JP2003339379A

JP2003339379A - 核酸分離方法

Info

Publication number: JP2003339379A
Application number: JP2002150836A
Authority: JP
Inventors: Juichi Saito; 寿一斉藤; Yoshifumi Kurihara; 芳文栗原; Norihiko Ishiguro; 敬彦石黒
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2002-05-24
Publication date: 2003-12-02
Also published as: EP1375660B1; US20040005616A1; EP1375660A1; DE60300318T2; DE60300318D1

Abstract

(57)【要約】【課題】フェノール、クロロホルムなどの劇物を使用せ
ず、また遠心分離やろ過といった分離手段を必要としな
い、自動化およびマイクロ化・集積化に適する核酸分離
方法を提供する。【解決手段】核酸を含有する試料について、第一の水
溶性ポリマーを含む水溶液（第一ポリマー水溶液）と、
第一の水溶性ポリマーと水性２相を形成する第二の水溶
性ポリマーを含む水溶液（第二ポリマー水溶液）を形成
し、ここで第一ポリマー水溶液と第二ポリマー水溶液の
いずれか一方または両方は、試料と界面活性剤の両方を
含む水溶液であり、第一ポリマー水溶液および第二ポリ
マー水溶液を接触させ、核酸とその他の成分を別個の水
溶液に分離する、核酸の分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する試
料について、核酸とその他の成分を分離する方法に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】核酸を含有する試料からの核酸の分離
（取得）は、バイオテクノロジーおよび臨床診断等の分
野で重要な操作である。例えば、遺伝子検査において
は、細胞中またはウイルス中の核酸を他の成分から分離
して、その後の核酸増幅工程や核酸検出工程に使用す
る。

【０００３】従来知られた核酸の分離方法として、劇物
であるフェノールおよびクロロホルムを使用するプロテ
アーゼＫ／フェノール法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）７．１２−７．１５）やＡＧ
ＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．およびＳａｃｃ
ｈｉ，Ｎ．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ（１９８７）１６２，１５６−１５９）があ
る。またこれらの他にも、特開平７−５９５７２号公報
に記載された、（１）デキストラン、アクリルアミドお
よびカルボキシメチルセルロースからなる群から選ばれ
る１種以上のキャリアーを試料と混合して混合液を形成
する工程、（２）チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニ
ジン、チオシアン酸カリウムおよびチオシアン酸ナトリ
ウムからなる群から選ばれる試薬Ａと、ｎ−プロピルア
ルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコ
ール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルア
ルコールおよびｔｅｒｔ−アミルアルコールからなる群
から選ばれる１種以上の試薬Ｂを含む試薬Ｃを工程
（１）の混合液に混合して核酸およびキャリアーを不溶
化する工程、（３）不溶化された核酸およびキャリアー
を液相と分離する工程とからなる、フェノールやクロロ
ホルムを使用しない核酸の分離方法もある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記した従来の方法に
おいて、プロテアーゼＫ／フェノール法およびＡＧＰＣ
法では、劇物であるフェノールやクロロホルムを使用し
なければならないことから、操作の際の安全性および使
用済試薬の廃棄に課題がある。またこれらの方法では、
核酸を分離する際に高速遠心による操作が必須で、特別
な機器が必要になるという課題もある。

【０００５】特開平７−５９５７２号公報に開示された
方法では、劇物であるフェノールやクロロホルムは不要
であり、液相からの核酸の分離も、高速遠心に比較すれ
ば簡便に実施できるものの、なおも不溶化された核酸と
キャリアーを液相から分離するためにろ過または遠心が
必要になるという課題がある。

【０００６】以上のように、従来の核酸の分離方法は、
操作が複雑で、また実施に当たっては特別な機器が必要
になるという課題がある。またこのように複雑な操作が
要求されるために従来の方法は自動化が困難で、この結
果、試料間または試料と環境間での核酸の汚染を避けつ
つ、多数の試料について核酸の分離・取得を迅速かつ再
現性良く実施するためには熟練した技術が必要であっ
た。

