DE69731939T2

DE69731939T2 - Isolierung von einzelsträngigen nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69731939T2
Application number: DE69731939T
Authority: DE
Inventors: Jaap Goudsmit; Johannes Cornelis SOL; Gualbertus Marcellinus BELD; Rene Willem BOOM
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-02-15
Also published as: JP2000505295A; DE69731939D1; AU723900B2; EP0880537A1; AU1676697A; KR19990082522A; JP3943597B2; KR100483498B1; US20010021518A1; EP0880537B1; CA2245888C; ES2235225T3; US7238530B2; WO1997030062A1; ATE284891T1; CA2245888A1

Description

Die Erfindung betrifft das Feld der Reinigung und Verstärkung von Nukleinsäuren aus einer Nukleinsäure, die Ausgangsmaterialien enthält, insbesondere aus biologischen Materialien wie Urin, Fäkalien, Sperma, Speichel, Blut als solches, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten, Anteilen von solchen Flüssigkeiten wie Leukozytenanteilen (Leukozytenfilm oder crusta phlogistica), Zellkulturen und ähnlichem, aber auch Proben aus der Umgebung wie Boden, Wasser und ähnlichem.
Bis vor kurzem war die Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren aus komplexen Mischungen wie oben beschrieben arbeitsintensive Prozeduren mit vielen Schritten. In EP 0 389 063 wird eine einfache und schnelle Reinigung von Nukleinsäurematerial aus einer komplexen Mischung offenbart. Dieses Verfahren umfasst die Behandlung der komplexen Mischung, wie Blut im Ganzen mit einem chaotropischen Agens in Gegenwart eines Nukleinsäure bindenden Siliziumdioxid festes Phasenmaterial unter Bedingungen, die das Binden vom gesamten Nukleinsäurematerial an die feste Phase und das Trennen der besagten festen Phase aus der Mischung gestatten. Die Referenz zeigt, dass sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren an die feste Phase gebunden wird, wenn diese in einer Mischung vorhanden sind. Die Referenz zeigt auch die Verstärkung (PCR) einer bestimmten Nukleinsäure mit einer bekannten Sequenz, von der man annimmt, dass sie in einer Mischung auftreten.
Zusätzlich zur Isolierung vom gesamten Nukleinsäurematerial offenbart die internationale Anwendung WO 95/04140 ein Verfahren zur Isolierung von ausschliesslich doppelsträngiger DNS unter Einsatz einer Siliziumdioxid festen Phase und eines chaotropischen Agens unter den geeigneten Bedingungen.
Eine Fraktionierung von Mischungen von doppel-(ds) und einzel-strängigen (ss) Nukleinsäuren (NA) in einzel- und doppel-strängigen Formen wird häufig benötigt beispielsweise in der Trennung von markierten ss-NA Proben aus ds-Hybriden, in der Trennung von in vitro Transkripten aus ds-DNS Templates, und in der Trennung von genomischer DNS aus mRNS. Derzeit kann die Trennung von verschiedenen Arten von Nukleinsäuren durch unterschiedliche Techniken erreicht werden. Electrophorese kann eingesetzt werden, um verschiedene Formen von Nukleinsäuren zu fraktionieren, wobei dies auf Grund der Unterschiede in Grösse und Form (1–3) möglich ist. Zentrifugierung nutzt zum Vorteil Unterschiede in der Dichte (4), und kürzlich ist die Technologie der hoch auflösenden Flüssigchromatographie (HPLC) angewandt worden, um einzel- und doppel-strängige DNS und RNS Moleküle (5–8) zu trennen und zu reinigen.
RNS, die von eukaryotischen Zellen durch die heutzutage am meisten und breitesten eingesetzte Verfahren (9) gereinigt worden ist, scheint signifikante Mengen von genomischer DNS zu enthalten, eine Adaptation davon, die genomische DNS Kontamination des ss-RNS Teils vermindert, ist kürzlich beschrieben worden (10).
Es ist nicht möglich, einzelsträngiges und/oder doppelsträngiges Material getrennt zu betrachten, wenn man das Verfahren nach der EP 0 389 063 oder der WO 95/04140 einsetzt.
Die vorliegende Erfindung liefert daher ein Verfahren zum Trennen von einzelsträngigem Nukleinsäure-Material aus doppelsträngigem Nukleinsäure-Material wie es in Anspruch 1 beschrieben ist, mit dem Kontaktieren einer Mischung von sowohl mit einer Flüssigkeit mit einem chaotropischen Agens und einer Nukleinsäure bindenden festen Phase, wobei die Flüssigkeit eine Zusammensetzung dergestalt, dass doppelsträngige Nukleinsäure an die feste Phase bindet und eine wesentliche Menge von einzelsträngiger Nukleinsäure dies nicht tut, und mit dem Trennen der festen Phase aus der Flüssigkeit. Geeignete Umstände, um zu solch einer Trennung zu gelangen, können durch den Fachmann leicht bestimmt werden.
Umstände, unter denen doppelsträngiges Material an das feste Material bindet und einzelsträngiges Material, wird variieren, wesentliche Parameter, um solche unterschiedliche Bindungen zu erhalten, sind die Konzentration des chaotropischen Agens, die grob gesehen zwischen 1–10 M, vorzugsweise zwischen 3–6 M und insbesondere um die 5 M angelegt, sein sollte; die Konzentration des chelatbildenden Agens, das in dem Fall, das EDTA angewandt wird, gleich oder grösser sein sollte als 10 mM und vorzugsweise nicht grösser als 1 M; der pH-Wert der wässrigen Lösung, in der die Trennung auszuführen ist, sollte über 2 sein, wenn ein Thiocyanat als chaotropischer Agens eingesetzt wird, und er sollte kleiner sein als 10, weil ansonsten immer ein Risiko besteht, dass das ds Material ss werden wird. Die Temperatur, bei der das Verfahren ausgeführt wird, scheint nicht kritisch zu sein, es ist jedoch wahrscheinlich am besten, sie zwischen 40 Grad Celsius und 60 Grad Celsius zu halten. Ein wesentlicher Aspekt des Verfahrens ist natürlich, dass das ds Material während der Trennung doppelsträngig verbleibt. Unter den Umständen, wie sie oben beschrieben worden sind, wird dies normalerweise der Fall sein, falls die ds Nukleinsäure mindestens 50 bp lang ist bei 40% GC Basispaaren. Der Fachmann weiss, wie diese Länge variieren kann bei geringerem oder höherem GC Gehalt. In van Ness et al. (26) und/oder Thompson et al. (27) wird gezeigt, dass das gesamte Verfahren von den verwickelten Wechselwirkungen zwischen den oben erwähnten Faktoren abhängt. Unter Einsatz dieser Offenbarung und den erwähnten Referenzen wird der Fachmann fähig sein, die Umstände an sein bestimmtes Verfahren anzupassen.
