CN109477099A - 用二价阳离子分离核酸和用阳离子螯合剂洗脱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离核酸的改进方法。特别地，所述方法包括在洗脱所述核酸之前使用包括二价阳离子的洗涤缓冲液。

Description

用二价阳离子分离核酸和用阳离子螯合剂洗脱的方法

本发明涉及分离核酸的改进方法。特别地，所述方法包括在洗脱所述核酸之前使用包括二价阳离子的洗涤缓冲液。

自从在临床和分子生物学实验室实践中建立核酸分析技术以来，与核酸纯化相关的方法已经经历了快速的技术发展。尤其是，非常关注提高核酸产率和纯度，同时还使过程流线型化和/或使其适用于自动化(例如使用液体处理系统)。

通常使用核酸分离的固相提取方法。在此类方法中，将样本中的核酸吸附到固体表面，洗涤以去除杂质，并且然后在溶液中从固相洗脱。利用这个原理的方法的最早实例之一在Gillespie和Vogelstein，1979(《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，76:615-619)中进行了描述，并且使用了硅质材料如细碎玻璃来吸附核酸和含有基本上离液的盐的缓冲溶液。类似地，Boom等人，1999(《临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)》，37:615-619)也描述了一种利用硅质基质和离液缓冲系统从复杂的生物样本如脑脊髓液和尿液中吸附和分离DNA的方法。此类核酸分离方法的一个缺点是核酸仅在结合缓冲液所提供的离液条件下保持吸附到固体表面。另外，保持与分离的核酸缔合的离液剂可能干扰敏感的下游应用(例如，酶促反应、核酸分析等)。

通常使用含有显著比例的与水混溶的有机溶剂(按体积计，通常>50％)的洗涤溶液从核酸和固体表面去除离液盐。然而，这些有机溶剂也可以以与其要去除的离液剂类似的方式抑制敏感的下游过程。因此，在洗脱吸附的核酸之前，必须去除有机溶剂以便最小化抑制下游过程的可能性，但是这样做会大大减慢过程并增加过程的复杂性。

基于使用非离液盐的方法描述于DE 19856064和US 2001041332中。在这些方法中，所谓的亲液盐(kosmotropic salt)用于促进核酸与硅酸盐表面结合，但是仍然存在与从系统中去除有机溶剂相关的不便。

相比之下，WO 9609379描述了承载带负电荷的羧基的磁性微粒和具有高比例聚乙二醇(即，非离液盐)的缓冲系统用于分离DNA的用途。与基于离液剂和亲液剂的方法一样，需要在洗涤缓冲液中使用有机溶剂以去除结合缓冲液中不需要的组分。WO 02066993中描述了类似的方法，其中具有磁性的纤维素衍生物与含聚乙二醇的缓冲剂结合使用以将核酸吸附到固体表面。

EP 0512767中描述了硅酸盐材料结合含有有机溶剂的缓冲系统使用，并且在这些系统中，组分的极性比在方法中起关键作用。同样，有机溶剂存在于洗涤缓冲液中，并且必须在洗脱吸附的核酸之前通过蒸发去除，否则可能会损害随后对纯化的核酸的分析/使用。

WO 0248164中描述了一种基本上不同类型的方法，所述方法使用所谓的电荷切换机制(例如，来自英杰公司(Invitrogen)的)。在这个方法中，使用离子交换系统将核酸与具有弱酸性pH的水性缓冲系统中的带正电荷的表面结合。在使用弱碱性条件洗脱结合的核酸之前，保持弱酸性pH并且然后从系统洗涤污染物。通过将净电荷为正电荷或中性的离子交换活性基团(例如，脂族或杂环氨基)引入系统，此类方法成为可能，这取决于培养基的pH。由于带负电荷的核酸与颗粒的带正电荷的表面的相互作用，核酸与固体表面发生结合。

基于离子交换的系统的一个问题是，因为核酸的分离仅基于电荷，所以具有净负电荷的任何其它大分子(在方法所使用的条件下)也可能与核酸一起被纯化。潜在的污染物包含蛋白质和多糖。另外，离子交换相互作用对高离子强度和结合缓冲液中去污剂的存在非常敏感，并且因此需要非常准确地设定结合条件。除了pH之外，需要仔细考虑如盐浓度等因素并且尤其是阳离子去污剂的量。这些考虑可能导致对用于消化初始样本材料的裂解条件的设计的妥协成问题。

