CN115197935A - 纤维素色谱纯化rna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供富集单链RNA的方法和组合物。

Description

纤维素色谱纯化RNA的方法
技术领域
本发明涉及纯化RNA的方法，具体涉及单链RNA的快速纯化方法。
背景技术
mRNA疗法以mRNA为制剂治疗疾病，是一种新兴的基因疗法，既可通过功能性蛋白的表达治疗基因缺陷性疾病或组织修复，又可通过抗原或抗体或受体的表达应用于免疫治疗，具有极大的应用价值。mRNA是一种单链RNA(ssRNA)，其需要依赖可重复的，高效率的ssRNA的生产纯化去除生产过程中的反应物和副产物，才能应用于医疗用途。众所周知，ssRNA生产基于依赖DNA的RNA聚合酶转录合成，在生产过程中产生的RNA往往是不纯的RNA混合物。转录合成产物中不仅含有NTP，T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNase Inhibitor(核糖核酸酶抑制剂)等，还包括流产转录本、转录终止产物等截短RNA副产物，冗余转录副产物；此外，依赖于RNA模板的非特异性RNA聚合酶活性还可能带来dsRNA(双链RNA)副产物。mRNA的生产还包括ssRNA的5’UTR加帽酶修饰、5’UTR甲基转移酶修饰、3’UTR的polyA修饰反应步骤，这些反应产物步骤中也包括各种酶蛋白、NTP底物等需要纯化去除。
通常情况下，传统的琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳、酚氯仿抽提、LiCl沉淀、乙醇或异丙醇沉淀、基于硅胶的商业化RNA纯化试剂盒方法，可以以不同效率去除反应产物中的游离核苷酸，蛋白质，盐和短RNA寡核苷酸，但无法实现生产的可重复和规模化放大及高效率生产。现有研究表明只有通过色谱纯化提高mRNA纯度，降低转录合成mRNA中副产物引起的免疫激活及其它副反应，才能大幅度提高mRNA的可翻译效率。
研究表明高效液相色谱可实现高效，可扩展的纯化生产毫克到克级别的药用RNA。目前已报道的mRNA或其它长链ssRNA的样品制备相关色谱分离技术包括反相离子对色谱(RP-IP)，离子交换色谱(IE)，亲和色谱(AC)，分子筛(SEC)等。McKenna SA等报道采用凝胶过滤分子筛的方法从转录化合物中纯化120-400nt的长链RNA的色谱纯化方法，这种方法只能分离短片段ssRNA，随着ssRNA长度的增加其分离效果会显著下降。Weissman D和Nwokeoji AO分别报道了用离子对反向高效液相色谱方法分离ssRNA、dsRNA、不完全配对dsRNA的案例，但是该方法中反相色谱填料的相对载量有限，不利于RNA纯化工艺的放大，色谱分离缓冲液中的某些有机物有一定的毒性也影响到其生产应用。Keel AY，Di Tomasso G等报道了利用MS2和ARiBO RNA配体亲和层析纯化RNA的案例，这些方法需要在治疗RNA序列中添加RNA配体序列，这可能会影响治疗性目标RNA的治疗性功能效率。离子交换(IEX)HPLC纯化方法的缺点是目前已公开文献中多数针对数百个碱基的长链RNA纯化，而大于1000nt的更长RNA纯化则需要在变性和/或碱性的流动相条件下才能实现，这使得RNA存在不稳定的风险，容易出现沉淀或降解等现象，产品回收率低。
除了上述HPLC纯化方法外，还有一种方法是通过纤维素色谱特异性吸附RNA纯化。早在上世纪90年代Maran A和Mellits KH就报道了使用纤维素分离ssRNA和dsRNA的方法。此后相继有其它文献报道了使用纤维素色谱纯化分离RNA的方法。这些文献均采用乙醇作为流动相纯化分离ssRNA。例如，CN109072232A公开了用于提供单链RNA的方法，在RNA阳性纯化工艺中，结合缓冲液乙醇浓度范围为大于35％，优选38％-42％；盐浓度15-70mM，最优是20-60mM。上述基于纤维素的纯化方法的缺点是RNA在纤维素色谱纯化之前都需要进行预处理离心沉淀分离，该预处理步骤明显不利于工艺的规模放大。
本领域仍需一种步骤简化、利于放大的RNA提取工艺。
发明内容
发明人研究了在不同有机溶剂和盐浓度下的样品预处理方式，以及在不同预处理方式下RNA色谱纯化的效率，开发了无需离心沉淀的样品预处理步骤而可以直接进行纤维素色谱纯化的溶剂和方法。
本发明第一方面提供一种用于通过纤维素材料富集单链RNA的包含40-70％(v/v)有机醇和盐的组合物，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或乙醇。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是具有细胞学功能的单链RNA。所述细胞学功能是翻译蛋白的功能。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA还包含双链形式的单链RNA。所述双链是由一条或多条单链RNA形成的非特异性双链二级结构。
在一个或多个实施方案中，所述RNA不含或基本不含双链RNA。
在一个或多个实施方案中，有机醇(正丙醇、异丙醇或乙醇)含量为40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或上述任意数值之间的范围，例如40-60％、50-60％、60％-70％。
在一个或多个实施方案中，盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂。
在一个或多个实施方案中，盐浓度为100-300mM，优选120-250mM，更优选125-250mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-1mM，优选0.1-0.5mM，更优选0.2mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-40mM，优选10-30mM，更优选20mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述组合物包含40％-70％正丙醇、异丙醇或乙醇，100-300mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.01-1mM EDTA，和1-40mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述组合物包含50％-60％正丙醇、异丙醇或乙醇，120-250mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.1-0.5mM EDTA，和10-30mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述组合物是溶液。
在一个或多个实施方案中，所述组合物用于富集单链RNA时，可与含有单链RNA的样品按照体积比1:1混合。所述含有单链RNA的样品例如是通过体外生物合成RNA或修饰RNA反应得到的产物体系。在一个或多个实施方案中，所述体外生物合成包括体外转录合成。
本发明第二方面提供一种用于通过纤维素材料富集单链RNA的组合物，所述组合物包含单链RNA、有机醇和盐，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或占所述组合物20-35％(v/v)的乙醇。所述组合物是混合物。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是具有细胞学功能的单链RNA。所述细胞学功能是翻译蛋白的功能。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA还包含双链形式的单链RNA。所述双链是由一条或多条单链RNA形成的非特异性双链二级结构。
在一个或多个实施方案中，所述RNA不含或基本不含双链RNA。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是由体内产生并经提取的单链RNA。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是体外生物合成或修饰产生的单链RNA。在一个或多个实施方案中，所述体外生物合成包括体外转录合成。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还含有RNA体外转录合成中的非RNA成分。
在一个或多个实施方案中，体外转录合成的单链RNA包括由RNA聚合酶以DNA为模板转录合成的RNA。在一个或多个实施方案中，RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶。