【０００７】そこで本発明の目的は、フェノールやクロ
ロホルムのような劇物を使用せず、ろ過や遠心といった
特別な機器を必要としない、従って自動化が容易な核酸
の分離（取得）方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】従来の核酸の分離・取得
方法に存在している課題は、タンパク質などの夾雑物質
を含む粗精製物から核酸をいかに簡便に分離するか、と
いう点にある。近年、ろ過や遠心等の分離操作を利用し
ない分離方法として、水性２相分配によるタンパク質の
分離が試みられているが、現在までのところ水性２相分
配によるタンパク質を含む粗精製物からの核酸の分離・
取得については具体的な条件等の報告はない。

【０００９】そこで本願発明者らは、水性２相分配を利
用する核酸の分離について鋭意検討を行い、本発明を完
成するに至った。すなわち、前記目的を達成するために
なされた本願請求項１の発明は、核酸を含有する試料に
ついて、試料、第一の水溶性ポリマー、第一の水溶性ポ
リマーと水性２相を形成する第二の水溶性ポリマーおよ
び界面活性剤を含む水溶液を形成し、該水溶液を静置し
て水性２相を形成させ、核酸とその他の成分を別個の相
に分離する、核酸の分離方法である。

【００１０】また本願請求項２の発明は、操作の自動化
等のために特に好ましい核酸の分離方法であり、核酸を
含有する試料について、第一の水溶性ポリマーを含む水
溶液（第一ポリマー水溶液）と、第一の水溶性ポリマー
と水性２相を形成する第二の水溶性ポリマーを含む水溶
液（第二ポリマー水溶液）を形成し、ここで第一ポリマ
ー水溶液と第二ポリマー水溶液のいずれか一方または両
方は、試料と界面活性剤の両方を含む水溶液であり、第
一ポリマー水溶液および第二ポリマー水溶液を接触さ
せ、核酸とその他の成分を別個の水溶液に分離する、核
酸の分離方法である。本願請求項３の発明は、前記請求
項２の発明に係り、第一ポリマー水溶液および第二ポリ
マー水溶液のそれぞれを流動させ、層流を形成させるこ
とによって第一ポリマー水溶液および第二ポリマー水溶
液を接触させることを特徴とする。

【００１１】本願請求項４の発明は、前記請求項１また
は２の発明に係り、第一の水溶性ポリマーがポリエチレ
ングリコールであり、第二の水溶性ポリマーがデキスト
ランであることを特徴とする。

【００１２】本願請求項５の発明は、界面活性剤が非イ
オン性界面活性剤であることを特徴とする。本願請求項
６の発明は、前記請求項５の発明に係り、非イオン性界
面活性剤が終濃度０．０５％以上であることを特徴とす
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明が分離（取得）の対象とする核酸
は、１本鎖または２本鎖のＲＮＡやＤＮＡであり、核酸
を含有する試料とは前記のような核酸を含有する試料で
ある。かかる試料としては、例えば、核酸伸長反応、核
酸増幅反応、核酸修飾反応などの反応後の反応液、血
清、血漿および尿などの生体成分、さらに、ウイルス、
細菌、そして細胞などを破砕して得られた未精製または
部分精製した試料を例示できる。ここで、破砕方法には
特別の制限はなく、既知の種々の方法を用いることがで
きる。

【００１４】本発明では、まず、試料、第一の水溶性ポ
リマー、第一の水溶性ポリマーと水性２相を形成する第
二の水溶性ポリマーおよび界面活性剤を含む水溶液を形
成する。第一の水溶性ポリマーおよび前記第二の水溶性
ポリマーは、相互に水性２相を形成するものであれば特
に限定されない。相互に水性２相を形成するか否かが不
明な水溶性ポリマーを用いる場合や、水性２相を形成す
ることは明らかであるが、所定濃度とした場合に水性２
相を形成するか否かが不明な場合には、例えば、予めそ
れらの水溶液を用意して水性２相を形成するか否かを確
かめ、形成された水性２相の上層および下層をそれぞれ
回収し、それらを使用することもできる。

