CN115141719A - 一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法及装置，其中装置包括移液枪头，移液枪头上端设置有第一广口；移液枪头下端直径从上到下依次渐缩形成尖端，尖端底部设置有中心孔以形成第一窄口；第一广口和第一窄口之间为中空腔，中空腔内放置有吸附剂颗粒，第一窄口的直径小于吸附剂颗粒粒径；中空腔的内壁上端设置有多孔的透气滤板。其中方法包括如下步骤：S1、准备样品裂解；S2、准备核酸吸附；S3、预饱和；S4、将经过预饱和的移液枪头插入到S1得到的裂解液中来回反复吸和吐数次，使核酸吸附在吸附剂颗粒上；S5、洗涤；S6、洗脱。相比于现有技术，本发明提供的方法具有设备简单、操作方便、提取效率高、可满足高通量提取需求的有益效果。

Description

一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法及装置
技术领域
本发明涉及生物样品制备技术领域，尤其涉及一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法及装置。
背景技术
核酸(DNA和/或RNA)分析广泛用于许多临床和基因组相关的诊断中。随着涉及核酸的研究的激增，诸如聚合链反应(PCR)和DNA测序等实验室程序已得到广泛使用。因此，已经为这些程序开发了高度自动化和高效的设备和仪器。但是，无论选择PCR还是DNA测序作为核酸分析的最终手段，都必须首先从生物细胞中提取它们。因此，从生物样品中提取高质量的核酸一直起着重要的作用。实际上，成功，可靠地进行大规模基因分型分析的前提是，分离大量纯净，完整，双链，高度浓缩，未污染的基因组DNA。
由于其复杂性，核酸的提取已成为分子生物学中最关键的方法，并已成为使用快速发展的自动化程序的限制因素之一。更进一步地，随着Covid-19大流行的扩散，迫切需要快速，方便，可持续和可靠的方法来快速分析和确诊该疾病。为了满足该需求，有必要开发有效的DNA/RNA提取方法。
可以从生物样品中提取两类DNA：1)重组DNA构建体，例如质粒或噬菌体；2)来自原核或真核生物的染色体或基因组DNA。通常，成功地提取和纯化核酸需要四个主要步骤：1)有效裂解细胞或裂解细胞的组织；2)核蛋白复合物的变性；3)灭活核酸酶，例如用于RNA提取的RNase和用于DNA提取的DNase。和4)远离污染和细胞碎片。靶核酸应不含污染物，包括蛋白质，碳水化合物，脂质或其他核酸，例如，不含RNA的DNA或不含DNA的RNA。分离的核酸的质量和完整性将直接影响所有后续科学研究的结果。
另一方面，RNA是一种不稳定的分子，一旦从细胞或组织中提取出来，其半衰期就非常短。天然存在的RNA有几种类型，包括核糖体RNA(rRNA)(80％–90％)，信使RNA(mRNA)(2.5％–5％)和转移RNA(tRNA)。RNA分离很容易降解，因此需要特别的注意和预防措施。由于RNase普遍存在，RNA尤其不稳定，RNase是血液，所有组织以及环境中大多数细菌和真菌中存在的酶。强变性剂一直被用于完整的RNA分离中，以抑制内源性RNase。RNA提取依赖于良好的实验室技术和无RNase的技术。RNA酶是热稳定的，并在热变性后重新折叠。它们很难灭活，因为它们不需要辅因子。最常见的分离方法可分为两类：利用4M硫氰酸胍和利用苯酚和SDS。
自1869年瑞士医生Friedrich Miescher首次分离DNA以来，已经开发出了几种方法，核酸提取经历了液液萃取到固相萃取的发展过程。
液液萃取(Liquid-Liquid Extraction，LLE)是指两个不相溶的液体(如水和有机溶剂)在相互接触的过程中，一个液体(如水)中的特定化合物(如核酸)可以向另外一个液体(如有机溶剂)中富集的过程。目前，LLE一般是在各自的实验室内由实验人员自己配制合适的组分(如苯酚加氯仿等)构成的溶剂来进行萃取。由于液液萃取的这个可变化性，它的实施往往是与某个具体实验室的情况相关的，一般缺少可重复性，从而无法广泛地对照。
作为一个更加广泛地应用且可以用于进行重复性对比的是固相萃取(SolidPhase Extraction，SPE)技术。SPE主要是指液体(如水)中的特定化合物(如核酸)向固体表面吸附从而被提取出去的过程。目前用于核酸提取的工艺主要有两种，一种是硅胶膜离心柱核酸提取工艺，一种是磁珠法核酸提取工艺。
1.液液萃取
1)硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取
