JPH09508638A

JPH09508638A - 二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法

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Publication number: JPH09508638A
Application number: JP7520958A
Authority: JP
Inventors: ヘルゲバスチャン; シモーネガウクス; メチンコルパン; ペトラファーザー
Original assignee: クイアジェン・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1994-02-11
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 1997-09-02
Anticipated expiration: 2017-02-12
Also published as: DK1146049T3; US20030224389A1; JP3256238B2; EP1146049A2; US6180778B1; US20020081619A1; US6946250B2; EP1146049B1; ATE302208T1; DE59511013D1; DK0743950T3; WO1995021849A1; US7074916B2; EP0743950A1; JP4036625B2; EP0743950B1; JP2002187897A; DE59509941D1; EP1146049A3; ATE210671T1

Abstract

(57)【要約】核酸混合物をその二本鎖及び単鎖核酸フラクションに分離するクロマトグラフィー方法を開示する。核酸全体を同時に無機支持体に吸着させ、次いで分別溶出により二本鎖及び単鎖核酸に分離するか、試料の二本鎖または単鎖核酸を無機支持体に選択的に吸着させる。この方法を実施するための溶液及びキットも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】二本鎖／単鎖核酸構造物の分離方法本発明は、全核酸を同時に無機支持体に吸収させ、分別溶出により二本鎖核酸及び単鎖核酸に分離するか、液体試料の二本鎖核酸または単鎖核酸を無機支持体に選択的に吸収させることによる、核酸混合物のその二本鎖及び単鎖フラクションへのクロマトグラフィー分離のための方法、並びに本発明の方法を実施するための溶液及びキットに関する。 RNA 及びDNA の両者を含む核酸の製造は益々重要なものとなってきている。これは例えは、RNA あるいはDNA を単離する生物学的原料を例えば機械的作用あるいは化学的作用、例えば洗剤による処理、により溶解することを含む。そして核酸の回収のための細胞溶解の後、通常は塩化セシウム密度勾配遠心分離、あるいはフェノール抽出を行う。これらの方法は核酸の単離のために有用であるが、その使用を困難にする欠点を有している。即ち、塩化セシウム密度勾配遠心分離は時間と費用のかかる超遠心分離の使用を必要とし、一方フェノールで処理することは作業者の保護の観点から問題である。そこで、核酸の単離を簡易化するための試みが過去に多くある。 DE 36 39 949 A1 、DE 40 34 036 A1 あるいはDE 41 39 664 A1 は、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のような多くの装置を要する方法を避けながらクロマトグラフィー法による核酸の精製を改良することに関する。これらの方法は例えば超遠心分離やフェノール抽出よりは進歩しているが、技術的にまだ複雑であり、労力を要するものである。分画化には多くの連続的な精製段階を必要とすることが多いので、例えば物質の損失の面から、少量の試料を処理することには特に問題が多い。 EP 0 389 063 A2 も核酸の単離方法に関する。核酸を含む原料はカオトロピックイオンの存在下に溶解され、次いでそのような条件下に核酸を吸着するような物質で処理される。そのような物質としては、珪藻土あるいはその他のシリカ含有無機支持体が挙げられている。EP 0 389 063 A2 に挙げられた方法によれば RNA とDNA 、及びRNA とssRNA を同時に分離することができる。しかし、二酸化ケイ素支持体に結合した核酸のDNA とRNA フラクションへの所望の分画化は達成されていない。RNA はその後RNアーゼを添加することにより分解し、DNA を残すことができる。米国特許5,155,018 号において、Gillespie et al.は、RNA 、DNA 及びその他の細胞内容物を含む生物学的原料から、生物学的に活性なRNA を単離及び精製する方法を開示している。RNA を含む原料は、例えば細かく粉砕されたガラスのような材料を含むシリカゲルからなる粒子と接触させられる。そこからRNA が前記物質に吸着される結合バッファーはカオトロピック塩を含む酸性化溶液である。そのような条件下、RNA はシリカ物質に結合するが、DNA はしない。酸性化カオトロピックバッファーの使用は、グアニジニウムチオシアネート(GTC)を含む結合バッファーの酸性化がシアン化水素の生成の危険を伴い、従って特に注意を払う必要があるという欠点を有する。また、DNA が酸の作用により破壊される。さらに、この方法では本来の試料からDNA を精製することはできない。米国特許第5,075,430 号において、LlttleはDNA をカオトロピック剤の存在下に珪藻土に固定し、水または低塩含量のバッファーによりDNA を溶出することによる単鎖及び二本鎖のプラスミドあるいはその他のDNA の精製方法を記載しているが、この方法ではDNA/RNA の精製は不可能である。 “Analytical Biochemlstry”121，p.382-387（1982）において、M.A．Markoe t al．は、アルカリ抽出及びガラス粉末に対する結合を使用した、高度に精製されたプラスミドDNA の大規模な単離のための方法を記載しているが、単一の試料からのRNA とDNA の分画化及び別々の精製については記載していない。核酸の未処理の調製物にその後の反応を行うが、これらのその後の反応については、単離手順及び単離された核酸の純度と完全性の両者について一定の要件が課される。特に、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、LCR(リガーゼ連鎖反応)、NASBA( 核酸配列をベースとする増幅)あるいは3SR(自己維持配列複製)等の酵素的増幅反応を行う場合には、他の試料との相互の汚染の危険なく核酸調製物を得ることが可能でなければならず、単離された核酸が阻害細胞成分及び／または代謝物を含まないものでなければならない。