NL1002781C1 - Isolatie en/of amplificatie van hepatitis-C-virus-(HCV) -nucleïnezuren uit monsters waarvan vermoed wordt dat zij HCV bevatten. - Google Patents

Description

Titelt Isolatie sn/of amplificatie_£BH_btPftt lfcl>-C~Tigttt- (flCY)_-BuelalMiurêB_ttiS_«OMf g>_¥«ΓΥ«_Υ·ΠΒΡ·β wordt dat die HCV bevatten.

Beschrijving

De uitvinding heeft betrekking op het veld van zuivering en amplificatie van nuclelnezuren vanuit nuclelnezuur bevattende uitgangsmaterialen, in het bijzonder uit biologische materialen 5 als urine, feces, sperma, speeksel, volledig bloed, serum of andere lichaamsvloeistoffen, fracties van dergelijke vloeistoffen zoals leukocyt-fracties (buffy coats [oranje-gele deklagen]), cel-cultures en dergelijke.

Tot voor kort was isolatie en/of zuivering van 10 nuclelnezuren uit complexe mengsels als boven beschreven, een arbeidsintensieve, veel-stappen-werkwijze. In EP 0389063, welke hier als ingelast dient te worden beschouwd, wordt een eenvoudige en snelle zuivering van nuclelnezuurmateriaal uit een complex mengsel geopenbaard. Deze werkwijze omvat behandelen van het 15 complexe mengsel, zoals volledig bloed, met een chaotroop middel in de aanwezigheid van een nuclelnezuur bindend vaste-fase-silica-materiaal bij omstandigheden die binden van al het nuclelnezuurmateriaal aan genoemde vaste fase mogelijk maken, en scheiden van genoemde vaste uit het mengsel. De referentie laat 20 zien dat zowel enkelstrengige als dubbelstrengige nuclelnezuren worden gebonden aan de vaste fase als deze aanwezig is in een mengsel. De referentie openbaart ook amplificatie (PCR) van een bepaald nuclelnezuur met een bekende sequentie, waarvan vermoed wordt dat dit in een mengsel aanwezig is.

1002781 -2-

Dienovereenkomstig onderwijst genoemde referentie een eenvoudige en snelle aantoonwerkwijze voor bekende nucleïnezuren waarvan vermoed wordt dat die in een monster aanwezig zijn.

In veel gevallen hoeft de aard van het doelwit-5 nucleinezuur (dubbelstrengig of enkelstrengig) mogelijk niet van tevoren bekend te zijn of kunnen er veel verschillende doelwitten zijn waarvan het noodzakelijk is dat die worden geanalyseerd. Bij deze gevallen is de snelle, maar nogal ruwe, boven beschreven werkwijze mogelijk niet verfijnd genoeg en kunnen verdere 10 scheidingen van het ruwe materiaal gewenst zijn. Fractionering van mengsels van dubbelstrengige (ds) en enkelstrengige (ss [single-stranded]) nucleïnezuren (NA [nucleic acids]) naar enkel- en dubbelstrengige vormen is vaak nodig, bv. bij de scheiding van gemerkte ss-NA-sondes uit ds-hybriden, bij de scheiding van 15 in-vitro-transcripten uit ds-DNA-afleesstrengen en bij de scheiding van genomisch DNA uit mRNA. In het bijzonder kan het ook nodig zijn bij identificeren van de aanwezigheid van een infectieus agens als HCV, in een monster dat andere (ds) nucleïnezuren bevat. Momenteel kan de scheiding van verschillende 20 soorten nucleïnezuren d.m.v. verscheidene methoden worden bewerkstelligd. Elektroforese kan worden toegepast om verschillende vormen van nucleïnezuren te fractioneren, op grond van verschillen in grootte en vorm. Centrifugeren benut verschillen in dichtheid en recentelijker is de technologie van 25 hoog-vermogen-vloeistofchromatografie [high-performance liquid chromatography] (HPLC) toegepast om enkel- en dubbelstrengige DNA-en RNA-moleculen te scheiden en te zuiveren.

RNA dat uit eukaryotische cellen wordt gezuiverd d.m.v. de momenteel meest wijdverbreid toegepaste werkwijze (1), blijkt 30 aanzienlijke hoeveelheden genomisch DNA te bevatten, een aanpassing die contaminatie van de ss-RNA-fractie met genomisch DNA vermindert, is recentelijk beschreven (2).

Het is niet mogelijk om afzonderlijk naar enkelstrengig en/of dubbelstrengig materiaal te kijken met toepassen van de 1002781 -3- werkwijze van EP 0389063, omdat de werkwijze geen onderscheid maakt tussen de twee. Dienovereenkomstig blijft er een behoeft bestaan aan een eenvoudige en snelle test voor aantonen van de aanwezigheid van enkelstrengig materiaal (afkomstig van een 5 infectieus agens) in een monster dat dubbelstrengig materiaal bevat. Dit is in het bijzonder het geval in het hepatitis-gebied waar er verschillende oorzakelijke agentia en daarmee geassocieerde agentia zijn, welke agentia dubbelstrengig of enkelstrengig, RNA of DNA, kunnen zijn. Deze agentia kunnen alle 10 in één monster aanwezig zijn samen met nuclelnezuurmateriaal van de waard, of deze kunnen aanwezig zijn als enig oorzakelijk agens of in elke combinatie.

Met de ontdekking in 1989 van hepatitis-C-virus (HCV) (5) werd het oorzakelijke agens voor de meeste gevallen van virale 15 niet-A-niet-B- (NANB) -posttransfusie-hepatitis geïdentificeerd en wordt sinds dien intensief onderzocht. Al in 1983 werd gerapporteerd dat een niet-A-niet-hepatitis-virus, dat achteraf gezien waarschijnlijk HCV was, bij chimpansees kon interfereren met het infectieproces van hepatitis-B-virus (HBV) (6-8). Hoewel 20 het aantal experimenteel geïnfecteerde dieren bij deze onderzoeken zeer laag was, suggereerden de resultaten dat expressie van HBV bij de tweeledige infecties werd onderdrukt. De laatste jaren waren er verscheidene rapporten betreffende de uitwerkingen van tweeledige HBV- en HCV-infecties bij mensen. De resultaten van 25 deze onderzoeken wijzen niet altijd in dezelfde richting. Deze variëren van de suggestie van suppressie van HCV-replicatie via gelijktijdige HBV-infectie (9), de samen optredende replicatie van beide virussen (10), tot de suppressie en zelfs usurpatie van HBV, in termen van expressie en replicatie, door HCV (11-17). 30 Hepatitis-delta-virus (HDV) werd aanvankelijk beschreven als een subviraal agens dat voor vermeerdering op HBV steunt (18) en HBV-replicatie effectief kan onderdrukken (19). Het laatste onderzoek werd gedaan toen tests voor HCV nog moesten worden ontwikkeld. De laatste jaren werd het duidelijk dat de replicatie van het HDV- 1002781 -4- genoom van HBV onafhankelijk is, behalve dat voor transmissie mede-infecteren van HBV belangrijk is. (20-22) . De prevalenties van HBV- en HCV-infecties zijn in Egypte zeer hoog. Zover wij weten, zijn er geen gegevens betreffende de prevalentie van HDV in 5 de Egyptische populatie. Wij redeneerden dat, als wij in staat zouden zijn serums afkomstig van Egyptenaren met een leverziekte te analyseren, wij een redelijk hoog aandeel van tweeledige infecties en mogelijk enige drieledige infecties zouden kunnen aantreffen, wat het ons mogelijk zou maken een aantal aspecten van 10 de in-vivo-interacties te onderzoeken. Het enige criterium dat wij toepasten om patiënten als zijnde leidend aan een leverziekte op te vatten, was een alanine-aminotransferase- (ALT-) -serumwaarde gelijk aan of hoger dan 45 E./L. Wij hebben 48 serums getest op de aanwezigheid van virale HBV-, HDV-, HCV-antigenen en/of 15 -antilicharoen d.m.v. serologische tests en de aanwezigheid van HBV-, HDV-, HCV-genomen d.m.v. reverse transcriptase (R.T.) en polymerase-ketting-[chain]-reactie (PCR).