【００１５】本発明に使用する第一および第二の水溶性
ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、
デキストラン、フィコールおよびこれらポリマーの誘導
体を例示することができる。なかでも、水性２相を容易
に形成するポリエチレングリコールとデキストランを、
それぞれ第一または第二の水溶性ポリマーとして使用す
ることが好ましい。第一および第二の水溶性ポリマーと
して、好ましくポリエチレングリコールとデキストラン
を組み合わせて使用する場合には、平均分子量３０００
から１００００のポリエチレングリコールと、平均分子
量１０万から２００万のデキストランを組み合わせるこ
とが特に好ましい。またこの場合には、ポリエチレング
リコールおよびデキストランは終濃度、すなわち、試
料、第一の水溶性ポリマー、第二の水溶性ポリマーおよ
び界面活性剤を含む水溶液における濃度が８％以上とな
るようにすることが好ましく、扱い易さを考慮すると終
濃度８％以上１５％以下となるようにすることが特に好
ましい。なお当然のことながら、ポリエチレングリコー
ルおよびデキストランは、所望の終濃度より高い濃度の
水溶液としてあらかじめ調製しておくことが可能であ
る。

【００１６】界面活性剤は、試料の液性や後工程への影
響、すなわち、例えば分離した核酸について核酸増幅操
作を実施する場合には該増幅操作に与える阻害効果等、
を考慮して任意に選択することができ、特に限定されな
いが、核酸増幅操作等への影響が少ない非イオン性界面
活性剤が好ましい。かかる好ましい非イオン性界面活性
剤は特に限定されないが、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００に代表されるポリオキシエチレンオクチルフェニ
ルエーテルやＴｗｅｅｎ２０に代表されるポリオキシ
エチレンモノラウリン酸ソルビタン等を例示することが
できる。なお界面活性剤は、二種類以上のものを混合し
て使用することもできる。本発明において、非イオン性
界面活性剤を使用する場合には、核酸の分離を良好とす
るために終濃度、すなわち、試料、第一の水溶性ポリマ
ー、第二の水溶性ポリマーおよび界面活性剤を含む水溶
液における濃度が０．０５％以上となるようにすること
が特に好ましい。

【００１７】試料、第一の水溶性ポリマー、第一の水溶
性ポリマーと水性２相を形成する第二の水溶性ポリマー
および界面活性剤を含む水溶液を形成するに際しては、
必要に応じて、水や緩衝液を用いることができる。また
水溶液を形成する操作は、最終的に上記のような水溶液
を形成すれば試料や各試薬の混合順序等に何ら制限はな
く、例えば、全てを混合した後に水等を加えて水溶液と
しても良いし、また例えば試料を第一の水溶性ポリマー
と混合して水溶液とし、これに界面活性剤や第二の水溶
性ポリマーを加えても良いし、また更には、例えば第一
の水溶性ポリマーを水溶液とし、これに試料、界面活性
剤および第二の水溶性ポリマーを加える等しても良い。

【００１８】以上の水溶液を静置すると水性２相が形成
され、核酸とタンパク質等のその他の成分は別々の相に
分離される。例えば第一および第二の水溶性ポリマーと
してポリエチレングリコールとデキストラン、界面活性
剤として非イオン性界面活性剤を用いた場合は、ポリエ
チレングリコールが主である上層（以後、ポリエチレン
グリコール層と呼ぶ）とデキストランが主である下層
（以後、デキストラン層と呼ぶ）からなる水性２相が形
成され、核酸はデキストラン層に主に分離される。従っ
て、デキストラン層を回収すれば所望の核酸を取得する
ことができる。なお、分離された核酸を含む相が、例え
ば核酸増幅操作や核酸検出操作等にそのまま提供できる
場合には該相をかかる操作に提供すれば良く、核酸を該
相から回収する必要がある場合には公知の方法を採用し
て回収すれば良い。

【００１９】本発明は、操作の自動化等のために特に好
ましい核酸の分離方法をも提供する。この発明では、ま
ず、第一の水溶性ポリマーを含む水溶液（第一ポリマー
水溶液）と、第一の水溶性ポリマーと水性２相を形成す
る第二の水溶性ポリマーを含む水溶液（第二ポリマー水
溶液）を形成する。第一の水溶性ポリマーおよび第二の
水溶性ポリマーについては、前記したようなものを例示
できるが、この発明においても第一および第二の水溶性
ポリマーとしてポリエチレングリコールとデキストラン
の組み合わせを用いることが好ましい。第一ポリマー水
溶液および第二ポリマー水溶液中の第一水溶性ポリマー
と第二水溶性ポリマーの濃度は、これら水溶液を混合し
た場合に水性２相を形成可能な濃度であればであれば特
に限定されない。第一の水溶性ポリマーと第二の水溶性
ポリマーとして、好ましくポリエチレングリコールおよ
びデキストランを組み合わせる場合には、それぞれの水
溶液として、前記のごとくあらかじめポリエチレングリ
コールおよびデキストランを終濃度が８％以上となるよ
うに混合して水性２相を形成させた後に該水性２相から
回収したポリエチレングリコール層液およびデキストラ
ン層液を用いることが好ましい。