その特異性及び感度により、DNA の酵素的増幅(例えばPCR)あるいはRNA の酵素的増幅(例えばRNA-PCR)は、基礎研究の分野だけでなく、例えば微量の細胞及び／または組織あるいはバイオプシー材料からの核酸配列の検出、あるいは血液もしくは血漿からのウイルス核酸の検出等のための医療分野及び診断用途の分野においても重要度を増しつつある。これらの用途は、上記に挙げた要件の他、核酸の単離方法の収率と再現性について最も高度な要件を課すものである。本発明の一つの目的は、細胞溶解物及び組織溶解物のような、同一の生物学的試料からRNA 及びDNA を別々に精製することだけでなく、一般的に単鎖核酸から二本鎖のものを分離することもできる方法を提供することである。そのような方法の実施は、例えば安価な非修飾分離材料を使用することにより、できるだけ安価なものであるべきである。加えてそのような方法は、診断用の試料調製に適し、種々の増幅方法にも適合したものであるべきである。さらに先行技術について述べたような欠点を有していないことが必要である。驚くべきことに、本発明の目的は、請求項１の択一的方法1.1 〜1.4 の特徴を有する方法により達成される。請求項２〜11は本発明の方法の好ましい態様に係わり、請求項12〜21は本発明の方法における使用のための溶液あるいはそのような溶液の使用に係わり、請求項22は本発明の方法を実施するのに必要な成分を含むキットに係わる。より詳細には、生物学的原料からの二本鎖及び単鎖核酸構造物を分画化するための本発明の方法は、以下の択一的方法により表される。分離するべき核酸の種類（単鎖及び二本鎖のもの）を含む試料を少なくとも１種の無機支持体で処理し、ここで処理条件は、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を含む物質の適当な水性混合物により、単鎖核酸フラクションが主として第１の無機支持体に吸着され、二本鎖核酸は吸着されないように調整する。その後流出する二本鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。任意に洗浄段階を行った後、第１の無機支持体上に吸着された単鎖核酸を低イオン強度条件下に、あるいは水で溶出する。回収された非吸着二本鎖核酸は、例えば、その後に塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、二本鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件にフラクションを調整することによりさらに精製することができる。本発明の方法の第２の態様においては、単鎖核酸及び二本鎖核酸の分離のための処理条件は、アルカリ土類金属イオンを錯化する物質がアルコール基を含む物質の存在しない前記溶液中に含まれ、前記単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離できるように調整される。分離された単鎖核酸はそれ自体公知の方法によりさらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。このようにして得られる二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。回収される非吸着単鎖核酸はその後、特にアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。処理条件を、溶液に湿潤剤、洗浄剤あるいは分散剤が含まれ、アルコール基を有する物質が存在しないように調整すると、そのような条件下では単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、従って試料の残りから分離し、さらに処理することができる。これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができる。溶出された二本鎖核酸はその後それ自体公知の方法でさらに精製することができる。回収される非吸着単鎖核酸はその後、好ましくはアルコール基を有する物質を添加することにより、単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになる条件に調整することができる。本発明の方法の別の態様においては、両者とも結合された単鎖核酸及び二本鎖核酸の分画化を行う。これは、塩、特にカオトロピック物質、及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、処理条件を、単鎖核酸及び二本鎖核酸からなる全核酸が無機支持体に吸着されるようになるように調整し、次いで第１の支持体に結合した二本鎖／単鎖核酸を、より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液で処理することにより二本鎖核酸を選択的に溶出するか、あるいはアルカリ土類金属イオンを錯化する物質及び／または湿潤剤、洗浄剤もしくは分散剤並びに１種以上の塩、特にカオトロピック剤を含む溶液で単鎖核酸を溶出することにより分画化することを含む。最初の場合においては、単鎖核酸は支持体に結合して残り、これに対し２番目の場合は二本鎖核酸が無機支持体に結合して残る。それぞれの溶出フラクションはその後それ自体公知の方法によりさらに処理することができる。本発明によれば、核酸の分離のためのアルコール基を有する物質及び塩、特にカオトロピック物質での処理条件の調整は、本明細書において初めて規定される以下の物理化学的原則に基づいて実施される。図１は、単鎖RNA 及び二本鎖DNA により例示される単鎖/二本鎖核酸の結合を示す。ここに記載するのは、アルコール基を有する物質（ここではエタノール）とカオトロピック物質(ここではGTC)の濃度の関数としての組織溶解物からのRNA /DNA の無機支持体への結合である。アルコールまたはカオトロピック剤のいずれかの物質の濃度を一定とする条件下では、高いアルコール濃度及び／またはカオトロピック物質の量において、両方の種類の核酸(RNA/DNA)が無機支持体に結合することが判った。一方または両方の物質（アルコールまたはカオトロピック剤）の濃度が規定値よりも低くなると、実質的な程度で無機支持体に結合する核酸はない。驚くべきことに、その中間においては、RNA 及びDNA が、核酸の分離に利用できるような異なる程度で無機支持体に結合する。