Chaotropische Agentien sind ein sehr wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung. Sie sind definiert als jegliche Substanz, die die sekundäre, tertiäre und/oder quaternäre Struktur der Nukleinsäuren verändern kann. Diese sollten keinen wesentlichen Effekt auf die primäre Struktur der Nukleinsäure haben. Falls Nukleinsäuren vorliegen, die anderen Molekülen zugeordnet sind, wie Proteine, können diese Zuordnungen auch durch dieselben oder verschiedenen chaotropischen Agentien verändert werden. Viele chaotropische Agentien sind für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung geeignet, sie Natriumiodid, Kaliumiodid, Natrium(iso)thiocyanat, Harnstoff oder Guanidinesalze, oder Kombinationen davon. Eine bevorzugte Klasse von chaotropischen Agentien gemäss der Erfindung sind Guanidinesalze, von denen Guanidinethiocyanat das am meisten bevorzugte ist.
Durch glücklichen Zufall haben wir gefunden, dass ss-Nukleinsäure nicht an Siliziumdioxid-Partikel oder zweiatomige Erden in Gegenwart von Puffer L11 (siehe Beispiele) binden, wohingegen ds Nukleinsäure es tat. Experimente unter verschiedenen Umständen haben gezeigt, dass das Hinzufügen von Mg²⁺ oder anderen positiven (bivalenten) Ionen an die ungebundene Fraktion von grosser Wichtigkeit war. Die besten Ergebnisse sind mit einer Konzentration an bivalenten Ionen (Mg²⁺) von ungefähr gleich zu der Konzentration des chelatbildenden Agens (EDTA) erhalten worden.
Die einzusetzende feste Phase ist weniger kritisch. Wesentlich ist, dass es Nukleinsäuren reversibel binden sollte.
Viele solche Materialien sind bekannt, von denen eine gewisse Anzahl Silizium-basiert sind, wie Aluminium-Silikat und ähnliches, vorzugsweise Siliziumdioxid. Siliziumdioxid bedeutet, SiO₂ Kristalle und andere Formen von Siliziumoxiden zu umfassen, wie Diatomskelette, Glaspulver und/oder Partikel und amorphe Siliziumoxide. Die feste Phase kann in jeglicher Form vorliegen, es kann sogar das Gefäss sein, welches die Nukleinsäure-Mischungen oder einen Teil von solch einem Behälter enthält. Es kann auch ein Filter oder jegliche andere geeignete Struktur sein. Abgesehen von Silizium-basierten Materialien sind auch andere Materialien geeignet, wie Nitrozellulose (Filter), Latex-Partikel und andere Polymer-Substanzen. Eine bevorzugte Form der festen Phase ist eine partikuläre Form, die eine einfache Trennung des gebundenen und des freien Materials gestattet, beispielsweise durch Zentrifugierung. Die Partikelgrösse der festen Phase ist nicht kritisch. Geeignete mittlere Partikelgrössenbereiche liegen zwischen 0.05 und 500 Mikrometer. Vorzugsweise wird der Bereich so gewählt, dass mindestens 80, vorzugsweise 90 Prozent der Partikel eine Grösse aufweisen, die zwischen den Werten liegen, die eben erwähnt worden sind. Dasselbe gilt für die bevorzugten Bereiche, von denen die mittleren Partikelgrössen zwischen 0.1 und 200 Mikrometer liegen, vorzugsweise zwischen 1 und 200 Mikrometer. Die Bindekapazität eines gegebenen Gewichts der Partikel erhöht sich mit abnehmender Grösse, die untere Grenze der Grösse ist jedoch erreicht, wenn Partikel nicht in einfacher Weise nach einer Trennung redispersiert werden können, beispielsweise durch Zentrifugierung. Dies wird der Fall sein bei Startmaterialien, die reich sind an Nukleinsäuren, die viele Nukleinsäuren eines höheren Molekulargewichts enthalten. Die Partikel und die Nukleinsäuren können in diesen Fällen Aggregate ausbilden. Der Fachmann wird fähig sein, die richtige Partikelgrösse für die bestimmte vorgesehene Anwendung zu wählen. Die Ausbildung der Aggregate kann durch Einsatz von fraktioniertem Siliziumdioxid oder diatomare Erde in einer Anzahl von Anwendungen vermieden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren von einzelsträngigem Nukleinsäure-Material aus einer Mischung von Nukleinsäure-Material, mit den Schritten des Unterwerfens der Mischung einem Verfahren wie oben beschrieben und Behandeln des Supernatants, das das einzelsträngige Nukleinsäure-Material, mit einer zweiten Flüssigkeit mit einem chaotropischen Agens und einer zweiten Nukleinsäure bindenden festen Phase, wobei die zweite Flüssigkeit eine Zusammensetzung dergestalt hat, dass es der sich ergebenden Mischung des Supernatants und der zweiten Flüssigkeit gestattet, das einzelsträngige Nukleinsäure-Material an die zweite feste Phase zu binden.
Dieserart wird das doppelsträngige Nukleinsäure-Material aus der rohen Mischung entfernt und die einzelsträngige Nukleinsäure wird aus der verbleibenden immer noch rohen Mischung in einem anderen Einzelschritt gereinigt. Sowohl das doppelsträngige Material als auch das einzelsträngige Material werden reversibel an die jeweiligen festen Phasen gebunden, so dass sie in einfacher Weise auf der besagten festen Phase eluiiert werden können, um weitere Analyse oder andere Behandlungen durchzuführen. Eine sehr nützliche weitere Behandlung ist die Verstärkung des (doppel- oder einzelsträngigen) Nukleinsäure-Material.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Abriss des Protokolls R
Wiedergewinnung der ds-NA findet statt von dem ursprünglichen Pressling (R-Pressling), Wiedergewinnung der ss-NA findet statt von dem ursprünglichen Supernatants (R-sup). L11, L10, L6 und L2 sind GuSCN basierte Puffer; SC ist Siliziumbasierte Suspension. Für Details wird auf den Abschnitt Materialien % Verfahren Abschnitt verwiesen.
