ES2235225T3 - Aislamiento de acidos nucleicos de ramalles simples. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A METODOS PAR ALA SEPARACION FACIL DE MATERIALES DE ACIDO NUCLEICO DE UNA SOLA FILA DE UN MATERIAL DE ACIDO NUCLEICO DE DOS FILAS PRESENTES EN UNA MUESTRA QUE CONTIENE LOS DOS. MEDIANTE LA ELECCION CORRECTA DE AL MENOS UN AGENTE CAOTROPICO, PREFERENTEMENTE UNA SAL DE GUANIDINA, A UNA CONCENTRACION SELECCIONADA Y OTRAS CONDICIONES ADECUADAS TALES COMO AGENTES QUELANTES, PH Y SIMILARES, SE PUEDE ENLAZAR EL MATERIAL DE DOS FILAS A UNA FASE SOLIDA TAL COMO PARTICULAS DE SILICE, MIENTRAS QUE EL MATERIAL DE UNA SOLA FILA NO SE ENLAZARA BAJO ESAS CIRCUNSTANCIAS. SI SE SEPARAN LAS PARTICULAS DE SILICE DE LA MUESTRA, SE RETIRA EL MATERIAL DE ACIDO NUCLEICO DE DOS FILAS. SE PUEDE ELUIR FACILMENTE DE LAS PARTICULAS DE SILICE. EN UN SEGUNDO PASO EL MATERIAL DE UNA SOLA FILA SE PUEDE UNIR A UNA FASE SOLIDA SELECCIONADO UNA SERIE DIFERENTE DE CONDICIONES. LAS PARTICULAS SE PUEDEN SEPARA DE NUEVO DE LA MUESTRA Y YA SE PUEDE ELUIR EL MATERIAL DE UNA SOLA FILA. PARA CADA UNA DE LAS SEPARACIONES EFICIENTES, SE PUEDE REPETIR EL PROCESO. TRAS LA SEPARACION DE LOS DOS TIPOS DE ACIDO NUCLEICO, SE PUEDE AMPLIFICAR CUALQUIER CLASE DE ELLOS. SE PRESENTAN METODOS DE AMPLIFICACION EN LOS QUE NO SON NECESARIOS DATOS DE LAS SECUENCIAS DEL MATERIAL A AMPLIFICAR. EN ESTOS METODOS UN IMPRIMADOR TENDRA UN MOTIVO DE AMPLIFICACION Y UN MOTIVO DE HIBRIDACION ALEATORIA.

Description

Aislamiento de ácidos nucleicos de ramales simples.

La invención se refiere al campo de la purificación de ácidos nucleicos a partir de materias primas que contengan ácido nucleico, especialmente de materiales biológicos como orina, heces, esperma, saliva, sangre total, suero u otros fluidos corporales, fracciones de estos fluidos como fracciones leucocitarias (capas leucocitarias en la sangre centrifugada), cultivos celulares, etc., sino también en muestras del medio ambiente como suelo, agua, etc.

Hasta hace poco el aislamiento y/o purificación de los ácidos nucleicos a partir de mezclas complejas como las descritas anteriormente era un procedimiento laborioso en varios pasos. En el documento EP 0389063 se revela un procedimiento de purificación simple y rápido del material que contiene ácido nucleico procedente de una mezcla compleja. Este procedimiento consiste en el tratamiento de la mezcla compleja como la sangre total con un agente desnaturalizante en presencia de una fase sólida de sílice para unión del ácido nucleico en condiciones que permiten la unión de todo el material que contiene ácido nucleico a la mencionada fase sólida y la separación de la mencionada fase sólida de la mezcla. En dicho documento de referencia se demuestra que los ácidos nucleicos tanto monocatenáricos como dicatenáricos se unen a la fase sólida cuando están presentes en la mezcla. En ese material de referencia también se revela la amplificación (PCR) de un determinado ácido nucleico que tiene una secuencia conocida cuya presencia se sospecha en la mezcla.

Además del aislamiento de todo el material que contiene ácido nucleico, en la solicitud internacional WO 95/04140 se revela un método para aislar sólo el ADN dicatenárico usando una fase sólida de sílice y un agente desnaturalizante en las condiciones apropiadas.

Con frecuencia es necesario proceder al fraccionamiento de las mezclas de ácidos nucleicos (AN) dicatenáricos (ds) y monocatenáricos (ss) en sus formas mono y dicatenáricas, por ejemplo, para separar las sondas marcadas de AN-ss a partir de híbridos ds, para separar in vitro transcriptos a partir de plantillas de ADN-ds y para separar el ADN genómico del ARNm. Actualmente se puede conseguir la separación de distintas clases de ácidos nucleicos utilizando varias técnicas. La electroforesis se puede usar para fraccionar distintas formas de ácidos nucleicos debido a sus diferencias de forma y tamaño^{1-3}. La centrifugación tiene la ventaja de diferenciar el material según la densidad^{4} y, más recientemente, se ha aplicado la tecnología de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para separar y purificar las moléculas mono y dicatenáricas de ADN y de ARN^{5-8}.

Parece que el ARN purificado de células eucariotas siguiendo el procedimiento más utilizado en la actualidad^{9} contiene cantidades significativas de ADN genómico. Recientemente^{10} se ha descrito una adaptación que reduce la contaminación del ADN genómico de la fracción ARN-ss.

