JPH09508638A - 二本鎖/単鎖核酸構造物の分離方法 - Google Patents
二本鎖/単鎖核酸構造物の分離方法Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. 二本鎖及び単鎖核酸をそのような物質を含む原料から分離するための方法 であって、試料を少なくとも1種の無機支持体で処理するものであり、 1.1 処理条件を、塩及びアルコール基を含む物質の水性混合物により、単鎖核 酸を含むフラクションが主として第1の無機支持体に吸着され、二本鎖核酸は吸 着されないように調整し、その後任意に行われる洗浄段階の後、前記第1の無機 支持体上に吸着された単鎖核酸を低イオン強度条件下に、あるいは水で溶出し、 回収された非吸着二本鎖核酸のためには、その後に条件を、塩及びアルコール基 を有する物質の適当な水性混合物により、特に前記二本鎖核酸が第2の無機支持 体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に低イオン強度条件下 、あるいは水で前記第2の無機支持体から溶出することができるようになるよう に調整し、あるいは 1.2 処理条件を、アルカリ土類金属イオンを錯化する物質がアルコール基を含 む物質の存在しない溶液中に含まれるように調整し、単鎖核酸はこれらの処理条 件下では第1の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離され、これに対し 二本鎖核酸は前記第1の無機支持体に主として結合し、その後任意に行われる洗 浄段階の後、前記二本鎖核酸を低イオン強度条件下、あるいは水で溶出し、非吸 着単鎖核酸のためには、その後に条件を、アルコール基を有する物質を添加する ことにより、特に前記単鎖核酸が前記第2の無機支持体に吸着できるようになり 、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で前記第2 の無機支持体から溶出することができるように調整し、あるいは 1.3 処理条件を、溶液に湿潤剤、洗浄剤あるいは分散剤が含まれ、アルコール 基を有する物質が存在しないように調整し、そのような条件下では単鎖核酸は第 1の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離され、これに対し二本鎖核酸 は第1の無機支持体に主として結合し、その後任意に行われる洗浄段階の後、前 記二本鎖核酸は前記第1の無機支持体から低イオン強度条件下、あるいは水で溶 出され、回収される非吸着単鎖核酸のためには、その後条件を、アルコール基を 有する物質を添加することにより、特に前記単鎖核酸が第2の無機支持体に吸着 できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、ある いは水で溶出することができるようになるように調整し、あるいは 1.4 処理条件を、塩及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、全 核酸(単鎖核酸及び二本鎖核酸)が第1の無機支持体に吸着されるようになるよ うに調整し、次いで、より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより 低い濃度の溶液で処理することにより前記二本鎖核酸を選択的に溶出するか、あ るいはアルカリ土類金属イオンを錯化する物質及び/または湿潤剤、洗浄剤もし くは分散剤並びに1種以上の塩を含む溶液で前記単鎖核酸を溶出することにより 、前記第1の無機支持体から前記単鎖/二本鎖核酸を溶出してその支持体に結合 した単鎖/二本鎖核酸を分画化し、 第1の無機支持体に結合したままの他方の核酸はそれぞれ、任意に行われる洗 浄段階の後、前記第1の無機支持体から低イオン強度条件下、あるいは水で溶出 し、前記第1の無機支持体から最初に溶出された二本鎖または単鎖核酸のために は、その後イオン強度またはアルコール基を含む物質の濃度を増加させることに より処理条件を調整し、前記二本鎖/単鎖核酸が第2の無機支持体に吸着するよ うにし、この核酸は、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、ある いは水で溶出できるようになる前記方法。 2. 核酸を含む原料を溶解するための系が0.1 〜10 Mの濃度のカオトロピック 物質を含む請求項1に記載の方法。 3. 核酸を含む原料を、過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジ ニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム 、ヨウ化カリウム、及び/またはこれらの組み合わせを0.1 〜10 Mの濃度で含む 溶液と混合する請求項1または2に記載の方法。 4. 核酸を含む原料を、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸 ナトリウム、塩化マグネシウム、尿素及び/またはこれらの組み合わせを0.1 〜 10 Mの濃度で含む溶液と混合する請求項1〜3の少なくとも1つに記載の方法。 