2: Trennung von ds-DNS und ss-DNS
NA ist gereinigt worden (im Doppel) durch Protokoll R aus einer Mischung von ds-DNS (Phage Lambda, HiadIII Digest, 1 μg) und ss-DNS (Phage M13 DNS, 500 ng). Letztendliche Elutionen waren in 50 μl TE und 25 μl sind durch 1% Agarose Gel (enthaltend Äthidiumbromid) elektrophoresiert worden, was nachfolgend unter UV-Beleuchtung photographiert worden ist. Fahne 1, 100% Wiedergewinnungsmarker für ds-DNS Fragmente; Fahne 2, 100% Wiedergewinnungsmarker für ss-DNS; Fahne 3, 100% Wiedergewinnungsmarker-Mischung ds-DNS/ss-DNS; Fahnen 4 und 5, Ausgangs-Protokoll R-Pressling; Fahnen 6 und 7, Ausgangs-Protokoll R-sup.
3: Trennung von ds-RNS und ss-RNS
NA ist gereinigt worden (im Doppel) durch Protokoll R aus einer Mischung von ds-RNS (Rotavirus ds-RNS) und ss-RNS (Phage MS2 RNS, 800 ng). Letztendliche Elutionen waren in 50 μl TE und 25 μl sind durch 1% Agarose Gel (enthaltend Äthidiumbromid) elektrophoresiert worden, was nachfolgend unter UV-Beleuchtung photographiert worden ist. Fahne 1, 100% Wiedergewinnungsmarker für ds-RNS Fragmente; Fahne 2, 100 Wiedergewinnungsmarker für ss-RNS; Fahne 3, 100 Wiedergewinnungsmarker für ds-RNS/ss-RNS Mischung; Fahnen 4 und 5, Ausgangs-Protokoll R-Pressling; Fahnen 6 und 7, Ausgangs-Protokoll R-sup.
4: Trennung von ds-DNS und ss-RNS
NA ist gereinigt worden (im Doppel) durch Protokoll R aus einer Mischung von ds-DNS (750 ng Phage Lambdas verdaut durch HindIII) und ss-RNS (Phage MS2 RNS, 800 ng). Letztendliche Elutionen waren in 50 μl TE und 25 μl sind durch 1% Agarose Gel (enthaltend Äthidiumbromid) elektrophoresiert worden, was nachfolgend unter UV-Beleuchtung photographiert worden ist. Fahne 1, 100% Wiedergewinnungsmarker für ds-DNS Fragmente; Fahne 2, 100% Wiedergewinnungsmarker für ss-RNS; Fahne 3, 100 Wiedergewinnungsmarker für ds-DNS/ss-RNS Mischung; Fahnen 4 und 5, Ausgangs-Protokoll R-Pressling; Fahnen 6 und 7, Ausgangs-Protokoll R-sup.
5: Trennung von ds-DNS und ss-RNS
NA ist gereinigt worden durch Protokoll R aus einer Mischung von ds-DNS (1000 ng linearisiertes pHC624, 2 kb) und ss-RNS (Phage MS2 RNS, 800 ng). Letztendliche Elution war in 50 μl TE und 25 μl oder zehnfache serielle verdünnungen der SS-NA Fraktion sind durch 1% Agarose Gel (enthaltend Äthidiumbromid) elektrophoresiert worden, was nachfolgend unter UV-Beleuchtung photographiert worden ist.
Panel A: Obere Reihe: Fahne 1, HindIII verdaute Phage Lambda DNS; Fahne 2, 100% Wiedergewinnungsmarker für ds-DNS und ss-RNS und zehnfache Verdünnungen davon (Fahnen 3 bis 6); Bodenreihe, Ausgang des Protokolls R-sup (Fahne 2) und zehnfache serielle Verdünnungen (Fahne 3 bis 6).
Panel B: ds-DNS ist nachfolgend einem Nitrozellulosefilter transferiert und mit einer ³²P-markierten Probe hybridisiert worden, die homolog zu Eingangs ds-DNS ist. Es ist auf ds-DNS und Ss-RNS hingewiesen worden.
6: Trennung von genomischer DNS und ss-RNS
Wie wird ss-RNS gefangen. E. coli Bakterien sind direkt als Eingangsmaterial für das doppelte Extrahieren durch das Protokoll R (Fahnen 6 und 7; R-Pressling; Bahnen 8 und 9; R-sup) eingesetzt worden. Alternativ ist das gesamte NA zuerst durch Protokoll Y unter Einsatz von Diatomen für das Protokoll R (was genomische DNS schert) gereinigt worden. Die gereinigten Nukleinsäuren sind nachfolgend als Eingang für das Protokoll R (Bahnen 2 und 3, R-Pressling; Bahnen 4 und 5, R-sup) eingesetzt worden. Letztendliche Elution war in 50 μl TE und 25 μl sind durch 1% Agarose Gel (enthaltend Äthidiumbromid) elektrophoresiert worden, was nachfolgend unter UV-Beleuchtung photographiert worden ist.
Markierungsbahnen 1 und 10 (500 ng Phae Lambda DNS, HindIII verdaut). 23S und 16S rRNS und ds-DNS Molekulargewichtsmarker (23 kb und 2.0 kb) sind gezeigt.
7: Abriss der Prozedur
8
Einzel-strängige Nukleinsäure ist aus Proben, die HIV-1 RNS und TE umfassen (negative Kontrolle) enthalten, durch das Protokoll R-sup gereinigt worden und nachfolgend mit dem nicht-selektiven RT-PCR verstärkt.
Panel A: Fahne 1, 100 bp DNS-Leiter; Fahnen 2 und 3 zeigen negative Auszugskontrollen; Fahnen 4 und 5 nicht selektive verstärkte HIV-1 RNS; Fahnen 6, 7, 8 und 9, 600, 60, 6 beziehungsweise 0 Moleküle des pHCrec (positive PCR-Steuerung).
Panel 8: Southern Blot Hybridisierung mit ³²P-markierten HIV-1 Proben (mit enthaltenen GAG, POL und ENV-Genen des Hiv-1) der in Panel A gezeigten Proben. Nach der Hybridisierung über Nacht bei 65 Grad Celsius in 6 × SSC, 0,1% SDS,. 10 Dextransulfat und 50 μg/l Lachssperma DNS, ist der Filter nachfolgend gewaschen worden unter starken Reinheitsbedingungen mit 0,1 SSC/0,1% SDS bei 65 Grad Celsius und auf einem Röntgenfilm für zwei Stunden bei –70 Gard Celsius autoradiographed worden. Dieses Experiment hat gezeigt, dass die meisten der sichtbaren Fahnen auf dem Äthiniumbromid gefärbten Agarosegel von dem HIV-1 Genom hervorgehen.