No es posible analizar por separado un material mono o dicatenárico usando el método descrito en los documentos EP 0389063 o WO 95/04140.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para separar material que contiene ácido nucleico monocatenárico del material que contiene ácido nucleico dicatenárico definido en la reivindicación 1, que consiste en poner en contacto una mezcla de ambos con un líquido que contiene un agente desnaturalizante y un ácido nucleico que se une a la fase sólida, con lo cual el líquido tiene una composición tal que el ácido nucleico dicatenárico se une a la fase sólida y una cantidad sustancial del ácido nucleico monocatenárico no se une, y en separar la fase sólida de la líquida. Los expertos en la materia podrán determinar las circunstancias adecuadas que permiten llegar a tal separación.

Las circunstancias en las cuales el material dicatenárico se une al material sólido y el material monocatenárico variarán, aunque hay parámetros importantes para obtener esta unión diferencial como son la concentración del agente desnaturalizante, que debe encontrarse aproximadamente entre 1-10 M, preferiblemente entre 3-6 M y en particular aproximadamente 5 M; la concentración del agente quelante, que en el caso de usar EDTA debe ser igual o mayor de 10 mM y preferiblemente no mayor de 1 M; el pH de la solución acuosa en la que se realiza la separación debe ser mayor de 2 cuando se usa un tiocianato como agente desnaturalizante y debería ser menor de 10 porque, de lo contrario, hay riesgo de que el material ds se convierta en ss. La temperatura a la cual se realiza el proceso no parece ser crítica, aunque probablemente sea mejor mantenerla entre 4ºC y 60ºC. Un aspecto importante del proceso es, desde luego, que el material ds se mantenga dicatenárico durante la separación. Así sucederá normalmente en circunstancias como las descritas anteriormente si el ácido nucleico ds tiene al menos 50 pb de longitud y con un 40% de pares de bases GC. El técnico experto en la materia sabe cómo puede variar esta longitud con un contenido mayor o menor de GC. En Van Ness y cols.^{26} y/o Thompson y cols.^{27} se muestra que todo el proceso depende de las interacciones intrincadas que existen entre los factores mencionados anteriormente. Usando estas revelaciones y las referencias citadas, el técnico experto en la materia podrá ajustar las circunstancias a cada proceso en particular.

Los agentes desnaturalizantes son una característica muy importante de la presente invención. Se definen como cualquier sustancia que pueda alterar la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de los ácidos nucleicos. No deben tener ningún efecto sustancial sobre la estructura primaria del ácido nucleico. Si los ácidos nucleicos están asociados a otras moléculas, como proteínas, estas asociaciones también se pueden alterar por el mismo o por agentes desnaturalizantes diferentes. Muchos agentes desnaturalizantes son adecuados para su uso en la presente invención, como yoduro sódico, yoduro potásico, (iso)tiocianato sódico, urea o sales de guanidina o una combinación de los mismos. Una clase preferida de agentes desnaturalizantes según la invención son las sales de guanidina, de las cuales el tiocianato de guanidina es el más preferido.

Por serendipia encontramos que el ácido nucleico-ss no se unía a las partículas de sílice o a la tierra de diatomeas en presencia del tampón L11 (ver los ejemplos), mientras que sí lo hacía el ácido nucleico ds. Los experimentos realizados en distintas circunstancias mostraron que la adición de Mg^{2}+ o de otros iones positivos (bivalentes) a la fracción libre tenía gran importancia. Los mejores resultados se obtuvieron con una concentración del ion bivalente (Mg^{2}+) aproximadamente igual a la concentración del agente quelante (EDTA).

La fase sólida que se use no es tan importante. Importante es que se debe unir reversiblemente a los ácidos nucleicos.

Se conocen muchos materiales de este tipo, entre los cuales algunos están basados en silicio como el síliceto de aluminio, etc., preferiblemente sílice. Por sílice se entiende la inclusión de cristales de SiO_{2} y otras formas de óxido de silicio, como los esqueletos de diatomeas, el polvo de vidrio y/o partículas y óxido de silicona amorfo. La fase sólida puede estar presente en cualquier forma, incluso puede ser el propio vaso que contiene las mezclas del ácido nucleico o una parte de dicho vaso. También puede ser un filtro o cualquier otra estructura adecuada. Aparte de los materiales de silicio también hay otros materiales adecuados, como la nitrocelulosa (filtros), partículas de látex y otras sustancias poliméricas. Una forma preferida de la fase sólida es la forma en partículas, que permite una separación rápida del material unido y del material libre, por ejemplo por centrifugación. El tamaño de las partículas de la fase sólida no es crítico. Los tamaños medios de partículas adecuados varían desde aproximadamente 0,05 a 500 \mum. Preferiblemente el intervalo se elige de forma que al menos el 80% y preferiblemente el 90% de las partículas tengan un tamaño entre los valores que se acaban de mencionar. Lo mismo se puede decir de los intervalos preferidos entre los cuales los tamaños medios de partículas se encuentran entre 0,1 y 200 \mum, preferiblemente entre 1 y 200 \mum. La capacidad de unión de un peso dado de partículas aumenta cuando disminuye su tamaño, aunque el límite inferior del tamaño se determina cuando las partículas no pueden redispersarse fácilmente después de su separación, por ejemplo, mediante centrifugación. Este es el caso de una materia prima rica en ácidos nucleicos que contiene muchos ácidos nucleicos de un peso molecular más elevado. En estos casos, las partículas y los ácidos nucleicos pueden formar agregados. Un experto en la materia podrá elegir el tamaño correcto de las partículas para cada aplicación prevista en particular. La formación de agregados puede evitarse utilizando sílice fraccionada o tierra de diatomeas en varias
aplicaciones.