従って、細胞から開始して、高い濃度のカオトロピック物質による細胞の溶解の後、カオトロピック物質とアルコール基を有する物質の濃度を、その後にアルコール基を有する物質またはアルコール基を有する物質及び水もしくはバッファーの混合物を加えることにより、RNA の選択的結合を得、一方DNA は通過物中に残るように調整できる。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び30容量% のエタノールの濃度を選択して分別結合によりDNA からのRNA の分離を得るものである。一方、単鎖核酸及び二本鎖核酸の無機支持体への同時の結合は、アルコール基を有する物質の高い濃度及び／またはカオトロピック物質の高い濃度の条件下で得られ、二本鎖核酸の脱着は、最初にアルコール基を有する物質及び／またはカオトロピック物質の濃度を低下させることにより開始できる。単鎖核酸は結合したまま残り、一方または両方の物質がさらに減少したときに溶出される。図１による実施例においては、1.75 M GTC及び45容量% のエタノールの濃度を選択して全核酸の結合を得るものである。実施例８において説明するように、DNA の選択的脱着のためには0.3 M のGTC 及び10容量% のエタノールの濃度を選択する。このように、無機支持体への吸着によりRNA 及びDNA を分離でき、あるいは全核酸を最初に無機支持体に吸着させ、次いで単鎖核酸または二本鎖核酸を選択的に溶出することができる。任意に、それぞれの核酸（単鎖核酸または二本鎖核酸）の溶出の前に洗浄段階を行うこともできる。次いで、低イオン強度条件下あるいは水で溶出をそれぞれ行う。無機支持体から最初に脱着される核酸は、後にイオン強度及び／またはアルコール基を含む物質の濃度を増加させることにより、二本鎖核酸または単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着され、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下あるいは水で溶出されるように調整することができる。核酸は、例えば塩化ナトリウム／エタノール混合物中で無機支持体に吸着し、低イオン強度条件下あるいは水で溶出できるので、本発明の方法に使用される塩溶液は必ずしもカオトロピック塩を含む必要はなく、任意の塩溶液をアルコール基を含む物質と組み合わせて使用することができると考えられる。本発明の方法は、少量の試料の処理を可能とし、取り扱いが簡単で安全であり沈殿段階がないので有利である。さらに本発明の方法は比較的安価に人手をあまり必要とせず行うことができ、多数の試料を同時の処理を容易に可能とする。本発明の方法は融通性があり取り扱いが容易であることから、操作を自動化するのにも適している。本発明の方法により、二本鎖/単鎖核酸構造物を核酸構造物を含む原料から分離することができる。分離される核酸構造物を含み得る原料は、例えば請求項７に挙げた原料を含む。それらは特に、細胞培養物、あらゆる種類の組織、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、糞便；微生物、例えば細菌、ウィルス、例えばサイトメガロウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス；植物、植物の部分、胎児、胚、果実、あるいは例えばin Vitro転写及び／またはcDNA合成及び／または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR) の後の核酸を含む混合物である。好ましくは、細胞は最初に、カオトロピック物質及び／またはその他の塩を含む水性溶解系中で、最も簡単な場合においてはそれを細胞に添加することにより溶解される。この溶解工程は任意に機械的作用により促進してもよい。その後、このように処理された試料を課題に応じて、即ちどの種類の核酸をその他のものから分離したいかにより、請求項１の方法の段階1.1 〜1.4 に記載したようにさらに処理する。例えば細菌のような、挙げられた材料のいくつかのものはその細胞壁の状態によりカオトロピック物質を含む水性系では直接溶解することができない。そこでこれらの出発材料については、本発明の方法に使用する前に、例えば溶解酵素により前処理しなければならない。核酸を含む原料を溶解するための系は、好ましくは、0.1 〜10 Mの濃度のカオトロピック物質の溶液である。カオトロピック物質としては、特に、塩、例えば過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート /グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、及び／またはこれらの組み合わせが挙げられる。塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウムを0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、または尿素を対応する0.1 〜10 Mの濃度で含む水溶液、及び／またはそのような物質の組み合わせも、核酸を含む原料を溶解しあるいは結合するための水性系として使用することができる。アルコール基を含む物質は好ましくは１〜５の炭素原子を有する低級脂肪アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノールである。これらは好ましくは１〜90容量% の濃度で使用される。無機支持体は好ましくは、多孔質あるいは非多孔質の金属酸化物あるいは混合金属酸化物、シリカゲル、主としてガラスからなる物質、例えば非改変ガラス粒子、粉末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなり、無機支持体の粒子径は0.1 μm 〜1000μm であり、孔径は2 〜 1000μm である。前記多孔質あるいは非多孔質の支持体材料は、緩くパックされた形態であってもよく、あるいはガラス、石英あるいはセラミックからなるフィルター層、及び／またはシリカゲルが配置された膜、及び／または無機支持体から形成される粒子または繊維、及び石英またはグラスウールの織物、並びに官能基を有しているか有していないラテックス粒子、あるいはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、特に超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレンからなるフリット材料の形態とすることができる。