The Erfindung wird nun im Folgenden in grösserem Detail mit Hilfe der beigefügten Beschreibung näher beschrieben.
Trennung/Isolierung
Materialien und Verfahren
Quelle der Nukleinsäuren
Phage MS-2 ss-RNS (3569 nt), E. coli rRNS (16 und 235; jeweils 1,7 kb und 3,5 kb), Phage M13 ss-DNS (7599 nt) und HindIII verdaute Phage Lambda ds-DNS sind von Boehringer (Mannheim, Deutschland) gekauft worden. Rotavirus ds-RNS ist aus Fäkalien eines infizierten Individuums durch Protokoll Y/SC (11) gereinigt worden. Plasmid DNS ist aus E. coli HB101 wie durch Ish-Horowicz und Burke (13) beschrieben gereinigt worden, gefolgt von Säulenchromotographie mit Sepharose CL2B (Pharmacia, Inc. Uppsala, Schweden). Gesamte NA ist aus E.coli durch das Protokoll Y/D (11) gereinigt worden.
Chemikalien
Guanidinethiocyanat (GuSCN) ist von Fluka (Buchs, Schweiz) erhalten worden.
EDTA (Titriplex) und MgC12·6H20 ist von Merck (Darmstadt, Deutschland) erhalten worden. TRIS ist von Boehringer (Mannheim, Deutschland) erhalten worden. Die Herstellung von grössen-fraktionierten Siliziumdioxid-Partikel (Siliziumdioxid grob, SC) und diatome Suspension ist beschrieben worden (11). Triton X-100 war von Packard (Packard Instrument Co., Inc., Downers Grove, Ill).
Zusammensetzung von Puffern
Der Lyse/Binde-Puffer L6, der Wasch-Puffer L2, und TE (10 mM Tris·HCl, 1 mM EDTA; pH = 8.0) ist beschrieben worden (11). 0.2 M EDTA (pH 8.0) ist durch Auflösen von 37.2 g EDTA (Merck, Deutschland) und 4.4 g NaOH (Merck, Deutschland) in aqua zu einem Gesamtvolumen von 500 ml hergestellt worden. Lyse/Binde-Puffer L11 ist durch Auflösen von 120 g von GuSCN in 100 ml 0.2 M EDTA (pH = 8.0) hergestellt worden.
Binde-Puffer L10 ist durch Auflösen von 120 g GuSCN in 100 ml 0.35 M TRIS·HCl (pH 6.4) hergestellt worden; nachfolgend sind 22 ml 0.2 M EDTA (pH 8.0) und 9.1 g Triton X-100 hinzugefügt worden und die Lösung ist homogenisiert worden; schliesslich sind 11 g von festem MgCl₂·6H₂O hinzugefügt worden. Die endgültige Konzentration von MgCl₂ in L10 liegt bei ungefähr 0.25 M. L10 ist für mindestens 1 Monat stabil, wenn es bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert werden.
Fraktionierung von ds-NA und ss-NA durch das Protokoll R
Das Verfahren wird in 1 umrissen. Ein 50 μl Muster (mit einer Mischung von NA-Typen in TE Puffer) ist zu einer Mischung von 900 μl L11 und 40 μl SC in einer Eppendorf-Röhre hinzugefügt worden und ist nachfolgend durch Verwirbeln homogenisiert worden. Nach 10 Minuten Binden bei Raumtemperatur ist die Röhre zentrifugiert worden (2 Minuten bei ungefähr 10.000 × g), was in einem Siliziumdioxid/ds-NA Pressling ("ursprünglicher Siliziumdioxid-Pressling") und einem Supernatant umfassend ss-NA resultierte.
Um ss-NA Formen (Protokoll R-sup) wiederzugewinnen, sind 900 μl des Supernatants zu einer Mischung des 400 μl L10 und 40 μl SC hinzuzufügen und ss-NA sind während einer 10 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur gebunden worden. Die Röhre ist nachfolgend zentrifugiert worden (15 Sekunden bei ungefähr 10.000 × g), und das Supernatant ist verworfen worden (durch Absaugen). Der sich ergebende Pressling ist nachfolgend zweifach gewaschen worden mit 1 ml des L2, zweifach mit 1 ml Äthanol 70% (vol/vol) und einfach mit 1 ml Azeton. Der Siliziumdioxid-Pressling ist getrocknet worden (10 Minuten bei 56 Grad Celsius mit einem offen Deckel in einem Eppendorf Heizblock) und in 50 μl TE Puffer (10 Minuten bei 56 Grad Celsius; geschlossener Deckel) eluiert worden. Nach Zentrifugierung (2 Minuten bei ungefähr 10.000 × g) enthält das Supernatant die ss-NA Fraktion.
Um ds-NA Formen (Protokoll R-Pressling) aus dem ursprünglichen Siliziumdioxid-Pressling wiederzugewinnen, ist das verbleibende Supernatant entfernt worden, und der Siliziumdioxid-Pressling ist zweifach mit L11 gewaschen worden, um ungebundenes ss-NA zu entfernen. Der sich ergebende Siliziumdioxid-Pressling ist nachfolgend zweifach mit L2, zweifach mit Äthanol 70%, einfach mit Azeton gewaschen worden, getrocknet und eluiert worden wie oben beschrieben. Nach Zentrifugierung (2 Minuten bei ungefähr 10.000 × g) enthält das Supernatant die ds-NA Fraktion.
In dem gesamten Verfahren (was ungefähr eine Stunden andauert) zur Fraktionierung des NA durch Protokoll R, werden nur zwei Eppendorf-Röhren eingesetzt werden.
Fraktionierung von genomischer DNS und ss-NA
Aufgrund des Aufnehmens der ss-NA in genomischer DNS mit einem hohen Molekulargewicht, ergibt Protokoll R wie oben beschrieben nur geringe Ausbeuten von ss-NA. Dies kann umgangen werden durch zuerst Isolieren des gesamten NA durch Protokoll Y/D (11), was zu einigem Scheren der genomischen DNS mit einem hohen Molekulargewicht führt, ausreichend, um ein Abfangen des ss-NA zu vermeiden. Die so gereinigte gesamte NA kann nachfolgend eingesetzt werden als Eingangsmaterial für das Protokoll R.
