CN114213492A - 一种dna纯化试剂、其制备方法及dna纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA纯化试剂、其制备方法及DNA纯化方法。DNA纯化试剂其制备原料包括A组分与B组分；所述A组分包括羧基磁珠；所述B组分包括：体积百分比33％～38％的乙醇、体积百分比为3％～5％的四乙二醇及2.0mol/L～3.0mol/L的NaCl；所述A组分与所述B组分的比例为：(1.5～2.5)g:1L。与现有技术相比，本发明采用乙醇与四乙二醇共同吸收体系中的水分子，再配合NaCl将DNA片段析出，增大析出量，进而增加后续羧基磁珠的吸附量，提高后续的磁珠回收率。
Description
技术领域
本发明涉及DNA纯化领域，具体涉及一种DNA纯化试剂、其制备方法及DNA纯化方法。
背景技术
Sanger法测序是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法，该方法广泛应用对细菌的质粒和扩增后产物的测序。
整个Sanger法测序流程中，需要相对DNA进行纯化沉淀，常用的纯化沉淀方法为酒精醋酸钠法。磁珠法通过DNA在几千分子量的聚乙二醇及高盐环境下，采用固相载体进行吸附，最后经乙醇洗涤脱附回收的过程。现有的磁珠体系包含：磁珠、聚乙二醇以及盐离子，该体系能将DNA沉淀并吸附，该磁珠试剂体系能吸附分子量区域窄小的DNA片段，但不能吸附PCR扩增产生的所有片段。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种DNA纯化试剂、其制备方法及DNA纯化方法。
本发明采用如下技术方案：
一种DNA纯化试剂，其不同之处在于，其制备原料包括A组分与B组分；所述A组分包括羧基磁珠；所述B组分包括：体积百分比33％～38％的乙醇、体积百分比为3％～5％的四乙二醇及2.0mol/L～3.0mol/L的NaCl；所述A组分与所述B组分的比例为：(1.5～2.5)g:1L。
与现有技术相比，本发明采用乙醇与四乙二醇共同吸收体系中的水分子，再配合NaCl将DNA片段析出，能够特异性结合Sanger测序反应中的所有片段，但不结合dNTPs、ddNTPs，酶等原料。
进一步，所述B组分中还包括6.0mmol/L～6.5mmol/L的EDTA。
采取上述进一步技术方案的有益效果在于：EDTA的加入通过络合反应去除纯化体系中的盐离子，提高其纯度。
上述DNA纯化试剂的制备方法，其不同之处在于，包括：
步骤S1:取羧基磁珠溶液,去除上清，得到羧基磁珠；
步骤S2:将乙醇、四乙二醇及NaCl混合后，得到预混合液；
步骤S3:将所述羧基磁珠与所述预混合液进行所述DNA纯化试剂。
进一步，所述步骤S2中，将乙醇、四乙二醇、NaCl及EDTA混合后，得到预混合液。
一种DNA纯化方法，其不同之处在于，包括：
步骤A1:往待纯化的样本中加入上述DNA纯化试剂和乙醇，混匀，得待处理混合液；
步骤A2:将所述待处理混合液放置在磁力架上进行吸附，弃上清；
步骤A3:然后加入乙醇混合均匀后得到待纯化液，将所述待纯化液再次放置在磁力架上进行吸附，弃上清；
步骤A4:重复所述步骤A3 1～3次，回收磁珠。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过在待纯化DNA样品中加入本发明DNA纯化试剂与乙醇，能吸附单向PCR扩增产生的所有片段，再通过80％乙醇洗涤，去除反应剩余的所有原料，从而达到纯化的目的。纯化后的产物可直接上3730xl等遗传分析仪进行电泳测序；信号强且均匀，背景噪音极低。
进一步，待纯化样本与所述DNA纯化试剂的的体积比例为1：(0.8～1.2)。
进一步，所述待处理混合液与所述待纯化液中的乙醇体积百分比为40％～50％。
附图说明
图1为实施例5的磁珠回收测试图；
图2为对比例1A公司的磁珠回收测试图；
图3为对比例1B公司的磁珠回收测试图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。
本发明实施例中，涉及的实验原料说明如下：
羧基磁珠溶液：本发明羧基磁珠溶液购于(百迈格生物)，规格为300nm，50mg/ml，货号为191116；
乙醇溶液：采用80％v/v乙醇溶液，购于(国药集团)500ml无水乙醇；