通常，DNA是通过液体提取方法提取的，例如乙醇沉淀或硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取。通过添加有机溶剂改变DNA在水溶液中的溶解度，通过沉淀来提取DNA。尽管在实践中很简单，但是这种方法存在很多问题。第一个问题是核酸样品中的盐杂质。在进行任何下游过程和分析之前，始终需要从核酸样品中将其除去。因此，需要单个或多个分离和/或纯化步骤来使包含核酸的样品脱盐。
尽管苯酚是一种易燃，腐蚀性和有毒的化合物，可以使蛋白质迅速变性，但并不能完全抑制RNA酶的活性。该问题可以通过使用苯酚，氯仿和异戊醇(25：24：1)的混合物来解决。通过用苯酚和氯仿的有机混合物萃取水相，可以去除蛋白质，脂质，碳水化合物和细胞碎片。当添加苯酚和氯仿时会形成两相乳液。然后通过离心将乳液的疏水层沉淀在底部，将亲水层沉淀在顶部[3]。收集含有DNA的上层相，可以通过以2：1或1：1的比例添加乙醇或异丙醇和高浓度的盐从上清液中沉淀DNA。通过离心收集DNA沉淀物，并用70％乙醇冲洗过量的盐，并离心以丢弃乙醇上清液。然后用TE缓冲液或无菌蒸馏水溶解DNA沉淀。
Ulrich等人首先提到了异硫氰酸胍在RNA提取中的用途。该方法费力。因此，它已由Chomczynski和Sacchi(1987)用一种称为“硫氰酸胍盐-苯酚-氯仿提取”的单步技术进行了置换[9]，从而在降低的pH值下用苯酚/氯仿提取了匀浆。胍基硫氰酸盐是一种用于蛋白质降解的离液剂。这种单步技术的原理是在用硫氰酸胍，乙酸钠，苯酚和氯仿组成的酸性溶液萃取后，将RNA从DNA中分离出来。在酸性条件下，总RNA将保留在整个混合物的上部水相中，而DNA和蛋白质则保留在中间相或下部有机相中。然后通过用异丙醇沉淀完成总RNA的回收。
2)碱性提取方法
碱性裂解已用于分离质粒DNA和大肠杆菌[9]。它在存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下，可与所有大肠杆菌菌株以及大小从1μmL到500μmL以上的细菌培养物良好配合使用。该方法的原理是基于高分子量染色体DNA的选择性碱性变性，而共价闭合的环状DNA仍为双链。
3)CTAB提取方法
对于植物提取，第一步是在用液氮冷冻样品后研磨样品，以分解细胞壁材料并允许获得核酸，同时有害的细胞酶和化学物质仍处于灭活状态。研磨样品后，可以将其重新悬浮在合适的缓冲液中，例如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，这是一种非离子型洗涤剂，可以从低离子强度的溶液中沉淀出核酸和酸性多糖。同时，蛋白质和中性多糖在这些条件下仍保留在溶液中。在高离子强度的溶液中，CTAB不会沉淀核酸并与蛋白质形成复合物。因此，CTAB可用于从产生大量多糖的生物(如植物和某些革兰氏阴性细菌)中纯化核酸。
此方法在后续步骤中也使用有机溶剂和酒精沉淀。通过离心去除不溶性颗粒以纯化核酸。通过与氯仿混合并离心分离可溶的蛋白质和其他物质。此后必须从上清液中沉淀出核酸，并彻底洗涤以除去污染性盐。然后将纯化的核酸重悬并保存在TE缓冲液或无菌蒸馏水中。
4)溴化乙锭(EtBr)-氯化铯(CsCl)梯度离心
与其他纯化方案相比，CsCl梯度离心是一种复杂，昂贵且耗时的方法。它需要大规模细菌培养。因此，它不适合质粒DNA的小量制备[4]。乙醇沉淀并重悬后，可通过在EtBr-CsCl梯度中离心来浓缩核酸。EtBr的插入改变了高摩尔CsCl中分子的游泳密度。共价闭合的环状分子将以较低的密度在CsCl梯度中积累，因为与线性分子相比，每个碱基对掺入的EtBr更少。然后在萃取后用适当的疏水性溶剂除去疏水性EtBr。纯化的核酸将与酒精一起沉淀。
5)通过Oligo(dT)-纤维素色谱法纯化Poly(A)+RNA
聚(A)+RNA是蛋白质翻译的模板，大多数真核mRNA在其3'末端带有其片段。它占总RNA的1-2％，可通过寡聚(dT)-纤维素亲和色谱分离。聚(A)尾巴形成稳定的RNA-DNA杂合体，带有短链的寡核苷酸(dT)，附着在各种支持基质上[4，12]。高盐必须添加到色谱缓冲液中，以稳定核酸双链体，因为仅形成了几个dT-A碱基对。将非聚腺苷酸化的RNA从基质中洗出后，使用低盐缓冲液。该缓冲液有助于破坏双链结构的稳定性，并从树脂中洗脱出poly(A)+RNA。
聚(A)+RNA的选择通常使用两种方法-寡聚(dT)柱上的柱色谱法和分批色谱法。柱色谱法通常用于纯化从哺乳动物细胞中分离的大量(>25μg)非放射性聚(A)+RNA。当处理少量(<50μg)总哺乳动物RNA时，批量色谱法是首选方法。当要处理许多RNA样品时，无论是否具有放射性，都可以使用它。分批色谱法是在最佳温度下用精细等级的低聚(dT)纤维素进行结合和洗脱的[12]。