【００２０】この発明では、第一ポリマー水溶液と第二
ポリマー水溶液のいずれか一方または両方は、試料およ
び界面活性剤の両方を含み、試料のみ、または、界面活
性剤のみを含むことはない。界面活性剤についても、前
記したように、非イオン性界面活性剤、特にＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００に代表されるポリオキシエチレンオクチ
ルフェニルエーテルやＴｗｅｅｎ２０に代表されるポ
リオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン等が好まし
く、また非イオン性界面活性剤を使用する場合には、水
溶液における終濃度が０．０５％以上となるようにする
ことが特に好ましい。

【００２１】第一ポリマー水溶液と第二ポリマー水溶液
を接触させ、必要に応じて攪拌、静置して水性２相を形
成させれば、前記したように、核酸とタンパク質等のそ
の他の成分は別々の相に分離される。従って、上層また
は下層を回収すれば所望の核酸を取得することができ
る。この発明では、第一ポリマー水溶液と第二ポリマー
水溶液の接触を、溝や管等の流路内で、第一ポリマー水
溶液および第二ポリマー水溶液のそれぞれを流動させ、
層流を形成させることによって実施することが好まし
い。このような、層流形成による第一ポリマー水溶液と
第二ポリマー水溶液の接触は、光リソグラフィー等の既
存の技術によって基材上に構築されたマイクロチャンネ
ル内で実施することが可能であり、流路のマイクロ化に
よる核酸分配に要する時間の短時間化、発明の実施に要
する器具や基材の小型化、低価格化、そして更には発明
実施の自動化に寄与するものである。

【００２２】例えば、第一ポリマー水溶液および第二ポ
リマー水溶液として、好ましくポリエチレングリコール
水溶液およびデキストラン水溶液を使用し、マイクロチ
ャンネル内でこれら水溶液を流動させ、層流を形成させ
ることによって接触させた場合には、夾雑タンパク質は
ポリエチレングリコール層に主に分配され、核酸はデキ
ストラン層に分配される。従って、デキストラン層を回
収すれば所望の核酸を取得することができる。なお、分
離された核酸を含む相が、例えば核酸増幅操作や核酸検
出操作等にそのまま提供できる場合には該相をかかる操
作に提供すれば良く、核酸を該相から回収する必要があ
る場合には公知の方法を採用して回収すれば良い。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下に本発明を実施例により更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定さ
れるものではない。

【００２４】実施例１界面活性剤を添加した水性２相
分配によるタンパク質と核酸の分離（１）ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７
５００）を終濃度９％、デキストラン（分子量４８万）
を終濃度８．５％、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を終濃度
０から０．５％となるように添加した水溶液１ｍｌに、
１００μｇのウシ血清アルブミン（以後「ＢＳＡ」と記
載する）、５×１０⁷コピーのＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイル
ス）ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ（塩基番号１から１８６５
（配列および塩基番号はＫａｔｏ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０），８
７，９５２４−９５２８に従った）を含む２本鎖ＤＮＡ
（以後「ＨＣＶＤＮＡ」と記載する））を添加し、混
合した。

【００２５】（２）上記水溶液を静置し、２相形成させ
た後、上層（ポリエチレングリコールを主に含む）およ
び下層（デキストランを主に含む）をそれぞれ回収し
た。

【００２６】（３）回収した水溶液５０μｌに、３５０
μｌの蒸留水と１００μｌのタンパク定量用試薬（ＢＩ
Ｏ−ＲＡＤＰＲＯＴＥＩＮＡＳＳＡＹ、商品名、Ｂ
ｉｏ−ＲａｄＬａｂ．製）を添加し、５９５ｎｍにお
ける吸光度を測定した。