在一个或多个实施方案中，其中修饰产生的单链RNA包括经加帽、甲基化、和/或加尾修饰的单链RNA。在一个或多个实施方案中，所述修饰通过酶促进行，所述酶优选自牛痘病毒加帽酶、牛痘病毒mRNA二氧甲基转移酶、大肠杆菌poly(A)RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂。
在一个或多个实施方案中，有机醇含量为(v/v)20％、22.5％、25％、27.5％、30％、32.5％、35％或上述任意数值之间的范围，例如20-30％、25-30％、30-35％。上述含量为体积百分比。
在一个或多个实施方案中，盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂。
在一个或多个实施方案中，盐浓度为50-250mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，进一步优选100-125mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。
在一个或多个实施方案中，所述组合物的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，50-150mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.01-0.5mM EDTA和1-20mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇，62.5-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述组合物包含25％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇、60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂、0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述组合物不含有沉淀。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中还含有水。水在所述组合物中的体积百分比可为65-80％。
本发明第三方面提供一种富集单链RNA的方法，包括：
(1)将含单链RNA、有机醇和盐的混合物与纤维素材料接触，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或占混合物20-35％(v/v)的乙醇，
(2)使用洗脱液从纤维素材料获取含单链RNA的液体。
在一个或多个实施方案中，所述混合物如本文第二方面所述。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是具有细胞学功能的单链RNA。所述细胞学功能是翻译蛋白的功能。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA还包含双链形式的单链RNA。所述双链是由一条或多条单链RNA形成的非特异性双链二级结构。
在一个或多个实施方案中，单链RNA的长度为至少200bp，例如至少300bp、至少500bp、至少1000bp、至少2000bp、至少3000bp、至少4000bp、至少5000bp。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是由体内产生并经提取的单链RNA。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是体外生物合成或修饰产生的单链RNA。在一个或多个实施方案中，所述体外生物合成包括体外转录合成。
在一个或多个实施方案中，体外转录合成的单链RNA包括由RNA聚合酶以DNA为模板转录合成的RNA。在一个或多个实施方案中，RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶。
在一个或多个实施方案中，其中修饰产生的单链RNA包括经加帽、甲基化、和/或加尾修饰的单链RNA。在一个或多个实施方案中，所述修饰通过酶促进行，所述酶优选自牛痘病毒加帽酶、牛痘病毒mRNA二氧甲基转移酶、大肠杆菌poly(A)RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的接触包括混合所述混合物和纤维素材料或将所述混合物装载到填充有纤维素材料的柱上。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的接触时间为30-150min，温度为室温。
在一个或多个实施方案中，混合物中有机醇(正丙醇、异丙醇或乙醇)含量为(v/v)20％、22.5％、25％、27.5％、30％、32.5％、35％或上述任意数值之间的范围，例如20-30％、25-30％、30-35％。在优选实施方案中，混合物中正丙醇或异丙醇含量为(v/v)20-35％，优选20-30％，更优选25-30％。
在一个或多个实施方案中，盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂。
在一个或多个实施方案中，盐浓度为50-150mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，最优选100-125mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，50-150mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.01-0.5mM EDTA和1-20mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇，62.5-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：
(2a)使用洗脱液从纤维素材料洗脱含单链RNA的液体，所述洗脱的速度优选为30-100cm/h，或
(2b)使用洗脱液从纤维素材料获得单链RNA并通过固液分离获得含单链RNA的液体。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液含有4-18％，优选6-16％或8-10％，更优选8％或10％的有机醇，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或乙醇。
在一个或多个实施方案中，洗脱液中的有机醇与混合物中的有机醇相同。
在一个或多个实施方案中，洗脱液中还含有盐，所述盐优选自氯化钠、氯化钾和氯化锂。盐浓度为50-150mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，最优选100-125mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液包含6％-16％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris。
在一个或多个实施方案中，纤维素材料的粒径为20微米-250微米，优选50-100微米。
在一个或多个实施方案中，纤维素材料的RNA载量为2.5-6.25mg/g，优选3.75-6.25mg/g。
在一个或多个实施方案中，所述纤维素材料在与混合物接触前经预处理，预处理液包含20-35％的有机醇，50-150mM的盐(氯化钠、氯化钾或氯化锂)。任选地，所述预处理液还包含0.01-0.5mM的EDTA和/或1-20mM的HEPES或Tris。
在一个或多个实施方案中，在步骤(1)之前，单链RNA或含有单链RNA的混合物不经预纯化处理。
在一个或多个实施方案中，所述预纯化处理包括核酸沉淀，例如通过LiCl的沉淀。
本发明第四方面还提供一种富集单链RNA的方法，包括：
(1)将本文所述的组合物与含单链RNA的样品以体积比1:1混合，将所得的混合物与纤维素材料接触，
(2)使用洗脱液从纤维素材料获取含单链RNA的液体。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA是具有细胞学功能的单链RNA。所述细胞学功能是翻译蛋白的功能。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA还包含双链形式的单链RNA。所述双链是由一条或多条单链RNA形成的非特异性双链二级结构。
在一个或多个实施方案中，单链RNA的长度为至少200bp，例如至少300bp、至少500bp、至少1000bp、至少2000bp、至少3000bp、至少4000bp、至少5000bp。
在一个或多个实施方案中，所述含单链RNA的样品是由体内产生并经RNA提取的含单链RNA的样品。