De onderhavige uitvinding verschaft dienovereenkomstig een werkwijze voor scheiden van veroorzakende agentia van hepatitis, 20 van elkaar en van waardmateriaal d.m.v. toepassen van differentiële bindingseigenschappen van enkelstrengige en dubbelstrengige materialen, aan een vaste drager bij verschillende omstandigheden. In het bijzonder verschaft de uitvinding een werkwijze voor scheiden van HCV-RNA uit een monster waarvan 25 vermoed wordt dat dit genoemd RNA bevat, welke in contact brengen van genoemd monster met een eerste vloeistof die een chaotroop middel en een nucleinezuur bindende vaste fase omvat, waarbij de eerste vloeistof een samenstelling heeft zodanig dat het dubbelstrengige nucleinezuur aan de vaste fase bindt en een 30 aanzienlijke hoeveelheid enkelstrengig nucleinezuur niet, en scheiden van de vaste fase uit het supernatant omvat. Bij deze uitvoeringsvorm zal het enkelstrengige HCV-nucleinezuurmateriaal aanwezig zijn in het supernatant waar dit rechtstreeks kan worden aangetoond of verder gezuiverd of geamplificeerd kan worden .

1002781 -5-

Geschikte omstandigheden om te komen tot een scheiding van dubbelstrengige nuclelnezuren uit het enkelstrengige HCV-materiaal, kunnen door de deskundige van het vakgebied worden vastgesteld.

5 Omstandigheden waarbij dubbelstrengig materiaal aan het vaste materiaal bindt en enkelstrengig materiaal niet, zullen wisselen, belangrijke parameters voor verkrijgen van dergelijk differentieel binden zijn echter de concentratie van het chaotrope middel, welke ruwweg tussen 1-10 M moet zijn, bij voorkeur tussen 10 3-6 M en in het bijzonder rond 5 M; de concentratie van het cheleermiddel, welke in het geval dat EDTA wordt toegepast, gelijk of hoger dan 10 mM en bij voorkeur niet hoger dan 1 M moet zijn; de pH van de waterige oplossing waarin de scheiding wordt uitgevoerd, moet boven 2 zijn als een thiocyanaat wordt toegepast 15 als chaotroop middel en moet onder 10 zijn omdat er anders een risico is dat het ds materiaal ss wordt. De temperatuur waarbij de werkwijze wordt uitgevoerd, lijkt niet-kritisch, het is echter waarschijnlijk het beste om deze tussen 4*C en 60'C te houden. Belangrijk bij de werkwijze is natuurlijk dat het ds materiaal 20 dubbelstrengig blijft tijdens de scheiding. Bij de omstandigheden zoals hierboven geopenbaard, zal dit gewoonlijk het geval zijn als het ds nuclelnezuur ten minst 50 bp lang en met 40% GC-basenparen is. De deskundige van het vakgebied weet hoe deze lengte kan variëren met lagere of hogere GC-inhoud. In Van Ness e.a. (3) 25 en/of Thompson e.a. (4) wordt aangetoond dat de hele werkwijze afhankelijk is van ingewikkelde interacties tussen o.a. de bovengenoemde factoren. Met toepassen van deze openbaring en de aangehaalde referenties zal de deskundige van het vakgebied in staat zijn de omstandigheden aan zijn of haar bijzondere werkwijze 30 aan te passen.

Chaotrope middelen zijn zeer belangrijk bij onderhavige uitvinding. Deze worden gedefinieerd als ieder materiaal dat de secundaire, tertiaire en/of quaternaire structuur van nuclelnezuren kan veranderen. Deze dienen geen belangrijk effect 1002781 -6- op de primaire structuur van het nucleinezuur te hebben. Als nucleïnezuren geassocieerd met andere moleculen aanwezig zijn, zoals eiwitten, kunnen deze associaties ook door dezelfde of andere chaotrope middelen worden veranderd. Veel chaotrope 5 middelen zijn geschikt voor toepassing bij de onderhavige uitvinding, zoals natriumjodide, kaliumjodide, natrium(iso)-thiocyanaat, ureum of guanidinezouten, of combinaties daarvan. Een voorkeursklasse van chaotrope middelen volgens de uitvinding zijn guanidinezouten, waarvan guanidinethiocyanaat de grootste voorkeur 10 heeft.

Door geneigdheid tot toevalstreffers vonden wij dat ss-nucleinezuren en dienovereenkomstig HCV-nucleïnezuurmateriaal niet aan silicadeeltjes of diatomeeënaarde bond in de aanwezigheid van buffer Lil (zie voorbeelden), terwijl ds-nucleinezuur wel bond. 15 Experimenten met verschillende omstandigheden lieten zien dat toevoeging van Mg2* of andere positieve (tweewaardige) ionen aan de niet-gebonden fractie van groot belang was. De beste resultaten werden verkregen met een concentratie tweewaardig ion (Mg2*) die ongeveer gelijk was aan de concentratie van het cheleermiddel 20 (EDTA).

De toe te passen vaste fase is minder kritisch. Belangrijk is dat deze nucleïnezuren op reversibele wijze dient te binden.

Veel van dergelijke materialen zijn bekend, waarvan een aantal op silicium-basis zijn, zoals aluminiumsilicaat en 25 dergelijke, bij voorkeur silica. Van silica is de bedoeling dat daar Si02-kristallen en andere vormen van siliciumoxyde toe behoren, zoals diatomeeénskeletten, glaspoeder en/of -deeltjes en amorfe siliciumoxyde. De vaste fase kan aanwezig zijn in een willekeurige vorm, deze kan zelfs het vat zijn dat de 30 nucleinezuurmengsels bevat, of een deel van een dergelijk vat.

Deze kan ook een filter of elke andere geschikte structuur zijn. Naast op silicium gebaseerde materialen zijn andere materialen ook geschikt, zoals nitrocellulose (-filters), latexdeeltjes en andere polymere materialen. Een voorkeursvorm van de vast fase is een 1 0 0 21 -7- deeltjesvorm, wat gemakkelijke scheiding mogelijk maakt van gebonden en ongebonden materiaal, bijvoorbeeld d.m.v, centrifugeren. De deeltjesgrootte van de vaste fase is niet kritisch. Geschikte gemiddelde deeltjesgroottes liggen in het 5 bereik vanaf ongeveer 0,05 tot 500 μπ\. Bij voorkeur wordt het bereik zodanig gekozen dat ten minste 80, bij voorkeur 90% van de deeltjes een grootte hebben tussen de net genoemde waarden. Hetzelfde geldt voor de voorkeursbereiken waarvan de gemiddelde deeltjesgroottes tussen 0,1 en 200 μιη, bij voorkeur tussen 1 en 10 200 lim, zijn. De bindingscapaciteit van een bepaald gewicht van de deeltjes neemt toe met afnemende grootte, de benedengrens van de grootte is echter bereikt als deeltjes niet eenvoudig opnieuw kunnen worden gedispergeerd na scheiding via bijvoorbeeld centrifugeren. Dit zal het geval zijn bij uitgangsmateriaal dat 15 rijk is aan nuclelnezuren en dat veel nuclelnezuren van een hoger molecuulgewicht bevat. De deeltjes in de nuclelnezuren kunnen in deze gevallen aggregaties vormen. De deskundige van het vakgebied is in staat de juiste deeltjesgrootte voor de bijzondere voorziene toepassing te kiezen. De vorming van aggregaties kan bij een 20 aantal toepassingen worden vermeden door toepassen van gefractioneerde silica of diatomeeënaarde.

Een verdere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een als hierboven geopenbaarde werkwijze die voorts behandelen van het supernatant dat het enkelstrengige HCV-nuclelnezuur-25 materiaal bevat, met een tweede vloeistof omvat die een chaotroop middel en een tweede nuclelnezuur bindende vaste fase omvat, waarbij de tweede vloeistof een samenstelling heeft zodanig dat het resulterende mengsel van supernatant en tweede vloeistof binden van het enkelstrengige HCV-nuclelnezuurmateriaal aan de 30 tweede vaste fase mogelijk maakt.

