JP4690656B2 - 核酸の分離精製方法及び分離吸着体 - Google Patents
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Description
フラグメントDNAの精製は、分子生物学的研究において、非常に頻繁に用いられる技術で、PCR、クローニング、シークエンシング、制限酵素消化、その他酵素的作用などのアプリケーションに先立って行われている。
例えば、組換M13ファージからDNAを単離する方法があり、ガラス繊維フィルター上でカオトロピック物質の添加により、M13ファージDNAを結合させ、次いで分離洗浄乾燥を経て溶離する単離方法が示されている。(非特許文献1参照)
又、ガラスパウダーを添加してDNAをガラスパウダーに結合させ、遠心分離して、ガラスパウダーを集め、洗浄、溶離し単離する方法が示されている。(非特許文献2参照)又、同様の方法は、特許文献1、非特許文献3、非特許文献4等に記載されている。
又、複合性生物出発材料、カオトロピック物質及びシリカ又はその誘導体を含む核酸結合性固相を混合し、 核酸を結合した固相を液体から分離し、洗浄し、核酸を溶離する方法が提案されている。(特許文献2参照)
前記のどの担体を使用するにしろ、吸着させる担体を容器(カートリッジ、チップなど)に保持し、その容器に生体試料を通液し、吸着バッファー液で担体に核酸を吸着させ、その後洗浄液で核酸成分以外の夾雑物をカートリッジ外に追い出し、更にその後、溶出液を通液して核酸成分をその液と共に取り出す手順が一般的である。
又、ポリマーを使用する方法は、そのポリマーの性質によって核酸と特異的に反応する働きが充分でなかったり、又その部分以外に影響を与える部分が存在したりと分離系が複雑になり、単純なプロトコルでの精製は不可能である。
何れも高純度なフラグメントDNAを精製することは不可能である。又、粉末シリカ樹脂や懸濁液が持つ取扱い難さや、その後のアプリケーション反応を妨げる虞がある等の欠点がある。
特許文献2の発明に於ける如く、複雑な出発材料から、前処理なしで核酸を直接単離する考え方は、所謂「消化」と「精製」を同時に行うものである。そのために過激な反応条件が必要となり、且つ適用できる核酸の分子量範囲が狭くなると云う弊害が生じる。
然し、この方法に於いては、高濃度の塩を含む吸着水溶液から、核酸混合物を無機体上に吸着させること及び低濃度ではあるが、塩を含む溶液で核酸を溶出するため、例えばDNAサンプルが大きなアガロース片に含まれる場合には、複数のカラムを使っての処理が必要であり、溶出したフラグメントDNAをプールし、更に得られたフラグメントDNAに塩や有機溶媒が含まれるので、濃縮や脱塩等の操作工程が必要であり、その上エタノール沈殿中に精製DNAを損失する虞もある。
モノリス構造体とは、上端から下端まで連通した開放構造のマクロ細孔を持つ、一体型多孔質体のことを指し、そのマクロ細孔に更にミクロ細孔を持つものが多く合成されている。
この反応時に種々の有機モノマーを添加すると、有機・無機ハイブリッドモノリスも簡単に作成できる。従って、添加する有機モノマーの種類によって、化学的特性を加えることも可能となる。例えば、親水基を持つ有機モノマーを添加することによって、水系試料成分の吸水性を向上することができる。又、選択的な化学作用を示す官能基を持つ有機モノマーを添加することによって、精製における不純物となる特性成分の吸着に利用し、その不純物を固相に残すことで、核酸の精製効率をアップすることができるようになる。又、弾性率の単位ポリマーをゾル−ゲル工程中に入れることにより、モノリス構造体に弾力性を持たせることも出来る。更に基本的には、有機・無機を混在させることによって、モノリス構造体の化学的安定を上げることも可能となる。
ゾル−ゲル法におけるモノリス構造の合成に於いては、連続行程により作成され、金属のコンタミネーションは全くない。従来、シリカゲルでは、塩酸や硝酸等で洗浄するなどの工夫や、金属影響を減らすようなEDTAなどの添加があったが、本発明固相では全く必要ない。