在一个或多个实施方案中，所述含单链RNA的样品是体外生物合成RNA或修饰RNA产生的含单链RNA的样品。在一个或多个实施方案中，所述体外生物合成包括体外转录合成。
在一个或多个实施方案中，体外转录合成的单链RNA包括由RNA聚合酶以DNA为模板转录合成的RNA。在一个或多个实施方案中，RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶。
在一个或多个实施方案中，其中修饰产生的单链RNA包括经加帽、甲基化、和/或加尾修饰的单链RNA。在一个或多个实施方案中，所述修饰通过酶促进行，所述酶优选自牛痘病毒加帽酶、牛痘病毒mRNA二氧甲基转移酶、大肠杆菌poly(A)RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的接触包括将混合物与纤维素材料混合或将混合物装载到填充有纤维素材料的柱上。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的接触时间为30-150min，温度为室温。
在一个或多个实施方案中，混合物中有机醇(正丙醇、异丙醇或乙醇)含量为(v/v)20％、22.5％、25％、27.5％、30％、32.5％、35％或上述任意数值之间的范围，例如20-30％、25-30％、30-35％。在优选实施方案中，混合物中正丙醇或异丙醇含量为(v/v)20-35％，优选20-30％，更优选25-30％。
在一个或多个实施方案中，盐选自氯化钠、氯化钾、氯化锂。
在一个或多个实施方案中，盐浓度为50-150mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，最优选100-125mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。
在一个或多个实施方案中，所述混合物的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，50-150mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.01-0.5mM EDTA和1-20mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，所述混合物包含20％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇，62.5-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：
(2a)使用洗脱液从纤维素材料洗脱含单链RNA的液体，所述洗脱的速度优选为30-100cm/h，或
(2b)使用洗脱液从纤维素材料获得单链RNA并通过固液分离获得含单链RNA的液体。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液含有4-18％，优选6-16％或8-10％，更优选8％或10％的有机醇，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或乙醇。
在一个或多个实施方案中，洗脱液中的有机醇与混合物中的有机醇种类相同。
在一个或多个实施方案中，洗脱液中还含有盐，所述盐优选自氯化钠、氯化钾和氯化锂。盐浓度为50-150mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，最优选100-125mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液还包含EDTA。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液还包含HEPES或Tris。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述洗脱液包含6％-16％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris。
在一个或多个实施方案中，纤维素材料的粒径为20微米-250微米，优选50-100微米。
在一个或多个实施方案中，纤维素材料的RNA载量为2.5-6.25mg/g，优选3.75-6.25mg/g。
在一个或多个实施方案中，所述纤维素材料在与混合物接触前经预处理，预处理液包含20-35％的有机醇，50-150mM的盐(氯化钠、氯化钾或氯化锂)。任选地，所述预处理液还包含0.01-0.5mM的EDTA和/或1-20mM的HEPES或Tris。
在一个或多个实施方案中，在步骤(1)之前，含单链RNA的样品不经预纯化处理。
在一个或多个实施方案中，所述预纯化处理包括核酸沉淀，例如通过LiCl的沉淀。
本发明第五方面提供第三或第四方面所述方法获得的单链RNA或含单链RNA的液体。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA或含单链RNA的液体中不含或基本不含双链RNA。
在一个或多个实施方案中，所述单链RNA或含单链RNA的体系中包含双链形式的单链RNA。
附图说明
图1是乙醇、异丙醇、正丙醇纯化的AKTA图谱。
图2是dsRNA残留斑点印记分析图。
图3显示毛细管电泳分析纤维素纯化RNA的完整性。
图4是加帽mRNA乙醇、异丙醇、正丙醇流动相纯化AKTA图谱。
图5是dsRNA残留斑点印迹检测图。
图6是加帽后纤维素纯化RNA完整性图。
图7显示毛细管电泳分析假尿苷修饰mRNA纯化中dsRNA洗脱样品。箭头处为dsRNA检测峰。
图8显示不同纯化方式处理的EGFP-mRNA在PBMC上的EGFP阳性率及荧光强度。注：Cap样品为对照，为NEB RNA纯化试剂盒纯化的eGFP mRNA样品
图9是>2000nt RNA纯化图谱。
图10是dsRNA残留斑点印迹检测图。
图11显示盐浓度与异丙醇浓度与转录后RNA样品的影响。
图12显示本发明方法用于转录后、加帽后、加尾后混合体系RNA纯化。
图13是RNA纯化图谱。
图14显示异丙醇洗脱后收集RNA完整性检测。
图15是dsRNA残留检测。
图16显示PB mRNA介导eGFP表达框转座子敲入PBMC细胞的绿色荧光阳性率。
图17显示纤维素填料用于转录RNA色谱纯化图。
图18显示纤维素色谱纯化RNA的过程。A，现有技术，B，本申请示例性实施方案。
具体实施方式
发明人经研究，筛选到了两种未在纤维素纯化中使用过的有机溶剂异丙醇和正丙醇同样适用于纤维素的RNA纯化，并基于异丙醇、正丙醇和乙醇研究了RNA样品预处理的优选条件，在此条件下的预处理样品不会产生RNA或蛋白的沉淀可直接用于纤维素纯化，因此无需额外的沉淀分离等步骤。
本发明通过下述方法实现上述效果，包括：
(1)将含单链RNA、有机醇和盐的混合物与纤维素材料接触，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或占混合物20-35％(v/v)的乙醇，
(2)使用洗脱液从纤维素材料获取含单链RNA的液体。
如本文所用，“单链RNA”或“ssRNA”包括任何形式的单链状态RNA，如mRNA、microRNA、shRNA。单链RNA可以是由体内或细胞产生并经提取的单链RNA。由病毒、细胞或组织提取单链RNA的方法和试剂本领域周知，例如TRIZOL法。单链RNA还包含“双链形式的单链RNA”，该术语表示一个或多个单链RNA分子形成的非特异性二级结构，而非RNA模板依赖产生的碱基互补的双链RNA。双链形式的单链RNA经过热变性后分子内或分子间二级结构不稳定可以恢复成目标单链RNA单分子。本文中，“双链RNA”或“dsRNA”表示由RNA模板依赖产生的序列互补的双链RNA。
单链RNA也可以是体外合成或修饰产生的单链RNA。本文所述“体外合成”包括生物合成和化学合成。生物合成主要指由DNA转录得到的单链mRNA。这种转录通常通过RNA聚合酶进行。可用于获得本文所述生物合成RNA的RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、Syn5 RNA聚合酶。本领域知晓体外DNA转录获得RNA的试剂和方法，例如rNTP、DNA模板、无核酸酶水、抑制剂、RNA聚合酶、MgCl2等；示例性的方法如本文实施例1中所述。
本文所述“体外修饰”包括但不限于RNA的加帽、甲基化、碱基置换、碱基颠换或加尾修饰。这样的修饰可以通过酶促或非酶促进行。常见的修饰酶包括但不限于：牛痘病毒加帽酶、牛痘病毒mRNA二氧甲基转移酶、大肠杆菌poly(A)RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制剂。本领域知晓体外修饰RNA的试剂和方法，例如GTP、SAM、牛痘加帽酶、2-O-甲基转移酶等；示例性的方法如本文实施例1中所述。
