DE60300318T2

DE60300318T2 - Verfahren für die Nukleinsäureisolierung

Info

Publication number: DE60300318T2
Application number: DE60300318T
Authority: DE
Inventors: Juichi Yamato-shi Saitoh; Yoshifumi Ebina-shi Kurihara; Takahiko Yokohama-shi Ishiguro
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2023-05-23
Also published as: JP2003339379A; EP1375660A1; EP1375660B1; US20040005616A1; DE60300318D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäuren von anderen Bestandteilen einer Probe.
Die Isolierung (Präparierung) von Nukleinsäure aus Proben, die Nukleinsäuren enthalten, ist ein wichtiger Vorgang auf dem Gebiet der Biotechnologie und der klinischen Diagnose. Zum Beispiel umfassen genetische Untersuchungen die Isolierung von zellulärer oder viraler Nukleinsäure von anderen Bestandteilen, um eine isolierte Nukleinsäure zu ergeben, die in einem nachfolgenden Nukleinsäureamplifikations- oder Nachweisschritt verwendet wird.
Herkömmliche Techniken für die Nukleinsäureisolierung schließen das Protease K/Phenol-Verfahren unter Verwendung von schädlichem Phenol oder Chloroform (Sambrook, J et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 7.12–7.15) und das AGPC-Verfahren (Chomczunski, P. and Sacchi, N., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156–159) ein. Zusätzlich wird ein weiteres Verfahren in JP-A-7-59572 für die Nukleinsäureisolierung ohne Verwendung von Phenol oder Chloroform offenbart und umfasst (1) einen Schritt des Mischens einer Probe und wenigstens eines Trägers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Acrylamid und Carboxymethylcellulose in eine flüssige Mischung, (2) einen Schritt des Zugebens eines Reagenz C mit einem Reagenz A, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Guanidinthiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Natriumthiocyanat, und wenigstens einem Reagenz B, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus n-Propylalkohol, Isopropylalkohol, n-Butylalkohol, sec-Butylalkohol, tert-Butylalkohol und tert-Amylalkohol, zu der flüssigen Mischung erhalten im Schritt (1), um die Nukleinsäure und den Träger unlöslich zu machen, und (3) einen Schritt der Trennung der unlöslich gemachten Nukleinsäure und des Trägers von der flüssigen Phase.
Von den vorher erwähnten herkömmlichen Techniken, haben das Protease K/Phenol-Verfahren und das AGPC-Verfahren Probleme bei der Sicherheit der Handhabung und der Entsorgung von verwendeten Reagenzien aufgrund der Verwendung von schädlichem Phenol oder Chloroform. Diese Techniken erfordern ebenfalls Zentrifugation, um Nukleinsäure abzutrennen und haben das Problem der Notwendigkeit eines speziellen Instruments.
Obwohl das in JP-A-7-59572 offenbarte Verfahren kein schädliches Phenol oder Chloroform erfordert und auch keinen Vorgang mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifugationsabtrennung der Nukleinsäure von der flüssigen Phase als Schwierigkeit erfordert, hat es nach wie vor ein Problem, dass eine Filtration oder Zentrifugation notwendig ist, um die unlösliche Nukleinsäure und die Träger von der flüssigen Phase zu trennen.
Wie vorher beschrieben, haben die herkömmlichen Techniken für die Nukleinsäureisolation die Probleme von komplexen Vorgängen und die Notwendigkeit spezieller Instrumente. Aufgrund der komplexen Vorgänge sind die herkömmlichen Techniken schwer zu automatisieren und erfordern Fachkönnen um Nukleinsäure schnell und reproduktionsfähig aus zahlreichen Proben ohne Nukleinsäureverschleppung zwischen den Proben, oder zwischen den Proben und deren Umwelt, zu isolieren und zu präparieren.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren für die Isolierung (Präparierung) von Nukleinsäure zur Verfügung zu stellen, welches weder schädliche Substanzen, wie etwa Phenol oder Chloroform verwendet, noch ein spezielles Instrument, wie etwa Filtration und Zentrifugation, erfordert, und daher leicht zu automatisieren ist.