本発明に於いて最も基本的な構成は、フラグメントDNAをアガロースゲル、PCR反応物、制限酵素処理DNA、1本鎖DNA及びRNA等から精製するために、カオトロピック塩の存在下、ガラスやシリカに吸着させること、殊に優れた分離能力を有するガラスやシリカにより形成されるモノリス構造体、即ち、細孔が上端から下端まで連通した開放構造を有する一体型多孔質体を使用し、これに吸着させることにある。
然し、従来の方法は全て充填材を使用していた。このため、充填材の充填にばらつきがあり、均一にならないこと、また充填材通過の後に粒がDNA液に残留してしまうこと、液との接触面積が小さく反応効率が悪いこと、通液圧力が大きく扱いにくいこと等の欠点が残るものであった。
この従来の技術は、高濃度のカオトロピック塩の存在下で吸着を定量的に生じさせ、吸着した核酸の溶出はより低い塩濃度で行なうものであった。
然も、特許文献3の方法は、分離すべき核酸を予備的精製行程なしに1つの操作行程で、核酸分画を行う方法である。このために高濃度の塩のバッファーによる過激な反応条件が必要となり、適用できる核酸の分子量範囲が狭くなる。更に精製DNAは極めて希薄で、塩や有機溶媒があるため、更にエタノール沈殿や濃縮する必要がある。
本発明はアガロースゲルからのDNA断片とPCR増幅反応DNA液、酵素反応液からのフラグメントDNAなどの精製を1つの目的とするものである。
A バッフアー(溶解、吸着バッファー)
B バッフアー(洗浄バッファー)
C バッフアー(溶出バッファー又無菌水)
これを更に詳述すると
A1 バッフアー PCR反応液用(グアニジン塩酸塩1〜8M、酢酸カリウム0.1〜1M未満、2−プロパノール1〜70%)
A2 バッフアー アガロースゲル用(グアニジンチオシアン酸1〜8M、酢酸カリウム0.1〜1M未満、2−プロパノール1〜70%)
B バッフアー(酢酸カリウム0.1〜1M未満、エタノール1〜80%)
C バッフアー(pH=8〜8.5 Tris−HCI10mM、EDTA1mM、又は無菌DNA、RNA free水)
A1バッファーに於いて、グアニジン塩酸塩はグアニジンチオシアン酸が好適で、1〜8Mがより好ましい。2−プロパノールは40%以上が効率的である。
A2バッファーに於いても以上の条件が当て嵌まる。
溶出バッファー液Cに於いては、水による溶出が可能であるが、雑菌の混入を防ぐために、限外濾過膜処理やディエチルピロカーネートで処理などを行ったRNaseフリーな水を使用する事が推奨される。又、精製したDNAを保管する場合、菌の混入を防ぐため、溶出バッファー液Cとして、先にEDTAバッファーを添加した水を使用してもよい。分離機構から見てもEDTAバッファーの有無で精製効率が変わることは無い。
又、ゾル−ゲル過程におけるスピノールダル分解を利用し、2種類の細孔を有するシリカ骨格中に細孔の存在するモノリス構造体も作成できる。
又、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔の内部に開放構造を有するミクロ細孔を持つ多孔質体が充填された構造の多孔質体も作成できる。因みに、この多孔質体はマクロ細孔の直径1〜100μmであり、ミクロ細孔が0〜100nmである。
この他、ガラス、シリカが含有されて形成されるものであれば、適宜のモノリス構造体が使用しうること勿論である。
又、モノリス構造体の基体としてディスク7が挙げられているが、これに限らず皿状や筒状等溶液の通過の自在である型で使用できる。
又、不純物などとの相互作用を高め、より効率的に精製するためには、ミクロ細孔の付加が行われる。各種試験、実験などの経験から、ミクロ細孔が数10nm前後であれば分子量数10万の化合物、10nm前後であれば分子量数百〜数万の化合物と相互作用があることが確認されており、更に大きな分子量の化合物ならば、その分子の破壊を助長すると云われるミクロ細穴が限りなくない状態、つまり0nmがよいことが判っている。
マクロ細孔にミクロ細孔を付加した種々の一体型モノリス構造体を数種用意し、DNAの種類及び不純物除去などの目的毎に使い分けることも可能である。ちなみに、数種類の一体型モノリス構造体を作成するには、マクロ細孔を予め作成し、その後にミクロ細孔を形成させる方法の方が合成上便利である。