使用多种溶剂和费时的步骤来回收DNA并去除细胞干扰物(例如多糖，多酚和其他次级代谢产物)，而DNA分离可能成为生物分析工作流程中的主要瓶颈。因此，在物种分子遗传学研究中，迫切需要快速且经济高效的DNA提取方案，以产生高质量的DNA。很明显，液体提取方法不能满足要求。
使用多种溶剂和费时的步骤来回收DNA并去除细胞干扰物(例如多糖，多酚和其他次级代谢产物)，而DNA分离可能成为生物分析工作流程中的主要瓶颈。因此，在物种分子遗传学研究中，迫切需要快速且经济高效的DNA提取方案，以产生高质量的DNA。很明显，液体提取方法不能满足要求。
2.固相萃取
近来，固相核酸提取技术变得流行。与传统方法相比，它可以进行快速有效的纯化。可以防止许多与液-液萃取有关的问题，例如不完全的相分离。固相系统将在提取过程中吸收核酸，具体取决于缓冲液的pH值和盐含量。吸收过程基于以下原理：在离液条件下与亲水基质的氢键相互作用，在水性条件下通过阴离子交换剂进行离子交换以及亲和力和尺寸排阻机制。
固相纯化通常是通过使用离心柱在离心力下进行的。二氧化硅基质，玻璃颗粒，硅藻土和阴离子交换载体是已在固相萃取方法中用作固体载体的实例。固相萃取涉及的四个关键步骤是细胞裂解，核酸吸附，洗涤和洗脱。
在特定的pH条件下对色谱柱进行调节后，将已使用裂解缓冲液降解的样品加到色谱柱上。所需的核酸将借助结合溶液的高pH和盐浓度吸收到色谱柱中。其他化合物(例如蛋白质)也可能与色谱柱表面具有很强的特异性键。这些污染物可以在洗涤步骤中通过使用含有竞争剂的洗涤缓冲液去除。对于洗脱步骤，引入TE缓冲液或水以从色谱柱中释放出所需的核酸，以便可以纯化的状态进行收集。通常，在纯化过程的洗涤和洗脱步骤中需要快速离心，真空过滤或柱分离。
已经公开了混合床固相核酸提取及其在核酸分离中的用途。本发明的混合床固相是至少两种不同固相的混合物，可以是固体或半固体，多孔或无孔的。每个固相可以在不同的溶液条件下与靶核酸结合，并在相似的洗脱条件下释放核酸。
1)硅胶基质
大多数与核酸纯化有关的产品的基础是硅胶基质具有选择性DNA结合的独特性能。二氧化硅材料的类型包括玻璃颗粒，例如玻璃粉末，二氧化硅颗粒和通过研磨玻璃纤维滤纸制备的玻璃微纤维，还包括硅藻土[16]。通过将二氧化硅在氢氧化钠或氢氧化钾中以约2：1至10：1的摩尔比回流至少约48小时制得的水合二氧化硅基质已引入DNA纯化中。DNA与无机基质结合并在热水中释放[17]。
带负电荷的二氧化硅与带正电荷的DNA紧密结合，可以进行大量洗涤以去除所有污染物。除了二氧化硅基质，硝化纤维膜和聚酰胺膜(例如尼龙基质)还可以与核酸结合，但特异性较低。这些材料通常用作固相核酸转移和杂交基质。聚酰胺基质比硝化纤维素更耐用，并且已知不可逆地结合核酸。可以将核酸固定在低离子强度缓冲液中的聚酰胺基质上。
2)玻璃微粒
玻璃颗粒，粉末和珠子可用于核酸纯化。例如，从琼脂糖凝胶中分离DNA涉及使用离液盐来促进DNA与普通硅酸盐玻璃，硅酸镁石玻璃和硼硅酸盐玻璃(玻璃纤维过滤器)的结合。基于类似于吸附色谱法的机理和原理，核酸最可能发生在玻璃基板上的吸附。核酸纯化也可以在硅胶和玻璃混合物上进行，在离液盐溶液存在的情况下，两者均可用于将核酸与其他物质分离。
3)硅藻土
硅藻土(也称为硅藻土或硅藻土)的二氧化硅含量高达94％，可用于在离液剂存在下将DNA固定在其颗粒上，从而用于质粒和其他DNA的纯化。然后用含醇的缓冲液洗涤所得的硅藻土结合的DNA。
4)基于磁珠的核酸纯化
磁分离是当今纯化核酸的一种简单有效的方法。通常，具有固定的亲和配体的磁性载体或由对目标核酸显示亲和力的生物聚合物制得的磁性载体用于分离过程。例如，由不同的合成聚合物，生物聚合物，多孔玻璃或基于无机磁性材料(如表面改性的氧化铁)的磁性颗粒制成的磁性颗粒。具有磁性或顺磁性的颗粒被包封在诸如可磁化纤维素的聚合物中。纤维素的磁性成分也可以被其他磁性化合物所取代，例如氧化亚铁或氧化镍。磁珠不需要任何有机溶剂，因此无需重复离心，真空过滤或色谱柱分离。使用氧化锆珠纯化核酸是另一种基于磁珠的纯化方法。
固相可逆固定基于准成因珠的技术已被用于PCR纯化系统，以传递高质量的DNA。它需要简单的操作流程，而无需离心和过滤。PCR扩增子与准成因颗粒结合，将其从溶液中抽出，从而使诸如dNTP，引物和盐之类的污染物被冲洗掉。