Das Problem mit herkömmlichen Verfahren für die Isolierung und Präparierung von Nukleinsäuren liegt darin, wie die Abtrennung von Nukleinsäure aus ungereinigten Extrakten, die Protein und andere Verunreinigungen enthalten, vereinfacht werden kann. Die Isolierung von Protein, basierend auf der Abtrennung zwischen zwei wässrigen Phasen, wurde vor kurzem als eine Isolierungstechnik versucht, welche keine Filter- oder zentrifugale Abtrennung umfasst. Jedoch wurden keine spezifischen Bedingungen für die Isolierung und Präparierung von Nukleinsäure aus ungereinigten Extrakten, die Protein enthalten, basierend auf der Abtrennung zwischen zwei wässrigen Phasen berichtet.
Die Erfinder haben aufwendige Untersuchungen über die Isolierung von Nukleinsäuren basierend auf der Abtrennung zwischen zwei wässrigen Phasen durchgeführt, und die vorliegende Erfindung zu Stande gebracht. Die vorliegende Erfindung wurde zu Stande gebracht, um die vorher erwähnte Aufgabe zu lösen. Die im Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung, stellt ein Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure in einer Probe zur Verfügung, welches die Herstellung einer wässrigen Lösung mit der Probe, einem ersten wasserlöslichen Polymer, einem zweiten wasserlöslichen Polymer, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, und einem oberflächenaktiven Stoff umfasst, und Stillhalten der wässrigen Lösung, damit sich die Lösung in zwei wässrige Phasen trennt, und Trennen der Nukleinsäure und der anderen Bestandteile in unterschiedlichen Phasen.
Die wie in Anspruch 2 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung stellt ein besonders bevorzugtes, automatisierbares Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure in einer Probe zur Verfügung, welches umfasst die Herstellung einer wässrigen Lösung (einer ersten wässrigen Polymerlösung) mit einem ersten wasserlöslichen Polymer und einer wässrigen Lösung (einer zweiten wässrigen Polymerlösung), die ein zweites wasserlösliches Polymer enthält, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, wobei wenigstens eines davon die Probe und einen oberflächenaktiven Stoff umfasst, in Kontakt bringen der ersten wässrigen Polymerlösung und der zweiten wässrigen Polymerlösung, und Trennen der Nukleinsäure und der anderen Bestandteile in unterschiedliche wässrige Lösungen.
Die wie in Anspruch 3 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung stellt das Verfahren nach Anspruch 2 zur Verfügung, wobei die erste wässrige Polymerlösung und die zweite wässrige Polymerlösung in der Form von laminaren Strömungen in Kontakt gebracht werden.
Die wie in Anspruch 4 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung stellt das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Verfügung, wobei das erste wasserlösliche Polymer Polyethylenglycol und das zweite wasserlösliche Polymer Dextran ist.
Die wie in Anspruch 5 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung stellt das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Verfügung, wobei der oberflächenaktive Stoff ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff ist. Die wie in Anspruch 6 der vorliegenden Anmeldung definierte Erfindung stellt das Verfahren nach Anspruch 5 zur Verfügung, wobei die Endkonzentration des nichtionischen oberflächenaktiven Stoffs wenigstens 0,05% ist.
Die 1 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 1, nämlich die Extinktionen der wiedergewonnenen wässrigen Lösungen gemischt mit einem Protein-Assayreagenz bei 595 nm und die relativen Dichten (optischen Dichten) der Banden von elektrophoretisch aufgetrennten PCR-Produkten (auf der Grundlage einer Kontrollbande, erhalten durch Elektrophorese des PCR-Produkts von 10⁶ Kopien HCV-DNS). Die Abszisse zeigt die Endkonzentration an Triton X-100 in dem wässrigen Zweiphasensystem an. ND bezeichnet ein nicht nachweisbares PCR-Produkt, welches eine Bande mit einer relativen optischen Dichte von weniger als 0,8 ergab.