1〜100μm、好ましくは20μm程度のマクロ細孔と、0〜100nm、好ましくは10nm程度のミクロ細孔を形成したモノリス構造体を用いれば、実施例にあるような、35bp(mer)〜100Kbp(mer)の広範囲のDNAの精製が充分可能である。
(1)マイクロ遠心法
このプロトコールは、PCR反応液から2本鎖DNAフラグメントを精製する目的でデザインされ、1つのモノリス固相カラムと精製用バッファーを用いれば、遠心操作により、35bp〜100Kbpのフラグメントがプライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩等から分離可能である。
PCR反応液10μlに対して、100μlのバッファーA1(吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約300μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
全ての遠心操作は一般的な卓上マイクロ遠心機で〜10,000rpmで行う。
1.PCR反応液に10倍容量のバッファーA1を加えて混合する。ミネラルオイルを除去する必要はない。例えば、50μlのPCR反応溶液(オイルを含まない量)には500μlバッファーA1を加える。
2.コレクションチューブ8にモノリス固相カラム9を挿入し、調整したサンプルをモノリス固相カラムにアプライする。高回収率を得るため、サンプル液を残さないでモノリス固相カラム9に添加する。
3.モノリス固相カラム9を10,000rpm、30秒間遠心した後、モノリス固相カラム9を取外し、コレクションチューブ8内の液体を除去。モノリス固相カラム9を、コレクションチューブに再度挿入する。
4.バッファーB(洗浄バッファー)500μlを添加し、モノリス固相カラム9を10,000rpm、30秒間遠心。更に10,000rpm、1分間遠心する。
コレクションチューブ8内の液体を捨てた後に、バッファー由来の残留エタノールを完全に除去するためには再遠心操作を行うことが必要である。
5.モノリス固相カラム9を新しい1.5ml遠心サンプリングチューブに移し、バッフアーC(溶出バッファー)10〜50μlをモノリス表面の中央に添加し、モノリス固相カラム9を1分間室温でインキュベートした後、10,000rpm、1分間遠心する。遠心チューブ内に溶出されたDNAは精製されたDNAで、−20℃で保存する。又は後の操作にそのまま使用する。
モノリスに結合したDNAが完全に溶出されるように、モノリス表面中央部分に溶出バッファーCを添加する。10μlの溶出バッファーCを用いた場合は溶出液量は9μlである。
溶出効率はpHが8〜8.5の間で最大となる。溶出に滅菌水系を用いる場合には、pHがこの範囲であることを確認するのがよい。
モノリス固相カラムは、一般的なルアーアダプターを含む吸引マニホールドにより操作を行うことが出来る。このプロトコールは、PCR反応液から2本鎖DNAフラグメントを精製する目的でデザインされている。1つのモノリス固相カラムと精製用バッファーを用いれば、吸引装置によるサンプル処理操作により、35bp〜100Kbpのフラグメントがプライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩等から分離可能である。
PCR反応液10μlに対して、100μlのバッファーA1(吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約300μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
一定で安定した吸引が行われるよう、各操作ステップ毎に一端吸引スイッチを切る。
1.PCR反応液に10倍量のバッフアーA1を加えて混合する。ミネラルオイルを除去する必要はない。例えば、50μlのPCR反応溶液(オイルを含まない量)には500μlバッファーA1を加える。
2.吸引マニホールドとモノリス固相カラムを準備する。
ルアーアダプター吸引マニホールドを吸引装置に接続する。
3.吸引マニホールド上のポートに取付けたバキュームアダプターを装着。モノリス固相カラム9をバキュームアダプターに挿入する。