四乙二醇：sigma lot:04818AHV。
实施例1～实施例4
实施例1～实施例4提供DNA纯化试剂，具体成分及含量如表1所示：
表1实施例1～实施例4DNA纯化试剂成分及含量
实施例1～实施例4的制备方法均采用下列步骤进行制备：
步骤S1：取羧基磁珠溶液,吸附去上清，得到A组分；
步骤S2:将乙醇溶液，四乙二醇，NaCl，EDTA混合后得到B组分；
步骤S3:将A组分与B组分混合后得到DNA纯化试剂。
实施例5～实施例8
实施例5～实施例8提供一种DNA的纯化方法，具体操作方法如下：
步骤A1：在96孔板中加入5ul测序产物，加入羧基磁珠混合液5ul和乙醇震荡混匀，得待处理混合液；
步骤A2:将96孔板放置在磁力架上，吸附30s，去上清；
步骤A3:加入乙醇，震荡混匀1min，得到待处理液，将96孔板放置在磁力架上，吸附30S，去上清。
重复步骤A3一次后，室温静置5min。
步骤A1及步骤A3加入乙醇后，其终浓度一样，具体如表2所示。
表2实施例5～实施例8步骤A1与步骤A3的乙醇终浓度
| 实施例 | DNA纯化剂 | 乙醇(％v/v) |
| 实施例5 | 实施例1 | 45 |
| 实施例6 | 实施例2 | 50 |
| 实施例7 | 实施例3 | 40 |
| 实施例8 | 实施例4 | 40 |
对比例1
将市售的MCLAB lot:L580A59M(简称A公司)磁珠体系与Thrmo lot:1706084磁珠体系(简称B公司)参照说明书对DNA样品进行纯化。
将经实施例5、对比例1及对比例2纯化后的DNA磁珠的孔中添加40μL的灭菌水，混匀后离心检测其磁珠回收效率，检测方法为：各取20ul的纯化后样品，进行毛细管电泳检测，回收效率越高，荧光信号值越强。
可以看出，每张图的荧光信号值都是由强至弱递次分布，但是实施例相较于A公司以及B公司从整体上而言，x轴对应的每个y轴信号均较强，证明采用实施例5磁珠体系的每个区域片段的DNA分子回收量是大于市售磁珠体系的。
实施例5、对比例1及对比例2的结果如图1～3所示，各实施例以及对比例的磁珠信号强度如表3所示。
表3磁珠检测最强的信号
| 检测对象 | 磁珠信号 |
| 实施例5 | 18000 |
| 对比例1A公司 | 6000 |
| 对比例1B公司 | 12000 |
从表3可以看出，采用本发明DNA纯化试剂及提取方法，其磁珠信号远远大于市售公司。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种DNA纯化试剂，其特征在于，其制备原料包括A组分与B组分；所述A组分包括羧基磁珠；所述B组分包括：体积百分比33％～38％的乙醇、体积百分比为3％～5％的四乙二醇及2.0mol/L～3.0mol/L的NaCl；所述A组分与所述B组分的比例为：(1.5～2.5)g:1L。
2.根据权利要求1所述的DNA纯化试剂，其特征在于，所述B组分中还包括6.0mmol/L～6.5mmol/L的EDTA。
3.如权利要求1所述的DNA纯化试剂的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1:取羧基磁珠溶液,去除上清，得到羧基磁珠；
步骤S2:将乙醇、四乙二醇及NaCl混合后，得到预混合液；
步骤S3:将所述羧基磁珠与所述预混合液进行所述DNA纯化试剂。
4.根据权利要求3所述的DNA纯化试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，将乙醇、四乙二醇、NaCl及EDTA混合后，得到预混合液。
5.一种DNA纯化方法，其特征在于，包括：
步骤A1:往待纯化的样本中加入权利要求1所述的DNA纯化试剂和乙醇，混匀，得待处理混合液；
步骤A2:将所述待处理混合液放置在磁力架上进行吸附，弃上清；
步骤A3:然后加入乙醇混合均匀后得到待纯化液，将所述待纯化液再次放置在磁力架上进行吸附，弃上清；
步骤A4:重复所述步骤A3 1～3次，回收磁珠。
6.根据权利要求5所述的DNA纯化方法，其特征在于，待纯化样本与所述DNA纯化试剂的体积比例为1：(0.8～1.2)。
7.根据权利要求5所述的DNA纯化方法，其特征在于，所述待处理混合液与所述待纯化液中的乙醇体积百分比为40％～50％。
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