Die 2 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 2, nämlich die Extinktionen von wiedergewonnenen wässrigen Lösungen gemischt mit einem Protein-Assayreagenz bei 595 nm und die relativen Dichten (optische Dichten) der Banden der elektrophoretisch aufgetrennten PCR-Produkte (auf der Grundlage einer Kontrollbande, erhalten durch Elektrophorese des PCR-Produkts von 10⁶ Kopien HCV-DNS). Die Abszisse zeigt die Endkonzentration an Polyethylenglykol (PEG) oder Dextran (DEX) in dem wässrigen Zweiphasensystem an.
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Die 3 zeigt einen strömungstechnischen Chip, verwendet für die Aufteilung zwischen laminaren Strömungen von zwei Phasen. Die Öffnungen A, B, C und D führen zu den Kanälen, und in Beispiel 3 wurden die PEG-Schichtlösung und die DEX-Schichtlösung aus A bzw. B (Fließgeschwindigkeit: 100 μl/min) eingebracht, um laminare Strömungen in dem laminaren Strömungsbereich zu bilden. Die PEG-Schichtlösung und die DEX-Schichtlösung wurden in der Form von laminaren Strömungen in Kontakt gebracht, und dann wurden die entsprechenden wässrigen Lösungen von C und D wiedergewonnen.
Die 4 zeigt die Ergebnisse des Beispiels 4, nämlich die Extinktionen der wässrigen Lösungen, wiedergewonnen aus den laminaren Strömungen von zwei wässrigen Phasen, gemischt mit einem Protein-Assayreagenz bei 595 nm, und die relativen Dichten (optischen Dichten) der Banden der elektrophoretisch getrennten PCR-Produkte (auf der Grundlage einer Kontrollbande erhalten durch Elektrophorese des PCR-Produkts von 10⁶ Kopien an HCV-DNS).
Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
Die durch die vorliegende Erfindung zu isolierende (zu präparierende) Nukleinsäure ist eine einzelsträngige oder doppelsträngige RNS oder DNS und die die Nukleinsäure enthaltende Probe ist eine Probe, die eine derartige Nukleinsäure enthält, wie etwa eine Reaktionslösung erhalten nach Verlängerung, Amplifikation, Modifikation oder anderer Reaktionen einer Nukleinsäure, biogenen Komponenten, wie etwa Serum, Plasma und Urin, oder ein ungereinigtes oder teilweise gereinigtes virales, bakterielles oder zelluläres Homogenat, erhalten ohne besondere Beschränkungen durch jedes Homogenisierungsverfahren.
In der vorliegenden Erfindung wird zunächst eine wässrige Lösung mit einer Probe, einem ersten wasserlöslichen Polymer, einem zweiten wasserlöslichen Polymer, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, und einem oberflächenaktiven Stoff hergestellt. Es gibt keine besondere Beschränkung auf die ersten und die zweiten wasserlöslichen Polymere, solange sie zwei wässrige Phasen miteinander bilden können. Wenn es nicht sicher ist, ob die zu verwendenden wasserlöslichen Polymere zwei wässrige Phasen miteinander bilden, oder ob sie zwei wässrige Phasen miteinander bei gegebenen Konzentrationen bilden, obwohl sie sicher zwei wässrige Phasen bilden können, können ihre wässrigen Lösungen vorher hergestellt werden, um zu überprüfen, ob sie zwei wässrige Phasen bilden, und dann können die zwei, von den unteren und oberen Schichten wiedergewonnen wässrigen Phasen, verwendet werden.
Als die ersten und zweiten wasserlöslichen Polymere können z.B. Polyethylenglykol, Dextran, Ficoll und ihre Derivate genannt werden. Unter ihnen werden Polyethylenglykol und Dextran, welche leicht zwei wässrige Phasen bilden können, bevorzugt als die ersten bzw. zweiten wasserlöslichen Polymere verwendet. Im Fall der bevorzugten Kombinationen von Polyethylenglykol und Dextran als die ersten und zweiten wasserlöslichen Polymere, ist die Kombination eines Polyethylenglykols mit einem mittleren Molekulargewicht von 3.000 bis 10.000 mit einem Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 100.000 bis 2.000.000 besonders bevorzugt. In diesem Fall sind mit Blick auf die Handhabung die Endkonzentrationen des Polyethylenglykols und des Dextran in der wässrigen Lösung mit einer Probe, dem ersten wasserlöslichen Polymer und dem zweiten wasserlöslichen Polymer und einem oberflächenaktiven Stoff, bevorzugt wenigstens 8%, besonders bevorzugt von 8 bis 15%. Es muss nicht erwähnt werden, dass Polyethylenglykol und Dextran vorher als Stammlösungen in der Form von wässrigen Lösungen bei höheren Konzentrationen als die Endkonzentrationen hergestellt werden können.