4.調整したPCRサンプルをピペットによりモノリス固相カラム9にアプライし、DNAを結合させるために吸引する。溶液がモノリス固相カラム9を完全に通過するまで吸引する。サンプルがカラムを通過した後、吸引を止める。
高回収率を得るため、サンプル液を残さないでモノリス固相カラム9に添加する。添加最大容量は800μlで、800μlよりサンプル量が多い場合には、数回に分けて添加する。
5.バッファーB(洗浄バッファー)500μlをモノリス固相カラム9に添加し、液体がモノリス固相カラムを通過するまで吸引する。
6.モノリス固相カラム9をマニホールドから外し、コレクションチューブ8に移す。10,000rpmで1分間遠心する。
バッファー由来の残留エタノールを完全に除去するために遠心操作が必要である。(液体がモノリス固相カラムを通過するまで吸引し、乾燥させる。モノリス固相カラム9に残っている洗浄バッファーを完全に除去するための必要手段である。)
7.モノリス固相カラム9を新しい1.5ml遠心サンプリングチューブに移し、バッファーC(溶出バッファー)10〜50μlをモノリス表面の中央に添加し、カラムを1分間室温でインキュベータした後、10,000rpm、1分間遠心する。遠心チューブ内の溶出されたDNAは精製されたDNAで、−20℃で保存する。又は後の操作にそのまま使用する。
モノリスに結合したDNAが完全に溶出されるように、モノリス表面中央部分に溶出バッファーCを添加する。10μlの溶出バッファーCを用いた場合は溶出液量は9μlである。
溶出効率はpHが8〜8.5の間で最大となる。溶出に滅菌水系を用いる場合には、pHがこの範囲であることを確認するのがよい。
(1)マイクロ遠心法
このプロトコールは、標準的又は低温融解アガロースゲル(TE又はTEBバッファー使用)から、DNAフラグメントを精製する目的でデザインされ、1つのモノリスカラムと精製用バッファーを用いれば、遠心操作により、35bp〜100Kbpのフラグメントがプライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩等から分離可能である。1個のモノリスカラムにつき、最大1000mgのアガロースの処理が可能である。
アガロースゲル10mgに対し10μlのバッファーA(溶解、吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約500μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
全ての遠心操作は一般的な卓上マイクロ遠心機で〜10,000rpmで行う。
1.清潔なカミソリやメスで目的のバンドを切取り、1.5ml遠心チューブに入れる。余分なゲルを取除いて、ゲルスライスのサイズを最小になるようにする。
2.バッファーA2(溶解、吸着バッファー)をゲルスライス100mgに対し100μl添加する。
100mgのゲルには、バッファーA2を100μl添加するが、濃度が2%以上のアガロースゲルを用いる場合は、バッファーBを600μl添加する。1個のモノリスカラムで処理できるゲル量は1,000mgであるので、ゲル量が1,000mgを超える場合は2個以上のモノリスカラムを使用する。
3.60℃で5分間又はゲルスライスが完全に溶解するまでインキュベーションする。インキュベーション中、2回チューブをボルテックスにかけて溶液を混合する。アガロースを完全に溶解させる。2%以上のゲルを用いる場合は、インキュベーション時間を長くすると回収率がアップする。
以下の操作は、前記A.モノリス固相カラムを用いたPCR反応液の精製(1)マイクロ遠心法と同じであるから省略する。
モノリスカラムは、ルアーアダプターを含む吸引マニホールドにより操作を行うことが出来る。このプロトコールは、標準的又は低温融解アガロースゲル(TE又はTBEバッファー使用)から、DNAフラグメントを精製する目的でデザインされた。1つのモノリスカラムと精製用バッファーを用いれば、吸引装置によるサンプル処理操作により、35bp〜100Kbpのフラグメントがプライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、塩等から分離可能である。