Gel-Elektrophorese
Bei allen Experimenten ist NA electrophoresiert worden (8 bis 10 V/cm) durch neutrale Agaroseplattengels mit Äthidiumbromid (1 μg/ml) in dem Puffersystem (40 mM TRIS-20 mM Natriumazetat 2 mM EDTA eingestellt auf pH 7.7 mit Essigsäure; Äthidiumbromid ist hinzugefügt worden auf eine Konzentration von 1 μg/ml Puffer) beschrieben durch Aaij und Borst (14).
Hybridisierung
DNS-Fragmente sind zu Nitrozellulosefilter durch das Verfahren von Southern (15) transferiert worden und mit [alpha-³²P]dCTP markierte pHC624 (16) hybridisiert worden, hergestellt durch zufälliges Markieren (Boehringer, Deutschland). Hybridisierungsbedingungen sind oben früher beschrieben worden (12).
Ergebnisse
Der Vergleich von verschiedenen GuSCN-enthaltenden Lysepuffern in Bezug auf das Binden von verschiedenen NA-Typen an Siliziumdioxid-Partikel hat aufgezeigt, dass nur doppelsträngige Formen gebunden werden, wenn L11 (was ungefähr 100 mM für EDTA ist) als Bindepuffer eingesetzt wird; auf der anderen Seite werden sowohl doppel- und einzel-strängige Formen in Bindepuffer L6 gebunden (was ungefähr 20 mM für EDTA ist) (Tabelle 1). Diese Betrachtungen bildeten die Basis für die Entwicklung eines Protokolls (Protokoll R) für die Fraktionierung von einzel-strängigen Nukleinsäuren und doppelsträngigen Nukleinsäuren (1).
Sobald doppel-strängige Nukleinsäure durch Siliziumdioxid-Partikel in L11 gebunden sind, wird eine kurze Zentrifugierung den Siliziumdioxid/ds-NA Pressling von dem Supernatant getrennt, der die einzel-strängigen Formen enthält. Das Hinzufügen dieses Supernatants zu einer Mischung von Siliziumdioxid-Partikeln und Bindepuffer L10 (was ungefähr 250 mM für Mg²⁺ ist) ist das Binden der einzel-strängigen Nukleinsäuren an die Siliziumdioxid-Partikel wiederhergestellt. Double-strängige und einzel-strängige Formen kann nachfolgend durch Waschen und Eluieren der Siliziumdioxid-NA Komplexe (Protokoll R) gereinigt werden. Doublesträngige Nukleinsäure wird aus dem anfänglichen Siliziumdioxid-Pressling (Protokoll R-Pressling) wiedergewonnen, wohingegen einzel-strängige Formen aus dem ursprünglichen Supernatanten (Protokoll R-sup) wiedergewonnen werden.
Zur Optimierung des Protokolls R wurden Rekonstruktionsexperimente durchgeführt, in denen vorab gereinigte oder kommerziell verfügbare Nukleinsäuren gemischt und nachfolgend durch das Protokoll R fraktioniert worden sind.
Fraktionierung einer Mischung von doppel-strängiger DNS und einzel-strängiger DNS
Die Fraktionierung einer ds-DNS/ss-DNS-Mischung in doppelsträngige- und einzelsträngige Formen ist in 2 dargestellt. Die geschätzte Wiedergewinnung von der Bandintensität des Äthidiumbromid verfärbtes Gel für ss-DNS lag bei ungefähr 50 Prozent, die geschätzte Wiedergewinnung von ds-DNS im Bereich von 500 bp zu 4,6 kb 1ag bei 80%–90% [ähnliche Wiedergewinnungen sind für ds-DNS Fragment im Bereich von 100–500 bp (nicht dargestellt) erhalten worden], wobei grössere Fragmente in wesentlichem Masse geschert sind, wie früher festgestellt (11). Auf dem Niveau der Erfassung durch UV-Beleuchtung war die Fraktionierung in ds- und ss-Formen vollständig.
Fraktionierung einer Mischung von doppel-strängiger RNS und einzel-strängiger RNS
3 zeigt die Fraktionierung einer Mischung von ds-RNS (menschliches Rotavirusgenomsegmente 1–11; für einen Review siehe 14) und ss-RNS (Phage MS2 RNS) in doppelsträngige- und einzelsträngige Formen. Die geschätzte Wiedergewinnung von ds-RNS und ss-RNS lag bei mindestens 80%. Auf dem Niveau der Erfassung durch UV-Beleuchtung war die Fraktionierung in ds- und ss-Formen vollständig.
Fraktionierung einer Mischung von doppel-strängiger DNS und einzel-strängiger RNS
In 4 ist dargestellt worden, dass ds-DNS auch effizient von ss-RNS getrennt werden kann.
Wieder lag das Wiedergewinnen für beide Fraktionen bei mindestens 80%. Ähnliche Ergebnisse sind erhalten worden, wenn E.coli rRNS (23S und 16S) als ss-RNS Eingang (nicht dargestellt) eingesetzt worden sind.
Bei den oben beschriebenen Experimenten erschien die Fraktionierung der ds- und ss-NA Formen (geprüft durch visuelle Inspektion von Bandintensitäten nach Äthidiumbromid-Färbung und UV-Beleuchtung) komplett zu sein. Um die Leistung des Fraktionierungs-Verfahren für eine Mischung von ds-DNS und ss-RNS in ss- und ds-Formen zu etablieren, wurde durch das Protokoll R-sup gereinigtes NA von solch einer Mischung durch Southern-Blotting und Hybridisierung mit einer 32P-markierten DNS Probe zu prüfen, homolog zu der ds-DNS, die als Eingang für die Fraktionierung eingesetzt worden ist. Dieses Experiment hat gezeigt, dass die ss-NA Fraktion weniger als 0,1% des ds-DNS Eingangs (5) enthält.