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de material que contiene ácido nucleico monocatenárico a partir de una mezcla de material que contiene ácido nucleico, que comprende los pasos de someter la mezcla a un método como el que se describe anteriormente y tratar el sobrenadante que contiene el material del ácido nucleico monocatenárico con un segundo lípido que contiene un agente desnaturalizante y una segunda fase sólida de unión al ácido nucleico, por lo cual el segundo líquido tiene una composición tal que la mezcla resultante del sobrenadante y el segundo líquido permite la unión del material que contiene el ácido nucleico monocatenárico a la segunda fase
sólida.

De esta forma el material que contiene ácido nucleico dicatenárico se elimina de la mezcla cruda y el ácido nucleico monocatenárico se purifica de la mezcla restante, aún cruda, en otro paso único. Tanto el material dicatenárico como el material monocatenárico se unen reversiblemente a las fases sólidas respectivas, de forma que puedan eluirse fácilmente de dichas fases sólidas para someterse a nuevos análisis o a otros tratamientos. Un tratamiento posterior muy útil es la amplificación del material que contiene ácido nucleico (mono o dicatenárico).

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Diagrama del protocolo R

La recuperación del AN-ds tiene lugar a partir del pellet inicial (pellet R), la recuperación del AN-ss tiene lugar a partir del sobrenadante inicial (sob R). L11, L10, L6 y L2 son los tampones basados en GuSCN, SC es la suspensión de partículas de sílice. Consultar los detalles en la sección de Materiales y Métodos.

Figura 2

Separación de ADN-ds y ADN-ss

El AN se purificó (por duplicado) siguiendo el protocolo R a partir de una mezcla de ADN-ds (fago lambda digerido con Hindill, 1 \mug) y ADN-ss (ADN delfago M13, 500 ng). Las eluciones finales se realizaron en 50 \mul del TE y 25 \mul se utilizaron en una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (que contenía bromuro de etidio), que posteriormente se fotografió con iluminación UV. Pista 1, marcador de recuperación al 100% para los fragmentos de ADN-ds; pista 2, marcador de recuperación al 100% para el ADN-ss; pista 3, marcador de recuperación al 100% para la mezcla de ADN-ds/ ADN-ss. Pistas 4 y 5, protocolo de producción del pellet R; pistas 6 y 7, protocolo de producción del sob R.

Figura 3

Separación de ARN-ds y ARN-ss

El AN se purificó (por duplicado) siguiendo el protocolo R a partir de una mezcla de ARN-ds (ARN-ds de rotavirus) y ARN-ss (ARN del fago MS2, 800 ng). Las eluciones finales se realizaron en 50\mul del TE y 25 \mul se utilizaron en una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (que contenía bromuro de etidio) que posteriormente se fotografió con iluminación UV. Pista 1, marcador de recuperación al 100% para los fragmentos de ARN-ds; pista 2, marcador de recuperación al 100% para el ARN-ss; pista 3, marcador de recuperación al 100% para la mezcla de ARN-ds/ARN-ss. Pistas 4 y 5, protocolo de producción del pellet R; pistas 6 y 7, protocolo de producción del sob R.

Figura 4

Separación de ADN-ds y ARN-ss

El AN se purificó (por duplicado) siguiendo el protocolo R a partir de una mezcla de ADN-ds (750 ng del fago lambda digeridos con Hindill) y ARN-ss (ARN del fago MS2, 800 ng). Las eluciones finales se realizaron en 50 \mul del TE y 25 \mul se utilizaron en una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (que contenía bromuro de etidio) que posteriormente se fotografió con iluminación UV. Pista 1, marcador de recuperación al 100% para el ADN-ds; pista 2, marcador de recuperación al 100% para el ARN-ss; pista 3, marcador de recuperación al 100% para la mezcla de ADN-ds/ARN-ss. Pistas 4 y 5, protocolo de producción del pellet R; pistas 6 y 7, protocolo de producción del sob R.

Figura 5

Separación de ADN-ds y ARN-ss

El AN se purificó siguiendo el protocolo sob R a partir de una mezcla de ADN-ds (1000 ng de pHC624 linealizado, 2 kb) y ARN-ss (ARN del fago MS2, 800 ng). La elución final se realizó en 50 \mul del TE, y 25 \mul o diluciones seriadas diez veces de la fracción del AN-ss se utilizaron en una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (que contenía bromuro de etidio) que posteriormente se fotografió con iluminación UV.

Parte A: fila superior: pista 1, ADN del fago lambda digerido con Hindill; pista 2, marcador de recuperación al 100% para el ADN-ds y el ARN-ss y diluciones seriadas en diez veces del mismo (pistas 3-6). Fila inferior: protocolo de producción del sob R (pista 2) y diluciones seriadas diez veces (pistas 3-6).

Parte B: el ADN-ds se transfirió a continuación a un filtro de nitrocelulosa y se hibridó con una sonda homóloga marcada con ^{32}P para su introducción en el ADN-ds. Se indican el ADN-ds y el ARN-ss.

