速に分離する方法を可能にすることができる。本発明はまた、DNAを実質的に含まないRNAを精製する方法も提供する。
RNAまたはDNAを結合し、効率的な結合を可能にするのに十分な表面積を有するポリマー修飾固体表面および/または樹脂修飾固体表面を本発明に使用することができる。微粒子、ファイバー、ビーズおよび支持体は好適な表面を含む。本発明の一部の特定の態様において、磁性微粒子を使用する。本明細書において使用する「磁性微粒子」は、磁場によって誘引される磁気的に反応性の微粒子である。本発明の方法に使用される磁性微粒子は、磁性金属酸化物コアを含み、DNA、RNAまたはPNAに結合することができる表面を形成するポリマーコートが一般に取り囲んでいる。磁性金属酸化物コアは、好ましくは、酸化鉄であり、鉄はFe2+とFe3+の混合物である。好ましいFe2+/Fe3+比は、好ましくは、2/1であるが、約0.5/1〜約4/1まで変わってもよい。
「デキストラン修飾表面」は、デキストランを含む粒子、微粒子、ビーズ、磁性ビーズ、樹脂または任意の粒状物質である。
本発明のある態様においてポリエチレングリコール(PEG)およびPEG修飾表面を使用してポリヌクレオチドを精製する。「PEG修飾表面」は、PEGを含む、粒子、微粒子、ビーズ、磁性ビーズ、樹脂または任意の粒状物質である。
本発明のある態様においてポリビニルピロリドン(PVP)およびPVP修飾表面は、ポリヌクレオチドを精製するために使用される。「PVP修飾表面」は、PVPを含む粒子、微粒子、ビーズ、磁性ビーズ、樹脂または任意の粒状物質である。
本発明のある態様において多糖および多糖修飾表面は、ポリヌクレオチドを精製するために使用される。「多糖修飾表面」は、多糖を含む粒子、微粒子、ビーズ、磁性ビーズ、樹脂または任意の粒状物質である。
本発明のある態様において、化学的樹脂および化学的樹脂修飾表面をポリヌクレオチドを精製するために使用することができる。このような樹脂には、イソシアネート、グリセロール、ピペリジノ-メチル、ポリDMAP(ポリマー結合ジメチル4-アミノピリジン)、DIPAM(ジイソプロピルアミノメチル)、アミノメチル、ポリスチレンアルデヒド、トリス(2-アミノメチル)アミン、モルホリノ-メチル、BOBA(3-ベンジルオキシベンズアルデヒド)、トリフェニル-ホスフィンまたはベンジルチオ-メチルが含まれるが、それに限定されるわけではない。「樹脂修飾表面」は、上記の樹脂を含む粒子、微粒子、ビーズ、磁性ビーズ、樹脂または任意の粒状物質である。
「ポリヌクレオチド」は、DNA、RNA、またはPNAなどの合成DNAアナログであってもよい(Nielsen et al., 1991)。
以下は、RNAおよびDNAで例示されているポリヌクレオチドに関連する本発明の説明である。本発明は、同様の方法でのPNAの分離にも有用であることが理解されるべきである。
性質が磁性であってもよいポリマー修飾および/または樹脂修飾固体表面にポリヌクレオチドを結合することによって、ポリヌクレオチドを含有する溶液からDNA、RNAおよびPNAなどのポリヌクレオチドを分離するために必要な試薬の一部または全てを含むキットも本明細書において提供される。これらのキットは、修飾表面を有する非磁性または磁性微粒子および結合緩衝液を含むことが多い。結合緩衝液は、通常、磁性微粒子の表面にDNAを結合するのに好適な濃度で共に存在する好適な塩および好適な有機溶媒を含む。または、有機溶媒は含まれない場合があるが、ユーザーが適宜それを提供することが期待される。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例に開示する開示内容は、本発明を実施する際に十分に機能するために本発明者らによって発見された開示内容を提供しており、従って本発明を実施するための好ましい形態を構成すると考えることができることが当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱しないで、多数の変更を開示されている具体的な態様に加えることができ、類似または同様の結果を得ることができることを理解している。
デキストラン磁性ビーズを使用して希釈液から精製したRNAの収率および無傷性
デキストラン粒子がRNAに結合し、溶出する能力を実証する研究において、50μlの0.5×イソチオシアン酸グアニジニウム(GITC)溶解液(Ambion)および50μlの100%エタノール(従って、エタノールの最終濃度は50%)を含有する96ウェルプレートのウェル内の250ugの磁性ビーズに合計10 ugのRNA(ラット腎臓全RNA、Ambion)を添加した。溶液を室温(23℃)において2〜3分インキュベーションし、次いで従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)にプレートを接触させることによって粒子を側面に引き付けてから結合緩衝液を除去した。結合RNAは、25μlのRNaseフリー水(Ambion)に直接溶出された。NanoDrop分光光度計を使用してRNA収率を吸光度によって定量した。RNAの無傷性は、RNA Labchipでの分離後に2100 BioAnalyzer(Agilent)分析ソフトウェアを使用して評価した。注入RNAは28S/18S比が〜1.0であった。表1に示すように、注入RNAの92%が回収された(25μlの溶液は、それぞれ、365および366 ng/μlを含有する)。さらに、溶出後のRNAの完全性は注入物質と等価であった。従って、無傷RNAは、デキストランビーズを使用して希釈溶液から効率的に回収することができる。
デキストラン磁性ビーズのRNA結合能力
デキストラン粒子について、それらの質量の大きい割合がRNAに結合することを実証するために、結合能力測定を実施した。最初に、40μlの1% Nanomag Dextranまたは100μlの2.5% Nanomag Dextran-SO3Hビーズを1 mlの水または0.5×GITC溶解緩衝液(Ambion)で3回事前洗浄した。最後の洗浄後、ビーズの最終濃度が1%となるように、ビーズを0.5×GITC溶解緩衝液(Ambion)のいずれかの洗浄液に再懸濁させた。次に、5μlの1%ビーズスラリー(50μg)を、0.5×GITC溶解緩衝液(Ambion)、50%エタノールおよび10μgのRNA(ラット腎臓全RNA、Ambion)を含有する100 ul溶液に添加した。試料を室温において2〜3分インキュベーションし、磁性粒子を従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)でペレット化した。次いで、残存する結合緩衝液を、ピペットチップの小さい開口部で吸引することによって注意深く除去した。RNAを50μlのRNaseフリー水(Ambion)に溶出した。表2に示すように、注入した10μgの全RNAの6.7〜7.1μg(67〜71%)がデキストランビーズから溶出された。従って、Nanomag DextranおよびNanomag Dextran-SO3Hビーズは、それら質量の少なくとも20%がRNAに結合することができる。水または溶解緩衝液におけるビーズの事前洗浄は、RNAの回収効率に測定できるほどの影響を与えなかった。デキストラン粒子の質量より大きい質量のRNAを効率的に精製することができることを本発明者らはさらに実証した(実施例28)。
デキストランを使用するゲノムDNAの精製
DNAはRNAと同様、本明細書に記載するものなどのデキストラン粒子を使用して精製することができる。2本鎖DNA(dsDNA)の結合および溶出を評価するために、以下の研究を実施した。合計5μlの1% NDまたはND-SO3Hビーズを、100μlのGITC溶解液(Ambion)、100 ulの66%または100%エタノールまたはイソプロパノール、および500 ngのλゲノムDNAと合わせた。DNAをビーズに結合後、従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、80%エタノール、100 mM NaCl、4.5 mM EDTAおよび10 mM Tris(pH 7.5)を含有する200 ulの溶液でビーズペレットを2回洗浄した。dsDNAを、70℃に事前に加熱しておいた8μlの10 mM Tris(pH 8.0)、1 mM EDTAで溶出し、1%アガロースゲルで分離した。PicoGreen(Molecular Probes)で染色することによってDNAを可視化し、STORM Phosphorimager 860(Molecular Devices)でスキャンすることによって蛍光強度を測定した。図1に示すように、注入したDNAの約25%を、NDおよびND-SO3Hビーズを使用して単離することができた。
デキストラン粒子を使用するdsDNA PCR(商標)産物の精製
ゲノムDNAはデキストランビーズを使用して単離することができるが、試験した条件下における効率はわずか25%であった。より小型のdsDNAフラグメントを大きい効率で回収することができるかどうかを判定するために、830 bp PCR(商標)フラグメントをα32P-ATPでボディーラベルして、デキストラン磁性粒子への結合およびデキストラン磁性粒子からの溶出のためのレポーターを提供した。DNAclear(商標)(Ambion)を使用してDNAを精製した。次いで、このPCR(商標)産物の合計10 ngを、5μlの1% ND、ND-SO3H、Charcoal DextranまたはSicistar-Mビーズ(Micromod社販売の磁性シリカビーズ、カタログ番号#39-00-153)に添加した。DNAは、以下を含有する300μlに結合させた:i)2M GITC、50 mM TrisCl(pH 8.0)、22%イソプロパノール(G2);ii)2M GITC、50 mM TrisCl(pH 8.0)、33%イソプロパノール(G3);またはiii)1.7 M GITC、43 mM TrisCl(pH 8.0)、44%イソプロパノール(G4)。試料を23℃において2〜3分インキュベーションし、Magnetic Stand-96(Ambion)を使用してビーズをペレット化し、上清を除去した。次に、粒子をグアニジニウム溶解緩衝液(200μl)で1回、80%エタノール(200μl)を含有する溶液で2回洗浄した。最後に、10 mM TrisCl(pH 8.0)および1 mM EDTAを含有する18μlの高温の溶液(70℃に事前加熱)でDNAを溶出した。残存ビーズおよび溶出液の試料をろ紙にスポットし、STORM PhosphorImagerで放射能強度を定量した。図2に示すように、注入したdsDNAの50〜60%を、NDおよびND-SO3H磁性ビーズを使用して回収することができたが、磁性シリカビーズでは最大〜40%しか回収できなかった。従って、デキストランビーズは、これらの条件下ではシリカ粒子より優れていることが証明された。
2本鎖DNAはデキストランコーティングBioMag(登録商標) Plus磁性ビーズを使用して効率的に精製することができる
デキストランコーティング粒子を製造するための異なる方法を使用してDNA精製を評価するために、BioMag(登録商標) Plus磁性ビーズプラットホームを使用して特注のデキストランビーズをPolysciences, Inc.が製造した。この粒子を使用して2本鎖DNAの精製を評価し、Micromod社製造の2つのロットのND磁性ビーズおよびAgencourt Bioscience Corporation社製の別のDNA結合磁性ビーズ(AMPure(登録商標))と比較した。
