CN115058491A - 一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，包括结合、清洗以及洗脱过程获取纯化的引物溶液，于所述结合过程中，置引物粗品液于缓冲液系统中，所述缓冲液系统中包括磁珠悬液、结合液A以及结合液B；所述磁珠悬液浓度为50‑200mg/mL，结合液A为5‑50mmol/L柠檬酸、10‑50mmol/L柠檬酸钠和1‑5mol/L氯化钠的混合物，结合液B为无水乙醇或异丙醇中的任意一种。本发明通过使用优质的磁性微球，结合优化的缓冲液系统，可与市面上任意的核酸提取仪进行匹配，实现了寡核苷酸引物脱盐纯化阶段的自动化操作，节省了大量的人力成本。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取领域，尤其涉及一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法。
背景技术
引物是人工合成的寡核苷酸序列，目前已被广泛用于聚合酶链反应、测序和基因合成等。引物的合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法，然后通过氨水高温处理，将连接在CPG上的引物切下来，经过一系列的纯化反应后方可用于后续试验。目前常用的引物纯化方式有RPC、PAGE、HPLC等，其中无论哪种纯化方式均需要对引物粗品液进行直接或间接的脱盐处理，当前常用的脱盐处理方法是使用脱盐柱处理，包括C18脱盐柱、RPC脱盐柱、OPC纯化柱等。脱盐柱的使用方法一般先将脱盐柱活化及平衡，然后将寡核苷酸引物粗品液加入脱盐柱中过柱，先用TEAA溶液洗柱2次，再用去离子水洗柱2次，最后进行洗脱收集。该类方法需要多步加样及过柱操作。
使用脱盐柱进行引物脱盐处理，该方法全程需人工操作，十分繁琐，无法实现自动化，对于公司企业的规模化操作来说，急需一种高效快速的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，于采用磁珠法的基础上结合优化的缓冲液系统。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，包括结合、清洗以及洗脱过程获取纯化的引物溶液，于所述结合过程中，置引物粗品液于缓冲液系统中，所述缓冲液系统中包括磁珠悬液、结合液A以及结合液B；所述磁珠悬液浓度为50-200mg/mL，结合液A为5-50mmol/L柠檬酸、10-50mmol/L柠檬酸钠和1-5mol/L氯化钠的混合物，结合液B为无水乙醇或异丙醇中的任意一种；
结合液A、结合液B与引物粗品液的体积比为80-200:200-600:300；优选地，结合液A、结合液B与引物粗品液的体积比为80:500:300。
进一步地，所述磁珠悬液为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm；所述结合液A为20mmol/L柠檬酸、30 mmol/L柠檬酸钠和4mol/L氯化钠的混合物，pH 4.5。
进一步地，所述清洗液为5-50mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1-5mmol/L乙二胺四乙酸以及60-80%乙醇的混合物，其pH为6.0-8.0。
进一步地，所述洗脱液为超纯水或灭菌水中的任意一种。
进一步地，所述结合过程具体如下：200-400μL引物粗品液样本中，加入10-30μL磁珠悬液、50-500μL结合液A和200-600μL结合液B，室温震荡混匀5min，磁性分离后弃去上清液。
进一步地，所述清洗过程具体如下：向寡核苷酸与磁性微球复合物中加入500-1000μL清洗液，震荡混匀1min，磁性分离后弃去上清液，并重复上述过程清洗1次以去除盐离子杂质。
进一步地，所述洗脱过程具体如下：向清洗后的寡核苷酸与磁性微球复合物中加入200-500μL洗脱液，室温震荡混匀5min，磁性分离后，将洗脱液转移至一干净离心管中，即为纯化后的引物溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：通过使用优质的磁性微球，结合优化的缓冲液系统，可与市面上任意的核酸提取仪进行匹配，实现了寡核苷酸引物脱盐纯化阶段的自动化操作，节省了大量的人力成本。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，包括如下步骤：
S1、引物粗品液中的寡核苷酸与磁性微球结合；
S2、寡核苷酸与磁性微球复合物的清洗，去除各种盐离子等杂质；
S3、寡核苷酸与磁性微球复合物的洗脱，得到高纯度的寡核苷酸片段。
在一些实施例中，S1的结合步骤包括：200-400μL引物粗品液样本中，加入10-30μL磁珠悬液、50-500μL结合液A和200-600μL结合液B，室温震荡混匀5min，磁性分离后弃去上清液。
磁珠悬液为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm，浓度为50-200mg/mL。结合液A为5-50mmol/L柠檬酸、10-50mmol/L柠檬酸钠和1-5mol/L氯化钠的混合物，pH为4.0-5.0。结合液B为无水乙醇或异丙醇中的一种。