アルカリ土類金属イオンを結合する物質としては、特に、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)あるいはEGTAを使用することができ、サルコシネートを湿潤剤、洗浄剤または分散剤として使用できる。所望ならば、本発明により得られた核酸を、アニオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー法によりさらに精製することができる。本発明の方法においては、RNA 、特に単鎖核酸としてのRNA を二本鎖核酸(DNA )から分離できる。DNA が単鎖形態で存在する場合には、そのようなDNA も二本鎖DNA 並びに二本鎖RNA から分離できる。本発明の方法に使用される溶液もまた本発明の主題である。溶解バッファー及び／または結合バッファーとして、本発明に従い、特に0.5 〜8.0 M のグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウム、及び0 〜50% のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む水溶液を使用することができる。無機支持体に結合した核酸を洗浄除去または溶出するための溶液としては、0. 1 〜3 M のグアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、及び／または塩化グアニジニウムを、１〜30% のエタノール及び／またはイソプロパノールとともに含む水溶液を使用することができる。二本鎖核酸を無機支持体に結合するために使用する水性溶液系としては、１〜 5 M のグアニジニウムイソチオシアネート、及び／または1 〜8 M の塩化グアニジニウムを、0.1 〜5%のサルコシネート、または5 mM〜200 mMのEDTAとともに含む水溶液を使用することができる。二本鎖核酸を結合するためには、1 〜5 M のグアニジニウムチオシアネート、及び／または1 〜8 M の塩化グアニジニウム及び5 mM〜200 mMのEDTAまたはEGTAを含む水溶液も使用することができる。前記方法を実施するための本発明による成分のキットは、特に、１以上の無機支持体を上記したような形態でその中に配置する通過流路に適した中空体を含む。無機支持体は、２つの手段の間に固定された緩くパックされたものの中にあってもよく、あるいは中空体内部に配置された膜の形態であってもよい。さらにキットは、溶液を含んでもよく、あるいはそのような溶液を配合するための成分は濃縮形態であってもよい。ユーザーは必要な溶液をそれぞれ必要な濃度で調製することができる。キットのその他の成分として有利なものは、細胞溶解物の溶液を均質化するための装置である。均質化のための特に好ましい装置は国際特許出願PCT/EP95/000 37に提案されている。この装置は、本質的に少なくとも２つの多孔質層からなり、その多孔質層は層中の流れの方向にみて減少する孔径を有するものである。細胞溶解物が減少する孔径を通過すると、細胞溶解物の粘性の溶液が均質化される。以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明する。材料及び方法 1. シリカ支持体材料シリカ支持体材料は膜あるいは懸濁粒子の形態で使用した。 1.1. シリカ膜シリカ膜（例えばWhatman 社の繊維ガラスフィルター）の２層をP 43 21 904 に記載されたように遠心分離クロマトグラフィーカラム（「スピンカラム」）中に固定した。膜形態の支持体材料については標準プロトコルの「スピン法」を行った(cf．4.1)。 1.2. シリカ粒子いくつかの種類のシリカ粒子（例えば、Darmstadt 、ドイツのMerck社及びSt. Louis のSigma 社のもの）をそれぞれ使用した溶解バッファー(cf．3.1.)中の50 % 懸濁物として使用した。平均粒子径は材料により0.5 〜50μm であった。標準プロトコルの「バッチ法」を行った(cf．4.2)。 2. 核酸を含む原料 2.1. 組織調製に使用した組織は収集した直後に液体窒素中で凍結し、-70℃で貯蔵した。あるいは新鮮組織を使用した。 2.2. 植物葉を液体窒素下に乳鉢ですりつぶし、微細な粉末を得、調製に直接使用するか -70℃で貯蔵した。 2.3. 細胞培養物細胞を回収した後、PBS で２回洗浄し、ペレット化した。適当な数(Thomaチャンバー中で計数して測定した）の細胞を含むアリコートを、調製に新鮮なまま使用するか、-20℃で貯蔵した。あるいは、固着増殖した細胞を培養皿中で洗浄し、それぞれの溶解バッファー (cf．3.1.)を添加することにより培養皿中で直接溶解してもよい。 2.4. 血漿 ACD 血液を3000 x gで10分間遠心分離し、上清を取って再度同様に遠心分離した。２回目の遠心分離の後に得られた上清からアリコートを作製し、-70℃で貯蔵した。 2.5. 細菌培地に一晩培養物を接種し、0.5 〜0.8 のOD₆₀₀まで増殖させた。適当な数の細胞(1 OD₆₀₀＝10⁹細胞/ml)を含むアリコートをペレット化し、細胞ペレットを- 20℃で貯蔵するか、新鮮なまま調製に使用した。 3. 試薬 3.1. 溶解バッファー L1 4.5 M GTC，25 mMクエン酸ナトリウム，pH 7.5，0.7%β-メルカプトエタノール(MSH) L2 4.0 M GTC，25mMクエン酸ナトリウム，pH 7.5，0.7%β-MSH L3 5.0 M GTC，50 mMトリス/HCl，pH 7.0 L4 3.5 M GTC，25 mMクエン酸ナトリウム，pH 7.5，1%β-MSH L5 2.5 M GTC，25 mMクエン酸ナトリウム，pH 7.5，1%β-MSH，30%エタノール L6 8.0 M GuHCl，20 mM MOPS，pH 7.0，0.7% β-MSH L7 3.0 M GTC，25 mM クエン酸ナトリウム，pH 7.5，1%β-MSH L8 4.0 M GTC，50 mMトリス/HCl，pH 7.5，1%サルコシル L9 4.0 M GTC，50 mMトリス/HCl，pH 7.5，25 mM EDTA 3.2. 結合バッファー B1 エタノール B2 n-ブタノール B3 イソプロパノール B4 水中70% エタノール B5 5.9 M GTC 3.3. 洗浄バッファー W1 2.0 M GTC，25 mMトリス/HCl，pH 7.5，30% エタノール W2 4.0 M GTC，40 mMトリス/HCl，pH 7.5，20% イソプロパノール W3 1.0 M GTC，25 mMトリス/HCl，pH 7.5，20% エタノール W4 5.0 M GuHCl，15 mM MOPS，pH 7.0，37% エタノール W5 0.5 M GTC，25 mMトリス/HCl，pH 7.5，10% エタノール 4. 