Figura 6

Separación del ADN genómico del ARN-ss

Cómo se realiza el atrapamiento del ARN-ss. Se usaron bacterias E. coli directamente como material de base para duplicar las extracciones según el protocolo R (pistas 6 y 7, pellet R; pistas 8 y 9, sob R). Como alternativa, el AN total se purificó primero siguiendo el protocolo Y usando diatomeas como vehículos del AN (que provoca la fragmentación del ADN genómico). Los ácidos nucleicos purificados se usaron posteriormente como base para el protocolo R (pistas 2 y 3, pellet R; pistas 4 y 5, sob R). Las eluciones finales se realizaron en 50 \mul del TE y 25 \mul se utilizaron en una electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% (que contenía bromuro de etidio) que posteriormente se fotografió con iluminación UV.

Pistas marcadoras 1 y 10, 500 ng del ADN del fago lambda, digerido con Hindill. Se indican los marcadores del peso molecular del ARNr 23S y 16S y del ADN-ds (23 kb y 2,0 kb).

Figura 7

Diagrama del procedimiento de la figura 8

Figura 8

El ácido nucleico monocatenárico se purificó a partir de muestras que contenían ARN del VIH-1 y el TE (control negativo) siguiendo el protocolo del sob R y posteriormente se amplificó con una PCR-RT no selectiva.

Parte A: pista 1, bandas de ADN de 100 pb; pistas 2 y 3, controles de extracción negativos; pistas 4 y 5, ARN del VIH-1 amplificado no selectivamente; pistas 6, 7, 8 y 9, moléculas de 600, 60, 6 y 0, respectivamente, de pHCrec (control positivo de la PCR).

Parte B: hibridación por inmunotransferencia Southern con sondas de VIH-1 marcadas con ^{32}P (que contenía los genes GAG, POL y ENV del VIH-1) de las muestras marcadas en la parte A. Después de la hibridación durante toda la noche a 65ºC en SSC 6x, SDS al 0,1%, sulfato de dextrano al 10% y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, el filtro se lavó después en condiciones astringentes con SSC 0,1/SDS al 0,1% a 65ºC, y se autorradiografió en una película de rayos x durante dos horas a -70ºC. Este experimento mostró que la mayoría de las bandas visibles en el bromuro de etidio que teñían el gel de agarosa procedían del genoma del VIH-1.

La invención se explicará a continuación con más detalle en la siguiente descripción minuciosa.

Separación y aislamiento Materiales y métodos Fuente de los ácidos nucleicos

El ARN-ss del fago MS-2 (3569 nt), ARNr de E. coli (16 y 23S; 1,7 kb y 3,5 kb respectivamente), ADN-ss del fago M13 (7599 nt) y ADN-ds del fago lambda digerido con Hindill fueron adquiridos en Boehringer (Mannheim, Alemania). El ARN-ds del rotavirus se purificó a partir de las heces de un sujeto infectado siguiendo el protocolo Y/SC^{11}. El ADN del plásmido se purificó a partir de E. coli HB101 según describieron Ish-Horowicz y Burke^{13} seguido por cromatografía en columna con Sepharose CL2B (Pharmacia, Inc. Uppsala, Suecia). El AN total se purificó a partir de E. coli siguiendo el protocolo Y/D^{11}.

Productos químicos

El tiocianato de guanidinio (GuSCN) fue obtenido en Fluka (Buchs, Suiza).

EDTA (Titriplex) y MgCl_{2}.6H_{2}O se obtuvo en Merck (Darmstadt, Alemania). El TRIS se obtuvo en Boehringer (Mannheim, Alemania). Se ha descrito la preparación de las partículas de sílice fraccionadas según el tamaño (sílice ordinaria, SC) y la suspensión de diatomeas^{11}. Triton X-100 procedía de Packard (Packard Instrument Co. Inc., Downers Grove, Ill).

Composición de los tampones

El tampón de lisis y unión L6, el tampón de lavado L2 y el TE (Tris.HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH= 8,0) se han descrito en otros trabajos^{11}. El EDTA 0,2 M (pH 8,0) se elaboró disolviendo 37,2 g de EDTA (Merck, Alemania) y 4,4 g de NaOH (Merck, Alemania) en agua en un volumen total de 500 ml. El tampón de lisis y unión L11 se elaboró disolviendo 120 g de GuSCN en 100 ml de EDTA 0,2 M (pH= 8,0). El tampón de unión L10 se preparó disolviendo 120 g de GuSCN en 100 ml de TRIS.HCl 0,35 M (pH 6.4); posteriormente se añadieron 22 ml de EDTA 0,2 M (pH 8,0) y 9,1 g de Triton X-100 y la solución se homogeneizó; finalmente, se añadieron 11 g de MgCl_{2}.6H_{2}O sólido. La concentración final de MgCl_{2} en L10 es aproximadamente de 0,25 M. L10 es estable al menos durante 1 mes cuando se almacena a temperatura ambiente en la oscuridad.

Fraccionamiento de AN-ds y AN-ss siguiendo el protocolo R

El procedimiento se esboza en la figura 1. Se añadió una muestra de 50 \mul (que contenía una mezcla de varios tipos de AN en el tampón TE) a una mezcla de 900 \mul de L11 y 40 \mul de SC en un tubo Eppendorf y posteriormente se homogeneizó mezclando en un vortex. Después de 10 minutos de unión a temperatura ambiente el tubo se centrifugó (2 minutos aproximadamente a 10.000 x g), con lo que se obtuvo un pellet de sílice/AN-ds ("pellet de sílice inicial") y un sobrenadante que contenía AN-ss.