Op deze manier wordt het dubbelstrengige nucleinezuur-materiaal in de eerste stap verwijderd uit het ruwe mengsel en wordt het enkelstrengige nuclelnezuur in een andere enkelvoudige stap gezuiverd uit het overgebleven, nog steeds ruwe mengsel.

1 0 0 2 7 8 1 -8-

Zowel het dubbelstrengige materiaal als het enkelstrengige materiaal wordt reversibel gebonden aan de respectieve vaste fasen, zodat deze eenvoudig van genoemde vaste fasen kan worden geêlueerd om verdere analyse of andere behandelingen te ondergaan.

5 Een zeer toepasbare verdere behandeling is de amplificatie van het (dubbelstrengige of enkelstrengige) nucleïnezuurmateriaal.

Beide types kunnen worden geamplificeerd, of beide types kunnen worden omgezet naar elkaar zodat deze kunnen worden geamplificeerd. De onderhavige uitvinding verschaft in nog een 10 uitvoeringsvorm een werkwijze voor amplificeren van enkelstrengig nucleïnezuurmateriaal, welke de stappen omvat van hybridiseren van het enkelstrengige nucleïnezuur met primers [initiators] en verlengen van de sondes met toepassen van een enzym dat nucleotiden toevoegt aan de primer-sequentie met gebruiken van het 15 gehybridiseerde enkelstrengige materiaal als afleesstreng, waardoor ten minste één primer een willekeurig hybridiserende sequentie en een amplificatie-grondvorm omvat.

De criteria voor amplificatie zijn algemeen bekend in de stand van de techniek. De lengte van geschikte primers, geschikte 20 buffers, geschikte smelttemperaturen voor van elkaar losmaken van strengen en geschikte hybridisatieomstandigheden kunnen alle worden vastgesteld met gebruiken van standaard-handboeken van het vakgebied.

Natuurlijk kunnen de sequenties die als voorbeeld worden 25 gebruikt, worden gevarieerd zonder af te wijken van de onderhavige uitvinding. Het is niet zo zeer belangrijk welke sequentie wordt toegepast als een amplif icatie-grondvorm, als deze maar geschikt is voor hybridisatie en primer-verlenging. Geschikte grenzen hangen af van de omstandigheden welke kunnen worden gevarieerd 30 door de deskundige van het vakgebied. Gewoonlijk zijn primers ten minste 10 basen lang en niet veel langer dan 100 basen.

De amplificatie-uitvoeringsvormen van de uitvinding worden geïllustreerd met toepassen van PCR (polymerase-ketenreactie) .

1002781 -9-

Andere amplificatiewerkwijzen zijn natuurlijk gelijkelijk geschikt.

Het als voorbeeld dienende merkmiddel (of etiket) op de primers is DIG (digoxygenine). Andere merkmiddelen zijn echter 5 beschikbaar en algemeen bekend uit de stand van de techniek.

De uitvinding wordt nu met meer detail uitgelegd in de volgende gedetailleerde beschrijving.

Scheiding / Isolatie 10 MATERIALEN EN WERKWIJZEN Bron van nucleinezuren

Serums. Seruromonsters werden verkregen van patiënten die leden aan hepatitis en een algemeen ziekenhuis in Cairo, Egypte, bezochten. Voor dit onderzoek werden alleen serummonsters gekozen 15 met een alanine-aminotransferase- (ALT)-) -waarde die gelijk aan of hoger dan de bovengrens van normaal (45 E./L) was. Selectie van de monsters was willekeurig. Serums afkomstig van 26 mannen, gemiddelde leeftijd: 41 jaar (bereik 22-55); en 22 vrouwen, gemiddelde leeftijd: 42 jaar (bereik 31-52) .

20

Chemicaliën

Guanidinethiocyanaat (GuSCN) werd betrokken van Fluka (Buchs, Zwitserland).

EDTA (Titriplex) en MgC12.6H20) werden betrokken van Merck 25 (Darmstadt, Duitsland). TRIS werd betrokken van Boehringer (Mannheim, Duitsland). De bereiding van op grootte gefractioneerde silica-deeltjes (silica coarse, SC) en diatomeeênsuspensie is beschreven (11). Triton-X-100 was afkomstig van Packard (Packard Instruments Co., Inc., Downers Grove, 111.).

30 1002781 -10-

Samenstelling van buffers

De lysis/bind-buffer L6, wasbuffer L2 en TE (10 mM

Tris.HCl, 1 mM EDTA; pH= 8,0) zijn beschreven (27). 0,2 M EDTA (pH 8,0) werd gemaakt door 37,2 g EDTA (Merck, Duitsland) en 4,4 g 5 NaOH (Merck, Duitsland) in water op te lossen in een totaal volume van 500 ml. Lysis/bind-buffer Lil werd gemaakt door 120 g GuSCN op te lossen in 100 ml 0,2 M EDTA (pH= 8,0). Bindbuffer L10 werd bereid door 120 g GuSCN op te lossen in 100 ml 0,35 M TRIS.HCl (pH 6,4); vervolgens werd 22 ml 0,2 M EDTA (pH 8,0) en 9,1 g 10 Triton-X-100 toegevoegd en werd de oplossing gehomogeniseerd; als laatste werd 11 g vaste MgCl2.6H20 toegevoegd. De eindconcentratie MgCl2 in L10 is ongeveer 0,25 M. L10 is ten minste 1 maand stabiel als deze bij omgevingstemperatuur in het donker wordt bewaard.

15 Fractionering van ds-DNA an sa-DNA d.m.v. voorschrift R.

De werkwijze wordt in Figuur 1 geschetst. Een specimen van 50 μΐ (dat een mengsel van NA-types bevatte in TE) werd toegevoegd aan een mengsel van 900 μΐ Lil en 40 μΐ SC in een Eppendorf-buis en werd vervolgens gehomogeniseerd d.m.v. vortexen. Na 10 min. 20 binden bij kamertemperatuur werd de buis gecentrifugeerd (2 min. bij ongeveer 10.000 X g), wat resulteerde in een silica/ds-NA-neerslag ('eerste silica-neerslag*) en een supernatant dat ss-NA bevatte.

Om ss-NA-vormen terug te winnen (Voorschrift R-sup), werd 25 900 μΐ van het supernatant toegevoegd aan een mengsel van 400 μΐ L10 en 40 μΐ SC en werd ss-NA gebonden tijdens een incubatie van 10 min. bij kamertemperatuur. De buis werd vervolgens gecentrifugeerd (15 sec. bij ongeveer 10.000 x g) en het supernatant werd afgevoerd (d.m.v. afzuigen). Het resulterende 30 neerslag werd vervolgens twee keer gewassen met 1 ml L2, twee keer met 1 ml 70% ethanol (V/V) en één keer met 1 ml aceton. Het silica-neerslag werd gedroogd (10 min. bij 56'C met open deksel in een Eppendorf-verwarmingsblok) en in 50 μΐ TE-buffer geëlueerd 1002781 -11- (10 min. bij 56'C; gesloten deksel). Na centrifugeren (2 min. bij ongeveer 10.000 x g) bevat het supernatant de ss-NA-fractie.

Om ds-NA-vormen terug te winnen (Voorschrift R-neerslag) uit het eerste silica-neerslag, werd het overgebleven supernatant 5 afgevoerd en werd het silica-neerslag twee keer gewassen met Lil om ongebonden ss-NA te verwijderen. Het resulterende silica-neerslag werd vervolgens twee keer gewassen met L2, twee keer met 70% ethanol, één keer met aceton, gedroogd en geëlueerd als boven beschreven. Na centrifugeren (2 min. bij ongeveer 10.000 x g) 10 bevat het supernatant de ds-NA-fractie.

Bij de volledige werkwijze (welke ongeveer één uur in beslag neemt) voor fractioneren van NA d.m.v. voorschrift R, worden slechts twee Eppendorf-buizen gebuikt.

15 Fractionering van genomisch DNA an as-MA

Vanwege invangen van ss-NA in genomisch DNA van hoog molecuulgewicht geeft voorschrift R als boven beschreven, slechts lage opbrengsten ss-NA. Dit kan worden voorkomen door eerst totaal NA te isoleren d.m.v. voorschrift Y/D (27), welk enig breken van 20 het genomische DNA van hoog molecuulgewicht veroorzaakt, voldoende genoeg om invangen van het ss-NA te voorkomen. Dienovereenkomstig gezuiverd totaal NA kan vervolgens worden toegepast als invoer voor voorschrift R.