全RNAは、デキストランコーティングBioMag(登録商標) Plus磁性粒子を使用して効率的に精製することができる
デキストランBioMag(登録商標) Plus磁性ビーズもRNA精製アッセイにおいて評価して、これらの粒子を使用するRNA回収がNDビーズと同じくらい効率的であるかどうかを判定した。3 ugの全RNA(マウス肝臓、Ambion)を使用して三連の反応を実施した。2.1 M GITC、0.21% N-ラウリルサルコシン、42 mMクエン酸ナトリウムおよび42%イソプロパノール中でRNAと100 ugのデキストランコーティング粒子を合わせることによってRNA結合を開始した。2〜3分間結合後、従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)を使用して磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを100 ulの80%エタノール、10 mM KCl、2 mM Tris(pH 7.0)、0.2 mM EDTAで2回洗浄した。結合dsDNAを20 ulの溶出液(20 ul 1 mM KCl、0.2 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0))で溶出した。溶出液は、NanoDrop分光光度計を使用してA260によってRNA含量について直接アッセイした。表4に示すように、デキストランBioMag(登録商標) Plusは、NDビーズと同様に多くのRNAを回収した。従って、デキストランBioMag(登録商標) Plus粒子は、ND粒子と同様に、RNA精製を必要とする任意の適用に有用性を有することが期待される。
ND1およびND2は、Nanomagデキストラン磁性ビーズの2つの異なる製造ロットを表す。
全RNAは、ガラスフィルターを使用して得られるものより大きい回収率でデキストランコーティングBioMag(登録商標) Plus磁性粒子を使用して固定された組織から効率的に精製することができる
本発明が固定された組織に機能することができることを実証するために、マウス肝臓を犠牲にした動物から切開し、氷上の10倍容量の10%中性緩衝ホルマリンに入れて4℃において6ヶ月置いた。合計1 gの固定肝臓組織を以下のエタノール(EtOH)処理を通じて推移させた:氷上30% EtOH 10分;氷上40% EtOH 10分;氷上50% EtOH 10分;氷上60% EtOH 10分;氷上70% EtOH 10分;氷上80% EtOH 10分;氷上90% EtOH 10分;および氷上100% EtOH 4℃において終夜。次いで、組織をEtOHから取り出し、乾燥し、5 mLのプロテイナーゼK消化緩衝液(3% SDS、50 mM クエン酸Na、pH 7.5の200 mM Tris-HCl)に入れた。試料をホモジナイズし、15 mLのプロテイナーゼK消化緩衝液および10 mgプロテイナーゼKを添加した。溶解液を50℃において4時間インキュベーションした。合計50 uL(2.5 mgの組織に等価)を取り出して、ガラスファイバーフィルター法(mirVana miRNA単離キット(Ambionカタログ番号#1560))またはデキストラン磁性ビーズ法(MagMAX全RNA単離キット(Ambionカタログ番号#1830))を使用してRNAを抽出した。
デキストラン磁性ビーズ精製後のdsDNAのサイズ分画
フラグメントサイズによるDNA精製効率を求めるための研究を実施した。一連のPCRフラグメント(122、226、830および1500 bp)をα32P-ATPでボディーラベルし、プールした(各サイズ2.75〜16.7 ng)。次いで、このプールを、17 mM TricCl pH 8.0、33%イソプロパノール、および1.7 M GITCまたは1.7 M NaClのいずれかを含有する300 ulの溶液中の100 ug NDビーズに添加した。ビーズにDNAを結合後、従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)を用いて磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄した。dsDNAを、事前に70℃に加熱しておいた20μlの10 mM Tris(pH 8.0)で溶出した。合成10 ulの試料を5%ポリアクリルアミドゲルにロードした。STORM PhosphorImagerを使用して、回収された放射性フラグメントの強度を定量した。表5に示すように、dsDNAは最高70%の効率で精製することができるが、長さ100 ntのフラグメントの回収率は低かった。サイズ100 bp未満のDNAの回収の「カットオフ」が望ましいが、それは、望ましくないオリゴデオキシヌクレオチドが精製中に損失することを意味するからである。
デキストラン表面を使用して、溶液から汚染DNAプライマーを除去することができる
合計100 ugのNDプレーンビーズを、オリゴ(dT)およびT7プロモーター配列(長さ53塩基)を含む100 ugのオリゴデオキシヌクレオチドと合わせ、5'末端を32Pで標識した微量の同じオリゴヌクレオチドを添加した。これらの試薬を、17 mM TrisHCl pH 8.0、33%イソプロパノール、および1.7 M GITCまたは1.7 M NaClのいずれかの溶液中で混合した。23℃において2〜3分インキュベーション後、従来の磁石(Magetic Stand-96、Ambion)で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄した。依然として結合している任意のDNAを、事前に70℃に加熱した20μlの10 mM Tris(pH 8.0)で溶出した。表6に示すように、注入したT7オリゴ(dT)プライマーは4%未満しか回収されず、デキストランビーズは、cDNA合成段階由来の望ましくないプライマーを持ち込まないで、cDNAなどの長いDNAを効果的に精製することができることを示している。さらに、>100 bpのDNAフラグメントは存在しなかったので、この研究は極端な例を示している。このような長いDNAは、精製を必要とする典型的な酵素反応に存在すると思われ、結合性の低いプライマーを打ち負かし、さらにプライマーの持ち込み量を低下することが期待される。
磁気的に最も反応性の粒子についてデキストランビーズ集団を濃縮して、アッセイする方法
Micromod社供給の公称250 nmのND粒子は、典型的には、粒子サイズ分布が50 nM未満〜500 nm超である。RNA精製中(33%イソプロパノールおよび1.7 M NaCl中での結合、次に80% ETOH洗浄および70CでのdH2Oにおける溶出)、これらの粒子は>80%のRNA収率を実現するが、溶出液は、溶出ペレットからの一部のビーズの損失を反映する茶色みがかった色がつく。強い彩度は、例えば、100 ugのビーズを使用して>50 ugのRNAを精製した場合には、RNA試料の高い濃縮率を明らかにしている。ペレットから溶出液へのビーズの「ドリフト(drift)」は、RNA結合段階の塩としてNaClではなくGITCを使用した場合に特に顕著であった。磁石スタンドで>1時間インキュベーションさせると溶出液中の残存ビーズは堆積し、単純な遠心分離段階において溶液から迅速に除去することができる。浮揚性が最も大きい粒子、おそらく最も小さい粒子、は、磁石にあまり引き寄せられないことをこれらの所見は示している。この問題を解決するためには、溶出液に残存する色の量を定量するアッセイが必要とされた。40 ulの容量においてデキストランビーズの連続希釈液を作製し、NanoDrop分光光度計のUV-Visスキャンを使用してスキャンした。380 nmの吸光度は、3 logの範囲にわたってビーズ濃度との強い線形の相関を示した(r>0.99)。濃度の関数としてのA380吸光度データを表7に示す。結果として、この分光光度アッセイを使用して、溶出液中の残存ビーズの濃度をモニターすることができる。
核酸をデキストラン粒子に結合するための別の塩
GITCおよびNaCl以外の数多くの塩が、NDビーズを使用するDNAまたはRNAの効率的な精製を可能にすると思われると本発明者らは仮定した。従って、ある範囲の塩および塩濃度ならびにアルコール分画を調査して、100 ngのDNA(100 bpラダー、NEBカタログ番号#N3231S)の注入量ならびに標準的な洗浄および溶出条件を使用して別の結合条件を特定した。表9に示すように、0.6 M Na2SO3および1.7 M NaNO3が実質的にNaClと同様に効果的であった。KCl、CsCl、KSCN、KOAcおよびNaOAcなどの他の塩は、1.7 M NaClの最良の条件と比較したとき、注入したDNAの半分より大きい回収率を可能にした。また、DNA精製は、33%イソプロパノールおよび1.66 M NaClにおいて最適であった。
デキストラン表面による精製後に残存するRNase AおよびDNase Iの測定
任意のRNA精製支持体の重要な特徴は、RNAの無傷性を損なうと思われるヌクレアーゼを排除してRNAを単離することができるということである。従って、以下の研究を実施した。25 U wt DNase I(Ambion)または0.00125 U RNase A(Ambion)を1.58 M NaCl、16.67 mM Tris/33%イソプロパノールまたは6 M GITC、16.67 mM Tris/33%イソプロパノールと混合した。合計1 ugのマウス肝臓全RNA(Ambion)を添加し、50 ugのNDビーズを提供した。23Cにおいて2〜3分インキュベーションした後、従来の磁石で磁性粒子を分離し、上清を除去した。ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄した。結合種を、70℃に事前に加熱しておいたヌクレアーゼフリー水で溶出した。製造業者の使用説明書により、残存ヌクレアーゼ活性量をDNaseAlert(商標)またはRNaseAlert(商標)(Ambion)によって測定した。合計5 ulの溶出液を、DNaseAlert(登録商標)基質を含有する95 ulの1×DNase I緩衝液またはRNaseAlert(商標)基質を含有する95 ul 1×RNaseAlert(商標)緩衝液に添加した。両アッセイは検出限界が<0.5%残存ヌクレアーゼである。GITCまたはNaClを結合塩として使用するかどうかにかかわらず、精製中のDNase IおよびRNase Iの除去は本質的に定量的であった(表10)。従って、記載した条件下において、デキストランビーズは、ヌクレアーゼなどの有意な量のタンパク質を共精製(co-purifying)しないでRNAまたはDNAを選択的に精製する。
デキストラン磁性ビーズを使用するヒト血漿からのRNAの精製