Para recuperar las formas de AN-ss (protocolo sob R) se añadieron 900 \mul del sobrenadante a una mezcla de 400 \mul de L10 y 40 \mul de SC y el AN-ss se unió durante una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó posteriormente (15 segundos aproximadamente a 10.000 x g), y el sobrenadante se desechó (por aspiración). El pellet resultante se lavó posteriormente dos veces con 1 ml de L2, dos veces con 1 ml de etanol al 70% (vol/vol) y una vez con 1 ml de acetona. El pellet de sílice se secó (10 minutos a 56ºC con la tapa abierta en un bloque de calentamiento Eppendorf) y se eluyó en 50 \mul del tampón TE (10 minutos a 56ºC; tapa cerrada). Después de la centrifugación (2 minutos aproximadamente a 10.000 x g) el sobrenadante contiene la fracción del AN-ss.

Para recuperar las formas de AN-ds (protocolo pellet R) a partir del pellet de sílice inicial se desechó el sobrenadante restante y el pellet de sílice se lavó dos veces con L11 para eliminar el AN-ss no ligado. El pellet de sílice resultante se lavó posteriormente dos veces con L2, dos veces con etanol al 70% y una vez con acetona, se secó y eluyó como se ha descrito anteriormente. Después de la centrifugación (2 minutos aproximadamente a 10.000 x g) el sobrenadante contiene la fracción del AN-ds.

En el procedimiento completo (que tarda aproximadamente una hora) para el fraccionamiento del AN se sigue el protocolo R y se usan sólo dos tubos Eppendorf.

Fraccionamiento del ADN genómico y del AN-ss

Debido al atrapamiento del AN-ss en el ADN genómico de alto peso molecular el protocolo R, tal como se describe anteriormente, sólo consigue un rendimiento bajo del AN-ss. Este inconveniente puede evitarse aislando primero el AN total siguiendo el protocolo Y/D^{11}, que provoca un cierto grado de fragmentación del ADN genómico de alto peso molecular suficiente para prevenir el atrapamiento del AN-ss. El AN total así purificado puede usarse posteriormente como base para el protocolo R.

Electroforesis en gel

En todos los experimentos el AN se sometió a una electroforesis (8 a 10 V/cm) a través de geles de agarosa neutra en bloques que contenían bromuro de etidio (1 \mug/ml) en el sistema tampón (TRIS 40 mM - acetato sódico 20 mM - EDTA 2 mM ajustado a pH 7,7 con ácido acético; el bromuro de etidio se añadió hasta una concentración de 1 \mug/ml de tampón) descrito por Aaij y Borst^{14}.

Hibridación

Los fragmentos de ADN se transfirieron a filtros de nitrocelulosa siguiendo el procedimiento Southern^{15} y se hibridaron con pHC624 marcado con [alfa-^{32}P]dCTP^{16} preparado por marcado aleatorio (Boehringer, Alemania). Las condiciones de hibridación son las descritas previamente^{12}.

Resultados

La comparación entre los distintos tampones de lisis que contienen GuSCN con respecto a la unión de los distintos tipos de AN a las partículas de sílice reveló que sólo se unieron las formas dicatenáricas cuando se usó el L11 (que contiene aproximadamente 100 mM de EDTA) como tampón de unión; por otro lado, tanto las formas dicatenáricas como monocatenáricas se unieron al tampón de unión L6 (que contiene aproximadamente 20 mM de EDTA) (Tabla 1). Estas observaciones sentaron la base para el desarrollo de un protocolo (Protocolo R) para el fraccionamiento de los ácidos nucleicos monocatenáricos y los ácidos nucleicos dicatenáricos (figura 1).

Una vez que el ácido nucleico dicatenárico se une a las partículas de sílice en L11 una breve centrifugación separará el pellet de sílice/AN-ds del sobrenadante que contiene las formas monocatenáricas. La adición de este sobrenadante a la mezcla de partículas de sílice y al tampón de unión L10 (que contiene aproximadamente 250 mM de Mg^{2}+) restaura la unión de los ácidos nucleicos monocatenáricos a las partículas de sílice. Las formas dicatenáricas y monocatenáricas pueden purificarse posteriormente lavando y eluyendo los complejos de sílice-AN (protocolo R). El ácido nucleico dicatenárico se recupera a partir del pellet de sílice inicial (protocolo pellet R), mientras que las formas monocatenáricas se recuperan a partir del sobrenadante inicial (protocolo sob R).

Para optimizar el protocolo R realizamos experimentos de reconstrucción en los que los ácidos nucleicos previamente purificados o comercializados se mezclaron y fraccionaron posteriormente siguiendo el protocolo R.

Fraccionamiento de una mezcla de ADN dicatenárico y ADN monocatenárico

El fraccionamiento de una mezcla de ADN-ds/ADN-ss en las formas dicatenáricas y monocatenáricas se muestra en la figura 2. La recuperación estimada a partir de la intensidad de la banda del gel teñido con bromuro de etidio para ADN-ss fue aproximadamente del 50%, y la recuperación estimada del ADN-ds en el intervalo de 500 pb a 4,6 kb fue del 80%-90% [se obtuvieron recuperaciones similares a partir de los fragmentos de ADN-ds en el intervalo de 100-500 pb (datos no presentados)], y los fragmentos de mayor tamaño se rompieron significativamente como se ha mencionado anteriormente^{11}. En cuanto a la detección mediante la iluminación UV, el fraccionamiento en las formas ds y ss fue completo.