Fraktionierung einer Mischung von genomischer DNS und einzelsträngiger RNS
Als wir die Trennung von (genomischer) dsDNS und ss-RNS mit hohem Molekulargewicht durch direkte Fraktionierung unter Einsatz von E. coli als Eingang für Protokoll R untersucht haben, erschien es, dass die ds-DNS Fraktion in grossem Masse mit rRNS (6, Bahnen 6 und 7) kontaminiert ist, und die ss-RNS Wiedergewinnung war gering (6, Bahnen 8 und 9). Dies ist wahrscheinlich dadurch bedingt, dass RNS in (genomischer) ds-DNS mit hohem Molekulargewicht gefangen wird, wenn Siliziumdioxid/NA Komplexe ausgebildet worden sind. Auf der anderen Seite ist keine genomische DNS in der ss-RNS Fraktion beobachtet worden. Die gesamte Nukleinsäure, die unter Einsatz des Standard Protokoll Y/D (11) zuerst isoliert worden ist und im Nachhinein als Eingangs-Material in Protokoll R eingesetzt wird, zeigte in wesentlichem Masse eine höhere Rückgewinnung der ss-RNS Fraktion (6, Bahnen 2 und 5).
Verstärkungen
Materialien und Verfahren
Quelle der Nukleinsäuren
HIV-1 RNS ist aus einer Viruskultur (23) isoliert worden, Phage MS-2 RNS ist von Boehringer (Mannheim, Deutschland) gekauft worden und die 7.5 Kb Poly(A)Tailed RNS und die 100 bp Leiter ist als Marker von Life Technologies (Gaithersburg, Maryland, USA) gekauft worden. Der PCR TA3 Klonierungsvektor ist von Promega (Madison, USA) erhalten worden. Plasmid 5' NOT Hxb₂ENN (24) [enthaltend die GAG und POL Gene des HIV-1 von Nukleotiden 638–4647] und 168.1 RTN (24) (enthaltend das ENV Gen des HIV-1 aus dem Nukleotide 5674–8474) sind gereinigt worden wie oben beschrieben durch Ish-Horowicz und Burke (13) gefolgt von dem Protokoll R-Pressling wie in den Beispielen beschrieben. Das Plasmid pHCrec, das als eine positive Kontrolle in den PCR Experimenten eingesetzt worden ist, wurde durch eine schwache Annealing PCR auf Lambda DNS (Boehringer) unter Einsatz von PCR Primer RB 8 (siehe unten) gemacht. Die diskreten PCR Produkte sind gereinigt worden durch Protokoll Y/D (11) und nachfolgend geklont in einem PCR III Vektor (Invitrogen) Das aufdeckende Plasmid pHCrec mit einem ungefähr 600 bp Einsatz ist nachfolgend von E.coli HB101 wie durch Ish-Horowicz und Burke (13) gereinigt worden, gefolgt von Säulenchromotographie durch Sepharose CL2B (Pharmacia, Inc. Uppsala, Schweden).
Chemikalien und Enzyme
EDTA, KCl, MgCl₂·6H₂O, NaCl und tri-Natriumcitratdihydrat sind von Merck (Darmstadt, Deutschland) erhalten worden. TRIS und BSA sind von Boehringer(Mannheim, Deutschland) erhalten worden. Triton X-100 ist von Packard (Packard Instruments Co., Inc., Downers, Ill, USA) erhalten worden. Natrium-Dodecylsulfat (SDS) ist von Serva (Heidelberg, Deutschland) erhalten worden.
Die dNTP's und Dextransulfat sind von Pharmacia (Uppsala, Schweden) erhalten worden.
Die in Protokoll R eingesetzten Chemikalien sind hier beschrieben.
Reverse Transkriptase Superscript II ist von Life Technologies (Gaithersburg, Maryland, USA) gekauft worden. DNS polymerase Sequenase 2 ist von Amersham (Vereinigtes Königreich) erhalten worden. Ampli-Taq DNS Polymerase ist von Perkin Elmer (Norwalk, USA) erhalten worden. RNAse H ist von Boehringer (Mannheim, Deutschland) erhalten worden. Lachssperma DNS ist von Sigma (St. Louis, USA) erhalten worden.
Zusammensetzung von Puffern und Lösungen
Die Herstellung von Puffern, die in Protokoll R eingesetzt worden sind, sind hier beschrieben worden, mit Ausnahme, dass Lysepuffer und Waschpuffer (L10, L11, und L2), die in Protokoll R eingesetzt worden sind, für die Isolierung der Nukleinsäuren durch eine Säule gefiltert worden sind, die mit Diatomen (11) gepackt worden sind, um jegliche endogene Nukleinsäuren in dem Lysepuffer und Waschpuffer zu entfernen.
Der 10 × reverse Transkriptionspuffer (CMB1) besteht aus 100 mM Tris·HCl (pH 8.5), 500 mM KCl und 1% Triton X-100.
Der 10 × PCR Puffer besteht aus 500 mM Tris·HCl (pH 8.3), 200 mM KCl und 1 mg/ml BSA.
Der Elutionspuffer Tris/EDTA (TE, pH 8.0) besteht aus 10 mM Tris·HCl (pH 8.0) und 1 mM EDTA (pH 8.0).
Oligonukleotide
Der erste Strangprimer TAG 20 ist:
5'GACAGAATGCCGAAATGACCCCNNNNNG3'
Der zweite Strangprimer TAG 7 ist:
5'DIG-GACAGAATGCGAAATGANNNNNG3'
Der PCR primer RB 8 ist:
5'GACAGAATGCCGAAATGA3'
unterstrichen: PCR Motiv
fett: Motiv für direkte Sequenzierung
N = A, T, C, oder G
Protokoll für erste Strangsynthese
ss-RNS, die in den kommerziell verfügbaren reversen Transkriptasen vorliegen, erschien, um ungewollte Seitenprodukte zu erzeugen, wenn diese in ersten Strangsynthesen eingesetzt werden. Um dieses Problem zu überwinden, ist reverse Transkriptase zuerst in einer Mischung für cDNS Synthese vorbehandelt worden, denen exogene zugefügte Primer fehlen:
Inkubiere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius
Nukleinsäuren (20 μl), gereinigt durch Protokoll R-sup, sind für 5 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubiert worden und nachfolgend auf Eis gequencht worden. Nachfolgend ist die folgende Mischung hinzugefügt worden:
Schliesslich sind 10 μl des vorinkubierten Superscripts II (SS II) sind hinzugefügt worden und die sich ergebende Mischung ist für 30 Minuten bei 42 Grad Celsius inkubiert worden.
Nach der reversen Transkriptionsreaktion ist SS II durch Inkubierung der Mischung für 5 Minuten bei 80 Grad Celsius inaktiviert worden, und die Mischung ist nachfolgend auf Raumtemperatur abgekühlt worden. Um die RNS/DNS Hybriden in einzel-strängige cDNS zu wandeln, werden zwanzig Einheiten der RNAse H zu der Mischung hinzugefügt und sind für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert worden. Die einzel-strängige cDNS ist nachfolgend unter Einsatz des Protokolls R-sup isoliert worden. Die einzelsträngige cDNS ist in 40 μl TE eluiert worden und 20 μl sind als Eingang für die zweite Strangsynthese eingesetzt worden.