【００２７】（４）また回収した水溶液をＴＥ（下記参
照）にて１０倍に希釈し、希釈液１０μｌをＰＣＲチュ
ーブ（容量０．５ｍｌ、ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−Ｗ
ａｌｌｅｄＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、商品名、
（株）パーキンエルマージャパン製）にとった。

【００２８】ＴＥの組成１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．１ｍＭＥＤＴＡ（５）引き続き、６５μｌのＰＣＲミックス（組成を以
下に示す）を添加した後、６０μｌのミネラルオイルを
重層した。サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９６
００ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ、商品名、（株）パーキン
エルマージャパン製）を用い、ＰＣＲを以下の条件で実
施した。

【００２９】ＰＣＲミックスの組成１１．５ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）５７．７ｍＭＫＣｌ２．６ｍＭＭｇＣｌ₂ ０．３ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ
およびＴＴＰそれぞれ０．３ｍＭ）０．２８ｍＭプライマー（Ｒ）（ＨＣＶｃＤＮＡの
塩基番号２４８から２６７（Ｋａｔｏ，Ｎ．ら）に相補
的、配列番号１）０．２８ｍＭプライマー（Ｆ）（ＨＣＶｃＤＮＡ塩
基番号１０から３１（Ｋａｔｏ，Ｎ．らと相同、配列番
号２）０．０２３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０００．０３５Ｕ／μｌＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（商
品名、（株）パーキンエルマージャパン製）ＰＣＲ条件９５℃、９分間９５℃、３０秒間６２℃、３０秒間７２℃、１分間からを４０サイクル。

【００３０】（６）ＰＣＲ産物１０μｌを４％アガロー
スで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（商品
名、宝酒造（株）製）で染色した。電気泳動のバンド濃
さをデンシトメーター（デンシトグラフ、商品名、アト
ー（株）製）で測定した。

【００３１】上記（３）のタンパク定量試薬を添加した
場合の吸光度、および、上記（６）の電気泳動のバンド
濃さの測定した結果を図１に示した。ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００を０．０５％以上添加することにより、ＨＣＶ
ＤＮＡは下層に主に分配され、ＢＳＡは上層に主に分
配された。以上から、０．０５％以上のＴｒｉｔｏｎＸ
−１００存在下において、ＨＣＶＤＮＡとＢＳＡを分
離可能であることが示された。

【００３２】実施例２水性２相分配によるタンパク質
と核酸の分離（１）ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７
５００）を終濃度６から９．６％、デキストラン（分子
量４８万）を終濃度５．５から８．８％、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００を終濃度０．１％となるように添加した水
溶液１ｍｌに、１００μｇのＢＳＡ、５×１０⁷コピー
のＨＣＶＤＮＡを添加し、混合した。

【００３３】（２）上記水溶液を静置し、２相形成させ
た後、上層（ポリエチレングリコールを主に含む）およ
び下層（デキストランを主に含む）をそれぞれ回収し
た。

【００３４】（３）回収した水溶液１００μｌに、５０
０μｌの蒸留水と１００μｌのタンパク定量用試薬（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤＰＲＯＴＥＩＮＡＳＳＡＹ、商品名、
Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ．製）を添加し、５９５ｎｍに
おける吸光度を測定した。

【００３５】（４）また回収した水溶液をＴＥにて１０
倍に希釈し、希釈液１０μｌをＰＣＲチューブ（容量
０．５ｍｌ、ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ
ＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、商品名、（株）パー
キンエルマージャパン製）にとった。

【００３６】（５）引き続き、６５μｌのＰＣＲミック
ス（実施例１と同一）を添加した後、６０μｌのミネラ
ルオイルを重層した。サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡ
ｍｐ９６００ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ、商品名、（株）
パーキンエルマージャパン製）を用い、ＰＣＲを実施例
１と同一の条件で実施した。

【００３７】（６）ＰＣＲ産物１０μｌを４％アガロー
スで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（商品
名、宝酒造（株）製）で染色した。電気泳動のバンド濃
さをデンシトメーター（デンシトグラフ、商品名、アト
ー（株）製）で測定した。

