DE10201487A1

DE10201487A1 - Verbesserte Gewinnung von linearen Nucleinsäuren durch Salzverdünnung und/oder verminderten Druck vor einer kontinuierlichen Druckdifferenz-Ultrafiltration

Info

Publication number: DE10201487A1
Application number: DE10201487A
Authority: DE
Inventors: Michael S Colman
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2001-01-19
Filing date: 2002-01-16
Publication date: 2002-07-25
Also published as: US20020096474A1; GB2375764A; GB2375764B; US7074333B2; GB0130251D0

Abstract

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft die Abtrennung und/oder Fraktionierung doppelsträngiger linearer Nucleinsäuren unter Verwendung von kontinuierlicher Druckdifferenz-Ultrafiltration, um eine verbesserte Gewinnung kleiner PCR-Produkte zu erreichen. In einer Ausführungsform wird vor der Reinigung durch Ultrafiltration eine Verdünnung der Probe, beispielsweise kleiner PCR-Produkte, durchgeführt. Die anschließende Filtration von beispielsweise linearer DNA unter Verdünnungsbedingungen erhöht die Gewinnung kleinerer PCR-Produkte signifikant und sie verbessert auch die Gewinnung größerer DNA-Fragmente. In einer anderen Ausführungsform wird während der Ultrafiltration ein verringerter Vakuumdruck verwendet, um die Gewinnung kleinerer PCR-Produkte zu erhöhen und auch die Gewinnung größerer DNA-Fragmente zu verbessern.

Description

Verbesserte Gewinnung von linearen Nucleinsäuren durch Salzverdünnung und/oder verminderten Druck vor einer konti nuierlichen Druckdifferenz-Ultrafiltration.

Ultrafiltration mit kleinen Vorrichtungen wird in der bio logischen Forschung, wie der Nucleinsäure- und Proteinfor schung, ein Hauptthema, da Forscher auf diesem Gebiet immer kleinere Mengen verwenden wollen und Automatisierung stär ker verwendet wird. Diese Vorrichtungen sind typischerweise Einzelfiltervorrichtungen, wie sie beispielsweise in der US-A-4 632 761, 4 772 972 und 4 832 851 beschrieben sind, oder Mehrfachvertiefungsplatten, wie sie aus der US-A-5 141 718 und 5 223 133 bekannt sind.

Das Verfahren der Ultrafiltration wird in diesen Vorrich tungen zur Fraktionierung von Molekülen unterschiedlicher Größe voneinander verwendet. Dies kann zur Entfernung von Verunreinigungen aus dem Verfahren oder zur Abtrennung ei ner gewünschten Komponente von einer anderen Komponente in der Probe, beispielsweise nicht-umgesetzten Komponenten, verwendet werden.

Kontinuierliche Druckdifferenz-Ultrafiltration wird häufig zur Reinigung amplifizierter doppelsträngiger DNA-Produkte von verunreinigenden Primern, dNTPs und Salzen beispiels weise vor der Verwendung in Folgeanwendungen, wie DNA- Sequenzierung und Microarraypräparierung verwendet. Dieses Verfahren vereinfacht die Reinigung, wobei es eine minimale Reagenszugabe benötigt, und es ist mit herkömmlichen La borautomatisierungsverfahren hoch kompatibel.

Eine MultiScreen-PCR-Vorrichtung mit 96 Vertiefungen und eine Vorrichtung mit 384 Vertiefungen, die bei Millipore Corporation erhältlich sind, können für diese Ultrafiltra tion verwendet werden. Diese Vorrichtung verwendet Hochva kuum (25 inch Hg) zum Antreiben der Filtration und zum Er reichen einer raschen Trennung der PCR-Produkte von verun reinigenden Reaktionskomponenten. Eine Zahl von 384 PCR- Proben kann in etwa 25 min unter Verwendung einer einzigen Vakuumfiltrationsstufe gereinigt werden. Die PCR- Reaktionsgemische werden auf die Platte geladen und Vakuum wird angegelegt, bis die Vertiefungen vollständig leer sind. PCR-Produkte verbleiben auf dem Filter, während Pri mer, dNTPs und Salze in das Filtrat laufen. Die gereinigten PCR-Produkte werden dann, beispielsweise unter Verwendung einer automatisierten Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung von der Membranoberfläche weg resuspendiert.