WO 2010018200 A1和DE 102007009347 B4描述了使用低聚胺以保持核酸吸附到带有弱有机酸基团的表面。这些低聚胺相对昂贵，并且即使以非常低的浓度使用也具有毒性。令人惊奇的是，发现使用二价阳离子代替低聚胺特别是碱土金属的二价阳离子可以以相同的效率保持核酸吸附到带有弱有机酸的结合表面。本领域已知镁离子与核酸相互作用并促进那些分子稳定化。确实，镁离子是许多基于核酸的应用(例如，聚合酶链反应(PCR))中的重要辅助因子。相比之下，钙离子虽然是与镁在同一组中的二价阳离子但在其与核酸的相互作用方面表现不同。事实上，钙离子已被示出为核酸相关过程如PCR的抑制剂(Schrader等人(2012)《应用微生物学(J.Appl.Microbiol.)》，113:1014-1026)。因此，钙离子驱动核酸与带有弱有机酸基团的表面结合的能力令人惊讶。此外，还发现，使用螯合剂络合二价阳离子(如钙离子)和/或将结合表面的pH增加到碱性条件可以破坏核酸与结合表面之间的相互作用，从而将核酸释放回用于洗脱的液相。在本领域已知的方法中，核酸的洗脱通常由加水或极弱碱性溶液介导。

在第一方面，本发明提供了分离核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包括核酸的结合混合物；

(b)使所述结合混合物与极性固体支持物相接触，使得核酸吸附到所述固体支持物的表面；

(c)去除未结合的结合混合物；

(d)用洗涤缓冲液来洗涤所述固体支持物；

(e)添加洗脱缓冲液并从所述固体支持物中去除核酸。

“分离核酸”包含从给定样本中基本上纯化核酸的含义。从中可以纯化核酸的样本包含但不限于：真核和原核细胞；临床样本，如组织样本或血液样本；实验室反应混合物，如PCR或限制性消化反应；法医样本，包含从犯罪现场获得的那些(例如，物理证据、血液、唾液等)；土壤样本；以及植物材料，如叶子、种子或根。

“结合混合物”包含包括含有核酸和结合缓冲液的样本的溶液的含义。

“结合缓冲液”包含具有产生促进核酸吸附到固体支持物的条件的组合物的缓冲溶液的含义。

“洗脱缓冲液”包含用于从固体支持物释放吸附的核酸的缓冲溶液的含义。

在优选的实施例中，洗涤缓冲液包括水溶液中的二价阳离子。在其它实施例中，所述二价阳离子来自周期表第II组的碱土金属。在进一步的实施例中，所述二价阳离子采取其氯化物形式。在优选的实施例中，所述二价阳离子是钙离子或钡离子。在更优选的实施例中，所述二价阳离子是钙离子。

在其它实施例中，所述洗涤缓冲液是纯水中的水溶液或水性缓冲溶液。在进一步的实施例中，所述水性缓冲溶液的pH值在pH 4.0与pH 7.0之间。在优选的实施例中，所述水性缓冲液的pH值在pH 6.0与pH 6.5之间。

适合用于本发明的方法的水性缓冲溶液是本领域技术人员公知的并且包含例如三(2-氨基-2-(羟甲基)-丙-1,3-二醇)和双-三(双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷)的溶液。

在优选的实施例中，所述洗涤缓冲液包括浓度在以下之间的二价阳离子：0.1mM与10mM、0.1mM与9mM、0.1mM与8mM、0.1mM与7mM、0.1mM与6mM、0.1mM与5mM、0.2mM与4.5mM、0.3mM与4mM、0.4mM与3.5mM、0.5mM与3mM、0.6mM与2.5mM、0.7mM与2mM、0.8mM与1.5mM或0.9mM与1mM。在更优选的实施例中，所述洗涤缓冲液包含浓度在1mM与5mM之间的二价阳离子。