25 Oel-elaktroforese

Bij alle experimenten werd NA geëlektroforeerd (8 to 10 V/cm) door neutrale agaroseplaat-gelen met ethidiumbromide (1 μg/ml) in het buffersysteem (40 mM TRIS, 20 mM natriumacetaat, 2 mM EDTA, gesteld op pH 7,7 met azijnzuur; ethidiumbromide werd 30 toegevoegd tot een concentratie van 1 μg/ml buffer), beschreven door AAij en Borst (25).

1002781 -12-

Hybridisatie DNA-fragmenten werden overgebracht naar nitrocellulose-filters d.m.v. de werkwijze van Southern en werden gehybridiseerd met met [alfa-32P]dCTP gemerkte pHC624 die werd bereid d.m.v.

5 willekeurig merken (Boehringer, Duitsland). Hybridisatieomstandig-heden waren als eerder beschreven werd(29).

RESULTATEN

Vergelijking van verschillende GuSCN bevattende lysis-10 buffers wat betreft het binden van verschillende NA-types aan silica-deeltjes, onthulde dat alleen dubbelstrengige vormen werden gebonden als Lil (welke wat betreft EDTA ongeveer 100 mM is) als bindbuffer werd toegepast; aan de andere kant werden zowel dubbelstrengige als enkelstrengige vormen gebonden in 15 bindbuffer L6 (die wat betreft EDTA ongeveer 20 mM is) (Tabel 1) . Deze waarnemingen vormden de basis voor de ontwikkeling van een voorschrift (Voorschrift R) voor de fractionering van enkelstrengige nucleïnezuren en dubbelstrengige nucleïnezuren (Fig. 1) .

20 Als dubbelstrengig nucleinezuur in Lil is gebonden door silica-deeltjes, scheidt een kort centrifugeren het silica/ds-NA-neerslag uit het supernatant dat de enkelstrengige vormen bevat. Toevoeging van dit supernatant aan een mengsel van silica-deeltjes en bindbuffer L10 (die wat betreft Mg2* ongeveer 250 mM is), wordt 25 het binden van enkelstrengige nucleïnezuren aan de silica-deeltjes hersteld. Dubbelstrengige en enkelstrengige vormen kunnen vervolgens worden gezuiverd d.m.v. wassen en elueren van de silica-NA-complexen (voorschrift R). Dubbelstrengig nucleinezuur wordt teruggewonnen uit het eerste silica-neerslag (voorschrift R-30 neerslag), terwijl enkelstrengige vormen worden teruggewonnen uit het eerste supernatant (voorschrift R-sup).

Voor optimaliseren van voorschrift R voerden wij her-samenstellingsexperimenten uit waarbij eerder gezuiverde of 1002781 -13- commercieel verkrijgbare nucleinezuren werden gemengd en vervolgens gefractioneerd d.m.v. voorschrift R.

Practionering van een mengeel van dubbeletrenglg DNA en 5 enkeletrenglg DMA.

De fractionering van een ds-DNA/ss-DNA-mengsel, naar dubbelstrengige en enkelstrengige vormen, wordt in Figuur 2 getoond. De terugwinning die vanuit de band-intensiteit van de met ethidiumbromide gekleurde gel werd geschat, voor ss-DNA was 10 ongeveer 50%, de geschatte terugwinning van ds-DNA in het bereik van 500 bp. tot 4,6 kb. was 80%-90% [vergelijkbare terugwinningen werden verkregen voor ds-DNA-fragmenten in het bereik van 100-500 bp. (niet getoond)], grotere fragmenten werden significant gebroken, zoals eerder opgemerkt (27). Op het niveau van aantoning 15 d.m.v. UV-belichting, was fractionering naar ds- en ss-vormen volledig.

Fractionering van een mengeel van dubbeletrenglg RNA en enkeletrenglg RNA.

Figuur 3 toont de fractionering van een mengsel van ds-RNA

20 (menselijk-rotavirus-genoomsegmenten 1-11) en ss-RNA (faag-MS2- RNA) naar dubbelstrengige en enkelstrengige vormen. De geschatte terugwinning van ds-RNA en ss-RNA was ten minste 80%. Op het niveau van aantoning d.m.v. UV-belichting was fractionering naar de- en ss-vormen volledig.

25

Practionering van een mengsel van dubbeletrenglg DNA en enkeletrenglg RNA.

In figuur 4 wordt getoond dat ds-DNA ook efficiënt kan worden gescheiden van ss-RNA.

30 Weer zijn de terugwinningen voor beide fracties ten minste

80%. Vergelijkbare resultaten werden verkregen als E. coli-rRNA

(23S en 16S) werden toegepast als ss-RNA-invoer (niet getoond).

1002781 -14-

Bij de boven beschreven experimenten bleek fractionering van ds- en ss-NA-vormen (zoals beoordeeld d.m.v. visuele controle van band-intensiteiten na kleuren met ethidiumbromide en UV-belichting) volledig te zijn. Om de prestatie van de 5 fractioneringswerkwijze voor een mengsel van ds-DNA en ss-RNA naar ss- en ds-vormen vast te stellen, werd NA dat uit een dergelijk mengsel werd gezuiverd d.m.v. voorschrift R-sup, onderzocht d.m.v. Southern-blotten en hybridisatie met een 3JP-gemerkte DNA-sonde, homoloog aan het ds-DNA dat als invoer voor fractionering werd 10 toegepast. Dit experiment onthulde dat de ss-NA-fractie minder dan 0,1% van de ds-DNA-invoer bevatte (figuur 5).

Practionerlng van aan mangeel van genomiach DNA en ankalatrangig RNA.

Toen wij de scheiding nagingen van (genomisch) ds-DNA van 15 hoog molecuulgewicht en ss-RNA d.m.v. rechtstreekse fractionering met toepassen van £j. coli als invoer voor voorschrift R, bleek het dat de ds-DNA-fractie zwaar was gecontamineerd met rRNA (Fig. 6, banen 6 en 7) en dat ss-RNA-terugwinning zeer laag was (Fig. 6, banen 8 en 9) . Dit was waarschijnlijk vanwege invangen van RNA in 20 (genomisch) ds-DNA van hoog molecuulgewicht op het moment dat silica/NA-complexen werden gevormd. Aan de andere kant werd geen genomisch DNA in de ss-RNA-fractie waargenomen. Totaal nucleinezuur, welk eerst werd geïsoleerd met toepassen van het standaardvoorschrift Y/D (28) en hierna werd toegepast als 25 invoermateriaal bij voorschrift R, vertoonde belangrijk hogere terugwinningen van de ss-RNA-fractie (Fig. 6, banen 2 en 5).

HCV-nucleInezuur-zuiverlag.

HCV-RNA, HDV-RNA en HBV-DNA werden gezuiverd uit serum 30 d.m.v. werkwijzen als hierin beschreven. In het kort: 100 μΐ serum werd toegevoegd aan een Eppendorf-buis van 1,5 ml (Type 3810) die 900 μΐ L6-lysis-buffer (zie hierin) en 20 μΐ van een silica-suspensie bevatte. De buis werd onmiddellijk gevortext. Tijdens 1 0 0 2 7 8 1 -15- een incubatie van 10 min. bij kamertemperatuur kreeg het nucleïnezuur in de specimens de gelegenheid met de silica-gel-deeltjes te complexeren. De buizen werden vervolgens opnieuw gevortext en gecentrifugeerd gedurende 15 s bij 10.000 t.p.m.

5 (24-gats-Hettich-KG-centrifuge), het supernatant werd afgevoerd en de silica-gel-nucleinezuur-complexen werden twee keer gewassen met 1 ml buffer L2 (zie hierin), twee keer met 1 ml 70% (V/V) ethanol en één keer met 1 ml aceton en werden gedroogd bij 56*C (10 min.); de nucleinezuren werden vervolgens geêlueerd bij 56‘C (10 min.) in 10 ofwel 50 1 10 mM Tris.HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5 (TE) voor HCV-aantoning of in 25 μΐ; TE voor HDV- en HBV-aantoning (zie onder).