Die Gewinnung der PCR-Produkte ist jedoch derart abgestuft, dass eine geringere prozentuale Gewinnung kleiner PCR- Produkte (beispielsweise weniger als 300 Basenpaare) im Vergleich zu größeren Produkten (beispielsweise größer als 300 Basenpaare), die eine erhöhte Gewinnung und mit einer geringeren Schwankung zeigen, beobachtet wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereit stellung eines Verfahrens zur Verbesserung der Gewinnung von DNA-Fragmenten, insbesondere kleinen DNA-Fragmenten durch kontinuierliche Druckdifferenz-Ultrafiltration.

Die Probleme des Standes der Technik wurden durch die vor liegende Erfindung gelöst, die ein Verfahren zur selektiven Entfernung von Verunreinigungen in einer flüssigen Probe liefert, das das Erhöhen der Konzentration der Verunreini gungen durch Zugabe eines Bestandteils, der aus Nucleinsäu rekondensationsmitteln und einwertigen Kationen ausgewählt ist, zu der Probe und das Kontaktieren der Probe mit einer Ultrafiltrationsmembran und das Einwirken einer Druckdiffe renz auf die Probe umfasst.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur selektiven Gewinnung von in einer flüssigen Probe enthaltenen linearen Nucleinsäuren, das das Verdünnen der flüssigen Probe, das Kontaktieren der verdünnten Probe mit einer Ultrafiltrati onsmembran und das Einwirken eines ersten Drucks auf die verdünnte Probe und anschließend das Einwirken eines von dem ersten Druck verschiedenen zweiten Drucks auf die ver dünnte Probe umfasst.

Fig. 1 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion des Vakuumdrucks erläu tert;

Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion inerter Solute erläutert;

Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Pufferzusammensetzung erläutert;

Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion von Kationen erläutert;

Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Kondensation erläu tert;

Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Solutmasse erläu tert;

Fig. 7 ist ein Diagramm, das erläutert, dass die Gewinnung von linearer DNA unabhängig von der Strangform ist; und

Fig. 8 ist ein Diagramm, das die Gewinnung von RNA als Funktion von pH-Wert und Salzen erläutert.

Obwohl die Erfinder der vorliegenden Erfindung an keine spezielle Theorie gebunden sind, ist in Übereinstimmung mit ihren Beobachtungen das differentielle Zurückhalten von einzel- oder doppelsträngigen linearen Nucleinsäurefragmen ten unterschiedlicher Größe eine Funktion der Fragmentlän ge, da lineare doppelsträngige DNA-Moleküle beispielsweise im allgemeinen über die Doppelhelix den gleichen radialen Abstand aufweisen. Der Radius der Drehbewegung eines linea ren Moleküls in einem Strömungsfeld (d. h. gegen die Mem bran) nimmt proportional mit der Fragmentlänge zu. Daher zeigen kleinere PCR-Produkte (die hier und im folgenden als 300 Basenpaare oder weniger aufweisend definiert werden, was teilweise von der verwendeten speziellen Membran ab hängt) kleinere Drehbewegungsradien als größere Fragmente und sie reagieren biophysikalisch sehr unterschiedlich auf geringe Änderungen hinsichtlich der Drehbewegung während der Ultrafiltration. Zusätzlich zur Strömungsrate der Lö sung bestimmt die Beweglichkeit linearer Nucleinsäuren de ren Drehbewegung. Entsprechend erhöht eine erhöhte Beweg lichkeit die Drehbewegungsradien von Soluten aus linearen Nucleinsäuren und sie erhöht dadurch den Reibungskoeffizi enten zwischen den Soluten und den Membranporen. Eine Ver dünnung der Probe dient einem Entsalzen des Phosphatgerüsts der Nucleinsäure, einem Erhöhen von deren Beweglichkeit und sie vermindert deshalb die Filtration kleiner Fragmente und/oder das Ausmaß, in dem diese Fragmente die Membrano berfläche durchdringen, was zu einer erhöhten Gewinnung kleinerer Fragmente durch kontinuierliche Druckdifferenz- Ultrafiltration führt.