在一些实施例中，所述核心通过络合二价阳离子而从所述固体支持物的表面去除。

“络合”包含使原子或分子与另一个原子或分子形成缔合即通过形成络合物的含义。

在进一步的实施例中，所述洗脱缓冲液包括螯合剂。

“螯合剂”包含其分子可以与单个金属离子形成若干键的物质的含义。

在一些实施例中，所述螯合剂络合所述洗涤缓冲液中提供的所述二价阳离子，从而促进所述核酸从所述固体支持物的表面释放。

在一些实施例中，所述螯合剂选自EGTA、EDTA、EDDS、MGDA、IDS、聚天冬氨酸、GLDA、BAPTA和柠檬酸。在优选的实施例中，所述螯合剂是EGTA。

在优选的实施例中，所述洗脱缓冲液包括浓度在以下之间的螯合剂：0.1mM与5mM、0.1mM与4.5mM、0.1mM与4mM、0.1mM与3.5mM、0.1mM与3mM、0.1mM与2.5mM、0.1mM与2mM、0.1mM与1.5mM、0.1mM与1mM、0.2mM与0.9mM、0.3mM与0.8mM、0.4mM与0.7mM、0.5mM与0.6mM，优选浓度在0.1mM与1mM之间。

在一些实施例中，包括螯合剂的所述洗脱缓冲液的pH值在以下之间：pH7.0与pH10.0、pH 7.0pH 9.5、pH 7.0pH 9.0、pH 7.0pH 8.5、pH 7.0pH 8.0、pH 7.0pH 7.5。在优选的实施例中，包含螯合剂的所述洗脱缓冲液的pH值在pH 7.0与pH 9.0之间。

在其它实施例中，所述核酸通过将所述固体支持物的pH升高到碱性条件而从所述固体支持物的表面去除。

“碱性条件”包含pH值大于pH 7.0的任何条件的含义。

在一些实施例中，所述洗脱缓冲液的pH值在pH 7.1与pH 10.0之间。在优选的实施例中，所述洗脱缓冲液的pH值在pH 8.0与pH 10.0之间。在最优选的实施例中，所述洗脱缓冲液的pH值在pH 9.0与pH 10.0之间。

本文所公开的洗脱缓冲液的pH可以通过另外的缓冲物质来支持。适合用于本发明的方法的另外的缓冲物质是本领域技术人员公知的并且包含例如Tris、氨甲基丙醇(AMP)和柠檬酸盐。

在一些实施例中，所述核酸通过以下而从所述固体支持物的表面去除：如上所述络合二价阳离子和/或将所述固体支持物的pH升高到如上所述碱性条件并且升高所述固体支持物的温度。在一些实施例中，所述固体支持物的温度升高到至少30℃。在一些实施例中，所述固体支持物的温度升高到以下之间：30℃与75℃、35℃与70℃、40℃与65℃、45℃与60℃、40℃与50℃或45℃与55℃。在优选的实施例中，所述固体支持物的温度升高到30℃与75℃之间。

在一些实施例中，所述固体支持物的表面结合二价阳离子。在优选的实施例中，二价阳离子与所述固体支持物的表面的所述结合导致核酸吸附到所述固体支持物的表面。

在一些实施例中，所述固体支持物的表面包括弱有机酸。

“弱有机酸”包含具有酸性的有机化合物的含义。弱有机酸的非限制性实例包含甲酸、苹果酸、马来酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、草酸、乳酸、柠檬酸和苯甲酸。

在进一步的实施例中，所述弱有机酸选自由膦酸、脂族羧酸和芳族羧酸组成的列表。

在优选的实施例中，所述弱有机酸是均聚物或杂聚物。

“均聚物”意指包括单一种类单体的聚合物。

“杂聚物”意指包括两种或更多种不同种类单体的聚合物。

在进一步的实施例中，所述弱有机酸聚合物选自由以下组成的列表：聚丙烯酸、聚膦酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、丙烯酸和甲基丙烯酸的杂聚物、甲基丙烯酸和马来酸的杂聚物、以及丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸的杂聚物。