標準プロトコル 4.1. 「スピン法」 1) 溶解バッファー(cf．3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。 2) 結合試薬(cf．3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。 3) 溶解物をスピンカラムにピペットで取り、卓上遠心分離器で10,000 rpmで15 秒間、スピンカラムの膜を通して遠心分離する。溶解物の容量がスピンカラムの最大容量よりも多い場合は、この結合段階を繰り返す。 4) カラム通過物を所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。 5) 700 μl の洗浄バッファー(cf．3.3.)をスピンカラムにピペットで取り、3) に記載したようにして遠心分離して混入細胞成分を除去する。 6) 5)のように行って膜に結合した核酸を700 μl の水中の80% エタノールで２回洗浄し、塩を含まないようにする。 7) スピンカラムを最大回転数で２分間遠心分離し、エタノールを完全に除去する。 8) 80℃に加熱した50〜100 μl の水をスピンカラムの膜上に直接ピペットで取り、最大回転数で１分間遠心分離し、核酸を溶出する。必要な場合には溶出段階を繰り返す。 4.2. 「バッチ法」 1) 溶解バッファー(cf．3.1.)を核酸を含む原料に加え、ハンドホモジナイザーにより完全に均質化する。 2) 結合試薬(cf．3.2.)を加えそれぞれの結合条件を調整する。 3) 50μl のシリカ懸濁物(溶解バッファー中50%)を加え、繰り返し攪拌しながら室温で10分間インキュベートして核酸を結合させる。 4) 卓上遠心分離器で10,000 rpmで15秒間遠心分離し、シリカ材料をペレット化する。 5) 上清をピペットで取り、所望の場合にはさらに処理し、あるいは捨てる。 6) 700 μl の洗浄バッファー(cf．3.3.)をペレットに加え、ペレットが完全に再懸濁されるまで攪拌し、4)に記載したように遠心分離する。 7) 700 μl の水中の80% エタノールで6)の洗浄段階を２回繰り返し、シリカ材料を塩を含まないように洗浄する。 8) ふたを開けて56℃で10分間ペレット化したシリカ材料を乾燥する。 9) 50〜100 μl の水を加え、攪拌することによりペレットを完全に再懸濁し、繰り返し攪拌しなから56℃で10分間インキュベートする。必要な場合にはこの溶出段階を繰り返す。 10) 最大回転数で１分間遠心分離し、上清を新しい反応容器に移す。 5. 電気泳動法単離された核酸をアガロースゲル上でエチジウムブロミドにより染色して分析した。この目的のため、1.2%ホルムアルデヒドまたは1.2% 1 x TBEゲルを調製した。ゲル上を流した後、ホルムアルデヒドゲルを水中で3 〜4 時間攪拌し、その後 10μg/ml RN アーゼA 中で一晩攪拌してRNA を消化し、DNA をより容易に可視化できるようにした。TBE ゲルは予め平衡化することなくRNアーゼ消化した。以下に記載する実施例は本発明の方法の性能を示すものである。これに従って単離した全ての核酸は電気泳動により分析し、分光分析により定量した。全ての溶出物についてOD₂₆₀/₂₈₀値は1.7 〜2.0 の間であった。参考例１〜５全核酸の単離以下の参考例１〜５においては、DNA 及びRNA の両方が無機支持体に結合し、一緒に溶出されるように、結合、洗浄及び溶出条件のそれぞれを選択した。これらの例はいくつかの異なるアルコール（エタノール、イソプロパノール、ブタノール）の結合試薬としての使用を説明するものである。参考例１腎臓組織からの全核酸の単離 15 mg の腎臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1 に従って全核酸を単離した。組織を400 μlのL1と混合し、均質化し、その後280 μl のB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2 x 50μl であった。参考例２肝臓組織からの全核酸の単離７mgの肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1 に従って全核酸を単離した。組織を300 μl のL2と混合し、均質化し、その後200 μl のB2を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2 x 50μl とした。参考例３ HeLa細胞からの全核酸の単離１ x 10⁶のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1 に従って全核酸を単離した。細胞を400 μl のL2と混合し、均質化し、その後200 μl のB1を加えた。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。参考例４血漿からの全核酸の単離標準プロトコル4.1 及び4.2 にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全核酸を血漿から単離した。それぞれの場合、800 μl のL3及び660 μl のB2を 200 μl の血漿に加え、混合した。この場合、均質化は必要なかった。「バッチ法」（4.2）のための混合物にさらに40μl のシリカ懸濁物を加えた。両方の実験において、第１の洗浄段階はW2で行い、溶出容量は2 x 100 μl とした。実施例１一定のGTC 濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA 及びDNA の分別結合一定のGTC 濃度及び増加するエタノール濃度によるRNA/DNA の無機支持体への結合の依存性を、各試料の実験について10 mg の腎臓組織を350 μl のL4中で溶解し、各実験について350 μl のエタノール/水混合物を加えてエタノールの濃度を調整することにより示した。前記混合物のエタノール含量は水中に20〜90% のエタノールであった。別のバッチに350 μl の無水エタノールを加えた。それぞれの実験において、これは1.75 Mの一定のGTC 濃度及び10〜50% の範囲で増加するエタノール濃度に対応した(cf.図1)。最初のシリーズの実験においては、このように調整した溶解物のそれぞれに、 150,000 cpm の³²P-標識0.9kb in vitro転写物を加え、溶解物をスピンカラム上に固定した無機支持体上にピペットで取った。