Überraschenderweise erhöht eine Verdünnung die Strömungsra te, sie erhöht jedoch auch die Gewinnung, insbesondere kleinerer Fragmente. Eine Verdünnung wird vorzugsweise mit einer beliebigen Flüssigkeit durchgeführt, die die Salzkon zentration verringert und für den Prozess oder einen an schließenden Prozess, wie eine weitere Sequenzierung, nicht schädlich ist, umfassend, ohne hierauf beschränkt zu sein, Wasser, EDTA, TRIS (Trishydrochlorid), TE (ein Gemisch von Trishydrochlorid und Natrium-EDTA), polarisierende Solute, viskositätserhöhende Solute, Gemische der genannten und dgl. Die Salzkonzentration kann auch durch eine Veränderung der Temperatur der Probe verringert werden. Die Temperatur kann die Gewinnung sowohl durch die Probenviskosität als auch die DNA-Salz-Wechselwirkung beeinflussen. Vorzugsweise wird das Verdünnen unter Verwendung eines geeigneten Puf fers, der vorzugsweise TRIS oder TE ist, durchgeführt. Die Strömung beeinflussende inerte Solute, wie Glycerin und Netzmittel, sind für eine verbesserte Gewinnung nicht not wendig, obwohl sie in geringen Konzentrationen (beispielsweise 0,1%) vorhanden sein können.

Das Ausmaß der Verdünnung kann in Abhängigkeit von der Identität der PCR-Produkte, dem Ausmaß der gewünschten ver besserten Gewinnung, Überlegungen hinsichtlich der Filtra tionsdauer und dem Volumenfassungsvermögen der Vorrichtung, in der die Verdünnung durchgeführt wird, variieren. Vor zugsweise wird eine 3- bis 5fache Verdünnung der Reaktions produkte durchgeführt. Die Verdünnung kann durch beliebige geeignete Mittel, wie Mischen der Reaktionsprodukte mit dem Verdünnungsmediufn in einen geeigneten Gefäß oder direkt in der Filtrationsvorrichtung, beispielsweise einer MultiScre en-PCR-Platte, durchgeführt werden. Die Gesamtprobenvolumi na betragen allgemein weniger als 1000 µl. Das Volumen wird teilweise durch das Fassungsvermögen der Vorrichtung dik tiert.

Alternativ können bestimmte Fälle auftreten, in denen es günstig ist, die Salzkonzentration einer Probe zu erhöhen, wenn beispielsweise kleine Verunreinigungen, die in an schließenden Prozessen, wie DNA-Sequenzierung, Klonieren, einem Microarray oder Einzelnucleotidpolymorphismusanalyse, stören könnten, günstigerweise entfernt werden sollen. Die Salzkonzentration kann durch beliebige geeignete Mittel, wie die Zugabe von Nucleinsäurekondensationsmitteln, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, mehrwertige Kationen, wie Mangan, Magnesium und Hexamincobaltchlorid; Polyamine, wie Spermin und Spermadin; basische Proteine, wie Histone; ka tionische Netzmittel, wie Cetyltrimethylammoniumbromid; neutrale Knäuelungspolymere, wie Polyethylenglykol; und Ge mische derselben umfassen, und die Zugabe einwertiger Ka tionen, wie Natrium, Kalium und Ammonium, erhöht werden. Dieses Verfahren kann auch zur Abtrennung linearer Nuclein säuren von ringförmigen Nucleinsäuren verwendet werden.

In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Filtration unter einem verminderten Vakuumdruck zur Erhöhung der Gewinnung von kleineren (weniger als 300 Basenpaare) PCR-Produkten sowie zur Verbesserung der Gewin nung größerer PCR-Produkte durchgeführt. Ein verminderter oder geringer Vakuumdruck beträgt üblicherweise weniger als etwa 25 in Hg, zweckmäßigerweise 10-20 in Hg, vorzugsweise etwa 10 in Hg. Vakuumdrücke von weniger als etwa 10 in Hg sind benutzbar, jedoch schwierig zu kontrollieren und sie erhöhen die Filtrationsdauer.