アガロースゲル10mg対し10μlのバッファーA2(溶解、吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約500μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
溶出は遠心操作により卓上マイクロ遠心機で〜10,000rpmで行う。
一定で安定した吸引が行われるよう、各操作ステップ毎に一端吸引スイッチを切る。
1.清潔なカミソリやメスで目的のバンドを切取り、1.5ml遠心チューブに入れる。余分なゲルを取除いて、ゲルスライスのサイズを最小になるようにする。
2.バッファーA2(溶解、吸着バッファー)をゲルスライス100mgに対し100μl添加する。
100mgのゲルには、バッファーA2を100μl添加するが、濃度が2%以上のアガロースゲルを用いる場合は、バッファーA1を600μl添加する。1個のモノリスカラムで処理できるゲル量は600mgであるので、ゲル量が600mgを超える場合は2個以上のモノリスカラムを使用する。
3.60℃で5分間又はゲルスライスが完全に溶解するまでインキュベーションする。インキュベーション中、2回チューブをボルテックスにかけて溶液を混合する。アガロースを完全に溶解させる。2%以上のゲルを用いる場合は、インキュベーション時間を長くすると回収率がアップする。
以下の操作は、前記A.モノリス固相カラムを用いたPCR反応液の精製(2)吸引マニホールド法と同じであるから省略する。
(1)マイクロ遠心法
このプロトコールは、制限酵素分解や標識反応などの酵素反応液から2本鎖DNAフラグメントを精製する目的でデザインされた。1つのモノリスカラムと精製用バッファーを用いれば、遠心操作により、35bp〜100Kbpのフラグメントが酵素、プライマー、ヌクレオチド、塩等から分離可能である。
酵素反応液10μlに対し、30μlのバッファーA1(吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約300μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
全ての遠心操作は一般的な卓上マイクロ遠心機で〜10,000rpmで行う。
1.酵素反応液に3倍容量のバッファーA1を加えて混合する。モノリスカラムで処理できる酵素反応液の最大容量は100μlである。
例えば、100μlの酵素反応液には300μlバッファーA1を加える。
以下の操作は、前記A.モノリス固相カラムを用いたPCR反応液の精製(1)マイクロ遠心法と同じであるから省略する。
モノリスカラムは、ルアーアダプターを含む吸引マニホールドにより操作を行うことが出来る。このプロトコールは、制限酵素分解や標識反応などの酵素反応液から2本鎖DNAフラグメントを精製する目的でデザインされた。1つのモノリスカラムと精製用バッファーを用いれば、吸引装置によるサンプル処理装置により35bp〜35Kbpのフラグメントが酵素、プライマー、ヌクレオチド、塩等から分離可能である。
例えば、酵素反応液10μlに対し30μlのバッファーA1(吸着バッファー)を添加する。バッファーBは約300μl(洗浄バッファー)で洗浄する。
全ての遠心操作は一般的な卓上マイクロ遠心機で〜10,000rpmで行う。
一定で安定した吸引が行われるよう、各操作ステップ毎に一端吸引スイッチを切る。
1.酵素反応液に3倍容量のバッファーA1を加えて混合する。モノリスカラムで処理できる酵素反応液は最大容量は100μlである。
例えば、100μlの酵素反応液には300μlバッファーA1を加える。
以下の操作は、前記A.モノリス固相カラムを用いたPCR反応液の精製(2)吸引マニホールド法と同じであるから省略する。
従来タイプの方法では、シリカゲル粒子、ガラス粒子、それらをフィルター状にしたものが使用されている。それら全てに於いて、液が通る空間は、粒子表面を通ることになり、粒子にぶつかり、乱流が生じ、不均一な流れとなってしまう。そのため、全て表面に均一に触れることはできない。モノリス構造は、一体構造で内部に連続孔があるので、粒子内部を通るイメージとなる。即ち、全ての液が均一に接触する。又、粒子に比べると、骨格が小さく、液がぶつかった後の乱流の生ずることなく均一な流れとなる。