卓上遠心分離器で10,000 rpmで15 秒間遠心分離し、カラムに結合した放射能及びカラム通過物中に存在する放射能をチェレンコフ計数により測定した。 ³²P-標識RNA の代わりに、150,000 cpm の、クレノウ充填反応により³²P-標識した直線化pTZ プラスミドを添加して一連の実験を繰り返した。図１に示すように、RNA フラクションは、すでに記載した条件下において25% より高いエタノール濃度から無機支持体に結合するが、DNA フラクションは40% より高いエタノール濃度からしか結合しない。実施例２〜８全RNA の単離以下の実施例においては、無機支持体への結合のためのアルコール／塩混合物を、RNA の選択的な結合が得られるように選択した(cf.図１)。結合条件は、それぞれ溶解された材料の種類（組織、細胞培養物、植物、細菌）に合わせた。これらの実施例は、出発材料の溶解のためのGTC 、GuHCl またはGTC/エタノール混合物の使用を説明するものである。単離されたRNA の完全性はノーザンブロッティングまたはRT-PCRにより確認した。これらの実施例においては、支持体に結合しなかったDNA はさらに処理しなかった。カラム通過物からのDNA のその後の精製については実施例12に示す。また DNA は、結合条件を参考例１〜５において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。実施例２脾臓組織からの全RNA の単離 15 mg の脾臓組織（マウス）から、標準プロトコル4.1 に従って全RNA を単離した。組織を350 μl のL4と混合し、均質化し、その後350 μl のB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。実施例３肝臓組織からの全RNA の単離(A) この実施例においては、エタノール含有溶解バッファーを使用して標準プロトコル4.1 を若干改変した。８mgの肝臓組織（ラット）を700 μl のL5と混合し、均質化した。溶解物をスピンカラムにピペットで取り、標準プロトコル4.1 を段階3)から実施した。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。実施例４肝臓組織からの全RNA の単離(B) 15 mg の肝臓組織（ラット）から、標準プロトコル4.1 に従って全RNA を単離した。組織を300 μl のL6と混合し、均質化し、その後175 μl のB1を加えた。第１の洗浄段階はW4で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。実施例５ HeLa細胞からの全RNA の単離 1 x 10⁷のHeLa細胞から、標準プロトコル4.1 及び4.2 にそれぞれ従って、２つの並行した実験において全RNA を単離した。それぞれの場合、細胞を350 μl のL7と混合し、均質化し、その後350 μl のB4を加えた。「バッチ法」（4.2）の混合物にさらに50μl のシリカ懸濁物を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。実施例６タバコからの全RNA の単離植物からの全RNA の単離のためには標準プロトコル4.1 を少し改変する。該プロトコルの段階1)（溶解）の後、卓上遠心分離器による5000 rpmでの遠心分離を加え、繊維残留物のような非溶解細胞成分を分離する。上清を除去し、結合試薬と混合し、前記標準法の段階2)からに従ってさらに処理する。 100 mgのタバコ葉から、植物用に改変した標準プロトコル4.1 により全RNA を単離した。粉末化した細胞材料を600 μl のL2と混合し、均質化し、その後350 μl のB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は1 x 50μl とした。実施例７大腸菌からの全RNA の単離細菌からの全RNA の単離については、細菌の細胞壁を溶解するために前記標準プロトコルを行う前に追加の段階を加える。細胞ペレットをTE中の400 μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、氷上で５分間、そして室温で10分間インキュベートする。その後これを標準法により溶解する。１ x 10⁹の大腸菌細胞から、細菌用に改変した標準プロトコル4.1 により全RN A を単離した。ペレットを80μl のTE中の400 μg/mlリゾチーム中に再懸濁し、上記のようにインキュベートした。その後これに270 μl のL2を加え、均質化し、350 μl のB4を加えた。第１の洗浄段階はW3で行い、溶出容量は2 x 50μl とした。実施例８洗浄バッファーを最適化することによる選択的RNA 結合この実施例に示すように、第１の洗浄段階(標準プロトコル4.1.5)で使用する洗浄バッファーを最適化することにより、特異的に結合したRNA からDNA 混入物を除去することができる。標準プロトコル4.1 に従い、それぞれの場合について1 x 10⁶のHeLa細胞を350 μl のL4中で溶解し、350 μl のB4と混合し、シリカ支持体に結合した。その後第１の洗浄段階において試料を以下の洗浄バッファーで洗浄した。標準プロトコルによりその後の段階を行った。溶出容量は1 x 50μl とした。溶出物の半分を1.2%ホルムアルデヒドゲル上で分析した(cf.図２)。次にゲルを「電気泳動法」で記載したようにしてRNアーゼA で処理した(cf.図３)。図２及び３の説明図２：実施例８からの溶出物を分析するための1.2%ホルムアルデヒドゲル、結合条件: 1.75 M GCT，12.5分; クエン酸ナトリウム，pH 7.5，35% エタノール、洗浄条件: cf．表１。トラックの番号は表１の試料の番号に対応する。図３：図２のゲルのRNアーゼ消化物実施例９及び10 DNA の単離以下の実施例９及び10においては、DNA だけが無機支持体に結合でき、RNA は通過するように結合条件を選択した。これらの実施例においては、支持体に結合しなかったRNA はさらに処理しなかった。カラム通過物からのRNA のその後の精製については実施例11に示す。さらにカラム通過物中のRNA は、結合条件を実施例２〜８において選択したものに調整することによりさらに精製してもよい。 DNA の選択的結合はアルコールの非存在下で溶解バッファー中で行う。即ち、標準プロトコル4.1 及び4.2 の段階2)を省略する。実施例９腎臓組織からのゲノムDNA の単離 10 mg の腎臓組織（ラット）を700 μl のL8中で溶解した。