JP6737179B2 - 核酸の分離精製方法および固相担体、デバイス、キット - Google Patents
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Description
1. 核酸を分離精製するための固相担体であって、前記固相担体は、多孔性無機粒子と有機または無機繊維とが疎水性の有機バインダーにより結合しており、
前記多孔性無機粒子は、平均粒子径が1〜50μmである多孔性シリカ粒子であり、
前記有機または無機繊維は、セルロース繊維またはガラス繊維であり、
前記疎水性の有機バインダーは、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエステルであり、
前記固相担体中の多孔性無機粒子/有機または無機繊維/疎水性の有機バインダーの含有比率が2〜60/28〜68.6/12〜29.4である、
固相担体。
2. 前記多孔性無機粒子の形状が球状である、1に記載の固相担体。
3. 前記固相担体の目付けが、25〜200g/m2である、1または2に記載の固相担体。
4. 前記固相担体の厚みが100〜500μmである、1〜3のいずれかに記載の固相担体。
5. 1〜4のいずれかに記載の固相担体を保持してなるデバイス。
6. 1〜4のいずれかに記載の固相担体または5に記載のデバイス、前記固相担体に核酸を吸着させるための結合液、前記固相担体から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、前記固相担体から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。
7. 6に記載の分離精製キットを用い、少なくとも下記工程(A)から(D)をこの順に経ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
(A)核酸を含む試料溶液と前記結合液とを混合して混合液を得る工程
(B)前記混合液と前記固相担体とを接触させ、前記固相担体に核酸を吸着させる工程
(C)前記洗浄液を用いて前記固相担体から核酸以外の成分を洗浄する工程
(D)前記溶出液を用いて前記固相担体から核酸を脱着させる工程
8. 前記核酸を含む試料溶液が血液である7に記載の核酸の分離精製方法。
本発明における分離精製の対象となる核酸の種類としては、特に限定されないが、例えば、DNAまたはRNA、1本鎖核酸または2本鎖核酸、直鎖状核酸または環状核酸が挙げられる。これらの中で、本発明は物理的な外力により極めて分解しやすいRNAの分離精製に用いることができ、total RNAの分離精製に好適に用いられる。
本発明における核酸の分離精製の原理は、BOOM法(非特許文献1)として広く知られているシリカを用いた核酸抽出方法と同様の原理で、核酸の固相担体への特異的な結合、洗浄および溶出により核酸を分離精製する。
具体的には、
工程(A):混合工程において核酸を含む試料と結合液とを混合し、
工程(B):結合工程において前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させ、
工程(C):洗浄工程において洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分を洗浄し、
工程(D):溶出工程において溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させることで、核酸を含む試料から核酸を分離精製することができる。
具体的には、4000G以下の遠心力で遠心分離を行うことができる卓上小型遠心機(例えば、チビタン(登録商標))の使用や、シリンジ、ピペットなどの空気の圧力変化により吸引および吐出を行なう装置の使用が好ましい。前記方法において遠心力の下限は特に限定されないが、1000G以上が好ましい。
本発明の工程(A):混合工程は、核酸を含む試料と結合液とを混合する工程である。
本発明の工程(B):結合工程は、前記混合液と固相担体とを接触させ、固相担体に核酸を吸着させる工程である。
(1)底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に混合液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
(2)ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、混合液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
(3)内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、混合液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体に核酸を吸着させる方法
が挙げられる。
なお、本発明の核酸分離精製方法において、通液方法は特に限定されない。例えば、重力を利用して液体を上から下へ流すことができる。あるいは、遠心分離機で遠心力をかけたり、シリンジ・ピペットなどの空気の圧力変化により吸引吐出を行うなど、何らかの外力をかけることによっても行うことができる。
本発明の工程(C):洗浄工程は、洗浄液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸以外の成分(例えば、タンパク質、脂質など)を洗浄する工程である。なお、洗浄工程は、1回の洗浄で済ませてもよいし、複数回洗浄を繰り返してもよい。
(1)底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に洗浄液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
(2)ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、洗浄液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