Ein Vorteil der Überwachung des für die Filtration verwen deten Drucks ist die Möglichkeit, einen weiteren Bereich von Membranen für die gleiche Trennung zu verwenden. Daher kann ein niedrigerer Vakuumdruck (beispielsweise 10-12 in Hg) für porösere Membranen verwendet werden und ein höherer Vakuumdruck (beispielsweise 20 in Hg) für weniger poröse Membranen verwendet werden. Außerdem kann ein abnehmender bzw. zunehmender Druck verwendet werden, beispielsweise kann ein höherer Vakuumdruck am Beginn des Filtrationsvor gangs verwendet werden und anschließend kann der Vakuum druck beim Fortschreiten der Filtration verringert werden, oder umgekehrt.

Die Filtrationsdauer variiert in Abhängigkeit vom verwende ten Druck und der gewünschten Gewinnung. Im allgemeinen werden mit vermindertem Vakuumdruck längere Zeiträume benö tigt. Beispielsweise können, wenn 15 Minuten zuvor für eine akzeptable Gewinnung bei 25 in Hg erforderlich waren, 25 Minuten bei 10 in Hg für eine zu erreichende signifikante Gewinnungsverbesserung nötig sein. Ein Fachmann kann ohne weiteres geeignete Filtrationszeiten ohne unnötige Versuche bestimmen.

Alternativ können bestimmte Fälle auftreten, in denen es günstig ist, die Salzkonzentration einer Probe zu erhöhen, beispielsweise wenn es günstig ist, kleine Verunreinigun gen, die anschließende Prozesse, wie DNA-Sequenzierung, Klonieren, einen Microarray oder eine Einzelnucleotidpoly morphismusanalyse, stören könnten, zu entfernen. Die Strö mungsrate kann durch Erhöhen des Drucks erhöht werden. Die ses Verfahren kann zur Abtrennung linearer Nucleinsäureri von ringförmigen Nucleinsäuren verwendet werden.

Ein Fachmann kann die Effizienz beider Verfahren zur weite ren Erhöhung der Gewinnung, insbesondere kleinerer Nuclein säuren kombinieren. Daher kann die Druckänderung in Kombi nation mit der Salzkonzentrationsänderung bei Bedarf ver wendet werden.

Beispiel 1 Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion des Vakuumdrucks

20-µl-PCR-Reaktionsgemische zunehmender Produktgrößen (n = 96, jedes Produkt bei jeder Betriebsbedingung) wurden unter Verwendung von MultiScreen-384-PCR-Platten gereinigt und während entweder 15 oder 25 min bei 25 bzw. 10 in Hg zur Trockene filtriert. Die gereinigten Proben wurden in 100 µl Trisethylendiamindiessigsäurepuffer resuspendiert und die Gewinnung in Massenprozent wurde durch Konzentration gegen über ungereinigtem Ausgangsmaterial unter Verwendung eines Fluoreszenz-basierenden Lösungstests mit SYBR Green I- Nucleinsäureanfärbung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Eine erhöhte Gewinnung, insbesondere von kleine rer linearer doppelsträngiger DNA ist beim verringerten Va kuumdruck von 10 in Hg belegt.

Beispiel 2 Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion eines inerten Soluts

20-µl-PCR-Reaktionsgemische zunehmender Produktgrößen (n = 96, jedes Produkt in jedem Puffer) wurden unter Verwendung von MultiScreen-384-PCR-Platten gereinigt und während ent weder 15 oder 25 min bei 10 in Hg ohne bzw. mit Netzmittel (Triton X-100 bei 0,1% Endkonzentration) filtriert. Die gereinigten Proben wurden resuspendiert und die Gewinnung in Massenprozent wurde unter Verwendung des SYBR Green I- Gewinnungstests bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 an gegeben. Eine erhöhte Gewinnung, insbesondere von kleinerer linearer doppelsträngiger DNA ist mit Netzmittel belegt.