柠檬酸的浓度可以为5mmol/L、15mmol/L、25mmol/L、35mmol/L、45mmol/L；柠檬酸钠的浓度可以为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L；氯化钠的浓度可以为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L；结合液A的pH可以为4.0、4.5、5.0。
本发明于结合液A中添加了高浓度的氯化钠溶液，与较传统的乙酸钠系统相比，提高了磁珠与目的核酸分子的结合效率，通过向溶液中加入高浓度的氯化钠，可使核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩转变为球状构象，其上的负电荷也大部分被屏蔽掉，从而促使核酸分子吸附到磁珠上。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液最佳缓冲pH较乙酸钠缓冲液pH低，而低pH条件下，磁珠可以特异性的结合DNA，从而将其与其它杂质分离开来，同时，柠檬酸钠可螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子，从而抑制Dnase酶活性，所以常用做核酸酶的抑制剂，以保护DNA不被变性或降解。
结合液A、结合液B与待纯化样本的体积比为80-200:200-600:300；优选地，结合液A、结合液B与待纯化样本的体积比为80:500:300。
在一些实施例中，S2的清洗包括：向寡核苷酸与磁性微球复合物中加入500-1000μL清洗液，震荡混匀1min，磁性分离后弃去上清液。重复清洗1次。
清洗液5-50mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1-5mmol/L乙二胺四乙酸，60-80%乙醇，pH6.0-8.0。
在一些实施例中，S3的洗脱包括：向清洗后的寡核苷酸与磁性微球复合物中加入200-500μL洗脱液，室温震荡混匀5min，磁性分离后，将洗脱液转移至一干净离心管中，即为纯化后的引物溶液。
洗脱液为超纯水或灭菌水中的任意一种。
以下结合实施例对于本发明中所请求保护的一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法的技术效果作具体说明。
实施例1 结合液A中柠檬酸及柠檬酸钠的浓度优化
于本发明中，结合液A为5-50mmol/L柠檬酸、10-50mmol/L柠檬酸钠和1-5mol/L氯化钠的混合物，为优化其中柠檬酸及柠檬酸钠的浓度配比，固定氯化钠的浓度为3mol/L，柠檬酸的浓度分别为20mmol/L和40mmol/L，柠檬酸钠的浓度分别为10mmol/L、30mmol/L和50mmol/L。本实施例选取300μL引物粗品液，加入20μL磁珠悬液、80μL结合液A和300μL结合液B，并参照上述具体实施方式进行系列纯化步骤。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表1所示。
表1 结合液A中柠檬酸及柠檬酸钠的浓度优化结果
依据表1结果可发现，结合液A中不同浓度的柠檬酸与柠檬酸钠试剂配比，最终引物样本的回收率相差并不明显，但其中相对较好的配比为20mmol/L柠檬酸和30 mmol/L柠檬酸钠，因此选择该浓度进行后续的优化。
实施例2 结合液A中氯化钠的浓度优化及溶液pH优化
于上述实施例中，结合液A中柠檬酸及柠檬酸钠的浓度分别选择20mmol/L和30mmol/L，本实施例优化其中氯化钠的浓度配比及溶液pH，氯化钠的浓度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L和5mol/L，溶液pH设置有4.0、4.5和5.0，并参照上述具体实施方式进行系列纯化步骤。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表2所示。
表2 结合液A中氯化钠的浓度优化结果
依据表2结果可发现，结合液A中氯化钠的浓度并非越高越好，当氯化钠浓度为4mol/L时回收率相对最好，同时，不同pH比较发现pH为4.5时回收率相对较高。因此选择4mol/L氯化钠，pH 4.5进行后续试剂优化。
实施例3 结合液B的优化
于本发明中，结合液B为无水乙醇或异丙醇中的任意一种，因此本实施例优化了结合液B的成分，分别选择无水乙醇和异丙醇，并参照上述具体实施方式进行系列纯化步骤。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表3所示。
表3 结合液B的成分优化结果
依据表3结果可发现，结合液B为异丙醇时回收率相对最好，因此选择该浓度进行后续的试剂用量优化。
实施例4 结合液A用量优化
本发明提出了一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，于所述结合过程中，置引物粗品液于缓冲液系统中，所述缓冲液系统中包括结合液A和结合液B；所述优选地结合液A为20mmol/L柠檬酸、30 mmol/L柠檬酸钠和4mol/L氯化钠的混合物，pH 4.5，结合液B为异丙醇；结合液A、结合液B与待纯化样本的体积比为(80-200):(200-600):300，优化其中结合液A与结合液B、待纯化样本的比例，具体用量如下：取300μL引物粗品液，加入20μL磁珠悬液和300μL结合液B，结合液A用量分别为80μL、120μL、160μL、200μL，各纯化步骤采用上述步骤。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表4所示。