磁性寡聚(dT)磁珠是其他寡聚(dT)基质的替代品，用于从总RNA样品中纯化poly(A)+RNA。可以通过引入涂有寡核苷酸(dT)的磁珠来提取poly(A)+RNA。带有poly-A尾巴的RNA附着在寡核苷酸(dT)上。然后将珠子吸引到试管底部，直接从总RNA中去除mRNA。经过特殊处理的磁珠可最大程度减少其他核酸的非特异性结合，并确保mRNA的纯度。
5)阴离子交换材料
带正电的阴离子交换树脂，例如二乙氨基乙基纤维素(DEAE)，可以与DNA主链的带负电的磷酸盐发生相互作用。阴离子交换树脂由限定的二氧化硅珠组成，该二氧化硅珠具有大孔径，亲水性表面涂层并具有高电荷密度。该树脂可在广泛的pH条件(pH 6–9)和/或盐浓度(0.1–1.6μM)下工作，可以优化从RNA和其他杂质中分离DNA的能力。DNA可以在很宽的盐浓度范围内结合到DEAE基团上，同时使用中盐缓冲液从树脂上洗去杂质，而DNA保持结合状态，直到用高盐缓冲液洗脱。
使用硅胶珠和硅胶树脂的方法可以分离DNA分子，用于随后的PCR扩增。但是，这些方法具有相关的问题。首先，珠子和树脂的高度可变取决于它们的包装程度，因此很难复制。微通道的每次加载都会导致不同数量的堆积，从而改变吸附到通道上的DNA量。此外，这些方法导致两步制造过程。
磁珠和基于旋转柱的DNA提取方法已显示出优于常规方法的某些优势。然而，他们仍然需要漫长的过程，涉及吸收，洗涤和洗脱等多个步骤。以速度和低成本为永恒的目标，不断需要在更少的时间和更少的时间内提取DNA的新材料和程序。
3.一步法
一步法：目前有很多方法试图去进行一步法提取核酸，最典型的就是在裂解液中加入各种有机试剂以便对其中的酶等生物活性物质进行抑制。但是，实验结果表明其可重复性低，不可靠。
由此可见，目前常用的核酸提取技术都无法满足实际需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，提取简单，动态、快速，高吞吐量和适用性高。
本发明的另一目的是提供一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法，设备简单，操作方便，提取效率高，并可满足高通量提取的需求。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，包括移液枪头，所述移液枪头的上端设置有第一广口；
所述移液枪头下端的直径从上到下依次渐缩形成尖端，所述尖端底部设置有中心孔以形成第一窄口；
所述第一广口和第一窄口之间为中空腔，所述中空腔内放置有吸附剂颗粒，所述第一窄口的直径小于所述吸附剂颗粒的粒径，以确保吸附剂颗粒在没有挡板的情况下依然不会掉出；
所述中空腔的内壁上端设置有多孔的透气滤板，所述透气滤板用于阻碍液体微粒污染移液枪头前端，同时用于阻挡吸附剂颗粒从第一广口逸出。
优选的，所述移液枪头的上端设置有防尘帽。
另一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，包括：
移液管，所述移液管的两端分别为上采样端和下出口端，所述上采样端设置有第二广口，所述下出口端的直径逐渐减小且其中心处向外延伸出短管，所述短管设置有中心孔以形成第二窄口；
所述移液管下出口端内壁以及柱塞的底部之间形成储存腔，所述储存腔里放置有若干吸附剂颗粒，所述第二窄口的直径小于所述吸附剂颗粒的粒径；
所述移液管的上采样端可拆卸连接有柱塞，所述柱塞一端的外径与所述移液管上采样端的内径相匹配，柱塞的底部固定设置有橡胶密封圈。
优选的，所述短管的第二窄口设置有橡胶帽。
优选的，所述移液管的顶部设置有环形支撑台，所述柱塞的顶部设置有环形限位台。
优选的，所述柱塞上端向内缩径形成颈部，所述颈部的一端抵接至环形限位台。
优选的，所述移液管的直径在0.2-20cm之间，长度在5-50cm之间。
根据上述所述移液管平行组合成一种高通量无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，包括一体注塑成型的方形塑料板，所述塑料板上纵横平行排布有若干移液管，所述方形塑料板的长和宽满足美国国家标准局的基本标准ANSI/SBS 1-2004，其高度满足ANSI/SBS 2-2004；所述移液管的数量设置为8或12或24或48或96或384或1536等适合实验室操作且符合ANSI/SLAS 1-2004标准的数量。移液管内置有吸附剂颗粒。
上述所述吸附剂颗粒采用能够特异性结合核酸的材料制成。
一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法，包括如下步骤：
S1、准备样品裂解：通过裂解液裂解细胞组织样本，包括加入适当的裂解液和加热等必要的裂解步骤，以及加入适量有利于吸附的调节剂；