在其它实施例中，所述结合混合物包括结合缓冲液。在进一步的实施例中，所述结合缓冲液包括可与水混溶的有机溶剂和/或离液剂和/或去污剂。

“可与水混溶的有机溶剂”包括能够溶解溶质并且能够与水形成均匀混合物的有机物质的含义。可与水混溶的有机溶剂的非限制性实例包含乙醇、甲醇、1-丙醇、丙-2-醇、丙酮、乙腈、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、2-丁氧基乙醇、二甲基甲酰胺、二甲氧基乙烷、二甲基亚砜、1,4-二恶烷、乙二醇、糠醇、甘油、1,3-丙二醇、1,5-戊二醇、丙酸、丙二醇、吡啶、四氢呋喃和三甘醇。

“离液剂”意指水溶液中可以破坏水分子之间的氢结合网络的物质。离液剂的非限制性实例包含盐酸胍、尿素、硫脲、高氯酸锂和乙酸锂。

“去污剂”包含离子或非离子表面活性剂或者不被硬水灭活并且具有润湿剂和/或乳化剂性质的表面活性剂的混合物的含义。

在一些实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比为至少5％。在优选的实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比在5％与50％之间。在优选的实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比在10％与50％之间。在更优选的实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比在20％与50％之间。在进一步优选的实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比在30％与50％之间。在最优选的实施例中，所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比在40％与50％之间。

在其它实施例中，所述结合缓冲液中离液剂的浓度为至少0.5M。在优选的实施例中，所述结合缓冲液中离液剂的浓度在以下之间：0.5M与3M、0.5M与2.75M、0.5M与2.5M、0.5M与2.25M、0.5M与2M、0.5M与1.75M、0.5M与1.5M、0.5M与1.25M、0.5M与1M、0.6M与1.4M、0.7M与1.3M、0.8M与1.2M或0.9M与1.1M。在最优选的实施例中，所述结合缓冲液中离液剂的浓度在0.5M与1.5M之间。

在一些实施例中，所述结合缓冲液中去污剂的体积/体积百分比为至少0.5％。在优选的实施例中，所述结合缓冲液中去污剂的体积/体积百分比在5％与20％之间。在另一个优选的实施例中，所述结合缓冲液中去污剂的体积/体积百分比在7％与15％之间。在最优选的实施例中，所述结合缓冲液中去污剂的体积/体积百分比在8％与12％之间。

在某些实施例中，所述结合缓冲液中的所述有机溶剂是醇。在优选的实施例中，所述醇是低分子量醇。适合用于本发明的方法的低分子量醇是本领域技术人员公知的并且包含例如乙醇、1-丙醇或丙-2-醇。

在某些实施例中，所述结合缓冲液中的所述离液剂是胍盐。优选的胍盐是硫氰酸胍和盐酸胍。在优选的实施例中，所述胍盐是盐酸胍。

在某些实施例中，所述结合缓冲液中的所述去污剂是离子或非离子去污剂。优选的非离子去污剂是基于聚乙二醇(PEG)的去污剂，如例如吐温-20或吐温-80。优选的离子去污剂是包括弱有机酸基团的去污剂，例如月桂酰肌氨酸钠。

在一些实施例中，所述固体支持物包括微粒。在某些实施例中，所述微粒具有超顺磁性。

在其它实施例中，所述微粒的直径为至少1μm。在优选的实施例中，所述微粒的直径在1μm与50μm之间。在最优选的实施例中，所述微粒的直径在1μm与20μm之间。

在进一步的实施例中，所述分离的核酸是DNA、RNA、PNA、GNA、，TNA或LNA。在优选的实施例中，所述分离的核酸是DNA或RNA。

在其它实施例中，所述分离的核酸的长度为至少20个核苷酸。

在某些实施例中，所述核酸是从起始样本中分离的。

“起始样本”包含可以从中获得核酸的任何样本的含义。

在其它实施例中，在分离核酸之前，所述起始样本经受以下中的一种或多种：化学处理、酶处理和/或机械处理。

化学处理的实例包含但不限于用去污剂处理或用细胞壁降解剂处理。

酶处理的实例包含但不限于用蛋白酶处理、用纤维素酶处理或用淀粉酶处理。

机械处理的实例包含但不限于研磨，碾磨、压碎、用超声波处理，或通常对样本施加机械应力。

在一些实施例中，所述起始样本包括实验室污染物。在某些实施例中，所述实验室污染物包括聚合酶链反应(PCR)试剂、限制性内切酶消化试剂、用于修饰和/或加工核酸的体外试剂系统、丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。