Beispiel 3 Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Pufferzusammensetzung

20-µl-PCR-Reaktionsgemische zunehmender Produktgrößen (n = 96, alle Produkte unverdünnt) wurden unter Verwendung von Multiscreen-384-PCR-Platten gereinigt und während 15 min filtriert und 100-µl-PCR-Produkte einer Verdünnung 1 : 5 (n = 96, jedes Produkt mit TE-Puffer verdünnt) wurden 20 min bei 10 in Hg filtriert. Die gereinigten Proben wurden resuspen diert und die Gewinnung in Massenprozent wurde unter Ver wendung des SYBR Green I-Gewinnungstests bestimmt. Die Er gebnisse sind in Fig. 3 angegeben. Eine erhöhte Gewinnung, insbesondere von kleinerer linearer doppelsträngiger DNA ist mit verdünnter Probe belegt.

Beispiel 4 Gewinnung von kleiner linearer doppelsträngiger DNA als Funktion von Kationen

Unter Verwendung von MultiScreen-PCR-Platten (96 Vertiefun gen) wurden 50-µl-PCR-Reaktionsgemische eines Produkts mit 137 Basenpaaren unter Verwendung unterschiedlicher Verdün nungsmittel (wie in Fig. 4 angegeben; n = 24, jedes Verdün nungsmittel bei jedem Druck) 1 : 3 verdünnt und durch Filtra tion zur Trockene bei entweder 25 oder 10 in Hg Vakuumdruck gereinigt. Die Proben wurden in 50 µl Trisethylendi amindiessigsäurepuffer resuspendiert und die Gewinnung in Prozent wurde unter Verwendung von SYBR Green I- Nucleinsäureanfärbung bestimmt. Wie in Fig. 4 gezeigt, ist der Effekt der Salzkonzentration auf die Fraktionierung (durch die Gewinnung ermittelt) bei einem höheren Vakuumbe triebsdruck stärker ausgeprägt. Bei niedrigerem Vakuumdruck belegen die differentiellen Effekte von 50 mM Kaliumchlorid und 1,5 mM Magnesiumchlorid, dass Salzeffekte eher eine Funktion der Kationenart und der Konzentration als ein anionischer Effekt sind. Ein größerer Fraktionierungsgrad ist mit einer weitaus geringeren Menge eines zweiwertigen Kations (Magnesium) als bei Verwendung eines einwertigen Kations (Kalium) erreichbar, wobei ihre kombinierten Wir kungen additiv sind.

Beispiel 5 Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Kondensation

Unter Verwendung von MultiScreen-PCR-Platten (96 Vertiefun gen) wurden 50-µl-PCR-Reaktionsgemische eines Produkts mit 301 Basenpaaren unter Verwendung unterschiedlicher Verdün nungsmittel (wie in Fig. 5 angegeben; n = 16, jedes Verdün nungsmittel bei jedem Druck) 1 : 3 verdünnt und durch Filtra tion zur Trockene bei entweder 25 oder 10 in Hg Vakuumdruck gereinigt. Die Proben wurden in 50 µl Trisethylendiamin diessigsäurepuffer resuspendiert und die Gewinnung in Pro zent wurde durch Konzentration gegenüber ungereinigtem Aus gangsmaterial mittels Gelelektrophorese, Ethidiumbromid anfärbung und densitometrische Abtastung bestimmt. Wie in Fig. 5 gezeigt, werden bei hohem Vakuumdruck additive Wir kungen von einwertigen und zweiwertigen Kationen beobach tet, während bei niedrigerem Druck synergistische Wirkungen beobachtet werden. Diese Daten belegen, dass die Wirkung des zweiwertigen Kations, Magnesium, wahrscheinlich das Er gebnis einer molekularen Kondensation gegenüber einem ein fachen Aussalzen des Phosphatgerüsts der DNA, das die grö ßere Konzentration von Kalium in Anwesenheit oder Abwesen heit des Magnesiums ohne weiteres erreichen könnte, ist.

Beispiel 6 Gewinnung von linearer doppelsträngiger DNA als Funktion der Solutmasse

Ein Produkt mit 301 Basenpaaren, das längere Runden ampli fiziert worden war und ein dreifach höheres Produkt ergab, wurde unter Verwendung von Multiscreen-PCR gereinigt und mit der Reinigung einer typischen Ausbeute des Produkts mit 301 Basenpaaren verglichen. 50-µl-unverdünnte-PCR- Reaktionsgemische (n = 16, jeweils) wurden durch Filtration zur Trockene bei 25 in Hg Vakuumdruck gereinigt. Die Proben wurden in 50 µl TE-Puffer resuspendiert und die Gewinnung in Prozent wurde durch die Konzentration gegenüber ungerei nigtem Ausgangsmaterial mittels Geldensitometrie bestimmt. Wie in Fig. 6 gezeigt, erhöht die Zugabe von Solutmasse die prozentuale Gewinnung.