【００３８】上記（３）のタンパク定量試薬を添加した
場合の吸光度、および、上記（６）の電気泳動のバンド
濃さの測定した結果を図２に示した。ＨＣＶＤＮＡ
は、ポリエチレングリコール７．２％、デキストラン
６．６％以下で上層に主に分配され、ポリエチレングリ
コール８．４％、デキストラン７．７％以上で下層に主
に分配された。一方、ＢＳＡはいずれの濃度でも上層に
主に分配された。以上から、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
存在下において、ポリエチレングリコールおよびデキス
トラン濃度が約８％以上の場合、ＨＣＶＤＮＡとＢＳ
Ａを分離可能であることが示された。

【００３９】実施例３層流形成による水性２相分配（１）ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７
５００）を終濃度１１．３％、デキストラン（分子量４
８万）を終濃度１０．６％となるように添加した水溶液
２ｍｌを混合、静置して２相を形成させた。

【００４０】（２）２相の上層（以後、ＰＥＧ層液と呼
ぶ）および下層（以後、ＤＥＸ層液と呼ぶ）のそれぞれ
を回収した。

【００４１】（３）ＤＥＸ層液０．８ｍｌにＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００を０．２％になるように添加し、さらに
１００μｇのＢＳＡおよび５×１０⁷コピーのＨＣＶ
ＤＮＡを添加し、１ｍｌとした。一方、ＰＥＧ層液０．
８ｍｌに蒸留水０．２ｍｌを加えて１ｍｌとした。

【００４２】（４）ＰＥＧ層液およびＤＥＸ層液を図３
に示した流路チップの開口部Ａ、Ｂのそれぞれよりシリ
ンジポンプを用いて流速１００μｌ／ｍｉｎで導入し、
層流を形成させた後、開口部Ｃ、Ｄから回収した。

【００４３】（５）回収した各水溶液５０μｌに、３５
０μｌの蒸留水と１００μｌのタンパク定量用試薬（Ｂ
ＩＯ−ＲＡＤＰＲＯＴＥＩＮＡＳＳＡＹ、商品名、
Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ．製）を添加し、５９５ｎｍに
おける吸光度を測定した。

【００４４】（６）また回収した水溶液をＴＥにて１０
倍に希釈し、希釈液１０μｌをＰＣＲチューブ（容量
０．５ｍｌ、ＧｅｎｅＡｍｐＴｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ
ＲｅａｃｔｉｏｎＴｕｂｅｓ、商品名、（株）パー
キンエルマージャパン製造）にとった。

【００４５】（７）引き続き、６５μｌのＰＣＲミック
ス（実施例１と同一）を添加した後、６０μｌのミネラ
ルオイルを重層した。サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡ
ｍｐ９６００ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ、商品名、（株）
パーキンエルマージャパン製）を用い、ＰＣＲを実施例
１と同一の条件で実施した。

【００４６】（８）ＰＣＲ産物１０μｌを４％アガロー
スで電気泳動した後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩ（商品
名、宝酒造（株）製）で染色した。電気泳動のバンド濃
さをデンシトメーター（デンシトグラフ、商品名、アト
ー（株）製）で測定した。

【００４７】上記（５）のタンパク定量試薬を添加した
場合の吸光度、および、上記（８）の電気泳動のバンド
濃さの測定した結果を図４に示した。ＨＣＶＤＮＡは
ＤＥＸ層液に分配され、ＢＳＡはＰＥＧ層液に主に分配
された。以上から、図３に示した流路チップを用い、層
流形成させて２相分配を行うことによって迅速に（核酸
を含む水溶液１００μｌの回収に要した時間は約１分間
である）ＨＣＶＤＮＡとＢＳＡを分離可能であること
が示された。

【００４８】

【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によれば、フェノールやクロロホルムのような劇物を使
用せず、またろ過や遠心といった特別な機器をも必要と
しない、従って自動化が容易な核酸の分離（取得）方法
が提供される。また本発明は、マイクロ化または集積化
されたプレート等のマイクロチャンネル内で実施するこ
とも可能である。この結果、本発明は、かかるプレート
内で核酸を分離し、その後核酸の増幅操作を実施して任
意核酸の存在や存在量を測定するためのマイクロプレー
トを提供するうえで、重要な方法を提供するものであ
る。