(3)内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、洗浄液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸以外の成分を洗浄する方法
が挙げられる。
本発明の工程(D):溶出工程は、溶出液と固相担体とを接触させ、固相担体から核酸を脱着させる工程である。
(1)底面に固相担体を固定したスピンカラムを用い、スピンカラムの上部に溶出液を添加し、遠心分離機により上から下へ通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
(2)ルアーフィッテングにより先端に固相担体を固定したシリンジを用い、溶出液をシリンジの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
(3)内部に固相担体を固定したピペットチップを用い、溶出液をピペットの吸引吐出により繰り返し通液させることで、固相担体から核酸を脱着させる方法
が挙げられる。
[各種評価法]
下記式(1)にて算出した。
含有率(%)=(多孔性無機粒子の重量/固相担体の重量)×100 (1)
各粒子を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察し、[1]球また楕円体である球状 [2]立方体または直方体であるシート状 [3]その他のランダムな形状である破砕状 に分類した。
各粒子を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察し、100個の粒子の直径を測定し、平均直径(平均粒子径)を算出した。
200mm×200mmの固相担体を、乾燥機で80℃×30分加熱し、デシケータ(乾燥剤:シリカゲル)で室温×30分静置した。その後、重量を測定し、1m2当りの重量(目付け)に換算した。
200mm×200mmの固相担体の10箇所で、荷重686Paの圧力を加えた時の厚みを測定し、平均厚みを算出した。
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が10ng/μL以上の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
(1)total RNAの場合
装置名 : Thermo Scientific社製
nano drop(登録商標)2000
測定モード : 核酸−RNA
試料液量 : 2μL
Blank : 水
(2)Genomic DNAの場合
装置名 : Thermo Scientific社製
nano drop(登録商標)2000
測定モード : 核酸−DNA
試料液量 : 2μL
Blank : 水
測定対象の核酸溶液について、核酸濃度が10ng/μL以下の場合は、下記条件で核酸濃度を測定した。
(1)total RNAの場合
装置名 : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)2.0
測定キット : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)
RNA Assay Kit
容器 : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)
assay tubes
測定モード : RNA−RNA
試料液量 : 10μL
Blank : 水
(2)Genomic DNAの場合
装置名 : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)2.0
測定キット : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)
dsDNA HS Assay Kit
容器 : Invitrogen社製 Qubit(登録商標)
assay tubes
測定モード : DNA−dsDNA High Sensitivity
試料液量 : 10μL
Blank : 水
測定対象のtotal RNA溶液について、下記条件でtotal RNA分解度(RIN値)を測定した。
装置名 : アジレント社製 Agilent 2200 TapeStation
測定キット : アジレント社製 HS RNA Screen Tape、
Sample Buffer、Ladder
試料液量 : 2μL
多孔性シリカ粒子を5重量%と、ガラス繊維を66.5重量%と、ポリエステルバインダーを28.5重量%の比率で、湿式抄紙装置(東洋紡エンジニアリング社製)を使い固相担体1を作成した。得られた固相担体1の詳細を表1に示す。
次いで、固相担体1をベルトポンチTPO−70(トラスコ社製)にて7mmφの大きさに打ち抜いた。その後、エコノスピン(登録商標)IIa(ジーンデザイン社製)のシリカメンブレン、およびO−リングをシリカメンブレンフィルターハウジングから取り除き、シリカメンブレンの代わりに固相担体1を2枚シリカメンブレンフィルターハウジング内に配し、O−リングで固定し、スピンカラム1(図1参照)を作成した。
次いで、固相担体1をベルトポンチTPO−40(トラスコ社製)にて4mmφの大きさに打ち抜いた。その後、テルモシリンジ SS−02SZ(テルモ社製)の先端に、固相担体1を2枚介してメスルアーフィッティング VPRF206(アイシス社製)を接続し、シリンジ1(図2参照)を作成した。
多孔性シリカ粒子、ガラス繊維、ポリエステルバインダーの配合比率が異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体2〜5を作成した。得られた固相担体2〜5の詳細を表1に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム2〜5、シリンジ2〜5を作成した。
多孔性シリカ粒子の平均粒子径が異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体6、7を作成した。得られた固相担体6、7の詳細を表1に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム6、7、シリンジ6、7を作成した。