De bereiding van op grootte gefractioneerde silica, lysis-buffer L6 en wasbuffer L2 wordt in detail beschreven in Boom e.a. (27). In het kort: lysis-buffer L6 werd gemaakt door 120 g GuSCN 15 op te lossen in 100 ml 0,1 M Tris.HCl (pH 6,4) en vervolgens werd 22 ml 0,2 M EDTA (pH 8,0) en 2,6 g Triton-X-100 toegevoegd. Wasbuffer L2 werd gemaakt door 120 g GuSCN op te lossen in 100 ml Tris.HCl (pH 6,4).

20 Amplificaties MATERIALEN EN WERKWIJZEN Chemicaliën en enzymen.

EDTA, KC1, MgCl2.6H20, NaCl en tri-natriumcitraat-dihydraat werden betrokken van Merck (Darmstadt, Duitsland). TRÏS en BSA 25 werden betrokken van Boehringer (Mannheim Duitsland). Triton-X-100 werd betrokken van Packard (Packard Instruments Co., Ine., Downers, 111., U.S.A.). Natriumdodecylsulfaat (SDS) werd betrokken van Serva (Heidelberg, Duitsland).

De dNTP's en dextransulfaat werden betrokken van Pharmacia 30 (Uppsala, Zweden).

De in voorschrift R toegepaste chemicaliën zijn hierin beschreven.

1002781 -16-

Reverse-transcriptase-SuperScript II werd betrokken van Life Technologies (Gaithersburg, Maryland, U.S.A.). DNA-polymerase-Sequenase 2 werd betrokken van Amersham (Verenigd Koninkrijk). Ampli-Taq-DNA-polymerase werd betrokken van Perkin 5 Elmer (Norwalk, U.S.A.). RNA-ase-H werd betrokken van Boehringer (Mannheim, Duitsland). Zalmsperma-DNA werd betrokken van Sigma (St. Louis, U.S.A.).

Samenstelling van buffers en oplossingen.

10 De bereiding van in voorschrift R toegepaste buffers zijn hierin beschreven, behalve dat de lysis-buffer en wasbuffers (L10, Lil en L2) die in voorschrift R toegepast werden voor de isolatie van nucleïnezuren, werden gefiltreerd door een met diatomeeën gestapelde kolom (27) om eventuele endogene nucleïnezuren in de 15 lysis-buffer en wasbuffers te verwijderen.

De 10 X reverse-transcriptiebuffer (CMB1) bestaat uit 100 mM Tris.HCl (pH 8,5), 500 mM KC1 en 1% Triton-X-100.

De 10 X PCR-buffer bestaat uit 500 mM Tris.HCl (pH 8,3), 200 mM KC1 en 1 mg/ml BSA.

20 De elutiebuffer Tris/EDTA (TE, pH 8,0) bestaat uit 10 mM

Tris.HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA (pH 8,0).

Primer· en sondes

De primer die voor reverse transcriptie van HCV-RNA werd 25 toegepast, was HCV-6: 5'ACC.TCC 3' (nt. 319-324, nt.-nummering volgens (23)). De anti-afleesstreng- [anti sense] -PCR-primer voor HCV was RB-6B: 5’ ACT.CGC.MG. CAC.CCT.ATC.AGG 3* (nt. 292-312) en de afleesstreng-PCR-primer was RB-6A: 5' GTG.AGG.AAC.TAC.TGT.CTT.-CAC.G 3' (nt. 47-68). De oligonucleotide RB-6P: 5' TTG.GGT.CGC.- 30 GM.AGG.CCT.TGT.GGT.ACT.G 3' (nt. 264291) werd gemerkt aan het 5- uiteinde met digoxyginine en werd toegepast als een sonde bij hybridisatieexperimenten om de specificiteit van PCR-produkten te bepalen. De HCV-oligo's hadden specificiteit voor het 5'-niet- 1002781 -17- getransleerde gebied van het HCV-genoom. De voor reverse transcriptie van HDV-RNA toegepaste primer was E21: 5' CCT.CGA.GM.CM.GM.GM.GC 3' (nt. 12571238, nt.-nummering volgens (26)) . De voor HDV-PCR toegepaste primers waren E22, de primer die 5 ook werd toegepast voor reverse transcriptie, en E22: 5’ CGG.CTC.GGC.MC.ATT.CCG.AG 31 (nt. 718-737). De plasmide pG4Z(D3) was een gulle gift van John Taylor (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia) en deze bevat 3 volledige cDNA-kopieën van het HDV-genoom achter elkaar, gekloneerd in de Eco-RI-plaats van 10 pGem4Z (Promega). Via digestie van pG4Z(D3) met Bal-II. isolatie van het fragment van 4,4 kb. uit een agarose-gel, ligering en transfectie tot in E. coli C 600, werd plasmide pG4Z(Dl) verkregen die een enkelvoudige cDNA-kopie van het HDV-genoom bevatte. pG4Z(Dl) werd gemerkt met digoxygenine-dUTP d.m.v. willekeurs-15 primer-DNA-bereiding volgens het voorschrift van de frabrikant (Boehringer Mannheim GmbH) en werd toegepast als een sonde bij hybridisatieexperimenten voor vaststellen van de specificiteit van het PCR-produkt. De primers die werden toegepast voor HBV-PCR (core-gebied) waren LBL: 5' GCG.GAT.CCG.TGG.AGT.TAC.TCT.- 20 CGT. 'l'l'l.TGC. 3' (nt. 1939-1960, nt.-nummering volgens (24)), en RAL: 5‘ GCA.AGC. '1-1-1' .CTA.ACA.ACA.GTA.GTT.TCC. GG 31 (nt.

2332-2352); de onderstreepte delen van de primers vertegenwoordigen toegevoegde restrictie-enzym-koppelstukken [-linkers]. De plasmide PCP10 bevat twee volledige kopieën van het HBV-genoom 25 achter elkaar, ingevoegd bij de Eco-Rl-plaats van pBR 322 en was een gulle gift van R. Heytink (Eramus Universiteit, Rotterdam). pHBt-III werd afgeleid van PCP10 d.m.v. Eco-RI-digestie. isolatie van de lineaire vorm van HBV-Eco-RI uit een agarose-gel en ligeren daarvan tot in de met Eco-RI gesplitste hoog-kopie-aantal-plasmide 30 pHC 624 (28). pHBtIII werd gemerkt met digoxygenine-dUTP d.m.v.

willekeurs-primer-DNA-bereiding volgens het voorschrift van de frabrikant (Boehringer Mannheim GmbH) en werd toegepast als een sonde bij hybridisatieexperimenten voor vaststellen van de specificiteit van PCR-produkten.

1002781 -18- R.T.-PCR van HCV.

Reverse transcriptie werd uitgevoerd in een 25-1-reactievolume dat 20 E. RNA-ase-reimner (Promega Biotec, Madison, 5 Wis.) 67 mM Tris.HCl, pH 8,0, 17 mM ammoniumsulfaat, 1 mM

3-mercapto-ethanol, 6 μΜ EDTA, pH 8,0, en 0,2 mg/ml runderseruinalbumine [Bovine Serum Albumine] (BSA) (Boehringer), 6 mM MgC12, 25 ng primer HCV-6, 0,6 μΐ 25 mM (voor elke) aan desoxynucleoside-trifosfaten, 11,5 μΐ van het eluaat van 50 μΐ 10 afkomstig van de nucleïnezuurzuivering (zie boven) en 200 E.

superscript-reverse-transcriptase-I (GIBCO-BRL, Gaithersburg, U.S.A.) bevatte. Het mengsel werd 5 min. bij kamertemperatuur gelncubeerd en vervolgens 60 min. bij 37’C. Reverse transcriptase werd gedenatureerd d.m.v. 5 min. incubatie bij 95'C (29) . De PCR 15 werd uitgevoerd in een volume van 50 μΐ dat 2,5 E. Taq-polymerase (Perkin Elmer Cetus), 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 20 mM KC1, 1,2 mM

MgCl2 en 1 mg/ml BSA), 12,5 μΐ van het R.T.-reactiemengsel, 200 μΜ van elke desoxynucleoside-trifosfaat en 100 ng van elk van primers RB-6A en RB-6B bevatte. Monsters werden 5 min. bij 95'C

20 gedenatureerd en onderworpen aan 35 ronden van temperatuurs- kringloop in een DNA-thermal-cycler (DNA-temperatuurs- kringlooptoestel] (type 480; Perkin Elmer Cetus). Een cyclus bestond uit 1 min. denaturatie bij 95*C, 1 min. renatureren bij 55*C en 2 min. verlenging bij 72'C. Na het kringloop-programma 25 werden de monsters 10 min. bij 72‘C gelncubeerd. Alle monsters die op HCV-RNA werden geanalyseerd d.m.v. de R.T.-PCR, werden in duplo uitgevoerd op verschillende dagen.