表4 结合液A用量优化结果
依据表4结果可发现，当结合液A用量为80μL时，样品回收率相对最高，并未随着用量的增加而提高回收率，因此后续选择80μL的结合液A用量。
实施例5 结合液B用量优化
本发明提出了一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，于所述结合过程中，置引物粗品液于缓冲液系统中，所述缓冲液系统中包括结合液A和结合液B；所述优选地结合液A为20mmol/L柠檬酸、30 mmol/L柠檬酸钠和4mol/L氯化钠的混合物，pH 4.5，结合液B为异丙醇；结合液A、结合液B与待纯化样本的体积比为(80-200):(200-600):300，优化其中结合液A、结合液B与待纯化样本的比例，具体用量如下：取300μL引物粗品液，加入20μL磁珠悬液和80μL结合液A，结合液B用量分别为200μL、300μL、400μL、500μL、600μL，各纯化步骤采用上述步骤。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表5所示。
表5 结合液B用量优化结果
依据表5结果可发现，当结合液B用量为500μL/600μL时，样品回收率相差不大且相对最高，但由于96通道全自动核酸提取仪配套的96深孔板最大反应体积不超过1mL，当结合液B用量为600μL时，反应体积达1mL，同时出于节约成本的角度，因此选择500μL的结合液B用量。
上述基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法可搭配核酸提取仪使用，如96通道全自动核酸提取仪QN-AUT-96，使纯化步骤实现自动化，节省人力。具体使用方法如下：
第1板加入300μL引物粗品液、20μL磁珠悬液、80μL结合液A和500μL结合液B；
第2板加入600μL清洗液；
第3板加入600μL清洗液；
第4板加入300μL洗脱液；
将相应的96孔板放入96通道全自动核酸提取仪对应的板位中。
仪器程序设置如下：
仪器运行完成后，第4板中的洗脱液即为纯化后的引物溶液。通过使用优质的磁性微球，结合优化的缓冲液系统，可与市面上任意的核酸提取仪进行匹配，实现了寡核苷酸引物脱盐纯化阶段的自动化操作，节省了大量的人力成本。
实施例6
本实施例采用本发明优化的缓冲体系与传统的乙酸钠体系进行了比较说明
将6管待纯化的引物粗品液以300μL/管平均分为2份，设置处理1和处理2两组实验，处理1采用本发明优化的缓冲体系，处理2采用传统的乙酸钠体系，加样及提取步骤均按照实施例1中所提及的方法进行。
纯化完成后，使用微量紫外分光光度计（NanoDrop）测定洗脱液中寡核苷酸的含量和纯度，并计算回收率，结果如表6所示。
表6 两种不同的缓冲液处理方式回收率比较
从上表中的结果可以看出，经过本发明优化的缓冲体系（处理1）对寡核苷酸引物的回收率要高于传统乙酸钠体系（处理2）。说明经过本发明方法可高效快速的纯化寡核苷酸引物粗品液。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，包括结合、清洗以及洗脱过程获取纯化的引物溶液，于所述结合过程中，置引物粗品液于缓冲液系统中，所述缓冲液系统中包括磁珠悬液、结合液A以及结合液B；
所述磁珠悬液浓度为50-200mg/mL，结合液A为5-50mmol/L柠檬酸、10-50mmol/L柠檬酸钠和1-5mol/L氯化钠的混合物，结合液B为无水乙醇或异丙醇中的任意一种；
所述结合液A、结合液B与引物粗品液的体积比为80-200:200-600:300。
2.根据权利要求1所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述磁珠悬液为超顺磁性硅羟基纳米磁性微球，粒径为50-500nm；所述结合液A的pH为4.0-5.0。
3.根据权利要求1所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述清洗液为5-50mmol/L三羟甲基氨基甲烷，1-5mmol/L乙二胺四乙酸以及60-80%乙醇的混合物，其pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述洗脱液为超纯水或灭菌水中的任意一种。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述结合过程具体如下：200-400μL引物粗品液样本中，加入10-30μL磁珠悬液、50-500μL结合液A和200-600μL结合液B，室温震荡混匀5min，磁性分离后弃去上清液。
6.根据权利要求5所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述清洗过程具体如下：向寡核苷酸与磁性微球复合物中加入500-1000μL清洗液，震荡混匀1min，磁性分离后弃去上清液，并重复上述过程清洗1次以去除盐离子杂质。
7.根据权利要求6所述的基于磁珠法的引物快速脱盐纯化的方法，其特征在于，所述洗脱过程具体如下：向清洗后的寡核苷酸与磁性微球复合物中加入200-500μL洗脱液，室温震荡混匀5min，磁性分离后，将洗脱液转移至一干净离心管中，即为纯化后的引物溶液。
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