多孔性シリカ粒子の形状が異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体8、9を作成した。得られた固相担体8、9の詳細を表2に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム8、9、シリンジ8、9を作成した。
ガラス繊維の代わりにセルロース繊維を用いる以外は、実施例1と同様にして、固相担体10を作成した。得られた固相担体10の詳細を表2に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム10、シリンジ10を作成した。
ポリエステルバインダーの代わりにポリエチレンバインダー、ポリプロピレンバインダーを用いる以外は、実施例1と同様にして、固相担体11、12を作成した。得られた固相担体11、12の詳細を表2に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム11、12、シリンジ11、12を作成した。
固相担持の目付け、厚みが異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体13、14を作成した。得られた固相担体13、14の詳細を表2に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム13、14、シリンジ13、14を作成した。
多孔性シリカ粒子、ガラス繊維、ポリエステルバインダーの配合比率が異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体15、16を作成した。得られた固相担体15、16の詳細を表3に示す。固相担体16は、品位が悪く、また非常に脆いため、後の評価を行なうことができなかった。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム15、シリンジ15を作成した。
多孔性シリカ粒子の平均粒子径が異なる以外は、実施例1と同様にして、固相担体17を作成した。得られた固相担体17の詳細を表3に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム17、シリンジ17を作成した。
ポリエステルバインダーの代わりにPVAバインダーを用いる以外は、実施例1と同様にして、固相担体18を作成した。得られた固相担体18の詳細を表3に示す。
また、実施例1と同様にして、スピンカラム18、シリンジ18を作成した。
市販品である、エコノスピン(登録商標)IIa(ジーンデザイン社製)、RNeasy(登録商標)(キアゲン社製)、PureLink(登録商標)(ライフテクノロジーズ社製)のカラムをそのまま用いた。
前記スピンカラム1〜18を用いて、固相担体の通液性を評価した。
Bovine Blood(フナコシ社製)600μLをスピンカラム1〜18にアプライし、微量高速冷却遠心機MX−307(トミー精工社製)にて1,000〜20,000Gでそれぞれ1分間遠心し、Bovine Blood(フナコシ社製)がスピンカラム中の固相担体を通液するために必要な最小の遠心力を評価した。得られた最小通液遠心力を表4に示す。
前記スピンカラム1〜18を用いてtotal RNA水溶液からのtotal RNA回収率、total RNA分解度の評価を行なった。試料溶液として、HeLa S3細胞よりセパゾール(登録商標)RNAI SuperG(ナカライテスク社製)を用いてプロトコール通りに分離精製した100ng/μLのtotal RNA水溶液(RIN値=9.9)100μLと、結合液としてRNeasy(登録商標)(キアゲン社製)のBuffer RLT 350μLとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールSP 250μL(ナカライテスク社製)を混合した後、スピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてRNeasy(登録商標)(キアゲン社製)のBuffer RPE 500μLをスピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、ろ液を廃棄する操作を2回繰り返した。最後に、溶出液としてNuclease−Free Water(ライフテクノロジーズ社製)30μLをスピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、total RNA水溶液を得た。得られたtotal RNA回収率、total RNA分解度を表5〜7に示す。なお、total RNA回収率は、下記式(2)より算出した。
total RNA回収率(%)={精製total RNA濃度(ng/μL)×溶出液量30(μL)}÷{投入total RNA濃度100(ng/μL)×投入total RNA液量100(μL)}×100 (2)
total RNA回収率(%)={精製total RNA濃度(ng/μL)×溶出液量30(μL)}÷{単位血液量当りのtotal RNA量1.5(ng/μL)×投入血液量200(μL)}×100 (3)
前記シリンジ1〜18を用いてtotal RNA水溶液からのtotal RNA回収率、total RNA分解度の評価を行なった。試料溶液として、HeLa S3細胞よりセパゾール(登録商標)RNAI SuperG(ナカライテスク社製)を用いてプロトコール通りに分離精製した100ng/μLのtotal RNA水溶液(RIN値=9.9)50μLと、結合液としてRNeasy(登録商標)(キアゲン社製)のBuffer RLT 175μLとを、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールSP 125μL(ナカライテスク社製)を混合した後、シリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてRNeasy(登録商標)(キアゲン社製)のBuffer RPE 500μLをシリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返した後、ろ液を廃棄する操作を2回繰り返した。最後に、溶出液としてNuclease−Free Water(ライフテクノロジーズ社製)50μLをシリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返し、total RNA水溶液を得た。得られたtotal RNA回収率、total RNA分解度を表5〜7に示す。なお、total RNA回収率は下記式(4)より算出した。