不希望受任何理论限制，本文方法可纯化的单链RNA可为任何长度，通常至少为200bp，例如至少300bp、至少500bp、至少1000bp、至少2000bp、至少3000bp、至少4000bp、至少5000bp。
本文中，纤维素材料可以是本领域已知任何可用于RNA纯化的纤维素填料产品。纤维素材料的形式多种多样，例如颗粒、球形、柱形、锥形等。纤维素材料的直径不受限制，例如20微米-250微米，优选50-100微米。纤维素材料在于RNA接触前可经预处理，例如用预处理液孵育后再任选固液分离(例如施加驱动力如离心)。通常，预处理液的成分与上样缓冲液(除了RNA、蛋白等转录产物或底物)相同。因此，本文的预处理液包含20-35％的有机醇，50-150mM的盐。任选地，所述预处理液还包含0.01-0.5mM的EDTA和/或1-20mM的HEPES或Tris。根据本发明方法富集单链RNA，纤维素材料的RNA载量可达2.5-6.25mg/g，优选3.75-6.25mg/g。
本文所述组合物或混合物主要是水溶液，其中的有机醇主要是正丙醇、异丙醇或乙醇。发明人发现，与20-35％的有机醇和盐共存时，含蛋白、NTP等杂质的单链RNA可直接与纤维素接触用于纯化而无需经过沉淀和复溶的预纯化过程(图18，B)。而在现有技术中(图18，A)，单链RNA需先经过沉淀步骤以去除蛋白、NTP等杂质后才可用于纤维素纯化。如无特别说明，本文中提及的有机醇的百分含量均为体积百分含量(v/v)。
本文中，盐是本领域已知可用于RNA纯化的任何形式的盐，主要是无机盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化锂。在一个或多个实施方案中，盐浓度为50-150mM，优选60-125mM，更优选62.5-125mM，最优选100-125mM。
含有机醇和盐的组合物或混合物还可螯合剂例如EDTA、缓冲剂例如HEPES或Tris。EDTA浓度可为0.01-0.5mM，优选0.05-0.3mM，更优选0.1mM。HEPES或Tris的浓度可为1-20mM，优选6-15mM，更优选10mM。所述组合物或混合物的pH为6-8，优选6.5-7.5。
在一个或多个实施方案中，所述组合物或混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris。优选地，所述组合物或混合物包含25-30％正丙醇、异丙醇或乙醇，125mM氯化钠，0.1mM EDTA和10mM HEPES或Tris。
含上述组分和单链RNA的混合物可通过混合已制备的预组合物和含有单链RNA的溶液(例如提取或合成RNA的反应液)来获得。所述混合的比例不受限制，只要所得混合物中各组分的终浓度如本文所述即可。
在上述方法中，步骤(1)的接触包括混合组合物或混合物和纤维素材料或将组合物或混合物装载到填充有纤维素材料的柱上。例如将含有RNA的混合物与具有一定孔径的纤维素颗粒置于容器中混合、搅拌(30-60min、室温)。或者，可将含有RNA的混合物施加在纤维素柱子的一部分或全部上持续(30-150min、室温)。
之后，步骤(2)中，使用洗脱液使单链RNA从纤维素材料上分离，从而获取含单链RNA的液体。例如，可以使用洗脱液从纤维素材料(例如填充有纤维素材料的柱)洗脱(洗脱速度30-100cm/h)含单链RNA的液体；或者，可以使用洗脱液使单链RNA从纤维素材料(例如纤维素颗粒)分离到溶液中并通过固液分离(例如施加驱动力如离心)获得含单链RNA的液体。能使单链RNA从纤维素材料上分离的洗脱液本领域已知，例如含有4-18％，优选6-12％或8-10％，更优选8％或10％的有机醇的洗脱液，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或乙醇。通常，洗脱液中的有机醇与含单链RNA的混合物中的有机醇相同。当单链RNA长度小于2000nt时，洗脱液中有机醇(例如异丙醇)的含量优选为10-20％，例如16％。当单链RNA长度大于2000nt时，洗脱液中有机醇(例如异丙醇)的含量优选为5-10％，例如8％或10％。
在一些最优选的实施方案中，所述单链RNA是经加帽的单链RNA，所述混合物包含30％异丙醇、125mM氯化钠、0.1mM EDTA和10mM HEPES或Tris，所述洗脱液包含10％异丙醇、125mM氯化钠、0.1mM EDTA和10mM HEPES或Tris；或者所述单链RNA是经加尾的单链RNA，所述混合物包含25％异丙醇、125mM氯化钠、0.1mM EDTA和10mM HEPES或Tris，所述洗脱液包含10％异丙醇、125mM氯化钠、0.1mM EDTA和10mM HEPES或Tris。
通过本发明的任何方法获得的单链RNA可以进行进一步处理，例如沉淀和/或修饰。例如，可使用常规方法(例如，使用“乙酸钠/异丙醇”沉淀法或“LiCl”沉淀法)沉淀通过本发明方法获得的单链RNA，从而产生干燥形式的单链RNA制备物。干燥的单链RNA可以储存(例如，在-70℃下)或者可以溶解在合适的溶剂(例如水或TE缓冲液(10mM TRIS，1mMEDTA))中，然后储存(例如，在-70℃下)或使用。另外，可以进一步修饰单链RNA，例如，通过去除未加帽的5′-三磷酸酯和/或添加帽结构，然后将其储存(例如，在-70℃下)或使用。
本发明的优点
1、现有技术中，RNA样品需要预处理离心沉淀后重新溶解才能进行纤维素色谱纯化，当进行工业化放大生产时，这将增加纯化步骤，提高生产难度，降低工艺效率。本发明方法的样品预处理更简单，步骤少，直接通过添加含有机溶剂的缓冲液后，即可直接上样进行纤维素色谱纯化。即保证合成产物中不出现沉淀物质，又能保证在此条件下只有RNA目标产物能吸附到纤维素色谱填料中，而其它反应副产物流穿不吸附，从而实现一步纯化转录合成的RNA。本发明方法同样也适用于加帽后RNA产物和加尾后的RNA产物。由于减少了离心沉淀和重溶样品的步骤，提高了生产效率避免使用离心设备，降低了生产成本。
2、发明人发现，副产物dsRNA并不完全是RNA模板依赖产生的dsRNA副产物。本发明的毛细管电泳鉴定和细胞试验结果表明，这些“dsRNA”(本文称为双链形式的单链RNA)只是目标单链RNA分子间形成的非特异性二级结构，经过热变性后分子间二级结构不稳定可以恢复成目标单链RNA单分子。如果在纯化中为了将这些RNA作为副产物去除而过度调节纯化参数，将导致纯化回收率降低，提高工艺成本。因此，本发明的方法能更好地平衡单链RNA纯化产物中的dsRNA副产物，在不影响单链RNA纯化产物转染细胞效果的同时简化纯化步骤，更有利于生产应用。
3、本发明中的每克纤维素RNA载量可以达到6.25mg，远高于现有专利所描述的1-2.5mg范围。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明关联使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1，RNA的转录和/或修饰合成产物制备
转录合成RNA：室温配制合适的T7 RNA聚合酶反应体系按下表示范所示顺序加入反应成分，反应体系可按等比例扩大或缩小反应。37℃温育条件下反应6-16小时。本实施例中转录RNA分别为绿色荧光eGFP mRNA(Cap-eGFP mRNA，转录模板如SEQ ID NO:1所示)和Piggybac转座酶mRNA(PB mRNA，转录模板如SEQ ID NO:2所示)，其序列长度分别为1156nt和2175nt。
表1-1，RNA转录合成体系
Figure BDA0003011823870000141
Figure BDA0003011823870000151
加帽修饰RNA：本步骤适用10μgRNA(≥100nt)的加帽反应，且可根据实验需要放大，取10μg RNA到1.5mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至14ul；65℃加热10分钟后取出离心管置于冰上5分钟；依次加入以下组分后37℃孵育30-90分钟。
表1-2，RNA加帽合成体系
Figure BDA0003011823870000152
转录和/或加帽和/或加尾产物可直接用于色谱纯化，也可以进行LiCl沉淀并重新溶解于无核糖核酸酶水溶液中，LiCl沉淀步骤如下：在转录体系中加入两倍体积的LiCl(7.5M Lithium Chloride,50mM EDTA)，使氯化锂的终浓度为2.5M，然后置于-20℃下冷却半小时(30min，可过夜)。随后在4℃下以16,000x g离心20-30min，用移液器吸取去除上清液。用70％乙醇轻轻洗涤底部沉淀，4℃下以16,000x g离心10min，吸取上清后将沉淀重悬于无核酸酶水。
实施例2，筛选用于制备纤维素纯化RNA流动相的新型有机溶剂及其条件