デキストランビーズがライフサイエンス適用のための有用性を有するためには、汚染タンパク質、炭水化物、脂質等を含まない希釈率の高い溶液ではなく、比較的粗い生体試料から、この表面がRNAを単離することができることを実証することが重要である。従って、以下の研究を実施した。67μlの100%ヒト血漿または10%ヒト血漿(水で希釈)を含有する溶液を、67μlの修飾グアニジニウム溶解緩衝液(6M GITC、50 mM TrisCl(pH 8.0)および10 mM EDTA)および67μlの100%イソプロパノールと合わせた。溶液を混合した後、2μgのRNA(ラット腎臓全RNA、Ambion)を添加した。合計5μlの5%デキストランビーズ(Nanomag Dextran、Nanomag Dextran-SO3HまたはCharcoal Dextran)を添加し、試料を23℃において2〜3分インキュベーションした。Magnetic Stand-96(Ambion)を使用してビーズをペレット化し、水溶液を除去した。次いで、デキストラン粒子をグアニジニウム溶解緩衝液で1回洗浄し、80%エタノール、10 mM KCl、2 mM Tris(pH 7.0)、0.2 mM EDTAを含有する溶液で2回洗浄した。RNAを25μlの溶出緩衝液(1 mM Tris(pH 7.0)、5 mM KCN、0.1 mM EDTA)で溶出した。表11は、(ヒト血漿中の全タンパク質は〜50 mg/mlであると仮定するとき)例えば全タンパク質のバックグラウンドはRNAのそれより100〜1000倍大きかったが、注入したRNAはこの「現実世界の」生体試料から効率的に回収されうることを明らかにしている。重要なことに、シリカ系磁性粒子は、ごく少量のRNAしか単離することができなかったので、この適用において無効であった。さらに、異なる2社製造の2種のかなり異なる種類のデキストランビーズは、この適用において効果的であることを証明しており、従ってRNAを精製する際のデキストラン表面の一般的な有用性を伝えている。
RT-PCRにおいてデキストランビーズから精製したRNAの機能性
実施例13においてデキストランビーズから溶出したRNAがRT-PCRに適格であることを確実にするために、ラットEGF mRNAに対するプライマー/TaqManプローブセットをデザインした。2 ulの溶出したRNAから2μlの1:1000希釈までわたる連続希釈セットをリアルタイムRT-PCRにおいて試験して、RNAの機能性を評価した。供給業者の使用説明書によりMessageSensor RTキット(Ambion)を使用し、ワンステッププロトコールを使用してRNAをアッセイした。比較のために、注入したラット腎臓RNAの10倍希釈液(160 ng〜160 pg)もアッセイした。試料は全てRT-PCRにおいて容易に検出され、連続希釈液の傾斜は、サイクル閾値(Ct)対理論的な注入RNA質量のプロットにおいて-3.1〜-3.9の範囲であった(図3)。これらの傾斜は、理想に近いPCR(商標)増幅効率を示す。一般に、デキストランビーズから溶出される試料は、精製されていない対応する(ストックの)RNA対照より〜2 Ct低かった。しかし、このアッセイにおいて特徴付けられる試料は、対照に存在するRNA質量の65〜75%を含有した。結果として、対照と検討試料間の感度の実際の差は〜1.5 Ctであり、リアルタイムRT-PCRにおける試料間の変動は、典型的には、少なくとも0.5〜1.0 Ctである。さらに、10%血漿から精製したRNAと100%血漿から精製したRNA間の感度には有意義な差はなかった(後者は「未精製度が大きい」試料である)。従って、RNAは血漿から効率的に精製することができること、さらに、このRNAはRT-PCRにおいて容易に増幅して、全RNA分子集団からランダムに選択された転写標的の定量を可能にすることをこれらのデータは実証している。
汚染RNaseはデキストラン磁性粒子から溶出されない
67μlの100%ヒト血漿を含有する溶液を、67μlの修飾グアニジニウム溶解緩衝液(6M GITC、50 mM TrisCl(pH 8.0)および10 mM EDTA)および67μlの100%イソプロパノールと合わせた。溶液を混合後、2μgのRNA(ラット腎臓全RNA、Ambion)を添加した。合計5μlの5%デキストランビーズ(Nanomag Dextran、Nanomag Dextran-SO3HまたはCharcoal Dextran)を添加し、試料を23℃において2〜3分インキュベーションした。Magnetic Stand-96(Ambion)を使用してビーズをペレット化し、水溶液を除去した。次いで、デキストラン粒子をグアニジニウム溶解緩衝液で1回洗浄し、80%エタノール、10 mM KCl、2 mM Tris(pH 7.0)、0.2 mM EDTAを含有する溶液で2回洗浄した。RNAを25μlの溶出緩衝液(1 mM Tris(pH 7.0)、5 mM KCl、0.1 mM EDTA)で溶出した。次いで、この溶出液の1μlを、RNase活性を報告するために設計された極めて感度の高い放射性同位体アッセイにおいて試験した。このアッセイは、RNA基質のインビトロにおける転写によって合成された放射性RNAを使用する。放射性RNAは、T7 MAXIscript(商標)転写キット(AMbion)を使用して合成された。インビトロにおける転写反応混合物は、例えば、1.0μgの線状化DNA鋳型、2μlの10×転写緩衝液、0.02μlのUTP[α-32P](800 Ci/mmol)、2μlの各10 mMリボヌクレオチドおよび2μlのT7 RNAポリメラーゼミックスを含有してもよく、最終容量を20μlにする。反応液を37℃において30分インキュベーションする。転写物はフェノール:クロロホルム抽出によって精製し、RNase不活性化アッセイに直接使用した(2.2×105カウント/分(プローブの比放射能の概算)/2.3 ng RNA)。
デキストランおよびPEGビーズを使用してヒト血漿からRNAを精製することができる
デキストラン(ND)、デキストランスルホネート(NDS)またはPEGで修飾した磁性ビーズを使用して、種々の試料マトリックスからの異なるサイズのRNA転写物の回収を評価した。最初に、ヒト血漿(50μl)を100μlの溶解/結合溶液(2.5 M GITC、0.25% N-ラウリルサルコシン、50 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、50%イソプロパノール)と混合して、血漿試料に存在するヌクレアーゼを不活性化した。次いで、合計200 ngの各RNA転写物を各試料に添加した。それぞれの磁性ビーズ(100 ug)各々も添加した。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、1.7 M GITC、0.17% N-ラウリルサルコシン、33 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、33%イソプロパノールを含有する溶液で2回、次いで10 mM KCl、2 mM TrisCl(pH 7.0)および80%エタノールで2回連続して洗浄した。RNAを1 mM KCl、0.2 mMクエン酸ナトリウムで溶出した。溶出液を1%変性アガロースゲルで分析し、臭化エチジウムで染色した(図4)。デキストラン、デキストランスルホネートまたはPEGでコーティングされた表面を使用して、100 b程度の小さいRNAおよび9 kb程度の大きいRNAを精製することができることを、データは明らかにした。
デキストラン表面は、種々の複雑な生体試料種からRNAを精製する
広域的な有用性のためには、デキストラン磁性粒子は、多数の異なる試料種からRNAを精製する際に有用でなければならない。試料マトリックス(50μlの水、ブレインハートインフュージョン(BHI)培地、ウイルス輸送培地(VTM)、口腔および鼻腔スワブ、乳汁または血清)を100μlの溶解/結合液(2.5 M GITC、0.25%N-ラウリルサルコシン、50 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、50%イソプロパノール)と合わせた;乳汁はヌクレアーゼフリーH20で50%に希釈した。次いで、RNA転写物(各250 ngの100〜9000 nt)を全ての試料培地に添加した。次いで、ND磁性粒子(100 ug)を添加した。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石で磁性粒子を分離し、上清を除去した。ビーズペレットを、1.7 M GITC、0.17%N-ラウリルサルコシン、33 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、33%イソプロパノールを含有する溶液で2回、次いでさらに10 mM KCl、2 mM TrisCl(pH 7.0)および80%エタノールで2回連続して洗浄した。RNAを1 mM KCl、0.2 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)で溶出した。RNAを1%変性アガロースゲルで分析し、SYBRゴールドで染色した。図5は、種々のサイズの高品質の無傷のRNAが異なる試料マトリックスから効率的かつ効果的に回収されたことを例示している。
デキストラン粒子は、水およびヒト血漿試料からRNAを精製して、2〜3転写物コピー程度の少数のRT-PCR検出を可能にする
公知の真核生物または原核生物における同定がない「エイリアン」対照RNAの20〜1,000,000コピーを、溶解/結合溶液(2.5 M GITC、0.25% N-ラウリルサルコシン、50 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、50%イソプロパノール)中の水またはヒト血漿の混合物に添加した。別に、全ての試料あたり同じコピー数(50コピー/μL)のアーマード(armored)EV(エンテロウイルス)RNA(Ambion)を溶解/結合溶液中の水またはヒト血漿の組み合わせに添加した。回収率を最大にするために、キャリヤーRNA(2 ugのポリ(A) RNA)も含めた。合計100 ugのNDビーズを精製支持体として添加した。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石を用いて磁性粒子を分離し、上清を除去した。ビーズペレットを、1.7 M GITC、0.17%N-ラウリルサルコシン、33 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)、33%イソプロパノールを含有する溶液で2回、次いでさらに10 mM KCl、2 mM TrisCl(pH 7.0)および80%エタノールでさらに2回洗浄した。RNAを、1 mM KCl、0.2 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)で溶出した。回収したキャリヤーRNAを260 nmの吸光度によって測定し、アーマードEV RNAおよびエイリアン対照RNAを、25μLのqRT-PCT反応において、3μLの溶出RNAを使用するqRT-PCRによって検出した。キャリヤーRNAの回収率は60〜80%であった。従って、このプロトコールにより、水または血漿においてRNA転写物の高感度検出が可能になる:20コピー程度の少数のRNA注入量を、400μLの水または血漿において測定することができた(または実際のRT-PCRチューブにおいては2.4コピーの注入量)(表12)。
デキストラン磁性粒子によるウイルスRNA単離は、現在の最良の方法と比較したとき、優れたRT-PCR感度を提供する