S2、准备核酸吸附：依据样品量和预期核酸的多少选择合适的已经预装有吸附剂颗粒的移液枪头或移液管；
S3、预饱和：将移液枪头安装到移液枪上，将移液枪头或移液管插入到纯净水中，来回反复吸和吐数次以使吸附剂预饱和；
S4、将经过预饱和的移液枪头或移液管插入到S1得到的裂解液中来回反复吸和吐数次，使核酸吸附在吸附剂颗粒上；
S5、洗涤：将移液枪头或移液管插入到核酸洗涤液中，来回反复吸和吐数次，最终尽量排出移液枪头或移液管中的液体；
S6、洗脱：将移液枪头或移液管插入到核酸洗脱液中，吸入洗脱液，必要时可以适当摇晃以使得液体将吸附剂颗粒上纯化的核酸洗脱到液体中，再把含有核酸的洗脱液推出到收集小瓶中，作为后续核酸分析(如PCR和测序)的样本。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果为：
1.相对于硅胶膜离心柱法提取核酸，无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法的优点是动态、快速。动态吸附所含的吸附剂单位体积吸附的核酸量要比硅胶膜离心柱法的大。由于该方法可以采用适合与各种自动仪器的样品处理平台，可以满足高通量提取的需求。
2.与磁珠法相比，无阻碍吸入式动态核酸提取无需加外磁场，也无需在液体进出口处额外添加滤膜网或挡板，因此降低了液体进出移液枪头或移液管的阻力，操作起来更加方便，提取效率更高。
3.与传统一步法相比，动态吸入式核酸提取的可重复性高，提取结果稳定可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提出的一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置的结构示意图；
图2为本发明提出的另一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置的整体结构示意图；
图3为本发明提出的另一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置的结构爆炸图；
图4为本发明提出的一种高通量无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置的仰视图。
附图标记：
100、移液枪头；101、第一广口；102、第一窄口；103、中空腔；110、透气滤板；120、防尘帽；
200、吸附剂颗粒；
300、移液管；301、第二广口；302、短管；303、第二窄口；304、储存腔；305、环形支撑台；
400、柱塞；401、环形限位台；402、颈部；410、橡胶密封圈；
500、橡胶帽；
600、方形塑料板。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明具体实施方案中提供的工艺参数仅为举例，不构成对本发明保护范围的限制。
下面先介绍本申请涉及的一些技术术语：
如本文所用，术语“测试样品”或“样品”是指可能含有核酸的任何材料。测试样品的示例包括但不限于生物样品、环境样品和非自然样品。生物样品的示例包括但不限于组织样品、生物流体样品、细胞样品、细菌样品和病毒样品。组织样品包括从任何动物或植物中分离的组织。生物流体样品包括但不限于血液、血浆、尿液、唾液、痰液、脑脊液、鼻咽、口腔、灌洗液(例如支气管)和白细胞电泳样品。细胞样品包括但不限于培养的细胞或从任何来源分离的细胞。病毒样品包括但不限于培养的病毒或分离的病毒。环境样品包括但不限于空气样品、水样品、土壤样品、岩石样品和从自然环境中获得的任何其他样品。人工样本包括任何不存在于自然环境中的样本。“人造样品”的例子包括但不限于纯化或分离的材料、培养材料、合成材料和任何其他人造材料。在一些实施方案中，测试样品包括痰、NALC处理的痰、全血或血培养物、血浆、脑脊髓液、鼻咽拭子和抽吸物、支气管灌洗液、新鲜或冷冻细胞和组织、FFPE样品、血沉棕黄层、血卡、唾液、口腔拭子、粪便、固体或液体细菌培养物、NPA和土壤。
参照图1，为本发明公开的一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置实施例，包括移液枪头100，移液枪头100的上端设置有第一广口101。移液枪头100的形状和尺寸不受特别限制。优选的移液枪头100设置为圆柱形，因此操作期间的流动矢量基本是直的，从而最小化或避免可能发生的非圆柱形的清洗。优选的，移液枪头100的体积为0.1-50ml。在一些实施例中，常用的移液枪头100是0.1-10ml，其中常见的是0.1-5ml，而最常用的体积是0.1-1ml。