【００４９】

【配列表】

SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 核酸分離方法 <130> PA211-0772 <160> 2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー（Ｒ） <400> 1 gcctttcgcg acccaacact 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー（Ｆ）<400> 2 acactccacc atagatcact cc 22

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の結果、すなわち、回収した水溶液に
タンパク定量用試薬を添加した場合の５９５ｎｍにおけ
る吸光度、および、ＰＣＲ産物を電気泳動した場合のバ
ンド濃さ（黒化度）の相対値（コントロールに対する
比、なおコンとロールは、１０⁶コピー／テストのＨＣ
ＶＤＮＡのＰＣＲ産物を電気泳動したものである）を
示した。横軸には、水性２相分配系におけるＴｒｉｔｏ
ｎＸ−１００の終濃度をとった。ＮＤとは、相対黒化度
０．０８未満で、ＰＣＲ産物のバンドが検出されなかっ
たものを示す。

【図２】実施例２の結果、すなわち、回収した水溶液液
にタンパク定量用試薬を添加した場合の５９５ｎｍにお
ける吸光度、およびＰＣＲ産物を電気泳動した場合のバ
ンド濃さ（黒化度）の相対値（コントロールに対する
比、なおコンとロールは、１０⁶コピー／テストのＨＣ
ＶＤＮＡのＰＣＲ産物を電気泳動したものである）を
示した。横軸には、水性２相分配系におけるポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）およびデキストラン（ＤＥＸ）
の終濃度をとった。

【図３】実施例３において、層流形成による２相分配を
行うために用いた流路チップ等を示した。開口部Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄは流路に通ずる開口部であり、実施例３では
ＡおよびＢからシリンジポンプによってＰＥＧ層液およ
びＤＥＸ層液のそれぞれを導入する（流速：１００μｌ
／ｍｉｎ）ことによって層流形成部にて層流を形成させ
た。また層流により、ＰＥＧ層液およびＤＥＸ層液を接
触させた後、ＣおよびＤより各水溶液を回収した。

【図４】実施例３の結果、すなわち、層流形成による水
性２相から回収した水溶液にタンパク定量用試薬を添加
した場合の５９５ｎｍにおける吸光度、およびＰＣＲ産
物を電気泳動した場合のバンド濃さ（黒化度）の相対値
（コントロールに対する比、なおコントロールは、１０
⁶コピー／テストのＨＣＶＤＮＡのＰＣＲ産物を電気泳
動したものである）を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA11 HA20 4B063 QA01 QA19 QR41 QR43 QR52 QS12 4D056 AB20 AC20 AC22 AC27 AC29 BA03

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する試料について、試料、第
一の水溶性ポリマー、第一の水溶性ポリマーと水性２相
を形成する第二の水溶性ポリマーおよび界面活性剤を含
む水溶液を形成し、該水溶液を静置して水性２相を形成
させ、核酸とその他の成分を別個の相に分離する、核酸
の分離方法。
【請求項２】核酸を含有する試料について、第一の水
溶性ポリマーを含む水溶液（第一ポリマー水溶液）と、
第一の水溶性ポリマーと水性２相を形成する第二の水溶
性ポリマーを含む水溶液（第二ポリマー水溶液）を形成
し、ここで第一ポリマー水溶液と第二ポリマー水溶液の
いずれか一方または両方は、試料と界面活性剤の両方を
含む水溶液であり、第一ポリマー水溶液および第二ポリ
マー水溶液を接触させ、核酸とその他の成分を別個の水
溶液に分離する、核酸の分離方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法において、第一ポ
リマー水溶液および第二ポリマー水溶液のそれぞれを流
動させ、層流を形成させることによって第一ポリマー水
溶液および第二ポリマー水溶液を接触させることを特徴
とする、核酸の分離方法。
【請求項４】第一の水溶性ポリマーはポリエチレング
リコールであり、第二の水溶性ポリマーはデキストラン
であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方
法。
【請求項５】界面活性剤は非イオン性界面活性剤であ
ることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】非イオン性界面活性剤は終濃度０．０５
％以上であることを特徴とする、請求項５に記載の方
法。