臨床気管(TR)および排泄腔スワブ(CL)試料の外来性ニューカッスル病ウイルス(END)を、デキストラン磁性ビーズプロトコール(実施例17に示す)または現在NVSL認証されているフィルターに基づく方法である競合他社のプロトコールを使用して単離した。各試料の10倍少ない試料容量をデキストラン磁性ビーズプロトコールに使用した;示すデータは、注入した試料容量については正規化されていない。表13に示すように、qRT-PCRによって得られた低Ct値によって実証されるように、デキストラン磁性粒子を使用すると、多量のウイルスRNAが試料から検出された。
培養細胞からの全RNA単離におけるデキストランビーズの有用性:注入した細胞数を変化させたときの直線的なRNA回収
注入数を変化させた4つの細胞種からの全RNA単離のために3つのロットのNDビーズを使用した。使用した4つの細胞系統はHela、K562、A549およびJurkatであった;細胞注入数は各々500,000、200,000、100,000、1,000であった。データの要約中の「K」は「1000」を示す。8単位のDNase I(2 U/μl)を16μlのDNase I緩衝液(37℃において10分間事前加温しておいた)に添加し、その後全RNAに添加した。それ以外は、標準的なプロトコールに従った(実施例18参照)。ヒトTATA結合タンパク質(hTBP)に特異的なプライマーおよびプローブを使用したqRT-PCRによって直線的なRNA回収が確認された(表14)。デキストランビーズの異なる製造ロット間でRNA回収の有意な差は観察されなかった。「RT+」は、逆転写酵素をqRT-PCRに添加したことを示すが、「RT-」は、逆転写酵素を添加しなかったことを示す。「RT-」反応の増幅は残存するゲノムDNA汚染によって生じ、典型的にはこの転写標的のRNA量より1000倍少ない。デキストラン磁性ビーズを使用して抽出したRNAはRT-PCR注入量の直線範囲にわたって反応性であり、再現性よく定量されることをデータは明らかに実証している。
デキストラン磁性ビーズを使用した生物組織からのRNAの精製
デキストランビーズが組織から全RNAを精製することができるかどうかを判定するために、以下の研究を実施した。3匹のマウスの脾臓(急速冷凍、Pel-Freez)をGITC溶解緩衝液(RNAqueousキット、Ambion)中でホモジナイズして、溶解液(108 mg/ml)を作製した。100 ulの溶解液(10.8 mg組織に等価)を、33% EtOHまたは33%イソプロパノール中の200 ulの0.5×GITC溶解液および5μlの5%デキストランビーズ溶液中と合わせることによって、この溶解液の内因性RNAを磁性粒子に結合した。試料を23℃において2〜3分インキュベーションした。次いで、Magnetic Stand-96(Ambion)を使用してビーズをペレット化し、水溶液を除去した。次に、デキストラン粒子をグアニジニウム溶解緩衝液(200μl)で1回、80%エタノールを含有する溶液(200μl)で2回洗浄した。10 mM TrisCl(pH 8.0)および1 mM EDTAを含有する30μlの溶液でRNAを溶出した。表15に示すように、Nanomag DextranおよびNanomag Dextran SO3Hビーズは、脾臓組織のRNAの高収率での回収を可能にした。比較として、Charcoal Dextranは、Nanomagビーズを使用して単離したRNAの10〜15%しか回収しなかった。重要なことに、デキストランビーズの各々によって精製したRNAは無傷性が高かった(図6)。また、デキストラン微粒子で単離したRNAの電気泳動プロファイルは、33%イソプロパノールを使用する場合には、ゲノムDNAを回収することができるが、33%エタノールを使用する場合には、該DNAは実質的に存在しないことを明らかにしている。従って、デキストランビーズを精製支持体として使用する場合には、結合液中の有機成分の性質は、DNAを排除したRNAの回収、または全核酸の回収を調節することができる。
PEGコーティング磁性粒子によるRNAの精製
PEG300をコーティングした磁性粒子(250 nm)はMicromod(ドイツ)から入手可能である。これらの粒子を使用したRNA精製を以下の実験において評価した:MessageAmp II(Ambion)で増幅した32 ugの未修飾RNAを50 ugのNanomag PEGまたはND粒子と合わせた。結合条件は、33%イソプロパノール存在下において、1.7 M NaCl、1.7 M GITCまたは1.45 M NaCl/尿素のいずれかを含んだ。全ての精製反応は96ウェルポリスチレンプレートにおいて実施した。成分を添加、混合し、室温において10分インキュベーションした。次いで、プレートを96ウェル磁性プレートに15分置き、ビーズをペレット化させた。上清を除去し、試料を80%エタノールで2回洗浄し、RNAを70CにおいてdH2Oで溶出した。精製したaRNA試料の濃度をNanoDrop分光光度計で測定した。表16に示すように、Nanomag PEGビーズは、全ての条件においてNDビーズと同様に多くのRNAを回収した。この知見は、RNA精製のためのPEGコーティング磁性粒子の有用性を実証している。
デキストランビーズはcDNAを効率的に精製して、高収率の増幅RNAを可能にする
合計1 ugのHeLa-S3全RNA(Ambionカタログ番号#7852)を、製造業者の使用説明書によりAmbion社のMessageAmp IIキットを使用して二連の反応において増幅した。追加の二連のセットの反応において、ガラスフィルターカラムを用いるcDNA精製段階をND粒子を使用する磁性ビーズ精製と代えたことを除いて製造業者のプロトコールを観察した。17 mM TrisCl pH 8.0、33%イソプロパノールおよび1.7 M NaCl中でcDNA(100 ul)を100 ugのNDビーズに結合させた。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石(Magetic Stand-96、Ambion)で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄し、結合cDNAを20μlのヌクレアーゼフリー水で溶出した。全ての反応についてインビトロ転写を4時間実施した。表17に示すように、cDNAクリーンアップのレベルにおいて、NDビーズでガラスフィルター精製段階を置換したことにより、対照の90 ug aRNAと比較して、80 ugのaRNAを生じた。得られたaRNAの平均長は、〜1308 nt対〜1238 ntと、実際、よりわずかに長かった。従って、NDビーズはcDNAを精製する際に非常に効果的で、効率的なRNA増幅を可能にし、(全RNAの3%をmRNAと仮定すると)2660倍の増幅が単一のラウンドにおいて達成され得る。さらに、増幅RNAの広範囲の提示の目標を損なう可能性のある、DNA長の亜集団における選択的な損失はなかった。
デキストランビーズは、ヌクレオチドまたはシアニン色素による望ましくない汚染を生じないで核酸を精製する
合計100 ugのNDプレーンビーズを、Ambion社のMEGAscript転写緩衝液中で、7.5 mMのATP、GTP、CTP、TTT、または1.88 mM ビオチン-UTP、または3.75 mMアミノアリル-UTPまたは80%単一パックのCy5色素(CyScribe(商標)Cy6反応色素、Amersham)と合わせた。これらの試薬を、17 mM TrisCl pH8.0、33%イソプロパノールおよび1.6 M NaClの溶液中で混合した。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石(Magnetic Stand-96、Ambion)で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄した。依然として結合している任意のヌクレオチドを、70℃に事前に加熱しておいた20μlのヌクレアーゼフリー水で溶出した。残存ヌクレオチドの割合(%)を、NanoDrop分光光度計を使用してA260吸光度の値および各ヌクレオチド種の適切な吸光係数によって測定した。表18に示すように、任意のヌクレオチドは4%未満が回収され、デキストランビーズはヌクレオチドに対する親和性がほとんどないことを示しており、この種は精製中に>100 b RNAから効率的に分離することができる。この所見は、残存する修飾ヌクレオチドがマイクロアレイからのバックグラウンドシグナルを上昇することがある、aRNAの精製に適用されるので、重要である。さらに、>100 b のRNAフラグメントは存在しなかったので、この研究は極端な例を示す。これらのより長いRNAは、精製を必要とする典型的な酵素反応に存在すると思われ、結合力の弱いプライマーよりも優勢で、プライマー持ち込み量をさらに低下することが期待されるであろう。
PEGコーティング表面は、汚染ヌクレオチドを生じないでRNA精製を可能にする
合計100 ugのPEG磁性ビーズを、Ambion社のMEGAscript転写緩衝液中で、(各々)7.5 mMのATP、GTP、CTP、TTP、または1.88 mM ビオチン-UTP(Enzo)、または3.75 mMアミノアリル-UTP(Ambion)または80%単一パックのCy5色素(CyScribe(商標)Cy5反応色素、Amersham)と合わせた。これらの試薬を、17 mM TrisCl pH8.0、33%イソプロパノールおよび1.6 M NaClの溶液中で混合した。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石(Magetic Stand-96、Ambion)で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄した。依然として結合している任意のヌクレオチドを、70℃に事前に加熱しておいた40μlのヌクレアーゼフリー水で溶出した。残存ヌクレオチドの割合を、NanoDrop分光光度計を使用してA260吸光度の値および各ヌクレオチド種の適当な吸光係数によって測定した。表19に示すように、任意のヌクレオチドは3%未満が回収され、PEGビーズはヌクレオチドに対する親和性がほとんどないことを示しており、この種は精製中に>100 b RNAから効率的に分離することができる。この知見は、残存する修飾ヌクレオチドがマイクロアレイからのバックグラウンドシグナルを上昇することがある、aRNAの精製に適用されるので、重要である。さらに、>100 b のRNAフラグメントは存在しなかったので、この研究は極端な例を示す。これらのより長いRNAは、精製を必要とする典型的な酵素反応に存在すると思われ、結合力の弱いプライマーよりも優勢で、プライマー持ち込み量をさらに低下することが期待されるであろう。
デキストランビーズは、RNA増幅手法においてcDNAおよび標識した増幅RNAを効率的に精製する
合計500 ngのHeLa-S3全RNA(Ambion)を、製造業者の使用説明書によりAmbion社のMessageAmp IIキットを使用して二連の反応において増幅した。追加の二連のセットの反応において、ガラスフィルターカラムの代わりにND磁性ビーズを使用することによって製造業者のプロトコールを変更し、cDNA(第2鎖cDNA合成段階の後)およびaRNA(インビトロ転写段階の後)の両方を精製した。17 mM TrisCl pH 8.0、33%イソプロパノール、および1.7 M NaCl中でcDNA(100 ul)を100 ugのNDビーズに結合させた。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石で磁性粒子を分離し、上清を除去した。次いで、ビーズペレットを、80%エタノールを含有する200 ulの溶液で2回洗浄し、結合cDNAを20μlのヌクレアーゼフリー水で溶出した。