在其它实施例中，所述起始样本包含括生物材料。在某些实施例中，所述生物材料包括真核或原核细胞。在进一步的实施例中，所述细胞是动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、古细菌细胞或原生动物细胞。

在一些实施例中，所述生物材料是来自动物的体液或固体生物材料。在某些实施例中，所述来自动物的体液或固体生物材料是血液、血浆、血清、尿液、粪便、唾液、精液、指甲、毛发或组织。

在特定实施例中，所述起始样本是获得的用于法医分析的材料。在进一步的实施例中，所述获得的用于法医分析的材料包括唾液、血液、尿液、粪便、精液、汗液、泪液、毛发、指甲或任何组织。

在其它实施例中，即使促进到所述固体支持物表面的吸附的化学条件不再存在，所述核酸仍吸附到所述固体支持物的表面。

在一些实施例中，所述洗脱缓冲液是水性洗脱缓冲液。优选的水性洗脱缓冲液包括浓度在1mM与50mm之间的三(羟甲基)氨基甲烷。在优选的实施例中，所述水性洗脱缓冲液包括浓度在1mM与20mM之间的三(羟甲基)氨基甲烷。在更优选的实施例中，所述水性洗脱缓冲液包括浓度在5mM与15mM之间的三(羟甲基)氨基甲烷。在最优选的实施例中，所述水性洗脱缓冲液包括浓度为10mM的三(羟甲基)氨基甲烷。

适合用于本发明的方法的其它缓冲物质是在pH 7.0与pH 10.0之间的pH范围内具有缓冲能力的那些缓冲物质。此类缓冲物质是本领域技术人员公知的并且包含例如氨基甲基丙醇(AMP)。

本发明的任何洗脱缓冲液还可以包括防腐剂或螯合剂。

适合用于本发明的方法的防腐剂是本领域技术人员公知的并且包含例如叠氮化钠。在某些实施例中，洗脱缓冲液包括体积/体积浓度为1％或更小的叠氮化钠。

适合用于本发明的方法的螯合剂是本领域技术人员公知的并且包含例如EDTA。在某些实施例中，洗脱缓冲液包含浓度为1mM或更小的EDTA。

在第二方面，本发明提供了一种用于分离核酸的试剂盒，其中所述试剂盒包括：

(a)如本发明第一方面所述的实施例中任一实施例所定义的极性固体支持物；

(b)如本发明第一方面所述的实施例中任一实施例所定义的结合缓冲液；

(c)如本发明第一方面所述的实施例中任一实施例所定义的洗涤缓冲液；以及

(d)使用说明。

在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括：

(e)如本发明第一方面所述的实施例中任一实施例所定义的洗脱缓冲液。

本说明书中列出或讨论明显在先公开的文件不应该一定被视为承认文件是现有技术的一部分或是公知常识。

现在将参考以下非限制性附图和实例更详细地描述本发明。

附图说明

图1：从鲑鱼精子DNA溶液中分离核酸。使用实例1中描述的方法从鲑鱼精子DNA溶液中分离DNA，并通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行解析。

(A)λDNA(8μL中200ng)。

(B)从鲑鱼精子DNA中分离的DNA(实例1：5mM CaCl ₂洗涤)(8μL洗脱物)。

图2：从欧芹的植物叶材料中分离DNA。使用Sbeadex植物DNA大量提取试剂盒(Sbeadex Maxi Plant DNA extraction kit)(LGC基因组学股份有限公司(LGC GenomicsGmbH)，货号(Cat.No.)41602/41620)或实例2到4中描述的方法从欧芹的植物叶材料中分离DNA。

(A)λDNA(8μL中200μl)。

(B)从欧芹叶从分离的DNA(Sbeadex植物大量试剂盒(Sbeadex Maxi Plant Kit))(8μL洗脱物)。

(C)从欧芹叶中分离的DNA(实例2：5mM CaCl ₂洗涤)(8μL洗脱物)。

(D)从欧芹叶中分离的DNA(实例3：1mM CaCl ₂洗涤)(8μL洗脱物)。

(E)从欧芹叶中分离的DNA(实例4：0.1mM CaCl ₂洗涤)(8μL洗脱物)。

图3：从大豆的植物叶材料中分离DNA。使用实例5中描述的方法从大豆的植物材料中分离DNA。泳道R1到R8中的每一个代表重复DNA分离实验(每孔8μL洗脱物)。

图4：从向日葵的植物叶材料中分离DNA。使用实例6中描述的方法从向日葵的植物材料中分离DNA。泳道R1到R8中的每一个代表重复DNA分离实验(每孔8μL洗脱物)。