Fraccionamiento de una mezcla de ARN dicatenárico y ARN monocatenárico

En la figura 3 se muestra el fraccionamiento de una mezcla de ARN-ds (segmentos 1-11 del genoma de Rotavirus humano; consultar una revisión en la cita 14) y ARN-ss (ARN del fago MS2) en sus formas dicatenáricas y monocatenáricas. La recuperación estimada del ARN-ds y del ARN-ss fue al menos del 80%. En cuanto a la detección mediante la iluminación UV, el fraccionamiento en las formas ds y ss fue completo.

Fraccionamiento de una mezcla de ADN dicatenárico y ARN monocatenárico

En la figura 4 se muestra que el ADN-ds también puede separarse eficientemente del ARN-ss.

De nuevo, las recuperaciones para ambas fracciones fueron al menos del 80%. Se obtuvieron resultados similares cuando se usó ARNr de E. coli (23S y 16S) como base de ARN-ss (datos no presentados).

En los experimentos descritos anteriormente pareció que el fraccionamiento de las formas de AN-ds y ss (valorado mediante la inspección visual de las intensidades de las bandas después de la tinción con bromuro de etidio e iluminación UV) era completo. Para establecer el rendimiento del procedimiento de fraccionamiento para una mezcla de ADN-ds y ARN-ss en las formas ds y ss, el AN purificado siguiendo el protocolo sob R a partir de una mezcla de este tipo se estudió utilizando la transferencia Southern e hibridación con una sonda de ADN marcada con ^{32}P, homóloga al ADN-ds usado como base para el fraccionamiento. Este experimento reveló que la fracción del AN-ss contenía menos del 0,1% del ADN-ds utilizado como base (figura 5).

Fraccionamiento de una mezcla de ADN genómico y ARN monocatenárico

Cuando investigamos la separación del ADN-ds de alto peso molecular (genómico) y ARN-ss por fraccionamiento directo usando E. coli como base para el protocolo R, pareció que la fracción del ADN-ds estaba muy contaminada con ARNr (figura 6, pistas 6 y 7) y que la recuperación del ARN-ss fue baja (figura 6, pistas 8 y 9). Probablemente, este resultado se debió al atrapamiento del ARN en un ADN-ds de alto peso molecular (genómico) cuando se formaron los complejos de sílice/AN. Por otro lado, no se observó ADN genómico en la fracción del ARN-ss. Se mostraron recuperaciones significativamente mayores de la fracción ARN-ss en el ácido nucleico total, que se aisló primero usando el protocolo estándar Y/ D^{11} y que se usó a continuación como material base en el protocolo R (figura 6, pistas 2 y 5).

Amplificaciones Materiales y métodos Origen de los ácidos nucleicos

El ARN del VIH-1 se aisló a partir de un cultivo de virus^{23}, el ARN del fago MS-2 se adquirió en Boehringer (Mannheim, Alemania) y el ARN de 7,5 Kb Poly(A)Tailed y la banda de 100 pb usada como marcador se adquirió en Life Technologies (Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). El vector de clonación PCR TA3 se obtuvo en Promega (Madison, EE.UU.). Los plásmidos 5' NOT Hxb_{2}ENN^{24} [que contiene los genes GAG y POL del VIH-1 a partir del nucleótido 638-4647) y 168.1 RTN^{24} (que contiene el gen ENV del VIH-1 a partir del nucleótido 5674-8474) se purificaron tal como describen Ish-Horowicz y Burke^{13} siguiendo el protocolo pellet R que se describe en los ejemplos. El plásmido pHCrec usado como control positivo en los experimentos de la PCR se elaboró mediante una PCR de anidación baja en el ADN lambda (Boehringer) usando el cebador de PCR RB 8 (ver más adelante). Los productos de la PCR discreta se purificaron usando el protocolo Y/D^{11} y posteriormente se clonaron en un vector PCR III (Invitrogen). El plásmido de revelado pHCrec con un inserto de aproximadamente 600 pb se purificó posteriormente a partir de E. coli HB101, tal como describen Ish-Horowicz y Burke^{13} seguido por cromatografía en columna con Sepharose CL2B (Pharmacia, Inc. Uppsala, Suecia).

Productos químicos y enzimas

El EDTA, el KCl, el MgCl_{2}.6H_{2}O, el NaCl y el citrato trisódico dihidrato se obtuvieron en Merck (Darmstadt, Alemania). El TRIS y la BSA se obtuvieron en Boehringer (Mannheim, Alemania). El Triton X-100 se obtuvo en Packard (Packard Instruments Co. Inc., Downers. Ill. EE.UU.). El dodecilsulfato sódico (SDS) se obtuvo en Serva (Heidelberg, Alemania).

El dNTP's y el sulfato de dextrano se obtuvieron en Pharmacia (Uppsala, Suecia).

Los productos químicos usados en el protocolo R se describen en este documento.