Beispiel 7 Die Gewinnung von linearer DNA ist von der Strangform unab hängig

Fluoreszenz-markierte Oligonucleotide unterschiedlicher Länge wurden aus 20 µl unter Verwendung einer MultiScreen- 384-SEQ-Platte in TE-Puffer oder in einem 1 : 2 verdünnten Blindminisequenzreaktionsgemisch (matrizenfrei; 5 mM Tris- HCl, pH-Wert 8,3, 15 mN Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesium chlorid, 25 µM der einzelnen dNTPs) zur Trockene filtriert. Die Proben wurden in 100 µl TE-Puffer resuspendiert und die prozentuale Gewinnung gegenüber jedem aufgegebenen Oligo nucleotid wurde durch relative Fluoreszenz bestimmt (n = 96, jeweils). Die Ergebnisse sind in Fig. 7 angegeben. Das Verhalten von Nucleinsäuren bei kontinuierlicher Druckdif ferenz-Ultrafiltration ist nicht auf doppelsträngige Frag mente beschränkt. Kurz einzelsträngige Oligonucleotide zei gen in Gegenwart von Salzen ähnliche Fraktionierungseigen schaften.

Beispiel 8 Gewinnung von RNA als Funktion des pH-Werts und von Salzen

Transfer-RNA (70-80 Basen) wurde in entweder Wasser oder TE-Puffer, pH-Wert 8,0, basierenden Lösungen, die zunehmen de Salzmengen enthielten verdünnt, bevor S00 ng pro Vertie fung unter Verwendung von MultiScreen-384-SEP-Platten fil triert wurden.

Wie in Fig. 8 gezeigt, verstärkt Puffer allein gegenüber Wasser die Gewinnung der tRNA in einem ähnlichen Ausmaß wie eine 10 mN Salzlösung in Wasser. Diese Daten legen nahe, dass die Wirkung von TE auf die tRNA-Gewinnung wahrschein lich ein Salzeffekt der Einführung einer Basenpaarung in der RNA-Sekundärstruktur ist, jedoch größere Gesamtsalzkon zentrationen eine umgekehrte Wirkung auf die Gewinnung be sitzen. Diese Daten schließen jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass die Wirkung von TE auf dem pH-Wert beruht. Des senungeachtet erhöht eine Erhöhung der Salzkonzentration das Potential der RNA-Fraktionierung und sie vermindert da durch die Gewinnung nach einer kontinuierlichen Druckdiffe renz-Ultrafiltration.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Entfernung von Verunreinigun gen in einer flüssigen Probe, das das Erhöhen der Kon zentration der Verunreinigungen durch Zugabe eines Be standteils, der aus Nucleinsäurekondensationsmitteln und einwertigen Kationen ausgewählt ist, zu der Probe und Kontaktieren der Probe mit einer Ultrafiltrations membran und Einwirken einer Druckdifferenz auf die Probe umfasst.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Nucleinsäurekon densationsmittel aus der aus Mangan, Magnesium, Hexamincobaltchlorid, Spermin, Spermadin und Gemischen derselben bestehenden Gruppe ausgewählt sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die einwertigen Ka tionen aus der aus Natrium, Kalium und Ammonium beste henden Gruppe ausgewählt sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Druckdifferenz eine konstante Druckdifferenz ist.

5. Verfahren zur selektiven Gewinnung von in einer flüs sigen Probe enthaltenen linearen Nucleinsäuren, das das Verdünnen der flüssigen Probe, das Kontaktieren der verdünnten Probe mit einer Ultrafiltrationsmembran und das Einwirken eines ersten Drucks auf die verdünn te Probe und anschließend das Einwirken eines von dem ersten Druck verschiedenen zweiten Drucks auf die ver dünnte Probe umfasst.