R.T.-PCR van HDV en PCR van HBV.

30 HDV-RNA en HBV-DNA werden te samen gezuiverd d.m.v. de boven beschreven werkwijze. Echter wordt HBV-DNA in TE van 56*C in tegenstelling tot HDV-RNA slecht van de silica-deeltjes geèlueerd, naar veronderstelling vanwege mede-zuivering van het eiwit dat 1002781 -19- covalent aan het HBV-DNA-genoom is gebonden. 7 μΐ van het eluaat (25 μΐ) werd uit de buis genomen voor HDV-R.T.-PCR. Aan het overgebleven eluaat en de silica-deeltjes werd 18 μΐ TE dat 200 ng proteïnase-K/ml bevatte, toegevoegd en de buis werd 10 min. bij 5 56*C gelncubeerd. Na 10 min verhitten bij 95‘C om de proteinase te inactiveren, en centrifugeren (1 min. bij 12.000 x g), werd 20 μΐ van het eluaat toegepast voor HBV-PCR.

Natureren van de primer met afleesstreng-HDV-RNA werd uitgevoerd in een mengsel dat 7 μΐ eluaat, 1 ng anti-af leesstreng-10 primer E21, 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 40 mM KC1, 6 mM MgC12, 10 mM dithiothreïtol en 150 μΜ (van elke van de) desoxynucleoside-trifosfaten (dNTP's) bevatte. Na 1 min. verhitten tot 80*C en af koelen tot kamertemperatuur, werd 12 E. AMV-reverse-transcriptase (Boehringer Mannheim GmbH) toegevoegd en werd R.T. 15 uitgevoerd gedurende 1 uur bij 42 "C in een totaal volume van 10 μΐ. Reverse transcriptase werd gedenatureerd d.m.v. 5 min. incubatie bij 95”C (27). PCR werd uitgevoerd in een reactiemengsel van 100 μΐ dat 200 ng primer E21, 200 ng primer E22, 50 mM

Tris.HCl, pH 8,3, 20 mM KC1, 1 mM MgC12, 0,1 mg BSA, 1,5 E. Taq- 20 polymerase, 200 μΜ van elke desoxynucleoside-trifosfaat en 10 μΐ van de R.T.-reactie bevatte. Na 5 min. incubatie bij 95*C werd het monster onderworpen aan 35 cycli amplificatie. Hetzelfde kringloop-programma als voor HCV werd toegepast.

De HBV-PCR werd uitgevoerd in een reactiemengsel van 25 100 μΐ dat 200 ng primer LBL, 200 ng primer RAL, 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 20 mM KC1, 1 mM MgC12, 0,1 mg BSA, 1,5 E. Taq-polymerase, 200 μΜ van elke desoxynucleoside-trifosfaat en 20 μΐ van het eluaat bevatte. Na 5 min. incubatie bij 95'C, werd het monster onderworpen aan 35 cycli amplificatie. Hetzelfde kringloop-30 programma als voor HCV en HDV werd toegepast.

Agarose-gel-elektroforesa en Southern-blotten

Na voltooiing van de amplificatiereacties werd 10 μΐ van elke reactie geanalyseerd d.m.v. elektroforese door horizontale 1002781 -20-

2%-agaroseplaat-gelen in het buffersysteero dat wordt beschreven door AAy en Borst (25) en ethidiumbromide (1 pg/ml) bevat. DNA

werd uit de gel bevat overgebracht tot op nitrocellulosefilter (Bio-Rad, U.S.A.), in essentie als beschreven door Southern 4. Het 5 overgebrachte DNA werd aan de filter vernet d.m.v. incubatie bij 80‘C gedurende 2-3 uur.

Merken en hybridisatie.

De HBV en HDV bevattende plasmiden werden gemerkt met 10 digoxygenine-dUTP d.m.v. willekeurig primen [initiëren] (Boehringer Mannheim GmbH). Nitrocellulosefliters werden voorbehandeld als eerder beschreven (26). Hybridisatie en na-hybridisatie-wassingen waren als eerder beschreven. Aantonen van digoxygenine werd gedaan volgens het voorschrift dat werd 15 verschaft door de frabrikant van de kit (Boehringer Mannheim

GmbH).

Statistiek

Statistische-significantietests werden gedaan met 20 toepassen van de two-tailed-Fisher-exact-test.

RNA-·fleesstreng-bereiding

Om een HCV-RNA-transcriptie-vector te construeren, werden HCV-sequenties vanaf nt. 47 tot 1032 na R.T.-PCR gekloneerd tot in 25 de pSP-64- (poly-A-) -vector (Promega, Madison, Wis.). De aanwezigheid van de juiste insertie werd bevestigd d.m.v. DNA-sequentieanalyse. Het construct kreeg de naam pMOZ.l.HCV.

HCV-afleesstreng-RNA werd in vitro vanaf PMOZ.l.HCV getranscribeerd. In het kort: 5 μg plasmide-DNA werd lineair 30 gemaakt d.m.v. Eco-RI en vervolgens met 50 E. SP6-RNA-polymerase 2 uur bij 37’C gelncubeerd in de aanwezigheid van 500 μΜ (van elke) ribonucleoside-trifosfaat (GTP, ATP, UTP en CTP) , 100 E.

1002781 -21- RNAsin, 10 inM dithiothreïtol, 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgC12, 2 mM spermidine en 10 mM NaCl, in een totaal reactievolume van 100 μΐ. Na de transcriptiereactie werd het DNA-afleesraam afgebroken d.m.v. twee ronden digestie met RNA-ase-loze DNA-ase 5 (Boehringer) gedurende 30 min. bij 37 *C, met 10 E. enzym. Na voltooiing van de digestie werden 2 ronden van extractie met toepassen van fenol-chloroform-isopropyl-alcohol, gevolgd door ethanol-precipitering, gedaan. De HCV-RNA-transcripten, welke een poly-(A)-staart bevatten, werden verder gezuiverd op een oligo-dT-10 cellulose-kolom. De RNA-concentraties werden spectrofotometrisch bepaald d.m.v. UV-A.260. Een deelvolume werd geanalyseerd d.m.v. agarose-gel-elektroforese om de integriteit ervan na te gaan. HDV-RNA werd bereid en, met uitzondering van de oligo-dT-cellulose-selectie, op een vergelijkbare wijze gezuiverd als boven voor HCV-15 RNA beschreven. Met Hin-dlII lineair gemaakte pG4B(Dl) was het substraat voor SP6-RNA-polymerase.

Gevoeligheid van de (R.T.)-PCR-tests.

In vitro bereide HCV- en HDV-RNA's en de met Eco-RI 20 lineair gemaakte HBV-plasmide pHBt-III werden in TE-buffer verdund tot een concentratie van ongeveer 10‘ kopieên/μΐ en bij -20 *C opgeslagen. Seriële tienvoudige verdunningen in H20, van deze moederoplossingen werden net voorafgaand aan de R.T.-PCR- of PCR-reacties gemaakt. Honderd kopieën werden routinematig aangetoond.