5. アルコール基を含む物質が1〜90容量%の濃度の低級脂肪アルコール、例 えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノール であり、NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、NaAc等の塩が1〜10 Mの濃度で存在する請求 項1〜4の少なくとも1つに記載の方法。 6. 無機支持体が、多孔質あるいは非多孔質の金属酸化物あるいは混合金属酸 化物、シリカゲル、主としてガラスからなる物質、例えば非改変ガラス粒子、粉 末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム からなり、無機支持体の粒子径は0.1 μm〜1000μm であり、孔径は2 〜1000μm であり、前記多孔質あるいは非多孔質の支持体材料は、緩くパックされた形態で あってもよく、あるいは支持体材料はガラス、石英あるいはセラミックからなる フィルター層、及び/またはシリカゲルが配置された膜、及び/または無機支持 体から形成される粒子または繊維、及び石英またはグラスウールの織物、並びに 官能基を有しているか有していないラテックス粒子、あるいはポリエチレン、ポ リプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、特に超高分子量ポリエチレン、高密 度ポリエチレンからなるフリット材料の形態にあってもよい請求項1〜5の少な くとも1つに記載の方法。 7. 生物学的原料が、細胞培養物、あらゆる種類の組織、体液、例えば血液、 血漿、血清、尿、糞便;微生物、例えば細菌、ウィルス、例えばサイトメガロウ ィルス、HIV、B型肝炎、C型肝炎、δ型肝炎ウィルス;植物、植物の部分、 胎児、胚、果実を含み、あるいは核酸を含む試料が例えばin vitro転写及び/ま たはcDNA合成及び/または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖 反応(PCR)から得られた混合物である請求項1〜6の少なくとも1つに記載の方 法。 8. カオトロピック物質もしくはその他の塩、またはそれらの混合物を含む水 性溶解系中で細胞が最初に溶解される請求項1〜7の少なくとも1つに記載の方 法。 9. 得られたフラクションをそれぞれ別のクロマトグラフィー段階によりさら に精製する請求項1〜8の少なくとも1つに記載の方法。 10. アルカリ土類金属イオンを結合する物質が、エチレンジアミンテトラ酢 酸(EDTA)またはEGTAであり、湿潤剤、洗浄剤または分散剤がサルコシネートであ る請求項1〜9の少なくとも1つに記載の方法。 11. 単鎖核酸がRNA であり、二本鎖核酸がDNA である請求項1〜10の少なく とも1つに記載の方法。 12. 0.5 〜3.0 M のグアニジニウムチオシアネート及び/または塩化グアニ ジニウム、及び1 〜50% のエタノール及び/またはイソプロパノールを含む水溶 液。 13. 核酸を含む原料を溶解し、及び/または核酸を無機支持体に結合するた めのバッファーとしての請求項12に記載の溶液の使用。 14. 0.1 〜3 M のグアニジニウムチオシアネート及び/または塩化グアニジ ニウム、及び1 〜30% のエタノール及び/またはイソプロパノールを含む水溶液 。 15. 無機支持体に結合した核酸を洗浄除去するためのバッファーとしての請 求項14に記載の溶液の使用。 16. 1 〜5 M のグアニジニウムチオシアネート及び/または1 〜8 M の塩化 グアニジニウム、及び0.1 〜3%のサルコシルを含む水溶液。 17. DNA を無機支持体に結合するためのバッファーとしての請求項16に記載 の溶液の使用。 18. 0.5 〜8.0 M のグアニジニウムチオシアネート及び/または塩化グアニ ジニウム、及び1 〜50% のエタノール及び/またはイソプロパノールを含む溶液 の使用。 19. 1 〜5 M のグアニジニウムチオシアネート及び/または1 〜8 M の塩化 グアニジニウム、及び5 mM〜200 mMのEDTAまたはEGTAを含む水溶液。 20. DNA 、二本鎖核酸を無機支持体に結合するためのバッファーとしての請 求項19に記載の溶液の使用。 21. 単鎖核酸(RNA)を無機支持体に結合しないためのバッファーとしての請 求項19に記載の溶液の使用。 22. 通過流路に適した中空体中に配置された無機支持体、請求項12、14、16 及び/または19のいずれかに記載の溶液、並びにその他の助剤及び/またはアク セサリーを含む請求項1〜11の少なくとも1つに記載の方法を実施するためのキ ット。 23. 医療診断のための、PCR 、LCR 、NASBA 、3SR 等の増幅反応における前 記方法により単離された核酸の使用。 24. 増幅反応を使用しない、医療診断のための前記方法により単離された核 酸の使用。
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