デキストラン粒子はインビトロ転写の合理化された手法に適合性である
同一のデキストランビーズを使用して、RNA増幅手法においてcDNAおよびaRNAを精製することができるので、本発明者らは、cDNA精製後にビーズを簡単に残せれば、手法は合理化されると思われると理由づけた。この方法の利点は、インビトロ転写(IVT)中に溶液に存在するビーズは転写段階直後にaRNA精製に利用可能であると思われ、ビーズの追加の添加が必要ないと思われることである。この経済的な方法は試料の取扱を最小にし、エラーを少なくし、再現性を増加する可能性がある。
デキストラン粒子は、修飾ヌクレオシドを含むRNAを効率的に精製する
修飾ヌクレオシドを含有するRNA分子をマイクロアレイプロトコールのレポーターとして使用する。NDビーズ(250 nm)がアミノアリル、Cyまたはビオチン修飾RNAを精製する能力を評価し、Agencourt Bioscience Corp.社製のRNA結合磁性粒子であるRNAclean(商標)製品と比較した。インビトロ転写反応は、典型的には、高収率のこれらの修飾RNAを作製するので、各精製反応に、高注入量の修飾aRNAを添加した。Ambion社のMegaScriptキットおよびCy修飾ヌクレオチドを使用してCy標識Xef転写物を作製した。HeLa全RNAから増幅したCy標識RNAは、Ambion社のMessegeAmpキットおよびCy修飾ヌクレオチドを使用して作製した。最適化した結合条件を使用して、20 ugものCy修飾Xef aRNAおよび10 ugものCy修飾Hela全aRNAの精製を、反応ごとにアッセイした。精製反応は以下の成分を添加した96ウェルプレートにおいて実施した:100 ug ND粒子、1.7 M NaCl、1.7 mM Tris pH 8、および33%イソプロパノール。また、0.33X IVT緩衝液およびT7RNAポリメラーゼ(800 U/rxn)を添加して、IVTからの持ち込みを模倣した。各反応について、上記の成分を十分に混合し、室温において10分インキュベーションしてから96ウェルmagnetic stand(Ambion)に20分置き粒子をペレット化させた。結合上清を除去し、ビーズを80%エタノールで2回洗浄し、次に70CにおいてdH2Oで溶出した。NanoDrop分光光度計を使用して結果を測定した。ND粒子は、注入したCy修飾Xef RNAの93%もの収率を生じた(表22)。同様の傾向は、81%の回収率を生じたHela全RNAから増幅したCy修飾aRNAの精製にも適用できた。デキストラン粒子が、かさ高な疎水性Cy修飾で修飾されたRNAを結合するのに効果的であることを、これらの結果は実証している。さらに、デキストラン磁性ビーズは、RNAclean(商標)磁性粒子より50%多いCy修飾RNAを回収した。
デキストラン磁性ビーズは、増幅されたビオチン化またはアミノアリルRNAを効率的に精製し、標準的なRNA増幅方法とのマイクロアレイ一致を可能にする
デキストランビーズを使用するaRNA精製と従来のガラスファイバーに基づく方法を比較するための研究を実施した。HeLa全RNA(Ambion)は、RNA増幅反応あたり0.1 ugまたは1 ugの注入量を使用した。Ambion社のMessageAmp II試薬およびプロトコールを第1鎖cDNAおよび第2鎖cDNA合成ならびに増幅RNAを合成するインビトロ転写反応に使用した。インビトロ転写段階に2つの別個の反応時間4および14時間を使用した。2本鎖cDNAクリーンアップのためのカルボキシレートビーズに基づく方法(AMPure(登録商標)、Agencourt Bioscience Corp.)と組み合わせた増幅RNA精製のためのデキストランビーズ方法を、2本鎖cDNAおよびaRNA精製のためにガラスファイバースピンカラムを使用する標準的なMessageAmpプロトコールと比較した。
修飾ビーズ表面の組み合わせは核酸精製選択肢の多用途性を可能にする
種々の官能性を有するデキストラン磁性ビーズを入手することができる。例えば、Polysciences, Inc.社製の一部の粒子はMicromod社製の一部の粒子より効率的にdsDNAを回収することが見出されている。結果として、両クラスの粒子を含有する1つのチューブは、1つのクラス単独よりも効率的に全核酸(RNAおよびDNA)を単離することを期待できる。例えば、5000個のHeLa細胞を含有する100 ulを200 ulの溶解結合溶液(2M GuSCN、12.5 mM クエン酸Na(pH 7.0)、0.25% Nラウリルサルコシン、0.05 M BME、50%イソプロパノール)に添加する。Polysciences, Inc.によって特注製造された合計50 ugのNDビーズおよび50 ugのデキストランを精製支持体として添加する。23Cにおいて2〜3分インキュベーション後、従来の磁石を用いて磁性粒子を分離し、上清を除去する。ビーズペレットを、1.3 M GITC、0.17% N-ラウリルサルコシン、8 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)および33%イソプロパノールを含有する200 ulの溶液で連続して2回洗浄し、次いで10 mM KCl、2 mM TrisCl(pH 7.0)および80%エタノールでさらに2回洗浄する。核酸を1 mM KCl、0.2 mMクエン酸ナトリウム(pH 7.0)で溶出する。RNAおよびDNAの回収は、A260の分光光度法によって、DNAおよびRNA定量のためのQuant-ITキット(Molecular Probes)を使用する蛍光定量によって、またはRT+およびRT-反応を使用するリアルタイムRT-PCRによってモニターすることができる。
共沈剤を固体表面に結合するとき、利用性を予見する共沈アッセイ
高スループット適用は、使用の容易さを改善し、試料スループット大きくし、変動を小さくするためにコーティング磁性粒子を使用することが多い。現在、高スループット核酸精製の大半のためにごく少数の化学物質しか広範に使用されていない。
ポリビニルピロリドンは、デキストランコーティング粒子への高収率のRNAの回収を可能にする
ポリビニルピロリドン(PVP)はモノマーn-ビニルピロリドンから製造され、化学物質供給業者から種々の分子量が容易に入手可能である。実施例31に記載するRNA共沈アッセイを使用して、10K、40Kおよび360K分子量のPVP製剤(Sigma)を評価した。研究は1 M NaCl、20 ugのRNAおよび50 ugのデキストランコーティング磁性粒子を含んだ。溶出したRNAはA260によって定量し、選択した試料を、2100 Bioanalyzerを使用してRNA LabChip(登録商標)でも分析した。LabChipでアッセイした試料については、RNAの質(RNA Integrity NumberまたはRIN)も示す。3つのPVPポリマーは全て、任意のアルコールの非存在下において注入したRNAの高収率の回収を可能にしたことを、表27は明らかにしている。一般に、PVPのポリマー長さが増加するにつれて、同じRNA収率を達成するためには、低い正味濃度のPVPが必要とされた。従って、より長い鎖のPVP分子は、精製段階中に、RNAとの多数の相互作用を提供すると思われ、ビーズ表面への沈殿を達成するために少ない分子しか必要とされない。また、固相支持体に結合されるときに核酸精製において利用性を有するPEGと同様に、PVP-10、PVP-40およびPVP-360は各々、表面に直接結合されると核酸精製において利用性を有することが期待される。
ポリマーポリオールは、コーティングした粒子へのRNAの回収を可能にする
表面でのRNAまたはDNAの精製において利用性を有することが期待される他のポリマー候補物質には、反復糖モチーフに基づいたものが挙げられる。これらには、グリコーゲン、アラビアゴム、キサンタンガム、カラギナン、アミロース、寒天、アミロペクチン、キシラン、β-グルカン等が挙げられる。このクラスの化合物はポリオールとしても公知である。1.2 M NaClにおいて25 ugの注入RNAおよび9.5、4.8または2.4%アラビアゴム(Fulka)を使用する研究において、共沈剤として9.5%アラビアゴムを使用して注入したRNAの〜53%を精製することができた(表28)。アラビアゴム中のポリマーは、固相支持体に結合されるとき、RNAまたはDNAに結合するために有用であると思われることをこれらのデータは示唆している。さらに広義的には、効果的な核酸共沈剤であるポリマーポリオールは、固相支持体に結合されると、RNAまたはDNAを精製する際に利用性を有することを本発明者らは期待している。
他の有用なRNA精製化学物質の同定
12種の異なる化学的樹脂を、RNAに結合して精製する能力についてスクリーニングした。Xef RNA転写物を、Ambion社のMEGAScriptキットを使用して32Pを内部標識し、200,000 cpm/ul RNAの比活性まで1 ugのマウス全RNAに添加した(20 ul全RNA+2 ul放射性標識Xef転写物)。
Claims (38)
- 以下の段階を含む、ポリヌクレオチドを含有する溶液から少なくとも1つのポリヌクレオチドを分離する方法:
ポリヌクレオチドを含む溶液を調製する段階;
少なくとも1つのデキストランを含む表面を有する磁性粒子と、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含有する該溶液とを混合して、混合物を作製する段階;
該少なくとも1つのポリヌクレオチドが該少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合する濃度に、該混合物の塩濃度および有機溶媒濃度を調節し、修飾されたデキストランを含む表面を作製する段階;
該混合物の残りから、少なくとも1つのポリヌクレオチドが該デキストランを含む表面に結合したまま、少なくとも1つの修飾されたデキストランを含む表面を含む磁性粒子を分離する段階;および
該修飾されたデキストランを含む表面を溶出緩衝液と接触させ、それによって該少なくとも1つの修飾されたデキストランを含む表面から少なくとも1つのポリヌクレオチドを分離する段階。 - 前記デキストランを含む表面が、磁性微粒子上である、請求項1記載の方法。
- 前記デキストランを含む表面を含む磁性粒子の分離段階が、磁石を使用して実施される、請求項2記載の方法。
- 前記少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合した少なくとも1つのポリヌクレオチドを、該デキストランを含む表面に結合した1つまたは複数の不純物を溶解するが、該少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合した少なくとも1つのポリヌクレオチドを残存させる緩衝溶液で洗浄する、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、少なくとも1つのRNAであるとさらに規定される、請求項1記載の方法。