Der oberflächenaktive Stoff kann frei gewählt werden, z.B. hinsichtlich der Fluidität der Probe und die Wirkung auf die nachfolgenden Schritte, nämlich der hemmenden Wirkung auf die Nukleinsäureamplifikation in dem Fall, wo die isolierte Nukleinsäure zu amplifizieren ist, und ist bevorzugt ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff, der geringen Einfluss während der Nukleinsäureamplifikation zeigt. Derartige bevorzugte nichtionische oberflächenaktive Stoffe enthalten z.B. Polyoxyethylenoctylphenylether, wie etwa Triton X-100 und Polyoxyehtylensorbitanmonolaurate, wie etwa Tween 20, ohne besondere Beschränkungen. Mehr als ein oberflächenaktiver Stoff kann in Kombination verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung ist es besonders bevorzugt, einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff in einer Endkonzentration von wenigstens 0,05% in einer wässrigen Lösung mit einer Probe, dem ersten und zweiten wasserlöslichen Polymer und dem oberflächenaktive Stoff, zu verwenden.
Für die Herstellung einer wässrigen Lösung mit einer Probe, dem ersten wasserlöslichen Polymer, dem zweiten wasserlöslichen Polymer, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, und einem oberflächenaktiven Stoff kann, wenn notwendig, Wasser oder ein Puffer verwendet werden. Die wässrige Lösung kann durch jedes Verfahren hergestellt werden, ohne Beschränkungen auf die Reihenfolge in welchem die Probe und die entsprechenden Reagenzien gemischt werden, solange die wässrige Lösung letztlich erhalten wird, z.B. durch Mischen von allen und dann Zugabe von Wasser, durch Mischen einer Probe und dem ersten wasserlöslichen Polymer in einer wässrigen Lösung und dann Zugabe des oberflächenaktiven Stoffes und des zweiten wasserlöslichen Polymers, oder durch Zugabe einer Probe, des oberflächenaktiven Stoffs und des zweiten wasserlöslichen Polymers zu einer wässrigen Lösung des ersten wasserlöslichen Polymers.
Die resultierende wässrige Lösung trennt sich beim Stehen in zwei wässrige Phasen auf und die Nukleinsäure und die anderen Bestandteile einschließlich Protein werden auf die verschiedenen Phasen verteilt. Wenn zum Beispiel die ersten und zweiten wasserlöslichen Polymere Polyethylenglykol und Dextran sind, und der oberflächenaktive Stoff ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff ist, werden die zwei wässrigen Phasen als eine Polyethylenglykol-dominierte obere Schicht (hiernach als eine Polyethylenglykolschicht bezeichnet) und eine Dextran-dominierte untere Schicht (hiernach als eine Dextranschicht bezeichnet) ausgebildet, und die meiste Nukleinsäure verteilt sich in der Dextranschicht. Daher wird die Nukleinsäure wie erwünscht durch Wiedergewinnung der Dextranschicht erhalten. Die die Nukleinsäure enthaltende Phase kann, wenn möglich, direkt bei der Nukleinsäureamplifikation oder -detektion nach der Abtrennung verwendet werden, oder die Nukleinsäure kann aus der Phase, wenn notwendig, durch ein bekanntes Verfahren wiedergewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein besonders bevorzugtes automatisierbares Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure zur Verfügung. In dieser Ausführungsform wird zunächst eine wässrige Lösung (eine erste wässrige Polymerlösung) hergestellt, die ein erstes wasserlösliches Polymer, und eine wässrige Lösung (eine zweite wässrige Polymerlösung) enthält, die ein zweites wasserlösliches Polymer enthält, das zwei Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann. Als das erste wasserlösliche Polymer und das zweite wasserlösliche Polymer können die vorher erwähnten genannt werden. In dieser Ausführungsform ist die Kombination von Polyethylenglykol und Dextran als die ersten und zweiten wasserlöslichen Polymere bevorzugt. Die Konzentrationen des ersten wasserlöslichen Polymers und des zweiten wasserlöslichen Polymers und der ersten wässrigen Polymerlösung und der zweiten wässrigen Polymerlösung sind nicht besonders begrenzt, solange diese wässrigen Lösungen zwei wässrigen Phasen nach dem Mischen ausbilden. Im Fall der bevorzugten Kombination von Polyethylenglykol und Dextran als die ersten und zweiten wasserlöslichen Polymere, ist es bevorzugt, zunächst Polyethylenglykol und Dextran in einem zweiphasigen wässrigen System zu mischen, mit Endkonzentrationen an Polyethylenglykol und Dextran von wenigstens 8%, wie vorher erwähnt, und dann die Polyethylenglykolschicht und die Dextranschicht aus dem zweiphasigen wässrigen System für die Verwendung als die entsprechenden wässrigen Lösungen wiederzugewinnen.