实例1

这个实例涉及从鲑鱼精子DNA溶液中分离核酸。

将可商购的鲑鱼精子DNA(西格玛公司(Sigma)，货号31149)以500ng/μL的最终浓度溶解在含有1％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、50mM TrisHCl(pH8)、2mM EDTA和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的缓冲液中。将200μL所述DNA溶液的等分试样与400μL结合缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合，如可在例如Sbeadex植物DNA大量提取试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)中得到的。将所得混合物在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀地悬浮在整个溶液中。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬浮于含有5mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH 8.0)的400μL洗涤缓冲液中，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

然后通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA并记录以下读数：

A<sub>260/280</sub>比	A<sub>260/230</sub>比	DNA浓度(ng/μL)
			2.0	3.6	17.0

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳和已知量的λDNA来解析8μL纯化DNA样本，并用溴化乙锭进行染色(图1)。

实例2

这个实例涉及从欧芹的植物叶材料中分离DNA。

将8g新鲜欧芹叶的样本在40mL裂解缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)中研磨，如可在例如Sbeadex植物大量试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)中得到的，并根据这个试剂盒的方案在60℃下孵育30分钟。

孵育后，将200μL裂解物与400μL结合缓冲液PN混合(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬于含有5mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH 8.0)的400μL洗涤缓冲液中，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

一式两份地进行DNA分离实验，并且通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA(参见下表1)。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来解析分离的DNA的每种洗脱物的8μL样本(图2，泳道B)。作为比较，使用Sbeadex植物DNA大量提取试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)从同一起始样本中分离DNA(图2，泳道A)。

实例3

这个实例涉及从欧芹的植物叶材料中分离DNA。

将8g新鲜欧芹叶的样本在40mL裂解缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)中研磨，如可在例如Sbeadex植物大量试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)中得到的，并根据这个试剂盒的方案在60℃下孵育30分钟。

孵育后，将200μL裂解物与400μL结合缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀地悬浮在整个溶液中。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬于含有1mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH 8.0)的400μL洗涤缓冲液中，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

一式两份地进行DNA分离实验，并且通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA(参见下表1)。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来解析分离的DNA的每种洗脱物的8μL样本(图2，泳道C)。作为比较，使用Sbeadex植物DNA大量提取试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)从同一起始样本中分离DNA(图2，泳道A)。

实例4

这个实例涉及从欧芹的植物叶材料中分离DNA。

将8g新鲜欧芹叶的样本在40mL裂解缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)中研磨，如可在例如Sbeadex植物大量试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)中得到的，并根据这个试剂盒的方案在60℃下孵育30分钟。

孵育后，将200μL裂解物与400μL结合缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀地悬浮在整个溶液中。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬于含有0.1mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH 8.0)的400μL洗涤缓冲液中，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

一式两份地进行DNA分离实验，并且通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA(表1)。

表1.用含Ca²⁺的缓冲液洗涤后的洗脱物DNA浓度。

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来解析分离的DNA的每种洗脱物的8μL样本(图2，泳道D)。作为比较，使用Sbeadex植物DNA大量提取试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)从同一起始样本中分离DNA(图2，泳道A)。

实例5

这个实例涉及从大豆的植物叶材料中分离DNA。

从干燥的大豆叶材料中取出四拳(直径为6mm)，并使用球磨仪(Genogrinder)在400μL裂解缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)中以每秒1,750次研磨1分钟。根据Sbeadex植物大量试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)的方案，将所得样本在60℃下孵育30分钟。

孵育后，将200μL裂解物与400μL结合缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀地悬浮在整个溶液中。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬于含有0.1mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH 8.0)的400μL洗涤缓冲液中，并在室温下以100rpm摇动5分钟，从而保持Sbeadex珠均匀悬浮在整个溶液中。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