- 前記デキストランを含む表面へのDNAの結合を可能にしないが、該デキストランを含む表面へのRNAの結合を可能にする選択的な結合溶液を使用する段階を含む方法において、該少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合した少なくとも1つのRNAを結合する段階を含むとさらに規定される、請求項5記載の方法。
- 前記デキストランを含む表面に結合したRNAを選択的な洗浄溶液で洗浄し、該選択的な結合溶液は、該デキストランを含む表面に結合したDNAフラグメントを溶解するが、RNAフラグメントを該デキストランを含む表面に結合させたままにする、請求項5記載の方法。
- 前記デキストランを含む表面から前記少なくとも1つのRNAフラグメントを溶出するが、DNAフラグメントを該デキストランを含む表面に結合させたままにする選択的溶出溶液で、該少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合した少なくとも1つのRNAを溶出する、請求項5記載の方法。
- 前記少なくとも1つのポリヌクレオチドが、少なくとも1つのデキストランを含む表面に結合したまま、1つまたは複数の酵素で消化される、請求項1記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスRNAまたはウイルスDNAである、請求項1記載の方法。
- 前記溶液が生体試料または生体試料の溶解物である、請求項1記載の方法。
- 前記溶液が、インビトロ転写反応物、逆転写反応物、第2鎖DNA合成反応物、DNase反応物、PCR反応物またはRNA増幅反応物である、請求項1記載の方法。
- DNA、RNAおよび/またはPNAを単離または濃縮する方法としてさらに規定される、請求項1記載の方法。
- 前記溶液を調製する段階が、RNA増幅反応、インビトロ転写反応、逆転写反応、第2鎖DNA合成反応、DNase反応および/またはPCR反応を実施する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 前記溶液を調製する段階が細胞を溶解する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 前記塩濃度が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化リチウム、塩化バリウム、塩化セシウム、過塩素酸ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジニウム(guanidinium isothiocyanate)、塩酸グアニジニウム(guanidinium hydrochloride)、ヨウ化カリウムおよびヨウ化ナトリウムのうち少なくとも1つを含む、1つまたは複数の塩の濃度である、請求項1記載の方法。
- 前記塩濃度が0.1 M〜5 Mである、請求項16記載の方法。
- 前記有機溶媒濃度が、C1〜C5アルコール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドまたはアセトンの少なくとも1つを含む、1つまたは複数の有機溶媒の濃度である、請求項1記載の方法。
- 前記有機溶媒の濃度が、5%〜50%に調節される、請求項18記載の方法。
- 前記塩が、イソチオシアン酸グアニジニウムである、請求項16記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド溶液が、血液の溶解物、血液分画、生体由来の新鮮組織、生体由来の固定組織または培養細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、細菌RNAまたは細菌DNAである、請求項1記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、宿主RNAまたは宿主DNAである、請求項1記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項1記載の方法。
- 前記溶液を調製する段階が、該溶液中のRNA、DNAまたはPNAをレポーター色素に結合する段階を含む、請求項1記載の方法。
- RNA、DNAまたはPNAを単離または濃縮する方法としてさらに規定される、請求項1記載の方法。
- 前記RNA、DNAまたはPNAをレポーター色素に結合する段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 前記RNA、DNAまたはPNAをフラグメント化する段階、次いでフラグメント化したRNA、DNAまたはPNAの少なくとも一部をマイクロアレイにハイブリダイズする段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 前記RNA、DNAまたはPNAの少なくとも一部をマイクロアレイにハイブリダイズする段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドを含む溶液が、生体由来の固定組織から調製される、請求項1記載の方法。
- 前記有機溶媒が、ポリビニルピロリドン、エタノール、またはイソプロパノールを含む、請求項1記載の方法。
- 前記少なくとも1つのデキストランを含む表面が、ポリエチレングリコール、またはFicoll(商標)をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記デキストランがデキストランスルホネートである、請求項1記載の方法。
- 結合緩衝液またはその1つもしくは複数の成分、および少なくとも1つのポリマー修飾表面を含む磁性粒子を含むキットであって、該結合緩衝液が、使用中に前記ポリマー修飾表面にポリヌクレオチドを結合するのに好適な濃度の好適な塩および好適な有機溶媒を含み、該ポリマー修飾表面が、デキストランを含むとさらに規定される、キット。
- 溶出緩衝液またはその1つもしくは複数の成分をさらに含み、該溶出緩衝液が、使用中に前記ポリマー修飾表面に結合したポリヌクレオチドを溶解することができる、請求項34記載のキット。
- 洗浄緩衝液またはその1つもしくは複数の成分をさらに含み、該洗浄緩衝液が、使用中に前記ポリマー修飾表面に結合した不純物を溶解することができるが、該ポリマー修飾表面に結合した選択的なポリヌクレオチドを溶解することができない、請求項34記載のキット。
- 使用中にRNAまたはDNAの無傷性を保存する、試薬またはその1つもしくは複数の成分をさらに含む、請求項35記載のキット。
- 前記デキストランがデキストランスルホネートである、請求項35記載のキット。
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EP1829978B1 (en) * | 2004-12-13 | 2011-09-21 | Bio-Dixam LLC | Method of detecting gene methylation and method of examining neoplasm by detecting methylation |
US20060188892A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Ambion, Inc. | Enzymatic digestion of tissue |
US20080113357A1 (en) * | 2006-06-29 | 2008-05-15 | Millipore Corporation | Filter device for the isolation of a nucleic acid |
DE102006031764B4 (de) * | 2006-07-06 | 2009-10-01 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zur parallelen Isolierung doppel- und einzelsträngiger Nukleinsäuren sowie zur selektiven Entfernung doppelsträngiger Nukleinsäuren aus einem Gemisch von doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren |
US8338109B2 (en) | 2006-11-02 | 2012-12-25 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Predicting cancer outcome |
ES2394815T3 (es) * | 2006-12-13 | 2013-02-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Utilización de TDE para el aislamiento de ácidos nucleicos |
US20110060135A1 (en) * | 2007-11-29 | 2011-03-10 | New England Biolabs, Inc. | Selective Purification of Small RNAs from Mixtures |
EP2071034A1 (en) | 2007-12-12 | 2009-06-17 | bioMérieux | Method for treating a solution in order to destroy any ribonucleic acid after amplification |
US8497065B2 (en) * | 2008-02-15 | 2013-07-30 | Life Technologies Corporation | Methods and kits for extraction of DNA |
US20100029925A1 (en) * | 2008-05-23 | 2010-02-04 | Life Technologies Corporation, A Delaware Corporation | Methods and kits for extraction of dna |
AU2009253675A1 (en) | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
US10407731B2 (en) | 2008-05-30 | 2019-09-10 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
EP2128169A1 (de) | 2008-05-30 | 2009-12-02 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Isolierung von kurzkettigen Nukleinsäuren |
FI20085934A0 (fi) * | 2008-10-03 | 2008-10-03 | Wallac Oy | Menetelmä ja laitteisto näytteiden eluoinnin havaitsemiseksi |