In der vorliegenden Erfindung enthält wenigstens eine der ersten wässrigen Polymerlösung und der zweiten wässrigen Polymerlösung sowohl die Probe als auch einen oberflächenaktiven Stoff, und keine der Lösungen kann die Probe oder den oberflächenaktiven Stoff allein enthalten. Als der oberflächenaktive Stoff wird, wie vorher angemerkt, ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff, insbesondere ein Polyoxyethylenoctylphenylether, wie etwa Triton X-100, oder ein Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, wie etwa Tween 20, bevorzugt. Wenn ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff verwendet wird, ist es besonders bevorzugt, einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff in einer Endkonzentration von wenigstens 0.05% in einer wässrigen Lösung zu verwenden.
Durch in Kontakt bringen der ersten Polymerlösung und der zweiten Polymerlösung, wenn notwendig mit Rühren, und Stillhalten der resultierenden wässrigen Lösung, um die wässrige Lösung zwei wässrige Phasen bilden zu lassen, werden die Nukleinsäure und die anderen Bestandteile, wie etwa Protein, in den unterschiedlichen Phasen verteilt. In der vorliegenden Erfindung werden die erste wässrige Polymerlösung und die zweite wässrige Polymerlösung in der Form von laminaren Strömungen in Kontakt gebracht, welche in Durchflusswegen, wie etwa Kanälen oder Röhren, fließen. Derartige laminare Strömungen der ersten wässrigen Polymerlösung und der zweiten wässrigen Polymerlösung können in Mikrokanälen, eingeschnitten in einem Substrat durch ein bekanntes Verfahren, wie etwa Photolithographie, in Kontakt gebracht werden, und die Verwendung von Mikrokanälen trägt zu einer schnellen Nukleinsäureverteilung, der Größen- und Kostenreduzierung der Instrumente und des erforderlichen Substrats zur Durchführung der Erfindung und zur Automatisierung der vorliegenden Erfindung bei.
Zum Beispiel werden in einem bevorzugten Fall, wo laminare Strömungen einer wässrigen Polyethylenglykollösung und einer wässrigen Dextranlösung als die ersten und zweiten wässrigen Polymerlösungen in Mikrokanälen in Kontakt gebracht werden, das meiste kontaminierende Protein in der Polyethylenglykolschicht verteilt, während Nukleinsäure in der Dextranschicht verteilt wird. Daher wird wie erwünscht die Nukleinsäure durch Wiedergewinnung der Dextranschicht erhalten. Die Nukleinsäure enthaltende Phase kann, wenn möglich, direkt in der Nukleinsäureamplifikation oder -detektion nach Abtrennung verwendet werden, oder die Nukleinsäure kann aus der Phase, wenn notwendig, durch ein bekanntes Verfahren wiedergewonnen werden.
Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf die Beispiele beschrieben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung keineswegs auf diese spezifischen Beispiele beschränkt.
BEISPIEL 1 Trennung von Protein und Nukleinsäure unter Verwendung der Abtrennung zwischen zwei wässrigen Phasen, die oberflächenaktive Stoffe enthalten.