迄今为止所有已报道的纤维素纯化RNA流动相中的有机溶剂均为乙醇，没有任何报道研究其它有机溶剂在该领域的应用。为了拓展纤维素RNA纯化的应用范围，我们设计筛选异丙醇、正丙醇2种有机溶剂用于纤维素纯化RNA用流动相的制备，其中有机溶剂阳性对照为乙醇。测试不同浓度的乙醇、异丙醇、正丙醇对目的RNA回收率和dsRNA去除效果的影响。选择AKTA Avant 150纯化仪连接纤维素柱开展实验。装填了一根XK16/20 25mL纤维素柱。以LiCl沉淀转录后长度大约为1000nt的RNA为研究对象，该RNA为eGFP mRNA。将RNA水溶液用含有70％(v/v)浓度的有机溶剂稀释缓冲液(20mM HEPES,250mM NaCl，0.2mM EDTA,70％(v/v)乙醇或异丙醇或正丙醇，余量为水，pH7.2)按1：1比例稀释。用含有35％(v/v)有机溶剂浓度的平衡缓冲液(10mM HEPES,125mM NaCl，0.1mM EDTA,35％(v/v)乙醇或异丙醇或正丙醇pH7.2)平衡纤维素柱，将3mg的RNA装载纤维素柱上，通过将洗出液中有机溶剂(乙醇或异丙醇或正丙醇)缓冲液中浓度降低至16％(v/v)、10％(v/v)和0％(v/v)，分别收集洗出的RNA。
用NEB公司的Monarch RNA纯化试剂盒Spin Column柱子回收样品RNA，回收RNA置换于水溶液中测定浓度，样品浓度使用Nanodrop仪器直接检测，计算各部分RNA收率。购买J2抗dsRNA单克隆抗体(Scicons公司)进行斑点印记分析洗出液中的RNA与起始输入的RNA样品中dsRNA含量。通过PerkinElmer公司Labchip检测仪毛细管电泳分析RNA完整性。各种方法回收率计算的统计数据如以下表格2。
表2乙醇、异丙醇、正丙醇用于纤维素纯化中不同浓度有机相洗出的转录RNA收率
Figure BDA0003011823870000161
色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示，在将乙醇、异丙醇、正丙醇三种有机溶剂洗出液浓度降低至16％(v/v)时，大部分目的RNA被洗脱出来，并表现为单一的UV峰(图1)。该部分收集的RNA收率，乙醇洗出液中RNA收率73.2％，异丙醇洗出液中RNA收率71.8％，正丙醇洗出液中RNA收率78.3％，正丙醇洗出RNA收率最高(表2)。dsRNA残留检测结果显示，当洗出液有机溶剂浓度16％(v/v)时，与起始输入的RNA相比，该部分中除去大部分的dsRNA(图2)。正丙醇洗出的RNA中，有dsRNA少量残留，乙醇和异丙醇中洗出的RNA中dsRNA残留最少。将洗出液有机溶剂浓度降低到10％(v/v)时，仅有少部分的RNA从纤维素柱上洗下来，该部分中显示含有大量的dsRNA。柱子再生时也显示含有大量的dsRNA。除了已报道过乙醇可用于dsRNA和ssRNA分离，这证实了异丙醇和正丙醇同样也能分离dsRNA和ssRNA，且异丙醇分离效果优于正丙醇。纤维素纯化后的RNA与起始输入的RNA完整性比较分析，RNA完整性未受到影响(图3)。
实施例3，筛选用于修饰的RNA纯化的溶剂和条件
基于以上的实验数据同时还测试了纤维素纯化加帽后的RNA，验证乙醇、异丙醇、正丙醇三种有机溶剂洗出液浓度是否也适用于加帽后的RNA。取3mg用LiCl沉淀加帽后的RNA用有机溶剂稀释缓冲液(20mM HEPES,250mM NaCl，0.2mM EDTA,70％(v/v)乙醇或异丙醇或正丙醇pH7.2)稀释，稀释后RNA在含35％有机溶剂的缓冲液(10mM HEPES,125mM NaCl，0.1mM EDTA,35％(v/v)乙醇或异丙醇或正丙醇pH7.2)中，将RNA装载到纤维素柱上，降低洗出液(10mM HEPES,125mM NaCl，0.1mM EDTA,16％(v/v)、10％(v/v)和0％(v/v)乙醇或异丙醇或正丙醇pH7.2)有机溶剂浓度16％(v/v)、10％(v/v)和0％(v/v)，分别收集洗出的RNA。
加帽后的RNA色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示与转录RNA洗脱曲线一致，在将乙醇、异丙醇、正丙醇三种有机溶剂洗出液浓度降低至16％(v/v)时，大部分目的RNA被洗脱出来，并表现为单一的UV峰(图4)。该部分收集的加帽RNA的收率，乙醇洗出液中RNA收率73.4％，异丙醇洗出液中RNA收率71.4％，正丙醇洗出液中RNA收率80.6％，正丙醇洗出RNA收率最高(表3)。
应用J2抗-dsRNA单克隆抗体进行dsRNA残留检测结果显示，当洗出液有机溶剂浓度16％(v/v)时，与起始输入的RNA相比，该部分中除去了约85％以上的dsRNA含量(图5)。当洗出液含异丙醇有机溶剂时，dsRNA残留最少，依次是乙醇和正丙醇。在相同浓度有机溶剂条件下，异丙醇作为有机溶剂分离dsRNA和ssRNA表现出较高的分辨率。当洗出液有机溶剂浓度为10％(v/v)时，仅有含有少部分的RNA从纤维素柱上洗下来，该部分中显示含有大量的dsRNA。这再次证实了异丙醇和正丙醇等有机溶剂同样也能作为流动相与纤维素作为固定相成功用于加帽RNA纯化实现dsRNA杂质的去除，且异丙醇分离dsRNA和ssRNA最佳。纤维素纯化后的RNA与起始输入的RNA完整性比较显示，RNA未受到影响，完整性良好(图6)。
进一步我们用毛细管电泳分析洗脱下来的含dsRNA样品，结果表明乙醇、异丙醇和正丙醇法流动相RNA纤维素纯化的结果非常类似，无明显差异。在0％有机相和水溶液条件下分别洗脱的dsRNA样品中的确含有一定比例的含二级结构的RNA检测峰，详见图7。
表3乙醇、异丙醇、正丙醇用于纤维素纯化中不同浓度有机相洗出的加帽RNA收率
Figure BDA0003011823870000171
实施例4，纯化的RNA的细胞功能
将上述不同有机缓冲液条件下纯化得到的不同Cap eGFP mRNA产物转染细胞验证其翻译效率，原代PBMC细胞转染程序如下：配制电转液：取LONZA电转液，取出待转EGFPmRNA，计算电转所需的量，EGFP mRNA-电转剂量为20μg，将混合液和电转液混合均匀，在电转前配制；12孔板准备，从-20℃冰箱取出CD3/CD28抗体，融化备用。在DPBS加入抗体，浓度为5μg/mL，混合均匀后加入孔板，放入37℃培养箱；将新鲜的细胞离心，1200rpm，离心5min，取出后弃去上清，加入DPBS，1200rmp，离心3min，弃DPBS，加入适量DPBS，轻轻吹打均匀，进行细胞计数。取1.5mL离心管，每管加入6.5×106个细胞，1200rmp,离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，按比例分别加入电转试剂共100μL，将电转样品按照需用量加入混匀，再将混合液转移至电转杯中，放入电转仪进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到预加好培液的12孔板中，4小时后，转板至包被板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养。电转第2天后检测EGFP阳性率。
从图8中可以看出，在PBMC细胞中，三种方法纯化得到的eGFP样品电转细胞后eGFP荧光阳性率相当；当用16％的异丙醇纯化时，其得到的EGFP-mRNA电转后其荧光强度及阳性率相对较高。结果表明用异丙醇作为缓冲液中的有机溶剂，具有比乙醇更佳的纯化效果。
实施例5，RNA链长度对异丙醇流动相纤维素纯化的影响
由于异丙醇有机溶剂在ssRNA和dsRNA分离上表现出较高的分辨率，为了验证RNA长度的增加是否会影响纤维素纯化RNA分离ssRNA和dsRNA，选择异丙醇这一种有机溶剂进行测试。将加尾后RNA混合物，用LiCl沉淀后的水溶液RNA样品，长度>2000nt RNA装载到纤维素柱上，由于RNA上样时含50％有机溶剂，此时全部RNA都能结合到纤维素柱上。将纤维素柱上洗出液异丙醇浓度降低到16％(v/v)、8％(v/v)、6％(v/v)、0％(v/v)依次释放ssRNA和dsRNA，收集各组分中的RNA并计算收率。斑点印记分析洗出液中的RNA与起始输入的RNA中dsRNA残留。
RNA色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示，与1000nt相比，>2000nt RNA在16％(v/v)有机溶剂浓度下未被洗脱下来，降低洗出液异丙醇浓度到8％(v/v)时，大部分RNA被洗脱下来，该部分RNA收率52％(图9)。当洗出液异丙醇浓度到6％(v/v)时，该部分RNA收率13％。dsRNA残留检测显示(图10)，与输入的RNA比较，当洗出液异丙醇浓度8％时，dsRNA去除率80％。当洗出液异丙醇浓度6％时，显示有较多的dsRNA存在。该实验证实了纤维素纯化RNA去除dsRNA污染物由洗出液有机溶剂浓度和RNA长度共同决定。>2000nt RNA从纤维素柱上释放需要洗出液中含有机溶剂浓度更低。
实施例6，筛选纤维素纯化RNA样品预处理的优化条件