重复DNA分离实验共八次，并且通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA(表2)。

表2.DNA分离(重复8次)后的洗脱物DNA浓度

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来解析分离的DNA的每种洗脱物的8μL样本(图3)。

实例6

这个实例涉及从向日葵的植物叶材料中分离DNA。

从干燥的向日葵叶材料中取出四拳(直径为6mm)，并使用球磨仪(Genogrinder)在400μL裂解缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)中以每秒1,750次研磨1次分钟。根据Sbeadex植物大量试剂盒(LGC基因组学股份有限公司，货号41602/41620)的方案，将所得样本在60℃下孵育30分钟。

孵育后，将200μL裂解物与400μL结合缓冲液PN(2.25M盐酸胍、15％吐温-20、50％1-丙醇)和10μL标准Sbeadex珠溶液混合并摇动5分钟。摇动后，通过施加永磁体来去除Sbeadex珠，并且去除上清液。

将Sbeadex珠重悬于400μL洗涤缓冲液PN1(1.5M盐酸胍、10％吐温-20、20％1-丙醇)中并摇动5分钟。通过施加永磁体来收集Sbeadex珠，并且去除上清液。然后将Sbeadex珠重悬于含有0.1mM氯化钙:10mM TrisHCl(pH8.0)的400μL洗涤缓冲液中并摇动5分钟。如前所述，通过施加永磁体来收集Sbeadex珠。

通过加入含有40mM 2-氨基甲基丙醇-2(pH 10.0)和0.1mM乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)的100μL洗脱缓冲液来洗脱与Sbeadex珠结合的DNA。在50℃下进行洗脱，偶尔摇动试管以使Sbeadex珠保持悬浮。

重复DNA分离实验共八次，并且通过UV分光光度法来测量洗脱的DNA(表3)。

表3.DNA分离(重复8次)后的洗脱物DNA浓度

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳来解析分离的DNA的每种洗脱物的8μL样本(图4)。

Claims (56)

1.一种分离核酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)提供包括核酸的结合混合物；

(b)使所述结合混合物与极性固体支持物相接触，使得核酸吸附到所述固体支持物的表面；

(c)去除未结合的结合混合物；

(d)用洗涤缓冲液来洗涤所述固体支持物；以及

(e)添加洗脱缓冲液并从所述固体支持物中去除核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包括水溶液中的二价阳离子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述二价阳离子是来自周期表第II组的碱土金属。

4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述二价阳离子采取其氯化物形式。

5.根据权利要求2到4中任一权利要求所述的方法，其中所述二价阳离子是钙离子或钡离子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述二价阳离子是钙离子。

7.根据权利要求2到6中任一权利要求所述的方法，其中所述二价阳离子的浓度在0.1mM与10mM之间，优选在1mM到5mM之间。

8.根据权利要求2到7中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸通过络合二价阳离子而从所述固体支持物的表面去除。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括螯合剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述螯合剂络合所述洗涤缓冲液中提供的所述二价阳离子，从而促进所述核酸从所述固体支持物的表面去除。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述螯合剂是EGTA、EDTA、EDDS、MGDA、IDS、聚天冬氨酸或GLDA，优选EGTA。

12.根据权利要求8到11中任一权利要求所述的方法，其中所述螯合剂的浓度在0.1mM与5mM之间，优选浓度在0.1mM与1mM之间。

13.根据权利要求8到12中任一权利要求所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值在pH7.0与pH 10.0之间，优选pH值在pH 7.0与pH 9.0之间。

14.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸通过将所述固体支持物的pH升高到碱性条件而从所述固体支持物的表面去除。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述洗脱缓冲液的pH值在pH 7.1与pH 10.0之间，优选在pH 8.0与pH 10.0之间，更优选在pH 9.0与pH 10.0之间。

16.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述核酸通过以下从所述固体支持物的表面去除：升高所述固体支持物的温度并且络合如权利要求8到13中任一权利要求所定义的二价阳离子和/或将所述固体支持物的pH升高到如权利要求14或权利要求15所定义的碱性条件。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述温度升高到至少30℃，优选其中所述温度升高到30℃与75℃之间。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体支持物的表面结合二价阳离子。