(1) Zu 1 ml wässriger Lösungen, die Polyethylenglykol 6000 (mittleres Molekulargewicht 7500) in einer Endkonzentration von 9%, Dextran (Molekulargewicht 480.000) in einer Endkonzentration von 8,5% und Triton X-100 in Endkonzentrationen von 0 bis 0,5% enthalten, wurden 100 μg bovines Serumalbumin (hiernach als „BSA" bezeichnet) und 5 × 10⁷ Kopien einer doppelsträngigen DNS (hiernach als „HCV-DNS" bezeichnet), die HCV (Hepatitis C Virus) cDNS enthält (Basen 1 bis 1865 (für die Sequenz und Basenzahl wird auf Kato, N et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87, 9524–9528 Bezug genommen) wurden zugegeben und gemischt.
(2) Die resultierenden wässrigen Lösungen wurden stehengelassen, um sich in zwei Phasen zu trennen und die obere Schicht (dominiert durch Polyethylenglykol) bzw. die untere Schicht (dominiert durch Dextran) wurden wiedergewonnen.
(3) Zu 50 μl-Portionen der wiedergewonnenen wässrigen Phasen wurden 350 μl destilliertes Wasser und 100 μl eines Protein-Assayreagenz (Produktname, BIO-RAD PROTEIN ASSAY, Bio-Rad Lab.) zugegeben und die Extinktionen wurden bei 595 nm gemessen.
(4) Getrennt voneinander wurden die wiedergewonnenen wässrigen Lösungen mit TE um den Faktor 10 verdünnt und 10 μl der resultierenden Lösungen wurden in PCR-Röhrchen gegeben (Kapazität 0,5 ml, Produktname, GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer). Die Zusammensetzung von TE 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 mM EDTA
(5) Dann wurden 65 μl einer PCR-Mischung (mit der folgenden Zusammensetzung) zugegeben und 60 μl Mineralöl wurde darauf geschichtet. Die PCR wurde in einem thermischen Zykler (Produktname, GeneAmp 9600 PCR System, Perkin Elmer) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Die Zusammensetzung der PCR-Mischung 11,5 mM Tris-HCl (pH 8,3) 57,7 mM KCl 2,6 mM MgCl₂ 0,3 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP und dTTP jeweils 0,3 mM) 0,28 mM Primer (R) (komplementär zu den Basen 248 bis 267 HCV cDNS (Kato et al.), SEQ ID Nr. 1) 0,28 mM Primer (F) (homolog zu den Basen 10 bis 31 von HCV cDNS (Kato et al., SEQ ID Nr. 2) 0,023% Triton X-100 0,035 U/μl AmpliTaq Gold (Produktname, Perkin Elmer Japan) PCR-Bedingungen ➀ 95°C, 9 Minuten ➁ 95°C, 30 Sekunden ➂ 62°C, 30 Sekunden ➃ 72°C, 1 Minute 40 Zyklen von ➁ bis ➃
(6) Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch auf einem 4% Agarosegel getrennt und mit SYBR Green II (Produktname, Takara Shuzo Co., Ltd.) gefärbt. Die Dichten der durch die Elektrophorese erhaltenden Banden wurden mit einem Densitometer gemessen (Produktname, Densitograph, ATTO Corporation).

Die Extinktionen, gemessen mit dem Protein-Assayreagenz in (3), und die Dichten der elektrophoretisch erhaltenden Banden, gemessen in (6), werden in der 1 gezeigt. In der Anwesenheit von wenigstens 0,05% Triton X-100, war die HCV DNS hauptsächlich in der unteren Schicht verteilt, während BSA hauptsächlich in der oberen Schicht verteilt war. Folglich konnte in der Anwesenheit von wenigstens 0,05% Triton X-100, HCV DNS und BSA getrennt werden.
BEISPIEL 2 Abtrennung von Protein und Nukleinsäure unter der Verwendung der Abtrennung zwischen zwei wässrigen Phasen

(1) Zu 1 ml wässriger Lösungen, die Polyethylenglykol 6000 (mittleres Molekulargewicht 7500) in Endkonzentrationen von 6 bis 9,6%, Dextran (Molekulargewicht 480.000) in Endkonzentrationen von 5,5% bis 8,8% und Triton X-100 in einer Endkonzentration von 0,1% enthalten, wurden 100 μg BSA und 5 × 10⁷ Kopien HCV DNS zugegeben und gemischt.