酶法生产mRNA转录产物中含有大量的生物工程酶蛋白和RNA，纤维素纯化RNA流动相中需要乙醇、异丙醇或正丙醇等有机溶剂，上述两种因素具有天然的矛盾。有机溶剂不仅影响蛋白的溶解度易造成沉淀，还会造成RNA的部分析出，从而无法直接进行下游的色谱纯化，因此目前已报道所有纤维素RNA纯化工艺中都采用LiCl沉淀和/或醇沉淀的方式预先沉淀并重溶RNA样品。
在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。这种现象称为盐溶。稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。
鉴于上述分析的原因，我们创新性的利用盐溶原理筛选出了一种样品预处理的优选条件，在此优选条件下，可以不用沉淀离心的预处理步骤，直接一步上样纤维素色谱纯化转录合成的RNA产物。
为了避免RNA纯化前需经过LiCl沉淀步骤，简化纤维素纯化RNA工艺，对RNA纯化方法做进一步优化。希望通过对上样前的RNA做简单的预处理，确保上样时RNA混合物没有沉淀能够直接上样，上样过程中，除RNA能结合到纤维素柱上，而其他混合物不能结合到纤维素柱上，目的RNA在洗出液中被收集到，最终达到纯化RNA的目的。
选择转录后的RNA混合物进行测试。首先配制稀释缓冲液，缓冲液配制成分见表4，然后取400μL转录后的RNA混合物与稀释缓冲液1：1混合，混合后的RNA混合物中分别含有异丙醇浓度20％、25％、30％、35％，盐浓度15.625mM、31.25mM、62.5mM、125mM、250mM、500mM。混合后的样品放室温静置30min，肉眼观察是否有浑浊产生。30min后，将混合物放置于离心机中12000rpm离心2min，去除沉淀的RNA及蛋白混合物，取RNA上清液用spin column柱子回收RNA，将回收后的RNA用水溶解，测量RNA浓度，计算样品收率。收率计算结果见表5。
表4稀释缓冲液配制成分表
Figure BDA0003011823870000191
Figure BDA0003011823870000201
当盐浓度≤60mM时，随着平衡缓冲液中异丙醇浓度的增加对转录混合物中RNA收率没有明显的影响，肉眼观察混合物没有沉淀发生。当盐浓度≤60mM时，转录混合物受异丙醇浓度影响较小(图11)。当盐浓度>125mM时，随着平衡缓冲液中异丙醇浓度的增加能明显降低转录混合物中RNA的收率，且肉眼能观察到混合物有沉淀发生，转录混合物受异丙醇浓度影响较大。根据异丙醇浓度为20％-30％(v/v)时，选择盐浓度≤125mM最佳。当异丙醇浓度35％时，盐浓度的增加能明显降低转录混合物中RNA的收率。基于收率的数据，选择转录后样品预处理有机溶剂浓度20-30％(v/v)，且盐浓度≤125mM。
基于筛选到的用于样品预处理时的异丙醇浓度20-30％(v/v)和盐浓度≤125mM，固定缓冲液盐浓度125mM，从20-30％(v/v)异丙醇浓度中进一步优化用于纤维素柱纯化的样品预处理的异丙醇浓度。将转录后的RNA混合物用含40％-60％浓度的异丙醇的稀释缓冲液进行稀释，稀释后的转录混合物分别含20％(v/v)异丙醇和125mM盐浓度、25％(v/v)异丙醇和125mM盐浓度、30％(v/v)异丙醇和125mM的盐浓度。当盐浓度125mM时，在含有20-30％(v/v)的异丙醇浓度下的转录混合物上纤维素纯化时，验证RNA是否流穿及洗脱后的产品中RNA最终收率。
装填了一根XK16/20 25mL的纤维素柱，首先纤维素柱分别用含有20％、25％、30％异丙醇平衡缓冲液平衡，然后将转录后的混合物含20mg RNA分别用稀释缓冲液(20mMHEPES,250mM NaCl，0.2mM EDTA,40％(v/v)或50％(v/v)或60％(v/v)异丙醇，pH7.2)稀释后用纤维素柱进行纯化。通过降低洗出液中异丙醇浓度10％(v/v)实现RNA的释放。收集各个洗脱峰中的RNA样品，用核酸浓度检测仪测量RNA浓度，并计算收率。
RNA色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示，上样时看到有出现流穿峰，将流穿的样品收集，用LiCl沉淀验证是否有RNA未结合到填料上。结果显示，当稀释后的转录混合物中异丙醇终浓度为20％和25％时，收集的流穿峰中有RNA被检测到，当稀释后的转录混合物中异丙醇终浓度为30％时，收集的流穿峰中无RNA被检测到。该实验确定了转录混合物中异丙醇终浓度为30％时，上样时RNA能完全结合到纤维素柱填料上，杂质则流穿(图12)。当洗出液异丙醇浓度减低到10％(v/v)时，出现单一的RNA峰，收集该组分RNA收率在90％以上。为了进一步完善纤维素纯化RNA方法，依次测试了加帽后的RNA混合和加尾后的RNA混合物，结果显示加帽后RNA的混合物上纤维素柱时，需要将样品稀释到终浓度含30％(v/v)异丙醇缓冲液中，这样可以保证RNA混合物上样时，RNA不发生沉淀且RNA全部结合到纤维素上。RNA在10％(v/v)异丙醇中被洗出来，且收率能达到80％以上。加尾后的RNA混合物上纤维素柱时，需要将样品稀释到终浓度含25％(v/v)异丙醇缓冲液中，这样可以保证RNA混合物上样时，RNA不会发生沉淀且混合物全部流穿，RNA全部结合到纤维素上。RNA在10％(v/v)异丙醇中被洗出来，且收率能达到80％以上。
表5不同盐浓度与异丙醇浓度对转录后RNA样品的影响
Figure BDA0003011823870000211
Figure BDA0003011823870000221
实施例7，工艺放大条件下RNA在纤维素填料上载量测试
选择XK 16/20 40mL纤维素柱(Sigma C6288)。分别将40mg、70mg、100mg转录后，长度>2000nt的PB RNA混合物用稀释缓冲液(20mM HEPES，250mM NaCl，0.2mM EDTA，60％(v/v)异丙醇pH7.2)进行稀释，稀释后样品中异丙醇浓度30％(v/v)。稀释后的样品直接上纤维素柱，上样保留时间50min，洗脱时用洗脱缓冲液(10mM HEPES,125mM NaCl，0.1mM EDTA,10％(v/v)异丙醇pH7.2)将结合到纤维素上的RNA洗脱下来，柱子再生时用注射水洗柱子。最终计算上样流穿的RNA、洗出液的RNA和柱子再生时的RNA样品量，根据上样时流穿的样品量及洗脱的样品量计算纤维素柱子载量。当上样量由40mg提高到100mg RNA样品量时，流穿里未出现目的RNA流穿，RNA被洗脱缓冲液完全洗脱下来。依此计算对于>2000nt的RNA混合物，纤维素的载量2.5mg/mL，对应每1g纤维素RNA结合量6.25mg。
实施例8，异丙醇流动相下dsRNA和ssRNA的色谱分离条件筛选
本发明中试验表明大部分的dsRNA是ssRNA分子间非特异二级结构，并不影响ssRNA即mRNA的细胞功能。在毛细管电泳中，这种dsRNA经变性后大部分可以恢复为ssRNA。细胞转染dsRNA收集峰，可以得到与纯ssRNA相当的翻译效率。
为了验证洗出液RNA中dsRNA残留是否会影响细胞转染。选择长度>2000nt加尾后的PB mRNA，用30％异丙醇缓冲液平衡纤维素柱。将RNA装载到纤维素柱上，降低洗出液异丙醇浓度12％(v/v)、10％(v/v)、6％(v/v)、0％(v/v)，并依次释放RNA，收集各组分RNA。用Spin column柱子回收RNA，并将RNA置换于水溶液中，计算各部分RNA收率。斑点印记分析洗出液中的RNA与起始输入的RNA中DsRNA含量。通过labchip检测仪分析RNA完整性。
RNA色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示，当洗出液异丙醇浓度减低到12％(v/v)、10％(v/v)、6％(v/v)、0％(v/v)时，均出现单一的RNA峰(图13)，收集各组分总的RNA收率在60％以上。RNA完整性分析结果显示(图14)，纤维素纯化后的样品RNA完整性不受影响，且柱子再生时也含有目的RNA。与起始输入的RNA样品比较，纯化后的dsRNA含量大大降低(图15)。将不同浓度异丙醇洗出的RNA样品和柱子再生时的RNA样品送细胞功能检测显示，纤维素柱洗出的RNA样品与上样前RNA细胞功能结果无明显差异(图16)。
从细胞功能数据分析，为了进一步提高样品收率，为工艺放大降低成本，可降低洗脱缓冲液异丙醇浓度6-10％(v/v)来增加收率，当洗脱缓冲液中异丙醇浓度6％时，收率可提高18％。且dsRNA少量的残留不会影响细胞功能。
实施例9，纤维素色谱填料粒径与RNA吸附载量的相关性试验
纤维素色谱填料粒径不同时，应该有不同的RNA吸附载量，优化的填料粒径主要目的是提高生产填料的载量和/或分离度，纯化兼顾蛋白、NTP的分离而不是局限于现有专利技术的ssRNA和dsRNA分离。