La transcriptasa inversa SuperScript II se adquirió en Life Technologies (Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). La polimerasa de ADN Sequenase 2 se obtuvo en Amersham (Reino Unido). La polimerasa de ADN Ampli-Taq se obtuvo en Perkin Elmer (Norwalk, EE.UU.). La RNasa H se obtuvo en Boehringer (Mannheim. Alemania). El ADN de esperma de salmón se obtuvo en Sigma (St. Louis, EE.UU.).

Composición de los tampones y soluciones

La preparación de los tampones que se usan en el protocolo R se describen en este documento, si bien el tampón de lisis y los tampones de lavado (L10, L11 y L2) usados en el protocolo R para el aislamiento de ácidos nucleicos se filtraron a través de una columna rellena con diatomeas^{11} para eliminar cualquier resto de ácidos nucleicos endógenos del tampón de lisis y de los tampones de lavado.

El tampón de trascripción inversa 10x (CMB1) está compuesto por Tris.HCl 100 mM (pH 8,5), KCl 500 mM y Triton X-100 al 1%.

El tampón de PCR 10x está compuesto por Tris.HCl 500 mM (pH 8,3), KCl 200 mM y 1 mg/ml de BSA.

El tampón de elución Tris/EDTA (TE, pH 8,0) está compuesto por Tris.HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM (pH 8,0).

Oligonucleótidos

El cebador de la primera cadena TAG 20:

5'GACAGAATGCCGAAATGA CCCCNNNNNG3'

El cebador de la segunda cadena TAG 7:

5'DIG- GACAGAATGCCGAAATGA NNNNNG3'

El cebador de PCR RB 8:

5' GACAGAATGCCGAAATGA3'

subrayado: motivo PCR

en negrita: motivo para secuenciado directo N= A, T, C, o G

Protocolo para la síntesis de la primera cadena

El ARN-ss, presente en las transcriptasas inversas comercializadas, pareció dar lugar a productos no deseados cuando se usó en la síntesis de la primera cadena. Para superar este problema se trató previamente primero la transcriptasa inversa en una mezcla para la síntesis de ADNc que carecía de cebadores añadidos exógenamente:

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1

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Incubar 15 minutos a 37ºC.

Los ácidos nucleicos (20 \mul) purificados siguiendo el protocolo sob R se incubaron durante 5 minutos a 60ºC y a continuación se neutralizaron en hielo. Posteriormente se añadió la mezcla siguiente:

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3

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Por último se añadieron 10 \mul de Superscript II preincubado (SS II) y la mezcla resultante se incubó durante 30 minutos a 42ºC.

Después de la reacción de trascripción inversa la SS II se inactivó incubando la mezcla durante 5 minutos a 80ºC y la mezcla se enfrió posteriormente hasta temperatura ambiente. Para convertir los híbridos de ARN/ADN en ADNc monocatenárico se añadieron veinte unidades de RNasa H a la mezcla y se incubó durante 60 minutos a 37ºC. El ADNc monocatenárico se aisló posteriormente usando el protocolo sob R. El ADNc monocatenárico se eluyó en 40 \mul del TE y se usaron 20 \mul como base para la síntesis de la segunda cadena.

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Protocolo para la síntesis de la segunda cadena

A veinte microlitros del ADNc monocatenárico se añadió la siguiente mezcla (en hielo):

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4

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La mezcla se incubó durante 10 minutos en hielo, y posteriormente durante 60 minutos a 37ºC. Después de la síntesis de la segunda cadena se aisló el ADNc dicatenárico usando el protocolo pellet R. El ADNc dicatenárico se eluyó en 40 \mul del TE. Se tomaron veinte microlitros de esa mezcla y se usaron 2 \mul como base para la PCR. Los 18 \mul restantes se almacenaron a -20ºC.

Protocolo para la reacción de la polimerasa en cadena

Se añadieron dos microlitros de ADNc dicatenárico a 48 \mul de una mezcla de PCR consistente en:

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5

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Después de la incubación durante 5 minutos a 95ºC la muestra se sometió a 45 ciclos de amplificación en un termociclador de ADN (tipo 480: Perkin Elmer Cetus). Cada ciclo consistió en la desnaturalización durante 1 minuto a 95ºC, anidación durante 1 minuto a 63ºC y alargamiento durante 2 minutos a 72ºC. Después de los ciclos la muestra se incubó durante 8 minutos a 72ºC, y posteriormente se bajó la temperatura hasta 4ºC. Se estudiaron veinticinco microlitros del producto de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. En cada experimento se usó el TE como control negativo de la extracción y como control negativo de la PCR.

*La sustitución parcial con dTTP por dUTP permite garantizar que los productos de las reacciones previas de PCR no pueden reamplificarse. Los productos de amplificación de la PCR serán ácidos desoxirribunucleicos que contienen uracilo. La posible contaminación de los productos de la PCR a partir de la amplificación previa por PCR se eliminará si se escinden las bases de uracilo usando la enzima Uracil N-glicosilasa (UNG) antes de la PCR^{25}.

Electroforesis en gel

En todos los experimentos se utilizaron los ácidos nucleicos en una electroforesis (8 a 10 V/cm) a través de geles de agarosa neutra en bloques que contenían bromuro de etidio (1 \mug/ml) en el sistema tampón, tal como describen Aaij y Borst^{14}.

Hibridación

Los fragmentos de ADN se detectaron después de la transferencia Southern^{15} mediante hibridación con sondas marcadas con ^{32}P que representan todos los genes GAG, POL y ENV del VIH-1 (plásmido 5' NOT Hxb_{2}ENN y plásmido 168 1 RTN)^{10}.