19.根据权利要求18所述的方法，其中二价阳离子与所述固体支持物的表面的所述结合导致核酸吸附到所述固体支持物的表面。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体支持物的表面包括弱有机酸。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述弱有机酸是均聚物或杂聚物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述弱有机酸聚合物选自由以下组成的列表：聚丙烯酸、聚膦酸、聚甲基丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸的杂聚物、以及丙烯酸、甲基丙烯酸和马来酸的杂聚物。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述弱有机酸是选自由膦酸、脂族羧酸和芳族羧酸组成的列表。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合混合物包括结合缓冲液。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述结合缓冲液包括可与水混溶的有机溶剂和/或离液剂和/或去污剂。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述结合缓冲液包括以下中的至少两种：可与水混溶的有机溶剂；离液剂；以及去污剂。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述结合缓冲液中有机溶剂的体积/体积百分比为至少5％，优选在5％与50％之间，更优选在20％与50％之间，还更优选在30％与50％之间，最优选在40％与50％之间。

28.根据权利要求25到27中任一权利要求所述的方法，其中所述结合缓冲液中离液剂的浓度为至少0.5M，优选在0.5M与3M之间，更优选在0.5M与1.5M之间。

29.根据权利要求25到28中任一权利要求所述的方法，其中所述结合缓冲液中去污剂的体积/体积百分比为至少0.5％，优选在5％与20％之间，更优选在7％与15％之间，最优选在8％与12％之间。

30.根据权利要求25到29中任一权利要求所述的方法，其中所述有机溶剂是醇，优选低分子量醇，更优选乙醇、1-丙醇或丙-2-醇。

31.根据权利要求25到30中任一权利要求所述的方法，其中所述离液剂是胍盐，优选硫氰酸胍或胍，盐酸盐，更优选盐酸胍。

32.根据权利要求25到31中任一权利要求所述的方法，其中所述去污剂是离子去污剂或非离子去污剂。

33.根据权利要求25到32中任一权利要求所述的方法，其中所述离子去污剂是基于聚乙二醇(PEG)的去污剂。

34.根据权利要求25到33中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂包括弱有机酸基团。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述固体支持物包括微粒。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述微粒具有超顺磁性。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述微粒的直径为至少1μm，优选在1μm与50μm之间，更优选在1μm与20μm之间。

38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的核酸是DNA、RNA、PNA、GNA、TNA或LNA，优选DNA或RNA。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的核酸的长度为至少20个核苷酸。

40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是从起始样本中分离的。

41.根据权利要求40所述的方法，其中在所述核酸的分离之前，使用以下中的一种或多种对所述起始样本进行处理：化学处理、酶处理和/或机械处理。

42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述起始样本包括实验室污染物。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述实验室污染物包括聚合酶链式反应(PCR)试剂、限制性内切酶消化试剂、用于修饰和/或加工核酸的体外试剂系统、丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。

44.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述起始样本包括生物材料。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述生物材料包括真核或原核细胞。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞是动物细胞、植物细胞、真菌细胞、细菌细胞、古细菌细胞或原生动物细胞。

47.根据权利要求44到46中任一权利要求所述的方法，其中所述生物材料是来自动物的体液或固体生物材料。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述体液或固体生物材料选自：血液、血浆、血清、尿、粪便、唾液、精液、指甲、毛发或组织。

49.根据权利要求40所述的方法，其中所述起始样本是获得的用于法医分析的材料。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述材料包括唾液、血液、尿液、粪便、精液、汗液、泪液、毛发、指甲或任何组织。

51.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中在去除之前，即使促进到所述固体支持物的表面的吸附的化学条件不再存在，所述核酸仍吸附到所述固体支持物的表面。

52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液是水性洗脱缓冲液。

53.根据权利要求53所述的方法，其中所述缓冲液包括三(羟甲基)氨基甲烷。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述三(羟甲基)氨基甲烷的浓度在1mM与50mM之间，优选在1mM与20mM之间，最优选在5mM与15mM之间。

55.一种试剂盒，其包括：

(a)如权利要求1和35到37中任一权利要求所定义的极性固体支持物；

(b)如权利要求1和24到34中任一权利要求所定义的结合缓冲液；

(c)如权利要求1到7中任一权利要求所定义的洗涤缓冲液；以及

(d)使用说明。

56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括：

(f)如权利要求1、8到16和52到54中任一权利要求所定义的洗脱缓冲液。