EP2350320A4 (en) | 2008-11-12 | 2012-11-14 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | METHODS AND SYSTEMS FOR USING EXOSOMES TO DETERMINE PHENOTYPES |
US9495515B1 (en) | 2009-12-09 | 2016-11-15 | Veracyte, Inc. | Algorithms for disease diagnostics |
US10236078B2 (en) | 2008-11-17 | 2019-03-19 | Veracyte, Inc. | Methods for processing or analyzing a sample of thyroid tissue |
US8133683B2 (en) * | 2009-01-23 | 2012-03-13 | Taipei Medical University | Methods for detecting biomolecules in a sample |
US9074258B2 (en) | 2009-03-04 | 2015-07-07 | Genomedx Biosciences Inc. | Compositions and methods for classifying thyroid nodule disease |
EP3360978A3 (en) | 2009-05-07 | 2018-09-26 | Veracyte, Inc. | Methods for diagnosis of thyroid conditions |
WO2011012121A1 (de) * | 2009-07-29 | 2011-02-03 | InViTek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH | Verfahren zur isolierung hochreiner rna mittels paramagnetischen mikro und nanopartikeln |
WO2011034864A1 (en) | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Life Technologies Corporation | Lysis buffers for extracting nucleic acids |
CA2782284A1 (en) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles |
US10446272B2 (en) | 2009-12-09 | 2019-10-15 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions for classification of samples |
US20140148348A1 (en) | 2010-01-13 | 2014-05-29 | Christine Kuslich | Dectection of gastrointestinal disorders |
CA2791905A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Biomarkers for theranostics |
JP2013526852A (ja) | 2010-04-06 | 2013-06-27 | カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス | 疾患に対する循環バイオマーカー |
WO2012075133A1 (en) | 2010-11-30 | 2012-06-07 | Life Technologies Corporation | Alkylene glycols and polymers and copolymers thereof for direct isolation of nucleic acid from embedded samples |
JP5385427B2 (ja) | 2011-08-04 | 2014-01-08 | 日本特殊陶業株式会社 | 点火プラグ、及び、点火装置 |
US10513737B2 (en) | 2011-12-13 | 2019-12-24 | Decipher Biosciences, Inc. | Cancer diagnostics using non-coding transcripts |
EP2809811B1 (en) | 2012-01-30 | 2018-04-11 | Exact Sciences Development Company, LLC | Modification of dna on magnetic beads |
DK3435084T3 (da) | 2012-08-16 | 2023-05-30 | Mayo Found Medical Education & Res | Prostatakræftprognose under anvendelse af biomarkører |
CN104620093B (zh) * | 2012-08-23 | 2018-04-20 | 干细胞技术公司 | 用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法 |
US9493766B2 (en) * | 2013-02-04 | 2016-11-15 | Corning Incorporated | PCR reaction cleanup buffers |
EP2971169A4 (en) * | 2013-03-13 | 2016-10-26 | Abbott Molecular Inc | SYSTEMS AND METHODS FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS |
US11976329B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-05-07 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for detecting usual interstitial pneumonia |
US9803230B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-10-31 | Abbott Molecular Inc. | One-step procedure for the purification of nucleic acids |
JP6381628B2 (ja) | 2013-03-18 | 2018-08-29 | キアゲン ゲーエムベーハー | 生物試料の安定化 |
US9719082B2 (en) | 2013-10-31 | 2017-08-01 | General Electric Company | Substrates and associated methods for elution of nucleic acids |
US9587268B2 (en) | 2014-01-29 | 2017-03-07 | Agilent Technologies Inc. | Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment |
JP6629185B2 (ja) * | 2014-03-26 | 2020-01-15 | ユニバーサル・バイオ・リサーチ株式会社 | 核酸抽出方法及び試薬 |
US9587263B2 (en) | 2014-03-26 | 2017-03-07 | General Electric Company | Isothermal amplification under low salt condition |
US10319502B2 (en) | 2014-10-23 | 2019-06-11 | Corning Incorporated | Polymer-encapsulated magnetic nanoparticles |
EP3770274A1 (en) | 2014-11-05 | 2021-01-27 | Veracyte, Inc. | Systems and methods of diagnosing idiopathic pulmonary fibrosis on transbronchial biopsies using machine learning and high dimensional transcriptional data |
KR101728096B1 (ko) * | 2015-03-12 | 2017-04-20 | 재단법인 아산사회복지재단 | Ffpe 조직에서 핵산의 분리 방법 |
KR102488291B1 (ko) * | 2015-03-20 | 2023-01-13 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 회수 방법 |
WO2016183292A1 (en) * | 2015-05-14 | 2016-11-17 | Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc | Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples |
TWI691595B (zh) * | 2015-09-02 | 2020-04-21 | 創想生物科技有限公司 | 選擇性分離核酸之方法及套組 |
EP3347485B1 (en) * | 2015-09-11 | 2021-11-03 | Bacteria Detection Ltd | Methods for isolating microbial cells from a blood sample |
WO2017065959A2 (en) * | 2015-09-25 | 2017-04-20 | Veracyte, Inc. | Methods and compositions that utilize transcriptome sequencing data in machine learning-based classification |
GB2565664A (en) * | 2016-03-07 | 2019-02-20 | Hitachi Chemical Advanced Therapeutics Solutions Llc | A closed system for labelling and selecting live cells |
EP3431598A4 (en) * | 2016-03-17 | 2019-11-13 | Toray Industries, Inc. | PROCESS FOR COLLECTING NUCLEIC ACID |
US10287625B2 (en) * | 2016-03-18 | 2019-05-14 | Norgen Biotek Corp. | Methods and kits for separating nucleic acids by size |