移液枪头100的直径从上到下依次渐缩形成尖端，尖端底部设置有中心孔以形成第一窄口102。第一广口101和第一窄口102之间为中空腔103，中空腔103内放置有吸附剂颗粒200，窄口的直径小于吸附剂颗粒200的粒径，以确保吸附剂颗粒200在没有挡板的情况下依然不会掉出。来自样品的核酸材料可以流过第一窄口102并进入中空腔103内，核酸与吸附剂颗粒200特异性结合。
需要进一步解释的是，吸附剂颗粒200采用能够特异性结合核酸的材料制成，例如硅胶、硅藻土或其他改性材料。吸附剂颗粒200的几何形状、孔隙的大小和空隙率往往影响其比表面积，进而影响其吸附能力。空隙率指的是：颗粒物料层中，颗粒与颗粒间的空隙体积(含开口孔隙)与整个颗粒物料层体积(堆积体积)之比称为空隙率。经过定制，选用大颗粒多孔吸附剂可以避免窄口端滤膜网的使用，从而最大限度地减少流体阻抗或堵塞，同时为总体积范围为0.1至50ml的移液枪头100内的核酸结合提供大表面积。本专利吸附剂颗粒200孔隙的大小一般为
Figure BDA0003744031990000121
空隙率为10-40％。因此，可以使用低压来驱动生物样品通过第一窄口102。样品抽吸和分配过程中的双向流动允许延长样品提取物和吸附剂颗粒之间的停留时间，以实现最佳的核酸回收和洗脱，并且能够处理相对较大的样品体积而不会在单个移液吸头内堵塞。移液枪头100适用于任何泵送液体的设备，例如手持式移液枪，也适用于样品数量较少或资源有限的大型液体处理系统，可同时处理多个样品。
中空腔103的内壁上端设置有多孔的透气滤板110，透气滤板110一般是由多孔的聚乙烯或者聚丙烯制成，它的主要作用是用于阻碍液体微粒污染移液枪头100前端，从而避免交叉污染。在此，它同时可用于阻挡吸附剂颗粒200从第一广口101端逸出。
可选的，在一实施例中，移液枪头100的上端设置有防尘帽120，从而防尘防水，防止移液枪头100的中空腔103受到外界污染。
为了保证核酸提取的操作过程中试剂不受到外界污染，一般将移液枪头100成品经过清洁后真空包装于包装袋中。
本装置的工作原理为：首先，撕开包装袋，取下防尘帽120，将移液枪头100安装到移液枪上，用拇指按下移液枪顶端的推杆，再将移液枪头100的尖端插入到样品中来回反复吸和吐5-10次，使核酸吸附在吸附剂颗粒200上，最终把推杆推下以排出移液枪头100中的液体，与核酸特异性结合的吸附剂颗粒200留在移液枪头100内。将移液枪头100的尖端插入到核酸洗涤液中，来回反复吸和吐5-10次，最终把推杆推下以排出移液枪头100中的液体。将移液枪头100插入到核酸洗脱液中，吸入洗脱液，将核酸从吸附剂颗粒中分离出来，再把含有核酸的洗脱液推出到收集小瓶中，得到核酸提取液。
本装置的有益效果为：相比于现有技术，本装置在核酸提取过程中无需在移液枪头100内额外增加滤膜网，降低了生物样品进出枪头的阻力，操作起来方便快捷，提取效率更高。
序号 总量比 单位 A260 A280 260/280 260/230
1 15 ng/μl 0.3 0.175 1.71 0.27
2 12.9 ng/μl 0.257 0.135 1.91 0.27
3 24.5 ng/μl 0.491 0.284 1.73 0.37
4 31 ng/ul 0.62 0.368 1.68 0.41
5 95.6 ng/ul 1.913 1.183 1.62 0.77
6 72.7 ng/ul 1.455 0.896 1.62 0.7
7 53.7 ng/ul 1.074 0.779 1.38 0.58
8 405.5 ng/μl 8.11 5.342 1.52 0.58
9 390 ng/ul 7.8 5.037 1.55 0.59
10 395.7 ng/μl 7.913 5.142 1.54 0.58
11 410.1 ng/ul 8.202 5.35 1.53 0.58
12 426.6 ng/ul 8.531 5.481 1.56 0.6
13 430.1 ng/ul 8.603 5.565 1.55 0.59
如上表所示，使用本装置提取核酸和使用离心柱再过滤进行核酸提取的对比结果。其中1-7号样本用的移液枪头，8-13号样本用的离心柱。A260(表中第四列)是核酸最高峰的吸收波长，A280(表中第五列)是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，A230是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，A260/A280(表中第六列)和A260/A230(表中第七列)是核酸纯度的指示值，可见移液枪头提取的纯度完全可以接受，但总量比相对较少一些。