25

Southern-hybridisatie en chemiluminescent aantonen

De elektroforese van de PCR-produkten, de overdracht van het DNA tot op positief geladen nylonmembraan (Boehringer Mannheim GmbH) en hybridisatie met de sonde werden als eerder beschreven 30 gedaan. Het aantonen van de gehybridiseerde, met digoxygenine gemerkte sonde werd gedaan met de DIG-Luminescence-Detection-Kit volgens de voorschriften die werden aanbevolen door de leverancier van de kit (Boehringer Mannheim GmbH).

1002781 -22-

VeraelUkand voorb«»ld

De werkwijzen volgens de uitvinding werden vergeleken met commerciële werkwijzen die antilichamen toepassen.

5

Enzym-gekoppelde-immunosorbens-test- [Enzym-Linked Immunosorbent Assay] (ELISA) -kits werden verschaft door Abott Laboratories (Chicago, Ilinois) of Sorin Biomedica (Sallugia, Italië) werden toegepast voor het aantonen van HBsAg, HBeAg, anti-10 HBe, IgG-anti-HBc en IgM-anti-HD. Antilichamen tegen structurele en niet-structurele synthetische HCV-peptiden werden aangetoond met de enzym-immunotest-kit SP-NANBASE-C-96 die werd verschaft door General Biologicals Corp. (Hsin Chu, Taiwan). De aanwezigheid van antilichamen tegen HCV werd ook bepaald met toepassen van een 15 recombinante immunoblot-test (RIBA-3, Chiron Corporation, Emeryville, CA) . Tests werden uitgevoerd volgens de aanwijzingen van de fabrikant. De resultaten worden in tabellen 2-7 gegeven. De serums werden verkregen van de eerder geïdentificeerde groep.

1002781 22a

Figuurbeschrijving:

Figuur 1. Schets van voorschrift R.

Terugwinning van ds-NA vindt plaats vanuit hec eerste neerslag (R-neerslag), terugwinning van ss-NA vindt plaats vanuit het eerste supernatant (R-sup). Lil, L10, L6 en L2 zijn op GuSCN 5 gebaseerde buffers, SC is suspensie van silica-deeltjes. Zie

Materialen & werkwijzen voor details.

Figuur 2. Scheiding van da-DNA en se-ONA

10 NA werd gezuiverd Mn duplo) d.m.v. voorschrift R, uit een mengsel van ds-DNA (faag-lambda, Hia-dlII-digestie, 1 Hg) en ss-DNA (faag-M13-DNA, 500 ng). Uiteindelijke eluties waren in 50 μΐ TE en 25 μΐ werd geëlektroforeerd door een 1%-agarose-gel (met ethidium-bromide) die vervolgens onder UV-belichting werd gefotografeerd. 15 Baan 1: 100%-terugwinningsmerker voor ds-DNA-fragmenten; baan 2: 100%-terugwinningsmerker voor ss-DNA; baan 3: 100%-terugwinnings merker voor mengsel van ds-DNA/ss-DNA. Banen 4 en 5: uitvoer van voorschrift R-neerslag; banen 6 en 7: uitvoer van voorschrift R- sup.

20 Figuur 3. Scheiding van da-RHA en as-RNA

NA werd gezuiverd (in duplo) d.m.v. van voorschrift R, uit een mengsel van ds-RNA (rotavirus-ds-RNA) en ss-RNA (faag-MS2-RNA, 800 ng) . Uiteindelijke eluties waren in 50 μΐ TE en 25 μΐ werd geëlektrof oreerd door een 1%-agarose-gel (met ethidiumbromide) die 25 vervolgens onder UV-belichting werd gefotografeerd. Baan 1: 100%- terugwinningsmerker voor ds-RNA-fragmenten; baan 2: 100%-terug winningsmerker voor ss-RNA; baan 3: 100%-terugwinningsmerker voor ds-RNA/ss-RNA-mengsel. Banen 4 en 5: uitvoer van voorschrift R- neerslag; banen 6 en 7: uitvoer voor voorschrift R-sup.

1002781 22b

Figuur- 4.. Scheiding: vut de—DBA en ss-RNA

NA werd gezuiverd (in duplo) d.m.v. voorschrift R, uit een mengsel van. ds-DNA (750 ng met Hin-dlII gedigereerde faag-lambda) en ss-RNA (faag-MS2-RNA, 800 ng) . Uiteindelijke eluties waren in 50 μΐ en 25 μΐ werd geèlektroforeerd door een 1%-agarose-gel (met 5 ethidiumbromide) die vervolgens onder UV-belichting werd gefotografeerd. Baan 1: 10 0 % - terugwinningsmerker voor ds-DNA; baan 2: 100%-terugwinningsmerker voor ss-RNA; baan 3: 100*- terugwinningsmerker voor ds-DNA/ss -RNA-mengsel. Banen 4 en 5: uitvoer van voorschrift R-neerslag; banen 6 en 7: uitvoer van 10 voorschrift R-sup.

Figuur- 5 . Scheiding van ds-DNA. en ss-RNA

NA werd gezuiverd d.m.v. voorschrift R-sup, uit een mengsel van ds-DNA (1000 ng lineair gemaakte pHC624, 2 kb.) en ss-RNA (faag-15 MS2-RNA, 800 ng) . Uiteindelijke elutie was in 50 μΐ TE en 25 μΐ of tienvoudige serièle verdunningen van de ss-NA-fractie werd geèlektroforeerd door een 1%-agarose-gel (met ethidiumbromide) die vervolgens onder UV-belichting werd gefotografeerd.

Kader A: Bovenrij: baan 1: met Hin-dlII gedigereerd faag-lambda-20 DNA; baan 2: 100%-terugwinningsmerker voor ds-DNA en ss-RNA en serièle tienvoudige verdunningen daarvan (banen 3-6). Onderrij: uitvoer van voorschrift R-sup (baan 2) en tienvoudige seriële verdunningen (banen 3-6) .

Kader B: ds-DNA werd vervolgens overgebracht tot op een 25 nitrocellulosefilter en gehybridiseerd met een 32P-gemerkte sonde homoloog aan invoer-ds-DNA. ds-DNA en ss-RNA worden aangegeven.

1002781 22c

Figuur 6. scheiding van ganoaiach DNA uit sa-RNA

Hoe om te gaan met invangen van ss-RNA. E. -coli-bacteriën werden rechtstreeks toegepast als invoer-materiaal voor in-duplo-extracties d.m.v. voorschrift R (banen 6 en 7: R-neerslag; banen 8 en 9: R-sup). Anderzijds werd totaal NA eerst gezuiverd d.m.v.

5 voorschrift Y met toepassen van diatomeeèn als NA-drager (wat breken van genomisch DNA veroorzaakt). De gezuiverde nucleinezuren werden vervolgens toegepast als invoer voor voorschrift R (banen 2 en 3: R-neerslag; banen 4 en 5: R-sup). Uiteindelijke eluties waren in 50 μΐ TE en 25 μΐ werd geèlektroforeerd door een 1%-10 agarose-gel (met ethidiumbromide) die vervolgens onder UV- belichting werd gefotografeerd.

Merkerbanen 1 en 10 (500 ng faag-lambda-DNA, met Hin-dlII

gedigereerd). 23S- en 26S-rRNA en ds-DNA-molecuulgewichtsmerkers (23 kb. en 2,0 kb.) worden aangegeven.

1002781 -23-

REFERENTIES

1. Chomczynski, P en Sacchi, N. (1989). Anal. Biochem.. 162, 156-159.

2. Siebert, P.D. en Chenchik, A. (1993), Nucleic Acids Res..

5 21, 2019-2020.

3. Van Ness e.a.. Nucleic Acids Research, deel 9, Nr. 19, pag.'s 5143-5151.

4. Thompson e.a. Anal. Biochem.. deel 3, pag.'s 281-291, 1987.

5. Choo, Q.L., Kuo, G., Weiner, A.J. Overby, L.R. Bradley, 10 D.W., Houghton, M., Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 1989; 244: 359-361.

6. Tsiquaye, K.N., Portroann, B., Tovey, G., e.a., Non-A, non-B hepatitis in persistent carriers of hepatitis B virus, «L.

15 Med. Virol.. 1983; 11: 179-189.

7. Bradley, D.W., Maynard, J.E., McCaustland, K.A., Murphy, B.L., Cook, E.H., Ebert, J.W., Non-A, Non-B hepatitis in chimpanzees: interference with acute hepatitis A virus and chronic hepatitis B virus infections., J. Med. Virol.. 1983; 20 11: 207-213.