即ち、従来の固相タイプでは、粒子における乱流が生じ、表面との接触が不均一となり、低分子側DNAの吸着が生ぜずに抜けてしまうことになる。
その抜けを防止させるために、従来のタイプでは、カオトロピクス塩濃度を増やすことにより、反応を起こし易くしている。然し、この場合塩沈殿が生じ、限界が生じるため、低分子DNA捕集には限界が生じる。
本発明モノリスタイプでは、均一な液の流れが保障されており、より低分子DNAの吸着が可能となる。
当然、洗浄工程でも同じことが起きる。従来の方法では洗浄液の乱流が生じてゲル表面を洗浄することが困難となる。実施例1に記載されているように、1回目洗浄後でも従来の方法では目的としないプライマーなどがかなり残っているが、本発明の方法では殆ど残らない。
繊維に粒子を埋め込んだフィルターや繊維そのものを用いたものでも乱流が生ずるのはやはり同じことになる。
この場合、分離に寄与する部分は、その無機基体材料部分であり、上下フリットは無機体を中空体の保持されるために用いられている。
いくらきつく押込められても、フリットと無機体の間には空間が生じることになり、その空間部分に液は残存してしまう。その空間部分の液の追出しや置換は困難となる。特に、上記の如き減圧方法では、一部に気相部分ができてしまうと、その部分が優先的に流れることになり、均一に液を抜くことができなきなる。試料付加、洗浄工程に於いては、液体の置換が成され難くなってしまう。
又、最後の溶出に於いては、液が残ってしまい、回収が悪くなってしまう。
又、従来タイプでは、押込み具合で、その空間は変化し、中空体への押込み時のロット間のバラツキも出易くなる。本発明に於いて、モノリス構造は一体構造であり、中空体への押込み時のバラツキは全くない。
市販品としては高価であり、実在しないが、フリットと無機体を更に押し潰し一体にすることも可能となるが、この方法でも押し潰した界面部分に異なる層ができてしまう。やはり均一な連続孔を持つモノリス構造に比べると、液体の流れは阻害される。
更に、本発明では、シリカゲルである無機物とフリット材料であるポリエチレンなどの有機物を、ゾル−ゲル行程で混合すれば、シリカとポリエチレンの性質を持つハイブリッドの均一相での作成も可能である。
無機体が粒子状の物では、それを止めるために、上下フリットは不可欠となり、上記説明のような置換効率の問題が生じる。
例え、フリットで止める必要のない固い繊維膜やシリカゲル薄膜を形成できたとしても、液の流れは、繊維やゲル表面を流れることにより、乱流が生じ、均一な分離が得られず、本発明のモノリス構造体を用いた場合ほどの分離は期待できない。
乱流の生じないモノリス構造体であることにより、初めて低分子DNAの吸着及び高い洗浄効果を達成できる。
基本的には、カオトロピック塩濃度を増やすことにより、それらの現象は軽減できるが、洗浄時でも取除かれず、溶出時に溶出してきてしまう。即ち、精製後の試料成分に多量の塩が入ることになる。これは、後の使用に於いては大きな問題となる。
モノリス構造体を用いた本発明方法では、塩濃度を下げることができ、上記の諸問題は解決でき非常に有効である。更に、よりカチオン交換作用を持つカリウム塩を合せて使用するとより効果的になる。カリウム塩はカチオン交換作用が強いので、核酸の表面への吸着に寄与するが、それが由に、溶出時に基体表面に残ってしまうと目的とする精製DNAが溶出しないと云う問題が生じるため、確実な洗浄が不可可決である。粒子タイプでは、洗浄時にも乱流が生じ、更に細孔への入込みが不均一のため、どうしてもカリウム塩が高濃度で基体に残存する部分が生じる。対策として溶出液にカリウムを除けるバッファー、即ち他の塩を加えたりすればよいことになるが、やはり後のアプリケーション目的に適さないことになる。
モノリス構造体では、均一な液の流れと均一な細孔への入込みが可能となるため、カリウム塩が有効に作用する。