参照图2-3，为本发明公开的另一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置实施例，包括移液管300，移液管300由耐普通化学试剂腐蚀且不会对内部液体造成潜在污染的材料制成，例如塑料，橡胶，玻璃，瓷器等材料，优选采用聚丙烯和/或聚乙烯的塑料。移液管300的直径在0.2-20cm之间，长度在5-50cm之间。
移液管300的两端分别为上采样端和下出口端，上采样端设置有第二广口301，下出口端的直径逐渐减小且其中心处向外延伸出短管302，短管302设置有中心孔以形成第二窄口303。移液管300的上采样端滑动设置有柱塞400，柱塞400一端的外径与移液管300上采样端的内径相匹配，使得柱塞可以插入移液管300中并在管内滑动，柱塞的底部固定设置有橡胶密封圈410，橡胶密封圈410与上述透气滤板110的作用类似，在此不再赘述。柱塞上下滑动，可在移液管300内形成负压以吸入或推出样品。
移液管300下出口端内壁以及柱塞的底部之间形成储存腔304，储存腔304里放置有若干吸附剂颗粒200，第二窄口303的直径小于吸附剂颗粒200的粒径。吸附剂颗粒200的材料、几何形状和孔隙率的具体要求同上述所述要求。。
移液管储存腔304的体积为0.1-50ml。移液管300的外侧壁设置有刻度，以示出吸入样品的体积。在一些实施例中，常用的移液管300是0.01-10ml，其中常见的是0.1-5ml，而最常用的体积是0.1-1ml。
移液管300的顶部设置有环形支撑台305，柱塞的顶部设置有环形限位台401，通过环形支撑台和环形限位台的配合，柱塞可以悬挂于移液管300的顶部。柱塞的向内缩径形成颈部402，颈部的一端抵接至环形限位台。设置颈部便于实验人员握持，方便操作。
可选的，在一些实施例中，例如移液管储存腔体积为1ml或2ml或5ml时，短管302的窄口处设置有橡胶帽500，避免操作过程中液体滴落。
本装置的工作原理为：首先，取下移液管300的橡胶帽，用拇指按下柱塞顶端，再将移液管的短管302插入到样品中来回反复吸和吐5-10次，样品从第二窄口303中进入储存腔，核酸与吸附剂颗粒200特异性结合，核酸吸附在吸附剂颗粒200上，最终按下柱塞以排出移液枪头中的液体，与核酸特异性结合的吸附剂颗粒留在移液管内。将移液管的短管302插入到核酸洗涤液中，来回反复吸和吐5-10次，最终把柱塞推下以排出移液枪头中的液体。将移液管的短管插入到核酸洗脱液中，吸入洗脱液，将核酸从吸附剂颗粒中分离出来，再把含有核酸的洗脱液推出到收集小瓶中，得到核酸提取液。
参照图4，为本发明公开的一种高通量无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置实施例，包括一体注塑成型的方形塑料板600，塑料板上纵横平行排布有若干移液管，方形塑料板的长和宽满足美国国家标准局的基本标准ANSI/SBS 1-2004，其高度满足ANSI/SBS 2-2004。
移液管的数量设置为8或12或24或48或96或384或1536等适合实验室操作且符合ANSI/SLAS 1-2004标准的数量。
利用本装置，可以并行同时处理多个样品，从而实现高通量快速提取核酸的需求。
本发明公开了一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法，包括如下步骤：
S1、准备样品裂解：通过裂解液裂解细胞组织样本，包括加入适当的裂解液和加热等必要的裂解步骤，以及加入适量有利于吸附的调节剂；
S2、准备核酸吸附：依据样品量和预期核酸的多少选择合适的已经预装有吸附剂颗粒的移液枪头或移液管；
S3、预饱和：将移液枪头安装到移液枪上，将移液枪头或移液管插入到纯净水中，来回反复吸和吐数次以使吸附剂预饱和；
S4、将经过预饱和的移液枪头或移液管插入到S1得到的裂解液中来回反复吸和吐数次，使核酸吸附在吸附剂颗粒上；
S5、洗涤：将移液枪头或移液管插入到核酸洗涤液中，来回反复吸和吐数次，最终尽量排出移液枪头或移液管中的液体；
S6、洗脱：将移液枪头或移液管插入到核酸洗脱液中，吸入洗脱液，必要时可以适当摇晃以使得液体将吸附剂颗粒上纯化的核酸洗脱到液体中，再把含有核酸的洗脱液推出到收集小瓶中，作为后续核酸分析(如PCR和测序)的样本。