(2) Die resultierenden wässrigen Lösungen wurden stehengelassen, damit sie sich in zwei Phasen abtrennen und die obere Schicht (dominiert durch Polyethylenglykol) bzw. die untere Schicht (dominiert durch Dextran) wurden wiedergewonnen.
(3) Zu 100 μl-Portionen der wiedergewonnenen wässrigen Lösungen wurden 500 μl destilliertes Wasser und 100 μl eines Protein-Assayreagenz (Produktname, BIO-RAD PROTEIN ASSAY, Bio-Rad Lab.) gegeben und die Extinktionen wurden bei 595 nm gemessen.
(4) Getrennt wurden die wiedergewonnenen wässrigen Lösungen mit TE um den Faktor 10 verdünnt und 10 μl der resultierenden Lösungen wurden in PCR-Röhrchen gegeben (Kapazität 0,5 ml, Produktname, GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer).
(5) Dann wurden 65 μl einer PCR-Mischung (welche die gleiche wie diejenige in Beispiel 1 verwendete ist) zugegeben und 60 μl Mineralöl wurden darüber geschichtet. Die PCR wurde in einem thermischen Zykler (Produktname, GeneAmp 9600 PCR System, Perkin Elmer) unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt.
(6) Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch auf einem 4% Agarosegel getrennt und mit SYBR Green II (Produktname, Takara Shuzo Co., Ltd.) gefärbt. Die Dichten der durch die Elektrophorese erhaltenden Banden wurden mit einem Densitometer gemessen (Produktname, Densitograph, ATTO Corporation).

Die mit dem Protein-Assayreagenz in (3) gemessenen Extinktionenen und die Dichten der elektrophoretisch erhaltenden Banden gemessen in (6) werden in 2 gezeigt. Die HCV DNS war hauptsächlich in der oberen Schicht in der Anwesenheit von höchstens 7,2% Polyethylenglykol und höchstens 6,6% Dextran und in der unteren Schicht in der Anwesenheit von wenigstens 8,4% Polyethylenglykol und wenigstens 7,7% Dextran verteilt, während BSA hauptsächlich in der oberen Schicht, unabhängig von ihren Konzentrationen, verteilt war. Folglich, in der Anwesenheit von Triton X-100, wenn die Polyethylenglykolkonzentration und die Dextrankonzentration wenigstens etwa 8% war, konnten HCV DNS und BSA getrennt werden.
BEISPIEL 3 Abtrennung zwischen laminaren Strömungen von zwei wässrigen Phasen

(1) 2 ml einer wässrigen Lösung, die Polyethylenglykol 6000 (mittleres Molekulargewicht 7500) in Endkonzentrationen von 11,3% und Dextran in einer Endkonzentration von 10,6% enthielt, wurde gerührt und dann stehengelassen, um sich in zwei Phasen aufzutrennen.
(2) Die zwei Phasen in der oberen Schicht (hiernach als die PEG-Schicht bezeichnet) bzw. die untere Schicht (hiernach als die DEX-Schicht bezeichnet) wurden wiedergewonnen.
(3) Zu 0,8 ml der DEX-Schichtlösung wurden 0,2% Triton X-100 zugegeben, und 100 μg BSA und 5 × 10⁷ Kopien an HCV DNS wurden zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zugegeben. Andererseits wurde zu 0,8 ml der PEG-Schichtlösung 0,2 ml destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zugegeben.
(4) Die PEG-Schichtlösung und die DEX-Schichtlösung wurden in einen in der 3 gezeigten strömungstechnischen Chip durch die Öffnungen A bzw. B mittels einer Spritzenpumpe bei Fließgeschwindigkeiten von 100 μl/min eingebracht, um so laminare Strömungen zu bilden, und wurden dann über die Öffnungen c und D wiedergewonnen.
(5) Zu 50 μl der wiedergewonnenen wässrigen Lösungen wurden 350 μl destilliertes Wasser und 100 μl eines Protein-Assayreagenz (Produktname, BIO-RAD PROTEIN ASSAY, Bio-Rad Lab.) gegeben und die Extinktionen wurden bei 595 nm gemessen.