DNA は結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700 μl のL8で洗浄した。その後標準プロトコル4.1 を段階6)から行った。溶出容量は2 x 50μl とした。実施例10 HeLa細胞からのゲノムDNAの単離１ x 10⁷のHeLa細胞を700 μl のL9中で溶解した。DNA は結合試薬の添加なしで無機支持体に結合し、第１の洗浄段階で700 μl のL9で洗浄した。その後標準プロトコル4.1 を段階6)から行った。溶出容量は2 x 50μl とした。実施例11〜13 全RNA 及びゲノムDNA の分離同じ細胞溶解物からのRNA 及びDNA の別々の処理についての以下の実施例11〜 13は、RNA 、DNA あるいは全核酸分離についての上記の例の組み合わせである。分離は、RNA 及びDNA の分別結合あるいは分別溶出により行うことができる。実施例11及び12 分別結合による全RNA 及びゲノムDNA の分離分別結合については、やはり２つの可能性がある。溶解の後、DNA が最初に無機支持体に結合するように条件を選択するか（実施例11）、RNA が第１の結合段階で吸着され、DNA は通過物から別途処理されるようにすることができる（実施例12）。実施例11 腎臓組織からのゲノムDNA 及び全RNA の単離 10 mg の腎臓組織（ラット）を350 μl のL8中で溶解し、DNA を溶解バッファー中で無機支持体に結合させた。カラム通過物に350 μl のB4を加え、実施例3. 1 に従って全RNA を単離した。ゲノムDNA の単離は参考例１のようにして行った。実施例12 肺組織からの全RNA 及びゲノムDNA の単離 20 mg の肺組織（ラット）から、全RNA を実施例２のようにして単離した。カラム通過物中の結合しなかったゲノムDNA を、標準プロトコル4.1 に記載したように、350 μl のB1及び350 μl のB5を添加し、DNA を無機支持体に結合することにより単離した。第１の洗浄段階はW1で行い、溶出容量は2 x 50μlとした。実施例13 分別溶出による全RNA及びゲノムDNA の分離以下の実施例は、無機支持体に結合した全核酸のDNA フラクションの選択的溶出を説明するものである。結合条件は、全核酸が無機支持体に結合するように選択した。その後DNA フラクションを溶出し、RNA フラクションは結合されたままとなるようにした。溶出されたDNA は、DNA 結合条件を再調整することによって別の無機支持体に結合させ(cf.図１)、さらに処理する。肝臓組織からのゲノムDNA 及び全RNA の単離標準プロトコル4.1，1)〜4)に従い、15 mg の肝臓組織（ブタ）を300 μl のL 2中で溶解し、250 μl のB1と混合し、全核酸を無機支持体に結合させた。DNAフラクションは300 μl のW5で溶出し、RNA フラクションを結合したままの無機支持体を標準プロトコル4.1 の5)からに従って処理した。標準プロトコル4.1 に従って350 μl のB1及び250 μl のB5を加え、別の無機支持体に結合させることによりDNA フラクションを溶出物から単離した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者コルパンメチンドイツ連邦共和国、エッセンＤ−45219、１ウーラントストラッセ５ (72)発明者ファーザーペトラドイツ連邦共和国、ケルンＤ−50933、ベルベデールストラッセ 46

Claims

【特許請求の範囲】１．二本鎖及び単鎖核酸をそのような物質を含む原料から分離するための方法であって、試料を少なくとも１種の無機支持体で処理するものであり、 1.1 処理条件を、塩及びアルコール基を含む物質の水性混合物により、単鎖核酸を含むフラクションが主として第１の無機支持体に吸着され、二本鎖核酸は吸着されないように調整し、その後任意に行われる洗浄段階の後、前記第１の無機支持体上に吸着された単鎖核酸を低イオン強度条件下に、あるいは水で溶出し、回収された非吸着二本鎖核酸のためには、その後に条件を、塩及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物により、特に前記二本鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に低イオン強度条件下、あるいは水で前記第２の無機支持体から溶出することができるようになるように調整し、あるいは 1.2 処理条件を、アルカリ土類金属イオンを錯化する物質がアルコール基を含む物質の存在しない溶液中に含まれるように調整し、単鎖核酸はこれらの処理条件下では第１の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離され、これに対し二本鎖核酸は前記第１の無機支持体に主として結合し、その後任意に行われる洗浄段階の後、前記二本鎖核酸を低イオン強度条件下、あるいは水で溶出し、非吸着単鎖核酸のためには、その後に条件を、アルコール基を有する物質を添加することにより、特に前記単鎖核酸が前記第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で前記第２の無機支持体から溶出することができるように調整し、あるいは 1.3 処理条件を、溶液に湿潤剤、洗浄剤あるいは分散剤が含まれ、アルコール基を有する物質が存在しないように調整し、そのような条件下では単鎖核酸は第１の無機支持体に吸着されず、試料の残りから分離され、これに対し二本鎖核酸は第１の無機支持体に主として結合し、その後任意に行われる洗浄段階の後、前記二本鎖核酸は前記第１の無機支持体から低イオン強度条件下、あるいは水で溶出され、回収される非吸着単鎖核酸のためには、その後条件を、アルコール基を有する物質を添加することにより、特に前記単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着できるようになり、任意に行われる洗浄段階の後に、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出することができるようになるように調整し、あるいは 1.4 処理条件を、塩及びアルコール基を有する物質の適当な水性混合物で、全核酸（単鎖核酸及び二本鎖核酸）が第１の無機支持体に吸着されるようになるように調整し、次いで、より低いイオン強度及びアルコール基を有する物質のより低い濃度の溶液で処理することにより前記二本鎖核酸を選択的に溶出するか、あるいはアルカリ土類金属イオンを錯化する物質及び／または湿潤剤、洗浄剤もしくは分散剤並びに１種以上の塩を含む溶液で前記単鎖核酸を溶出することにより、前記第１の無機支持体から前記単鎖／二本鎖核酸を溶出してその支持体に結合した単鎖／二本鎖核酸を分画化し、第１の無機支持体に結合したままの他方の核酸はそれぞれ、任意に行われる洗浄段階の後、前記第１の無機支持体から低イオン強度条件下、あるいは水で溶出し、前記第１の無機支持体から最初に溶出された二本鎖または単鎖核酸のためには、その後イオン強度またはアルコール基を含む物質の濃度を増加させることにより処理条件を調整し、前記二本鎖／単鎖核酸が第２の無機支持体に吸着するようにし、この核酸は、任意に行われる洗浄段階の後、低イオン強度条件下、あるいは水で溶出できるようになる前記方法。