total RNA回収率(%)={精製total RNA濃度(ng/μL)×溶出液量 50(μL)}÷{投入total RNA濃度 100(ng/μL)×投入total RNA液量 50(μL)}×100 (4)
total RNA回収率(%)={精製total RNA濃度(ng/μL)×溶出液量50(μL)}÷{単位血液量当りのtotal RNA量1.5(ng/μL)×投入血液量100(μL)}×100 (5)
前記スピンカラム1〜18を用いてGenomic DNA水溶液からのGenomic DNA回収率の評価を行なった。試料溶液として、100ng/μLのHuman Genomic DNA(ロシュ社製)100μLと、結合液としてジーンキューブ専用前処理セット(東洋紡社製)の溶解吸着液350μLとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールSP 250μL(ナカライテスク社製)を混合した後、スピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてジーンキューブ専用前処理セット(東洋紡社製)の洗浄液500μLをスピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、ろ液を廃棄する操作を2回繰り返した。最後に、溶出液としてNuclease−Free Water(ライフテクノロジーズ社製)30μLをスピンカラム1〜18にアプライし、小型微量遠心機PMC−060(トミー精工社製)にて1930Gで1分間遠心し、Genomic DNA水溶液を得た。得られたGenomic DNA回収率を表5〜7に示す。なお、Genomic DNA回収率は下記式(6)より算出した。
Genomic DNA回収率(%)={精製Genomic DNA濃度(ng/μL)×溶出液量30(μL)}÷{投入Genomic DNA濃度100(ng/μL)×投入Genomic DNA液量100(μL)}×100 (6)
前記シリンジ1〜18を用いてGenomic DNA水溶液からのGenomic DNA回収率の評価を行なった。試料溶液として、100ng/μLのHuman Genomic DNA(ロシュ社製)50μLと、結合液としてジーンキューブ専用前処理セット(東洋紡社製)の溶解吸着液175μLとを混合し、ボルテックスミキサーにて混合した。次いで、エタノールSP 125μL(ナカライテスク社製)を混合した後、シリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返した後、ろ液を廃棄した。次いで、洗浄液としてジーンキューブ専用前処理セット(東洋紡社製)の洗浄液500μLをシリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返した後、ろ液を廃棄する操作を2回繰り返した。最後に、溶出液としてNuclease−Free Water(ライフテクノロジーズ社製)50μLをシリンジ1〜18にて吸引吐出を10回繰り返し、Genomic DNA水溶液を得た。得られたGenomic DNA回収率を表5〜7に示す。なお、Genomic DNA回収率は下記式(7)より算出した。
Genomic DNA回収率(%)={精製Genomic DNA濃度(ng/μL)×溶出液量50(μL)}÷{投入Genomic DNA濃度100(ng/μL)×投入Genomic DNA液量50(μL)}×100 (7)
Claims (8)
- 核酸を分離精製するための固相担体であって、前記固相担体は、多孔性無機粒子と有機または無機繊維とが疎水性の有機バインダーにより結合しており、
前記多孔性無機粒子は、平均粒子径が1〜50μmである多孔性シリカ粒子であり、
前記有機または無機繊維は、セルロース繊維またはガラス繊維であり、
前記疎水性の有機バインダーは、ポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエステルであり、
前記固相担体中の多孔性無機粒子/有機または無機繊維/疎水性の有機バインダーの含有比率が2〜60/28〜68.6/12〜29.4である、
固相担体。 - 前記多孔性無機粒子の形状が球状である、請求項1に記載の固相担体。
- 前記固相担体の目付けが、25〜200g/m2である、請求項1または2に記載の固相担体。
- 前記固相担体の厚みが100〜500μmである、請求項1〜3のいずれかに記載の固相担体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の固相担体を保持してなるデバイス。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の固相担体または請求項5に記載のデバイス、前記固相担体に核酸を吸着させるための結合液、前記固相担体から核酸以外の成分を洗浄するための洗浄液、前記固相担体から核酸を溶出するための溶出液を含む、核酸の分離精製キット。
- 請求項6に記載の分離精製キットを用い、少なくとも下記工程(A)から(D)をこの順に経ることを特徴とする核酸の分離精製方法。
(A)核酸を含む試料溶液と前記結合液とを混合して混合液を得る工程
(B)前記混合液と前記固相担体とを接触させ、前記固相担体に核酸を吸着させる工程
(C)前記洗浄液を用いて前記固相担体から核酸以外の成分を洗浄する工程
(D)前記溶出液を用いて前記固相担体から核酸を脱着させる工程 - 前記核酸を含む試料溶液が血液である、請求項7に記載の核酸の分離精製方法。
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