8. Brotman, B. Prince, A.M., Huima, T. Richardson, L., van den Ende, M.C., Pfeifer, U., Interference between non-A, non-B and hepatitis B virus infection in chimpanzees. J. Med. Virol.. 1983; 11: 191-205.

25 9. Hanley, J.P., Dolan, G., Day, S., Skidmore, S., Irving, W.L., Interaction of hepatitis B and hepatitis C infection in haemophilia, Br. J. Haematol.. 1993; 85: 611-612.

10. Feray, C. Gigou, M. Samuel, D., e.a., Hepatitis C virus RNA and hepatitis B virus DNA in serum and liver of patients 1002781 -24- with fulminant hepatitis. Gastroenterology. 1993; 104: 549- 555.

11. Pontisso, P., Ruvoletto, M.G., Fattovich, G. e.a., Clinical and virological profiles in patients with multiple hepatitis 5 virus infections. Gastroenterology. 1993; 105: 1529-1533.

12. Fong, T.L., Di Bisceglie, A.M., Waggoner, J.G., Banks, S.M., Hoofnagle, J.H., The -significance of antibody to hepatitis C virus in patients with chronic hepatitis B. Heoatologv. 1991; 14: 64-67.

10 13. Fattovich, G., Tagger, A., Brollo, L. e.a., Hepatitis C

virus infection in chronic hepatitis B virus carriers. J. Infect. Dis.. 1991; 163: 400-402.

14. Wu, J.C., Chen, C.L., Hou, M.C., Chen, T.Z., Lee, S.D., Lo, K.J., Multiple viral infection as the most common cause of 15 fulminant and subfulminant viral hepatitis in an area endemic for hepatitis B: Application and limitations of the polymerase chain reaction. Hepatology. 1994; 19: 836-840.

15. Sheu, J.C., Huang, G.T., Shih, L.N., e.a. Hepatitis C en B

viruses in hepatitis B surface antigen-negative 20 hepatocellular carcinoma. Gastroenterology. 1992; 103: 1322- 1327.

16. Liaw, Y.F., Tsai, S.L., Chang, J.J., e.a. Displacement of hepatitis B virus by hepatitis C virus as the cause of continuing chronic hepatitis. Gastroenterology. 1994; 106: 25 1048-1953.

17. Sheen, I.S., Liaw, Y.F., Chu, C.M., Pao, C.C. Role of hepatitis C virus infection in spontaneous hepatitis B surface antigen clearance during chronic hepatitis B virus infection. J. Infect. Pis.. 1992; 165: 831-834.

•002781 -25- 18. Rizzetto, M., Canese, M.G., Arico, S.( e.a.

Immunofluorescence detection of a new antigen-antibody system (delta-antidelta) associated to the hepatitis B virus in the liver and in the serum of HBsAg carriers. Gut. 1977; 5 18; 997-1003.

19. Chen, P.J., Chen, D.S., Chen, C.R., e.a. Delta infection in asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen: low prevalence of activity and effective suppression of hepatitis B virus replication. Hepatology. 1988; 8: 1121- 10 1124.

20. Sureau, C., Guerra, B., Lanford, R.E. Role of the large hepatitis B virus envelope protein in infectivity of the hepatitis delta virion. J. Virol.. 1993 ; 67: 366-372.

21. Kuo, M.Y.P., Chao, M., Taylor, J. Initiation of replication 15 of the human hepatitis delta virus genome from cloned DNA: role of delta antigen. J. Virol.. 1989; 63: 1945-1950.

22. Sureau, C., Taylor, J., Chao, M., Eichberg, J.W., Lanford, R.E. Cloned hepatitis delta virus cDNA is infectious in the chimpanzee. J. Virol.. 1989; 63: 4292-4297.

20 23. Choo, Q.L. Richman, K.H., Han, J.H., e.a. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proe. Natl.-Acad. Sci.·., U.S.A., 1991; 88: 2451-2455.

24. Ono, Y., Onda, H., Sasada, R., Igarashi, K., Sugino, Y., Nishioka, K. The complete nucleotide sequence of the cloned 25 hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw. Nucleic Acids

Res.. 1983; 11: 1747-1757.

25. AAy, C., Borst, P. The gel electrophoresis of DNA. Biochim. Bipphvs. Acta. 1972; 269: 192-200.

1002781 -26-

26. Jeffrys, A.J., Flavell, R.A. A physical map of the DNA

regions flanking the rabbit-globin gene. Cell. 1977; 12: 429-439.

27. Boom, R., Sol, C.J.A., Heytink, R., Wertheim-van Dillen, 5 P.M.E., van der Noordaa, J. Rapid purification of hepatitis B virus DNA from serum. J. Clin. Microbiol.. 1991; 29: 1804-1811.

28. Stowers, D.J., Keim, J.M., Paul, P.S., Lyoo, Y.S., Merion, M., en Benbow, R.M. (1988), J. Chromatoar.. 444, 47-65.

10 1002781

Claims (13)

1. Werkwijze voor scheiden van HCV-RNA uit een monster waarvan vermoed wordt dat dat genoemd RNA bevat, welke in contact 5 brengen van genoemd monster met een eerste vloeistof omvat die een chaotroop middel en een nucleinezuur bindende vaste fase omvat, waarbij de eerste vloeistof een samenstelling heeft zodanig dat dubbelstrengig nucleinezuur aan de vaste fase bindt en een aanzienlijke hoeveelheid enkelstrengig 10 nucleinezuur niet bindt, en scheiden van de vaste fase uit het supernatant.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, welke voorts behandelen van het supernatant omvat dat het enkelstrengige nucleïne- zuurmateriaal bevat, met een tweede vloeistof die een 15 chaotroop middel en een tweede nucleinezuur-bindende vaste fase omvat, waarbij de tweede vloeistof een samenstelling heeft zodanig dat het resulterende mengsel van supernatant en tweede vloeistof binden mogelijk maakt van het enkelstrengige nuclelnezuurmateriaal aan de tweede vaste 20 fase.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de eerste vloeistof ten minste 100 mM EDTA omvat en welke een guanidinezout, bij voorkeur guanidinethiocyanaat, als een chaotroop middel omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, waarbij een vaste fase op silicium wordt gebaseerd.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij een vaste fase silica is. 1002781 -28-

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de silica de vorm heeft van deeltjes die een grootte hebben tussen 0,05 en 500, bijvoorkeur tussen 0,1 en 200 μκι.

7. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarbij 5 de vaste fase wordt gescheiden uit het supernatant d.m.v. centrifugeren.

8. Werkwijze voor amplificeren van HCV-nucleïnezuurmateriaal, welke de stappen omvat van hybridiseren van het enkelstrengige nuclelnezuur met primers en verlengen van de 10 sondes met toepasen van een enzym dat nucleotiden toevoegt aan de primer-sequent ie met gebruiken van het gehybridiseerde enkelstrengige materiaal als een aflees-sraaro, waarbij ten minste één primer een willekeurig hybridiserende sequentie en een amplificatie-grondvorm 15 omvat.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij ten minste één primer die een willekeurig hybridiserende sequentie en een amplificatiesequentie omvat, voorts een merkmiddel omvat.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, waarbij ten minste één 20 primer die een willekeurig hybridiserende sequentie en een amplificatie-grondvorm omvat, voorts een rechtstreeks-sequentie-bepaal-grondvorm omvat.

11. Werkwijze voor isoleren en amplificeren van HCV-nuclelne-zuurmateriaal dat van oorsprong aanwezig is in een mengsel 25 van nuclelnezuren, welke onderwerpen van het mengsel omvat aan een werkwijze volgens één van conclusies 1-6 gevolgd door onderwerpen van het geïsoleerde materiaal aan een werkwijze volgens één van conclusies 8-10.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarbij het HCV-nuclelnezuur 30 materiaal wordt omgezet naar cDNA. 1002781 -29-

13. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, welke een gel-elektroforese-stap omvat. Ié. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies die wordt gevolgd door een sequentie-bepaal-stap. 1002781