２．核酸を含む原料を溶解するための系が0.1 〜10 Mの濃度のカオトロピック物質を含む請求項１に記載の方法。３．核酸を含む原料を、過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート/グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、及び／またはこれらの組み合わせを0.1 〜10 Mの濃度で含む溶液と混合する請求項１または２に記載の方法。４．核酸を含む原料を、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、尿素及び／またはこれらの組み合わせを0.1 〜 10 Mの濃度で含む溶液と混合する請求項１〜３の少なくとも１つに記載の方法。５．アルコール基を含む物質が１〜90容量％の濃度の低級脂肪アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール及びペンタノールであり、NaCl、KCl、LiCl、MgCl₂、NaAc等の塩が1〜10 Mの濃度で存在する請求項１〜４の少なくとも１つに記載の方法。６．無機支持体が、多孔質あるいは非多孔質の金属酸化物あるいは混合金属酸化物、シリカゲル、主としてガラスからなる物質、例えば非改変ガラス粒子、粉末化ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムからなり、無機支持体の粒子径は0.1 μm〜1000μm であり、孔径は2 〜1000μm であり、前記多孔質あるいは非多孔質の支持体材料は、緩くパックされた形態であってもよく、あるいは支持体材料はガラス、石英あるいはセラミックからなるフィルター層、及び／またはシリカゲルが配置された膜、及び／または無機支持体から形成される粒子または繊維、及び石英またはグラスウールの織物、並びに官能基を有しているか有していないラテックス粒子、あるいはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、特に超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレンからなるフリット材料の形態にあってもよい請求項１〜５の少なくとも１つに記載の方法。７．生物学的原料が、細胞培養物、あらゆる種類の組織、体液、例えば血液、血漿、血清、尿、糞便；微生物、例えば細菌、ウィルス、例えばサイトメガロウィルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、δ型肝炎ウィルス；植物、植物の部分、胎児、胚、果実を含み、あるいは核酸を含む試料が例えばin vitro転写及び／またはcDNA合成及び／または逆転写のような酵素反応とその後のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)から得られた混合物である請求項１〜６の少なくとも１つに記載の方法。８．カオトロピック物質もしくはその他の塩、またはそれらの混合物を含む水性溶解系中で細胞が最初に溶解される請求項１〜７の少なくとも１つに記載の方法。９．得られたフラクションをそれぞれ別のクロマトグラフィー段階によりさらに精製する請求項１〜８の少なくとも１つに記載の方法。１０．アルカリ土類金属イオンを結合する物質が、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)またはEGTAであり、湿潤剤、洗浄剤または分散剤がサルコシネートである請求項１〜９の少なくとも１つに記載の方法。１１．単鎖核酸がRNA であり、二本鎖核酸がDNA である請求項１〜10の少なくとも１つに記載の方法。１２． 0.5 〜3.0 M のグアニジニウムチオシアネート及び／または塩化グアニジニウム、及び1 〜50% のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む水溶液。１３．核酸を含む原料を溶解し、及び／または核酸を無機支持体に結合するためのバッファーとしての請求項12に記載の溶液の使用。１４． 0.1 〜3 M のグアニジニウムチオシアネート及び／または塩化グアニジニウム、及び1 〜30% のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む水溶液。１５．無機支持体に結合した核酸を洗浄除去するためのバッファーとしての請求項14に記載の溶液の使用。１６． 1 〜5 M のグアニジニウムチオシアネート及び／または1 〜8 M の塩化グアニジニウム、及び0.1 〜3%のサルコシルを含む水溶液。１７． DNA を無機支持体に結合するためのバッファーとしての請求項16に記載の溶液の使用。１８． 0.5 〜8.0 M のグアニジニウムチオシアネート及び／または塩化グアニジニウム、及び1 〜50% のエタノール及び／またはイソプロパノールを含む溶液の使用。１９． 1 〜5 M のグアニジニウムチオシアネート及び／または1 〜8 M の塩化グアニジニウム、及び5 mM〜200 mMのEDTAまたはEGTAを含む水溶液。２０． DNA 、二本鎖核酸を無機支持体に結合するためのバッファーとしての請求項19に記載の溶液の使用。２１．単鎖核酸(RNA)を無機支持体に結合しないためのバッファーとしての請求項19に記載の溶液の使用。２２．通過流路に適した中空体中に配置された無機支持体、請求項12、14、16 及び／または19のいずれかに記載の溶液、並びにその他の助剤及び／またはアクセサリーを含む請求項１〜11の少なくとも１つに記載の方法を実施するためのキット。２３．医療診断のための、PCR 、LCR 、NASBA 、3SR 等の増幅反応における前記方法により単離された核酸の使用。２４．増幅反応を使用しない、医療診断のための前記方法により単離された核酸の使用。