溶出には溶出用バッファーC(EDTA4mM、Tris−HCI10mM、pH8又は無菌DNA、RNA free水)20μlを、別の1.5mlの遠心管で遠心用カラムに通して遠心分離する。こうして精製されたPCR産物(フラグメントDNA)にはプライマー、dNTPs、ポリメラーゼ及び塩が含まれず、後の操作に直接用いることができる。(図1,図2参照)図中M:分子量マーカー、丸1は従来方法で精製したサンプル、丸2は本発明で精製したサンプル。
丸1が従来の特許文献3の方法で精製した試料(400bp)での電気泳動による評価である。丸2が本発明方法である。丸1では、低分子側(下)部分が多く残っているが、丸2では殆ど残っておらず、高い精製効率が得られている。又、図2に於いて1−1及び1−2は従来方法で2回行い、残存を見たもので、2−1,2−2は本発明のものである。本発明の場合1回目で殆ど残っておらず、高い精製効率が得られることが分かる。図3はHPLCを使用しての評価である。HPLC条件は以下の通り
HPLC条件
カラム:CIM DEAE
溶離液:
A:20mM Tris−HCl pH7.4
B:A+1M NaCl
A/B=50/50−(10min)−0/100 Flow rate:3ml/min
検出:UV260nm
図3に於いて未精製のPCR溶液のHPLC評価データは、1番上のクロマトグラムであり、従来の特許文献3法による精製のクロマトグラム(一番下)と比べてパターンに変化がなく、dNTPs及びプライマーは、殆ど除かれていないことがわかる。本発明方法では、2番目のクロマトのようにdNTPs及びプライマーの2つのピークが大幅に取除かれ、目的とする核酸が高く精製されていることがわかる。
この溶解液を実施例1に従って、モノリス固相カラム9を、コレクションチューブ8に挿入し、混合物をモノリス固相カラム9に注入、1.5mlの遠心管内で遠心分離する。モノリス固相カラム9をバッファーB(0.2M酢酸カリウム、50%エタノール)での処理により洗って塩を含まないようにする。
溶出にはバッファーC(EDTA1mM、Tris−HCI10mM、pH8又は無菌DNA、RNA free水)20μlを、別の1.5mlの遠心管で遠心用カラムに通して遠心分離する。図4のうち、図4−1は35bpの、図4−2は100〜500bp、図4−3は10,000bpの、図4−4は35,000bpの電気泳動による評価である。
本発明方法では、低分子の35bpから約100Kbpまで回収されており、アガロースゲルからでも広い範囲のDNAが精製できることがわかる。溶出バッファーとして、EDTAバッファーを含まない水でも同様の結果が得られた。
100bpや100bp以下の小さなDNAでもここでは35bpのDNAのPCR反応液からの精製が出来た。
1000bp〜100KbpまでのDNAでもPCR反応液からの精製が出来た。
1本鎖DNA35merは、従来方法では回収できていない(3)が、本発明では(2)再現性よく2回とも回収されている。
従来からよく用いられるナトリウムと、本発明の効果があるカリウムとの精製比較を行なった。ナトリウムでは、保持が殆ど得られず、カリウムでは高い精製効率が得られた。又、シリカモノリスと同様にガラスモノリスでも同じくカリウムの方が高い生成効率が得られた。
Ecoli培養物3mlからのPQEプラスミドを含む大腸菌細胞を遠心分離し、10μg/mlのRNaseA、0.25ml中に再び懸濁し、そして2%のSDS、0.25mlを加える。バッファーA(4Mグアニジン塩酸塩、0.8M酢酸カリウム)を加えて試料を溶解中和する。細胞断片及び沈殿したSDSを取除くために、溶解した試料を15,000rpmのエッペンドルフ小遠心機で10分間遠心分離する。プラスミドDNAを含む上澄みを直ちに本願カラムにピペットでアプライする。該カラムを2mlの遠心管内で遠心分離にかけ、そして不純物及び蛋白を取り除くために、バッファーB(1Mグアニジン塩酸、0.3M酢酸カリウム、30%イソプロパノール)0.5mlで遠心分離によって塩を含まないように洗浄する。次いで、余分なエタノールを完全に除去するために10,000rmpで60秒間遠心分離する。溶出には、バッファーC(10mMのTris−HCl、pH8.5)0.1mlを、1.5mlの遠心管内でカラムに通して遠心分離する。塩が含まれない溶液中に濃縮した状態でプラスミドDNAは溶出した。収量は、A260/A280の比率が1.75であり、プラスミドDNA18μgであった。電気泳動図で示すように、4.0KbpのプラスミドDNAが単離精製されていた。図中M:分子量マーカー、1:大腸菌プラスミド(環状DNA):pQEvectors 6xHistag Constructs 4.0Kb、2:大腸菌プラスミド(環状DNA):pQEvectors 6xHistag Constructs 4.0Kb。一、二回同じ結果であった。