为了测试不同的粒径填料结合RNA的能力，我们以Sigma(C6288)为对照，分别筛选了25-200μm不同厂家不同粒径下填料结合RNA的能力(表5)。分别称取0.1g不同粒径的纤维素填料，加入400μL浓度为0.1M/L NaOH到纤维素填料中，在金属浴1000rpm转速下放置45min后，12000rpm离心2min后去除上清，再用移液器取400μL平衡缓冲液重悬填料，重复6次以上直到pH与缓冲液一致后停止换液。取转录后的RNA水溶液，用稀释缓冲液稀释，确保稀释后的RNA所在缓冲液中异丙醇浓度与平衡缓冲液中异丙醇浓度一致都是30％，稀释后的RNA浓度1.25mg/mL。将稀释后的RNA样品取0.6mg RNA溶液与填料孵育，金属浴转速1000rpm放置30min后，离心机12000rpm离心5min后取上清，用NEB公司的Monarch RNA纯化试剂盒Spin column柱子回收未被填料结合的RNA上清液，回收的RNA置换于水溶液中测定浓度，计算不同粒径填料结合RNA的量(表5)。
结果显示，三个不同厂家纤维素填料，对应的不同粒径的纤维素结合RNA的量有区别，针对Sigma填料不同的粒径其RNA载量差异不明显。针对阿拉丁厂家的填料，粒径越小的填料(≤250μm)，RNA的结合量越多，其填料载量也越高。粒径越大的填料，对应的RNA结合填料的量越少，载量也越低。针对麦克林厂家的纤维素填料，粒径65μm的填料载量略高于100μm粒径的填料。
表5不同粒径填料对应RNA载量
Figure BDA0003011823870000231
Figure BDA0003011823870000241
*色谱柱条件下的RNA吸附载量与试管混合吸附条件下的RNA吸附载量会有所不同，本试验中主要分析载量随粒径改变的变化趋势。
实施例10，纤维素色谱纯化mRNA的大规模生产工艺放大
为了验证纤维素柱是否可用于RNA生产的放大，将大规模转录后的PB mRNA混合物用纤维素柱进行纯化，装填一个XK50/18 350mL的纤维素柱，将350mg的RNA混合物用水1：1稀释，再用稀释缓冲液(20mM HEPES,250mM NaCl，0.2mM EDTA,60％(v/v)异丙醇pH7.2)稀释后，用0.22μm真空过滤系统将样品进行过滤后上样，上样流速21cm/h，洗脱缓冲液用(10mM HEPES,125mM NaCl，0.1mM EDTA,8％(v/v)异丙醇pH7.2)，收集洗脱后的样品，用核酸浓度检测仪测量RNA浓度，计算样品收率。
RNA色谱图的洗脱曲线(260nm处的UV吸光度)显示，上样时看到有出现流穿峰，将流穿的样品收集，用LiCl沉淀验证是否有RNA未结合到填料上(图17)。结果显示，当稀释后的转录混合物中异丙醇终浓度为30％时，收集的流穿峰中无RNA被检测到。当洗出液异丙醇浓度到8％(v/v)时，出现单一的RNA峰，收集该组分RNA收率在90％以上，共收集300mg的RNA。该实验证明纤维素柱可用于RNA放大生产。
序列表
<110> 上海细胞治疗集团有限公司
<120> 纤维素色谱纯化RNA的方法
<130> 210139
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1179
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tctagataat acgactcact atagggagaa ttcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag 60
ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag 120
ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc 180
atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac 240
ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc 300
gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac 360
aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag 420
ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac 480
agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag 540
atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc 600
cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc 660
ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc 720
gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaag gatcctgcac tagtgctgtc 780
gacgctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac 840
tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac 900
atttattttc attgcgctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc 960
cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc 1020
ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggtacc 1179
<210> 2
<211> 2198
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tctagataat acgactcact atagggagaa ttcgccacca tgggctctag cctggacgac 60
gagcacatcc tgagcgccct gctgcagagc gacgacgaac tggtgggcga ggacagcgac 120
agcgaggtca gcgaccacgt gtccgaggac gacgtgcagt ccgacaccga ggaagccttc 180
atcgacgagg tgcacgaagt gcagcctacc agcagcggct ccgagatcct ggacgagcag 240
aacgtgatcg agcagcctgg cagctccctg gccagcaaca gaatcctgac cctgccccag 300
agaaccatca gaggcaagaa caagcactgc tggtccacct ccaagagcac caggcggagc 360
agagtgtccg ccctgaacat cgtgcggagc cagaggggcc ccaccagaat gtgcagaaac 420
atctacgacc ccctgctgtg cttcaagctg ttcttcaccg acgagatcat cagcgagatc 480
gtgaagtgga ccaacgccga gatcagcctg aagaggcggg agagcatgac cagcgccacc 540
ttcagagaca ccaacgagga cgagatctac gccttcttcg gcatcctggt gatgaccgcc 600
gtgagaaagg acaaccacat gagcaccgac gacctgttcg acagatccct gagcatggtg 660
tacgtgtccg tgatgagcag agacagattc gacttcctga tcagatgcct gagaatggac 720
gacaagagca tcagacccac cctgcgggag aacgacgtgt tcacccccgt gcggaagatc 780
tgggacctgt tcatccacca gtgcatccag aactacaccc ctggcgccca cctgaccatc 840
gatgagcagc tgctgggctt cagaggcaga tgccccttca gagtgtacat ccccaacaag 900
cccagcaagt acggcatcaa gatcctgatg atgtgcgaca gcggcaccaa gtacatgatc 960
aacggcatgc cctacctggg cagaggcacc cagacaaacg gcgtgcccct gggcgagtac 1020
tacgtgaaag aactgagcaa gcctgtgcat ggcagctgca ggaacatcac ctgcgacaac 1080