Resultados

Paralelamente se extrajeron 10^{5} moléculas de ARN del VIH-1^{23} y los controles negativos (TE) usando el protocolo sob R. Los ácidos nucleicos monocatenáricos resultantes se amplificaron mediante una PCR-RT no selectiva, según se revela anteriormente, dando lugar a un patrón de creación de bandas discretas para el ARN del VIH-1, sin ninguna amplificación de los productos en los controles del TE (figura 8). La variación entre los duplicados refleja la falta de selectividad del procedimiento. Como control de la eficiencia de la parte de la PCR del procedimiento usamos una base de 0, 6, 60 y 600 moléculas del plásmido pHCrec.

Para confirmar el origen VIH de las bandas visibles en la figura 8 A realizamos una hibridación mediante transferencia Southern bajo condiciones muy restringidas con sondas marcadas con ^{32}P que incluyen casi todo el genoma del VIH-1 (figura 8 B). Este experimento mostró que la mayoría de las bandas visibles mediante la iluminación UV se habían hibridado con la sonda del VIH-1. Las bandas que no se hibridaron con la sonda podrían ser homólogas a partes del genoma del VIH-1 distintas de las que se encuentran en la sonda o podrían originarse en el ARN monocatenárico presente en el preparado de ARN del VIH-1 (por ejemplo, el ARNm celular) o en el ARN-ss presente en el Superscript II, que no se convirtió a híbridos-ds durante la preincubación del SuperScript II.

Se obtuvieron resultados similares con otros ARN monocatenáricos como el ARN del virus de la hepatitis C, ARN del fago MS2 y el ARN de 7,5 Kb Poly(A)-Tailed (resultados no mostrados).

Se concluye que el procedimiento descrito puede usarse para amplificar las dianas de ARN monocatenárico (presente, por ejemplo, en suero) hasta una serie de bandas discretas en geles de agarosa. Las bandas discretas pueden purificarse a partir de los geles de agarosa, clonados por ejemplo en un vector bacteriano y los clones pueden secuenciarse posteriormente. Debido a que uno de los cebadores de marcado (TAG 20) alberga un motivo de secuenciado, es posible secuenciar las bandas discretas sin clonarlas, una vez que las bandas se han purificado del gel. El método que aquí se describe es útil para aislar e identificar secuencias desconocidas presentes en las muestras clínicas (por ejemplo, secuencias víricas) o para la amplificación de los ADNc a partir de los transcriptos, sin disponer de ningún dato del secuenciado.

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TABLA 1

6

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Unión de distintos tipos de AN a partículas de sílice en distintos tampones de lisis: se obtuvieron resultados similares usando diatomeas en lugar de partículas de sílice (datos no mostrados).

Claims (10)

1. Un método para separar material que contiene ácido nucleico monocatenárico de material que contiene ácido nucleico dicatenárico y aislar el material que contiene el ácido nucleico monocatenárico, que consiste en poner en contacto una mezcla de ambos con un primer líquido que contiene un agente desnaturalizante y un ácido nucleico que se une a la fase sólida que es capaz de unirse reversiblemente al ácido nucleico, en el cual el líquido tiene una composición tal que el material del ácido nucleico dicatenárico se une a la fase sólida y una cantidad sustancial del ácido nucleico monocatenárico no se une y en separar la fase sólida de la líquida, consistiendo dicho método además en tratar el sobrenadante que contiene el material del ácido nucleico monocatenárico con un segundo líquido que contiene un agente desnaturalizante y una segunda fase sólida de unión al ácido nucleico que también es capaz de unirse reversiblemente al ácido nucleico, en el cual el segundo líquido tiene una composición tal que la mezcla resultante del sobrenadante y el segundo líquido permite la unión del material que contiene ácido nucleico monocatenárico a la segunda fase sólida, por lo cual se aísla el ácido nucleico monocatenárico.

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual el primer líquido contiene un agente desnaturalizante en una concentración entre 1-10 M y un agente quelante, y tiene un pH entre 2 y 10.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 2 en el cual el agente quelante es EDTA que está presente en una concentración entre 10 mM y 1 M.

4. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual el primer líquido contiene un agente desnaturalizante, un agente quelante e iones bivalentes positivos en concentraciones apropiadas.

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 4 en el cual la concentración de los iones bivalentes positivos se parece a la concentración del agente quelante.

6. Un método de acuerdo a la reivindicación 4 en el cual el agente quelante es EDTA y los iones son iones Mg^{2+}.

7. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 por el cual el primer líquido tiene la constitución de un tampón preparado disolviendo 120 g de GuSCN en 100 ml de EDTA 0,2 M (pH= 8).

8. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual el segundo líquido tiene la constitución de un tampón preparado disolviendo 120 g de GuSCN en 100 ml de TRIS.HCl 0,35 M (pH 6,4) y añadiendo 22 ml de EDTA 0,2 M (pH 8,0) y 9,1 g de Triton X-100, homogeneizando la solución y añadiendo MgCl_{2} hasta una concentración final de aproximadamente 0,25 M.

9. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual dichas primera y segunda fases sólidas están elaboradas con silicio.

10. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 en el cual la fase sólida se separa del sobrenadante mediante centrifugación.