相比于现有技术，本发明所提供的方法具有设备简单、操作方便，提取效率高，并可满足高通量提取的需求。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，其特征在于，包括移液枪头(100)，所述移液枪头(100)的上端设置有第一广口(101)；
所述移液枪头(100)下端的直径从上到下依次渐缩形成尖端，所述尖端底部设置有中心孔以形成第一窄口(102)；
所述第一广口(101)和第一窄口(102)之间为中空腔(103)，所述中空腔(103)内放置有吸附剂颗粒(200)，所述第一窄口(102)的直径小于所述吸附剂颗粒(200)的粒径，以确保吸附剂颗粒(200)在没有挡板的情况下依然不会掉出；
所述中空腔(103)的内壁上端设置有多孔的透气滤板(110)，所述透气滤板(110)用于阻碍液体微粒污染移液枪头(100)前端，同时用于阻挡吸附剂颗粒(200)从第一广口(101)逸出。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述移液枪头(100)的上端设置有防尘帽(120)。
3.另一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，其特征在于，包括：
移液管(300)，所述移液管(300)的两端分别为上采样端和下出口端，所述上采样端设置有第二广口(301)，所述下出口端的直径逐渐减小且其中心处向外延伸出短管(302)，所述短管设置有中心孔以形成第二窄口(303)；
所述移液管(300)下出口端内壁以及柱塞的底部之间形成储存腔(304)，所述储存腔(304)里放置有若干吸附剂颗粒(200)，所述第二窄口(303)的直径小于所述吸附剂颗粒(200)的粒径；
所述移液管(300)的上采样端可拆卸连接有柱塞(400)，所述柱塞一端的外径与所述移液管上采样端的内径相匹配，柱塞的底部固定设置有橡胶密封圈(410)。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述短管(302)的第二窄口设置有橡胶帽(500)。
5.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述移液管(300)的顶部设置有环形支撑台(305)，所述柱塞的顶部设置有环形限位台(401)。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述柱塞上端向内缩径形成颈部(402)，所述颈部的一端抵接至环形限位台(401)。
7.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，所述移液管(300)的直径在0.2-20cm之间，长度在5-50cm之间。
8.根据权利要求3所述移液管平行组合成一种高通量无阻碍吸入式动态快速提取核酸的装置，其特征在于，包括一体注塑成型的方形塑料板(600)，所述塑料板上纵横平行排布有若干移液管，所述方形塑料板的长和宽满足美国国家标准局的基本标准ANSI/SBS 1-2004，其高度满足ANSI/SBS 2-2004；
所述移液管的数量设置为8或12或24或48或96或384或1536等适合实验室操作且符合ANSI/SLAS 1-2004标准的数量。
9.根据权利要求1、3、8任一项所述的装置，其特征在于，所述吸附剂颗粒(200)采用能够特异性结合核酸的材料制成。
10.一种无阻碍吸入式动态快速提取核酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、准备样品裂解：通过裂解液裂解细胞组织样本，包括加入适当的裂解液和加热等必要的裂解步骤，以及加入适量有利于吸附的调节剂；
S2、准备核酸吸附：依据样品量和预期核酸的多少选择合适的已经预装有吸附剂颗粒的移液枪头或移液管；
S3、预饱和：将移液枪头安装到移液枪上，将移液枪头或移液管插入到纯净水中，来回反复吸和吐数次以使吸附剂预饱和；
S4、将经过预饱和的移液枪头或移液管插入到S1得到的裂解液中来回反复吸和吐数次，使核酸吸附在吸附剂颗粒上；
S5、洗涤：将移液枪头或移液管插入到核酸洗涤液中，来回反复吸和吐数次，最终尽量排出移液枪头或移液管中的液体；
S6、洗脱：将移液枪头或移液管插入到核酸洗脱液中，吸入洗脱液，必要时可以适当摇晃以使得液体将吸附剂颗粒上纯化的核酸洗脱到液体中，再把含有核酸的洗脱液推出到收集小瓶中，作为后续核酸分析的样本。
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