(6) Getrennt wurden die wiedergewonnenen wässrigen Lösungen mit TE um den Faktor 10 verdünnt, und 10 μl der resultierenden Lösungen wurden in PCR-Röhrchen gegeben (Kapazität 0,5 ml, Produktname, GeneAmp Thin-Walled Reaction Tubes, Perkin Elmer).
(7) Dann wurden 65 μl einer PCR-Mischung (welche die gleiche ist wie diejenige verwendet in Beispiel 1) zugegeben und 60 μl Mineralöl wurde darüber geschichtet. Die PCR wurde in einem thermischen Zykler (Produktname, GeneAmp 9600 PCR System, Perkin Elmer) unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt.
(8) Die PCR-Produkte wurden auf einem 4% Agarosegel elektrophoretisch getrennt und mit SYBR Green II gefärbt (Produktname, Takara Shuzo Co., Ltd.). Die Dichten der durch die Elektrophorese erhaltenen Banden wurden mit einem Densitometer gemessen (Produktname, Densitograph, ATTO Corporation).

Die mit dem Protein-Assayreagenz in (3) gemessenen Extinktionen und die Dichten der elektrophoretisch erhaltenen Banden, gemessen in (8), werden in der 4 gezeigt. Die HCV DNS war in der DEX-Schichtlösung verteilt, während BSA in der PEG-Schichtlösung verteilt war. Folglich erlaubte die Abtrennung zwischen laminaren Strömungen von zwei Phasen in einem strömungstechnischen Chip, gezeigt in der 3, die schnelle Trennung von HCV DNS und BSA (100 μl der wässrigen Lösung, die Nukleinsäure enthält, wurde innerhalb etwa 1 Minute wiedergewonnen).
Wie vorher beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Isolierung (Präparierung) von Nukleinsäure zur Verfügung, welches weder schädliche Substanzen, wie etwa Phenol und Chloroform, verwendet, noch ein spezielles Instrument, wie etwa Filtration und Zentrifugation erfordert, und daher leicht zu automatisieren ist. Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls in Mikrokanälen in Mikroplatten oder integrierten Platten durchgeführt werden. Daher stellt die vorliegende Erfindung ein wichtiges Verfahren zur Verfügung, welches dazu beiträgt, Mikroplatten zur Verfügung zu stellen, welche zu amplifizierende Nukleinsäure für den Nachweis und die Quantifizierung von bestimmten Nukleinsäuren isolieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure in einer Probe, welches die Herstellung einer wässrigen Lösung mit der Probe, einem ersten wasserlöslichen Polymer, einem zweiten wasserlöslichen Polymer, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, und einem oberflächenaktiven Stoff umfasst, und Stillhalten der wässrigen Lösung, damit sich die Lösung in zwei wässrige Phasen trennt, und Trennen der Nukleinsäure und der anderen Bestandteile in unterschiedlichen Phasen.
Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure in einer Probe, welches die Herstellung einer wässrigen Lösung (einer ersten wässrigen Polymerlösung) mit einem ersten wasserlöslichen Polymer und einer wässrigen Lösung (einer zweiten wässrigen Polymerlösung), die ein zweites wasserlösliches Polymer enthält, das zwei wässrige Phasen mit dem ersten wasserlöslichen Polymer bilden kann, umfasst, wobei wenigstens eines davon die Probe und einen oberflächenaktiven Stoff umfasst, in Kontakt bringen der ersten wässrigen Polymerlösung und der zweiten wässrigen Polymerlösung, und Trennen der Nukleinsäure und der anderen Bestandteile in unterschiedliche wässrige Lösungen.
Verfahren für die Isolierung von Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die erste wässrige Polymerlösung und die zweite wässrige Polymerlösung in der Form von laminaren Strömungen in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste wasserlösliche Polymer Polyethylenglycol und das zweite wasserlösliche Polymer Dextran ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der oberflächenaktive Stoff ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Endkonzentration des nichtionischen oberflächenaktiven Stoffs wenigstens 0,05% ist.