tggttcacca gcatccccct ggccaagaac ctgctgcagg aaccctacaa gctgaccatc 1140
gtgggcaccg tgcggagcaa caagcgggag atcccagagg tgctgaagaa cagcagatcc 1200
agacctgtgg gaacaagcat gttctgcttc gacggccccc tgaccctggt gtcctacaag 1260
cccaagcccg ccaagatggt gtacctgctg tccagctgcg acgaggacgc cagcatcaac 1320
gagagcaccg gcaagcccca gatggtgatg tactacaacc agaccaaggg cggcgtggac 1380
accctggacc agatgtgcag cgtgatgacc tgcagcagaa agaccaacag atggcccatg 1440
gccctgctgt acggcatgat caatatcgcc tgcatcaaca gcttcatcat ctacagccac 1500
aacgtgtcca gcaagggcga gaaggtgcag agccggaaga aattcatgcg gaacctgtac 1560
atgagcctga cctccagctt catgagaaag agactggaag cccccaccct gaagagatac 1620
ctgcgggaca acatcagcaa catcctgccc aaggaagtgc caggaacaag cgacgacagc 1680
accgaggaac ccgtgatgaa gaagaggacc tactgcacct actgtcccag caagatcaga 1740
agaaaggcca acgccagctg caagaaatgc aaaaaagtga tctgccggga gcacaacatc 1800
gacatgtgcc agagctgttt ctgaggatcc tgcactagtg ctgtcgacgc tcgctttctt 1860
gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta aactggggga 1920
tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctaataa aaaacattta ttttcattgc 1980
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 2040
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 2100
tattttcatt gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaggtacc 2198

Claims (10)

1.一种用于富集单链RNA的组合物，其特征在于，所述组合物是包含40-70％(v/v)有机醇和100-300mM盐的溶液，或其等比浓缩物或稀释物，所述有机醇选自正丙醇、异丙醇和乙醇，所述盐选自氯化钠、氯化钾和氯化锂；
优选地，
有机醇含量为40-60％、50-60％、或60％-70％，和/或
盐浓度为120-250mM，和/或
所述溶液还包含EDTA，优选其浓度为0.01-1mM，和/或
所述溶液还包含HEPES或Tris，优选其浓度为1-40mM。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，
所述组合物包含50％-60％正丙醇、异丙醇或乙醇，120-250mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.1-0.5mM EDTA，和10-30mM HEPES或Tris，或它们的等比浓缩物或稀释物。
3.一种用于富集单链RNA的混合物，所述混合物包含单链RNA、有机醇和盐，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或占所述溶液20-35％(v/v)的乙醇，
优选地，
所述单链RNA是由体内产生并经提取的单链RNA，和/或
所述单链RNA是体外生物合成或修饰产生的单链RNA，和/或
单链RNA的长度为至少200bp，和/或
有机醇含量为(v/v)20-35％、20-30％、25-30％，和/或
所述盐选自氯化钠、氯化钾和氯化锂，和/或
盐浓度为50-150mM，和/或
所述混合物还包含EDTA，优选其浓度为0.01-0.5mM，和/或
所述混合物还包含HEPES或Tris，优选其浓度为1-20mM。
4.如权利要求3所述的混合物，其特征在于，
所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，50-150mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.01-0.5mM EDTA和1-20mM HEPES或Tris，或
所述混合物包含20％-35％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或
所述混合物包含20％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇，62.5-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris，或
所述混合物包含25％-30％正丙醇、异丙醇或乙醇、60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂、0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris。
5.一种富集单链RNA的方法，包括：
(1)将含单链RNA、有机醇和盐的混合物与纤维素材料接触，所述有机醇选自：正丙醇、异丙醇或占混合物20-35％(v/v)的乙醇，
(2)使用洗脱液从纤维素材料获取含单链RNA的液体，
优选地，
所述单链RNA是由体内产生并经提取的单链RNA，和/或
所述单链RNA是体外生物合成或修饰产生的单链RNA，和/或
单链RNA的长度为至少200bp，和/或
所述混合物如权利要求3或4所述，和/或
在步骤(1)之前，单链RNA或含有单链RNA的混合物不经预纯化处理。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤(1)的接触包括混合所述混合物和纤维素材料或将所述混合物装载到填充有纤维素材料的柱上，和/或
步骤(1)的接触时间为30-150min，和/或
步骤(2)包括：(2a)使用洗脱液从纤维素材料洗脱含单链RNA的液体，所述洗脱的速度优选为30-100cm/h，或(2b)使用洗脱液从纤维素材料获得单链RNA并通过固液分离获得含单链RNA的液体。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
所述洗脱液含有4-18％的选自正丙醇、异丙醇和乙醇的有机醇，和/或
洗脱液中的有机醇与混合物中的有机醇相同，和/或
洗脱液中还含有选自氯化钠、氯化钾和氯化锂的盐，优选盐浓度为50-150mM，和/或
所述洗脱液还包含EDTA，优选EDTA浓度为0.01-0.5mM，和/或
所述洗脱液还包含HEPES或Tris，优选HEPES或Tris的浓度为1-20mM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱液包含6％-16％正丙醇、异丙醇或乙醇，60-125mM氯化钠、氯化钾或氯化锂，0.05-0.3mM EDTA和6-15mM HEPES或Tris。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
纤维素材料的粒径为20微米-250微米，和/或
纤维素材料的RNA载量为2.5-6.25mg/g，和/或
所述纤维素材料在与混合物接触前经预处理，预处理液包含20-35％的有机醇，50-150mM的盐，还任选包含0.01-0.5mM的EDTA和/或1-20mM的HEPES或Tris。
10.一种富集单链RNA的方法，包括：
(1)将权利要求1或2所述的组合物与含单链RNA的样品以体积比1:1混合后与纤维素材料接触，
(2)使用洗脱液从纤维素材料获取含单链RNA的液体，
优选地，
所述含单链RNA的样品是由体内产生并经RNA提取的含单链RNA的样品，和/或
所述含单链RNA的样品是体外生物合成RNA或修饰RNA产生的含单链RNA的样品，和/或
单链RNA的长度为至少200bp，和/或
在步骤(1)之前，含单链RNA的样品不经预纯化处理。
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