WO2018008032A1 (en) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Methods for isolation and quantification of short nucleic acid molecules |
WO2018039490A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | Genomedx Biosciences, Inc. | Use of genomic signatures to predict responsiveness of patients with prostate cancer to post-operative radiation therapy |
US20190203200A1 (en) * | 2016-09-14 | 2019-07-04 | Toray Industries, Inc. | Method of collecting cell-free dna |
EP3571322B9 (en) | 2017-01-20 | 2023-10-04 | VERACYTE SD, Inc. | Molecular subtyping, prognosis, and treatment of bladder cancer |
CA3055925A1 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Decipher Biosciences, Inc. | Subtyping prostate cancer to predict response to hormone therapy |
EP3399034B1 (en) * | 2017-05-05 | 2022-12-28 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Device for extracting nucleic acids from biological sample materials with solvent-free reagents |
CA3062716A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Decipher Biosciences, Inc. | Genetic signatures to predict prostate cancer metastasis and identify tumor agressiveness |
US11217329B1 (en) | 2017-06-23 | 2022-01-04 | Veracyte, Inc. | Methods and systems for determining biological sample integrity |
JP7136817B2 (ja) * | 2017-06-30 | 2022-09-13 | サーキュロミクス インク | 熱可塑性シリカナノ材料を使用するサイズ選択精製 |
KR20200103666A (ko) | 2017-12-27 | 2020-09-02 | 도레이 카부시키가이샤 | 핵산의 회수 방법 |
BE1030468B1 (fr) * | 2022-04-20 | 2023-11-21 | Quantoom Biosciences S A | Système et méthode pour la production d’arn |
WO2023198910A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Quantoom Biosciences S.A. | System and method for the production of rna |
CN115058491A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-16 | 南京瑞贝西生物科技有限公司 | 一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法 |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4452773A (en) | 1982-04-05 | 1984-06-05 | Canadian Patents And Development Limited | Magnetic iron-dextran microspheres |
US5075430A (en) | 1988-12-12 | 1991-12-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Process for the purification of DNA on diatomaceous earth |
US5234809A (en) | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
US5545522A (en) | 1989-09-22 | 1996-08-13 | Van Gelder; Russell N. | Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex |
US5523231A (en) | 1990-02-13 | 1996-06-04 | Amersham International Plc | Method to isolate macromolecules using magnetically attractable beads which do not specifically bind the macromolecules |
GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
JP3451667B2 (ja) * | 1993-08-24 | 2003-09-29 | 東ソー株式会社 | 核酸抽出及び特定核酸配列の検出方法 |
US5646263A (en) * | 1994-09-19 | 1997-07-08 | Promega Corporation | High efficiency method for isolating target substances using a multisample separation device |
US5705628A (en) | 1994-09-20 | 1998-01-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | DNA purification and isolation using magnetic particles |
DE19530132C2 (de) | 1995-08-16 | 1998-07-16 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien |
US5804684A (en) | 1995-08-24 | 1998-09-08 | The Theobald Smith Research Institute, Inc. | Method for isolating nucleic acids |
US5753477A (en) | 1996-03-19 | 1998-05-19 | University Technology Corporation | Magneto-biolistic methods |
US6027945A (en) | 1997-01-21 | 2000-02-22 | Promega Corporation | Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles |
US6231982B1 (en) * | 1997-12-10 | 2001-05-15 | Dade Behring Inc. | Particle reagents having reduced matrix effects and containing an aldehyde-reactive functional group |
US6534262B1 (en) | 1998-05-14 | 2003-03-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids |
US6664379B1 (en) | 1999-09-24 | 2003-12-16 | Ambion, Inc. | Nuclease inhibitor cocktail |
US7264932B2 (en) | 1999-09-24 | 2007-09-04 | Applera Corporation | Nuclease inhibitor cocktail |
FR2804117B1 (fr) | 2000-01-21 | 2004-08-20 | Bio Merieux | Procede d'isolement de proteines et/ou d'acides nucleiques, complexes de particules et de proteines et/ou d'acides nucleiques, reactif et applications |
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US20030092029A1 (en) | 2001-06-06 | 2003-05-15 | Lee Josephson | Magneitc-nanoparticle conjugates and methods of use |
US6902657B2 (en) | 2001-06-15 | 2005-06-07 | Amersham Biosciences Corp. | Electrophoresis separation media and methods |
WO2003006676A2 (en) * | 2001-07-13 | 2003-01-23 | Nanosphere, Inc. | Method for immobilizing molecules onto surfaces |
EP1421382B1 (en) * | 2001-08-31 | 2012-08-15 | Imego Ab | Methdo and arrangement for analyzing substances |
EP2258845B1 (en) * | 2001-11-06 | 2017-08-23 | Promega Corporation | Isolation and purification of nucleic acids |
JP2003339379A (ja) | 2002-05-24 | 2003-12-02 | Tosoh Corp | 核酸分離方法 |
AU2004220626B2 (en) | 2003-02-05 | 2010-07-29 | Iquum Inc. | Sample processing tubule |
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