Protokoll für zweite Strangsynthese
Zu zwanzig Mikroliter von einzel-strängiger cDNS ist die folgende Mischung (auf Eis) hinzugefügt worden:
Die Mischung ist für 10 Minuten auf Eis inkubiert worden, und nachfolgend für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der zweiten Strangsynthese ist die doppel-strängige cDNS unter Einsatz des Protokolls R-Pressling isoliert worden. Die doppel-strängige cDNS sind in 40 μl TE eluiert worden. Zwanzig Mikroliter sind genommen worden und 2 μl sind als Eingang für PCR eingesetzt worden. Die verbleibenden 18 μl sind bei –20 Grad Celsius gespeichert worden.
Protokoll für die Polymerasekettenreaktion
Zwei Mikroliter von doppel-strängiger cDNS sind zu 48 μl einer PCR Mischung hinzugefügt worden, die besteht aus:
Nach einer Inkubation für 5 Minuten bei 95 Grad Celsius ist die Probe 45 Zyklen der Verstärkung in einem DNS thermalen Zykler (Typ 480; Perkin Elmer Cetus) unterworfen worden. Ein Zyklus bestand aus der Denaturierung von 1 Minute bei 95 Grad Celsius, Annealing für 1 Minute bei 63 Grad Celsius, und Elongation für 2 Minuten bei 72 Grad Celsius. Nach dem Durchzykeln ist die Probe für 8 Minuten bei 72 Grad Celsius inkubiert worden, und nachfolgend ist die Temperatur auf 4 Grad Celsius abgesenkt worden. Fünfundzwanzig Mikroliter des PCR Produktes ist durch Agarose Gel Elektrophorese und Äthidiumbromid Färbung betrachtet worden. In jedem Experiment ist TE als eine negative Extraktionskontrolle und als eine negative PCR Kontrolle eingesetzt worden.
*Teilweiser Ersatz des dTTP mit dUTP liefert eine Methodologie zum Gewährleisten, dass Produkte aus früheren PCR Reaktionen nicht wieder verstärkt werden kann. Produkte von PCR Verstärkungen wird uracil-enthaltende Deoxyribonukleinsäuren enthalten. Mögliche kontaminierende PCR Produkte aus einer früheren PCR Verstärkung werden eliminiert durch Ausschneiden von Uracil-Basen unter Einsatz des Enzyms Uracil N-Glykosylase (UNG) vor der PCR (25)
Gelelektrophorese
In allen Experimenten sind die Nukleinsäuren durch neutrale Agaroseblockgels electrophoresiert worden (8 bis 10 V/cm), die Äthidiumbromid (1 μg/ml) in dem Puffersystem enthalten ist, wie es durch Aaij und Borst (14) beschrieben worden ist.
Hybridisierung
DNS Fragmente sind nach einem Southern Blotting (15) durch Hybridisierung mit ³²P-markierten Proben erfasst worden, die die gesamten GAG, POL, und ENV Gene des HIV-1 darstellen [Plasmid 5' NOT Hxb₂ENN und Plasmid 168 1 RTN] (10).
Ergebnisse
Parallel sind 10⁵ Moleküle von HIV-1 RNS (23) und negative Kontrollen (TE) extrahiert worden unter Einsatz des Protokolls R-sup. Die sich ergebenden einzel-strängigen Nukleinsäuren werden durch die nicht-selektive RT-PCR wie oben beschrieben verstärkt, was in einem diskreten Fahnenmuster für HIV-1 RNS resultiert, und keine Verstärkungsprodukte in den TE-Kontrollen (8). Die Variation zwischen den Duplikaten ist eine Reflektion der Nicht-Selektivität der Prozedur. Als eine Kontrolle für die Effizienz des PCR Teils des Verfahrens ist ein Eingang von 0, 6, 60 und 600 Molekülen des Plasmid pHCrec eingesetzt worden.
Um den HIV-Ursprung der in der 8A sichtbaren Fahnen zu bestätigen, ist eine Southern Blot Hybridisierung unter hohen Zwängen mit ³²p-markierten Proben durchgeführt worden, umfassend fast das ganze HIV-1 Genom (8B). Dieses Experiment zeigte, dass die meisten der Fahnen, die durch UV-Beleuchtung sichtbar sind, mit der HIV-1 Probe hybridisieren. Die Fahnen, die nicht mit der Probe hybridisieren, können homolog mit Teilen des HIV-1 Genoms sein, die anders sind als die in der Probe vorliegenden, oder könnten aus einzelsträngiger RNS, die in der HIV-1 RNS Herstellung vorliegt (beispielsweise zelluläre mRNS), oder aus ss-RNS hervorgehen, die in Superscript II vorliegt, was nicht gewandelt worden war in ds-Hybriden während der Präinkubation des SuperScript II.
Ähnliche Ergebnisse sind mit anderer einzel-strängigen RNSs wie Hepatitis C Virus RNS, Phage MS2 RNS, und der 7.5 Kb Poly(A)-Tailed RNS (Ergebnissen nicht dargestellt).
Es ist geschlossen worden, dass die beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können, um einzelsträngige RNS Ziele (beispielsweise in Serum vorliegend) in eine Abfolge von diskreten Fahnen in Agarosegels zu verstärken. Die diskreten Fahnen können aus Agarosegels gereinigt werden, geklont in beispielsweise einem bakteriellen Vektor und die Klone können nachfolgend sequenziert worden. Aufgrund der Tatsache, dass einer der Identifizierprimer (TAG 20) ein Sequenzmotiv beherbergt, ist es möglich, die diskreten Bänder ohne Klonierung zu sequenzieren, nachdem die Bänder von dem Gel zu reinigen. Das hier beschriebene Verfahren ist nützlich bei der Isolierung und der Charakterisierung von unbekannten Sequenzen, die in klinischen Proben vorliegen (beispielsweise virale Sequenzen), oder für die Verstärkung der cDNSs aus Transkripten ohne das Vorliegen von jeglichen Sequenzdaten.