1.5mlのPPM管中のクエン酸、ヘパリン又はEDTAで凝血防止処理を受けた血液200μlに、バッファーA(5Mグアニジン塩酸塩、0.7M酢酸カリウム)と、プロテアーゼ、SDSを全量で200μlを加え、溶解及び蛋白の変性と酵素的分解を(核酸に結合した蛋白の除去)行う。溶解した試料を本願カラムにピペットでアプライする。10,00rpmのエッペンドルフ小遠心機で1分間遠心分離する。該カラムを2mlの遠心管内で遠心分離にかけ、そして不純物及び蛋白を取り除くために、バッファーB(1.5Mグアニジン塩酸、0.2M酢酸カリウム、40%エタノール)0.5mlで遠心分離によって塩を含まないように洗浄する。次いで、余分なエタノールを完全に除去するために10,000rmpで60秒間遠心分離する。次に、バッファーC(10mMのTris−HCl、pH8.5及び蒸留水0.1ml)で溶出する。塩が含まれない溶液中に濃縮した状態でゲノムDNAは溶出した。この溶出操作により、得られたゲノムDNAは、更に沈殿やバッファー交換の行程なしに直接、次の反応、特にPCRに使用する事ができた。電気泳動図(図14)で示すように30KbpのゲノムDNAが単離精製されていた。図中M:分子量マーカー、1:全血ゲノムDNA:約30Kb、2:全血ゲノムDNA:約30Kb。一、二回同じ結果であった。
2 上端開放部
3 蓋
4 出口
5 段差
6 中口径部
7 ディスク
8 モノリス固相カラム
9 コレクションカラム
Claims (10)
- 核酸を含有する溶液をカリウム塩を介在させ、シラノール基を有する一体型モノリス構造体の通孔に通すことにより、該通孔に夫々対応する大きさの核酸を該構造体のシラノール基との相互作用によって吸着させ、洗浄液で洗浄後、溶出させ、該溶出液をそのままPCR、クローニング、シークエンシングまたは酵素的操作可能としたことを特徴とする核酸の分離精製方法。
- 前記カリウム塩は酢酸カリウムであることを特徴とする請求項1に記載の核酸の分離精製方法。
- 酢酸カリウムは0.1〜1M未満含有する溶解吸着バッファーを使用することを特徴とする請求項1又2に記載の核酸の分離精製方法。
- グアニジン塩を含有する溶解吸着バッファーにより、溶解吸着を行うことを特徴とする請求項1〜3のうち何れか1項に記載の核酸の分離精製方法。
- Tris−HCl、EDTAを含有する水により溶出を行うことを特徴とする請求項1〜4のうち何れか1項に記載の核酸の分離精製方法。
- 溶解、吸着、分離、洗浄操作を1つのモノリス固相カラムを用いて行なうことを特徴とする請求項1〜5のうち何れか1項に記載の核酸の分離精製方法。
- 吸着バッファーにカリウム塩を介在させることにより、核酸を吸着させる一体型モノリス構造体は、ガラス、シリカから成り、上面から下面まで貫通しているマクロ細孔を有し、該構造体に核酸吸着のためのシラノール基を有する多孔質体を使用したことを特徴とする核酸の分離吸着体。
- 核酸の大きさが35bp(mer)から100Kbp(mer)に対応すべく該マクロ細孔径を調整し、分離すべき核酸を含有する溶液を通過させることにより、該マクロ細孔に対応する核酸が夫々保持できるように構成したことを特徴とする請求項7に記載の核酸の分離吸着体。
- 前記モノリス構造体の多孔質体はマクロ細孔の内部にミクロ細孔を有し、不純物の分子量に応じた該ミクロ細孔径の調整を行うことを特徴とする請求項7又は8のうち何れか1項に記載の核酸の分離吸着体。
- 請求項3又は4のうちいずれか1項に記載の溶解吸着バッファー、請求項5に記載の水及び請求項7〜9のうち何れか1項に記載の分離吸着体よりなるキット。
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