Druckschriften

1. Server, P. (1989) Electrophoresis, 10 (5–6), 327–331.
2. Shain, D. H., Yoo, J., Slaughter, R. G., Hayes, S. E. und Tae H. J. (1992) Anal. Biochem., 200, 47–51.
3. Sheer, D. G., Yamane, D. K., Hawke, D. H. und Yuan, P. (1990) BioTechniken, 9, 486–495.
4. Mirkes, P. E. (1985) Anal. Biochem., 148 (2), 376–383.
5. Holstege, C. P., Pickaart, M. J. und Louters, L. L. (1988) J. Chromatogr., 455, 401–405.
6. Thompson, J. A. (1986) Biochromatographry, 1, 68–80.
7. Stowers, D. J., Keim, J. M., Paul, P. S., Lyoo, Y. S., Merion, M. und Benbow, R. M. (1988) J. Chromatogr., 444, 47–65.
8. Liautard, J. P. (1992) J. Chromatogr., 584, 135–139.
9. Chomczynski, P. und Sacchi, N. (1989) Anal. Biochem., 162, 156–159.
10. Siebert, P. D. und Chenchik, A. (1993) Nuclcleic Acids Res., 21, 2019–2020.
11. Boom, R., Sol, C. J. A., Salimans, M. M. M., Wertheim van Dillen, P. M. E. und van der Noordaa, J. (1990) J. Clin. Microbiol., 28, 495–503.
12. Boom, R., Sol, C. J. A., Heijtink, R., Wertheim van Dillen, P. M. E. und van der Noordaa, J. (1991) J. Clin. Microbiol., 29, 1804–1811.
13. Ish-Horowicz, D. und Burke, J. F. (1981) Nucleic. Acids Res., 9, 2989–2998.
14. Aaij, C., und Borst, P. (1972) Biochim. Biophys. Acta., 269, 192–200.
15. Southern, E. M. (1975) J. Mol. BioL, 98, 503–517.
16. Froussard, P. (1992) Nucleic Acids Res., 20, 2900.
17. Fritz, J. D., Greaser, M. L. und Wolff, J. A. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 3747.
18. Frohman, M. A., Dush, M. K. und Martin, G. R. (1988) Proc, Natl. Acad. Sci., 85, 8998–9002.
19. Schlayer, H.–J., Peters, T., Preisler, S., Fehr, J., Gerok, W. und Rasenack, J. (1992) J. Virol. Methods, 38, 333–341.
20. Trout, A. B., McHeyzer-Williams, MG., Pulendran, B. und Nossal, J. V. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 9823–9825.
21. Akowitz, A. und Manuelidis, L. (1989) Gene, 81, 295–306.
22. Fukuoka, S.–I. und Scheele, G. A. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 6961.
23. Layne, S. P., Merges, M. J., Dembo, M., Spouge, J. L., Conley, S. R., Moore, J. P., Raina, J. L., Renz, H., Gelderblom, H. R. und Nara, P. L. (1992) Virology, 189, 695–714.
24. de Jong, J., Goudsmit, J., Keulen, W., Klaver, B., Krone, W., Tersmette, M. und de Ronde, T. (1992) J. of Virol., 66, 757–765
25. Varshney, U., et al. (1988) J. Biol. Chem., 263, 7776–7784.
26. Van Ness et al., Nucleic Acids Research, Band 9, Nr. 19, Seiten 5143–5151.
27. Thompson et al. Anal. Biochem., Band 3, Seiten 281–291, 1987.

Tabelle 1
Das Binden von verschiedenen NA-Typen der Siliziumdioxid- Partikel in verschiedenen Lysepuffern; ähnliche Ergebnisse sind unter Einsatz von Diatomen im Gegensatz zu Siliziumdioxid-Partikeln (Daten nicht dargestellt) erhalten worden.

Claims

Verfahren zur Trennung von einzelsträngigem Nukleinsäurematerial aus doppelsträngigem Nukleinsäurematerial und Isolieren des einzelsträngigen Nukleinsäurematerials, mit dem Kontaktieren einer Mischung von beidem mit einer ersten Flüssigkeit, die ein chaotropisches Agens and eine Nukleinsäure bindende feste Phase umfasst, die fähig ist, in reversibler Weise die Nukleinsäure zu binden, wobei die Flüssigkeit eine solche Zusammensetzung aufweist, dass doppelsträngiges Nukleinsäurematerial die feste Phase bindet und eine wesentliche Menge des einzelsträngigen Nukleinsäurematerials nicht bindet, und mit der Trennung der festen Phase aus der Flüssigkeit, wobei das besagte Verfahren weiterhin das Behandeln des Supernatants, das das einzelsträngige Nukleinsäurematerial enthält, mit einer zweiten Flüssigkeit umfasst, die ein chaotropisches Agens und eine zweite Nukleinsäure bindende feste Phase aufweist, die auch fähig ist, in reversibler Weise die Nukleinsäure zu binden, wobei die zweite Flüssigkeit eine solche Zusammensetzung aufweist, dass die sich ergebende Mischung des Supernatants und der zweiten Flüssigkeit das Binden des einzelsträngigen Nukleinsäurematerials an die zweite feste Phase gestattet, wodurch das einzelsträngige Nukleinsäurematerial isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Flüssigkeit ein chaotropisches Agens in einer Konzentration von zwischen 1 und 10 M und einen Komplexbildner aufweist und einen pH-Wert zwischen 2 und 10 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Komplexbildner EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) ist, welche in einer Konzentration zwischen 10 mM und 1 M präsent ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Flüssigkeit ein chaotropisches Agens, einen Komplexbildner und bivalente positive Ionen in geeigneten Konzentrationen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Konzentration der bivalenten positiven Ionen der Konzentration des Komplexbildners ähnelt.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Komplexbildner EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) ist und die Ionen Mg²⁺ Ionen sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die erste Flüssigkeit die Zusammensetzung eines Puffers aufweist, der durch Auflösen von 120 g GuSCN in 100 ml 0,2 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (pH-Wert = 8) hergestellt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die zweite Flüssigkeit die Zusammensetzung eines Puffers aufweist, der durch Auflösen von 120 g GuSCN in 100 ml 0,35 M TRIS·HCL (pH-Wert = 6,4) und Hinzufügen von 22 ml 0,2 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (pH-Wert = 8,0) und 9,1 g Triton X-100, Homogenisieren der Lösung und Hinzufügen von MgCl₂ zu einer Endkonzentration von ungefähr 0,25 M hergestellt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die besagte erste und die besagte zweite feste Phase auf Silizium basiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die feste Phase von dem Supernatant durch Zentrifugierung getrennt ist.