JPH01135792A - 核酸の分離・精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸の分離・精製方法に関し、より詳しくは液
体クロマトグラフィーによる核酸の分離・精製方法に関
するものである。

〔従来の技術〕

生化学分野の発展は近年めざましいものがあるが、特に
、遺伝子工学の分野においては核酸をより短時間に、か
つ安価に分離・精製する方法が強く望まれている。

核酸の分離・精製方法としては古くから種々の方法が用
いられている。これらの方法の中で密度勾配遠心法（以
下「超遠心法」と略称する）と液体クロマトグラフィー
を使用する方法が良く知られている。

この２つの方法のうち超遠心法は、例えばプラスミドＯ
Ｎへの分離・精製やＯＮへの１本鎖と２本鎖の分離など
に用いられ、核酸６分離・精製手段としてよく知られた
方法である。

この超遠心法とは各成分の僅かな密度差を利用して、上
記それぞれの成分を分離するものであるが次のような問
題点を有している。

即ち、この方法は超遠心機を使用して飲方ｒｐｍという
超高速回転で数十時間、場合によって異なるが少ない場
合で２０時間という長時間の処理を必要とする。しかも
、上記超遠心機は非常に高価であり、かつ生化学分野お
いても汎用性に乏しいので、この超遠心機は利用頻度が
少なく一層高値なものとならざるを得ない。

またこの方法は、塩化セシウムやエチジムブロマイドな
どの高価でしかも人体に対して強い毒性を有する薬品を
用いる必要がある。

即ち上述のように超遠心法による核酸の分離・精製は長
時間を要し、そのコストも高くまた安全衛生面で問題を
有していた。

一方、液体クロマトグラフィーによる分離・精製方法も
一般的によく知られており、カラム充填材としてはヒド
ロキシアパタイトやＢＮＯ−セルロース（Ｂｅｎｚｏｙ
ｌａｔｅｄ−Ｎａｐｈｔｈｏｙｌａｔｅｄ　ＤＥＡＲ−
セルロース）などが核酸の分離・精製用に使われている
。

この液体クロマトグラフィーによる分離・精製方法は生
化学分野では古くから一般的に用いられており、操作時
間も特に高速液体クロマトグラフィーを用いれば数十分
程度で完了する。また使用する溶離液もリン酸塩や食塩
を含む水溶液であり、特に高価でしかも毒性の強い物質
を扱う必要がない。

従って、超遠心法に比べると液体クロマトグラフィーを
使用する方法は、はるかに短時間で、安価にかつ安全に
核酸を分離・精製することができ、しかも大量の試料の
取扱いにも比較的に容易に対応できるという利点がある
。

しかしながら従来より行われている液体クロマトグラフ
ィーを使用する方法は、上述のようにリン酸塩や食塩な
どの無機塩を含有する水溶液を溶離液として用いるため
、分離・精製後の核酸は無機塩との混合溶液として得ら
れる。このようにして分離・精製した核酸を利用すると
混入している無機塩が種々の障害を与えるので、従って
、この無機塩を透析法によって除去する必要がある。し
かしこの透析操作は通常１〜２日程度と比較的長時間を
要するという問題がある。

従って液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマト
グラフィーによる分離・精製自体は比較的に短時間で完
了するが、それに引き続いて必要な脱塩透析までの時間
を考慮すると分離・精製には長時間を要することとなる
。

上述のように核酸の分離・精製には上記２つのいづれの
方法によっても長時間を必要とするという問題がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等はかかる状況に鑑み、液体クロマトグラフィ
ーを使用して核酸を分離・精製する方法の改良について
種々検討を重ねた結果、液体クロマトグラフィーのカラ
ムの充填材としてヒドロキシアパタイトを使用し、かつ
溶離液に炭酸のアンモニウム塩水溶液を用いれば、短時
間でしかも安価で安全に核酸を分離・精製出来ることを
見出し本発明を完成するに至ったものである。

即ち本発明はカラム充填材としてヒドロキシアパタイト
を使用し、かつ溶離液として炭酸のアンモニウム塩水溶
液を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーに
よる核酸の分離・精製方法を提供するものである。

本発明の詳細な説明する。

ヒドロキシアパタイトとは理論式として下記（１）式で
示される化合物であり、Ｃａ／Ｐ　：原子比は理論的に
は１Ｇ／６−１．６７であるが実際にはこの値と合致す
るとは限らず、−船釣には１．３〜１．９程度の範囲の
組成のもが知られている。

Ｃａ＋ｅ（ＰＯａ）ｈ（ＯＨ）ｚ　−−−−−−−（１
）またＣａのサイトには他の金属原子、例えばＳｒ。

Ｂａ、　Ｐｂ、　Ｃｄ、　Ｎａ、に、ＡＩなどで置換さ
れることもある。さらに、（ＰＯ４）サイトにはＳＯ４
、Ａ３０４、ＶＯ４、ＣＯｚなどの酸根が、また（０■
）サイトにはＦ　、　ＣＩ、ＣＯｌ、などの陰イオン原
子（団）が置きかわることがある。従って、ヒドロキシ
アパタイトは、その合成条件や履歴によってその成分や
組成が種々異なる化合物群である。

本発明に用いられるヒドロキシアパタイトとは上記の化
合物群全てを含むものであり、そのいずれのヒドロキシ
アパタイトを用いても本発明では差し支えない。

また、本発明ではヒドロキシアパタイトは前記（１）式
における（ＰＯ４）サイトまたは／および（０１１）サ
イトの一部がＣＯ３に置きかわっている、いわゆるカー
ボネートアパタイトを用いると、クロマトグラフィーの
充填材としてより耐久性が良いので好ましい。

本発明においては溶離液として炭酸のアンモニウム塩水
溶液を使用する必要があるが、この水溶液は通常２　ｍ
Ｍ〜２Ｍの範囲の濃度（ＰＲ値として４〜１０の範囲）
で使用される。炭酸のアンモニウム塩は、その中でも炭
酸水素アンモニウムまたはカルバミン酸アンモニウムが
後述する理由で特に好ましい。

ここで液体クロマトグラフィーによる分離・精製方法に
ついてその概略を説明する。

液体クロマトグラフィーとは、周知のようにカラムと呼
ばれる円筒管内に充填材（吸着材）を詰めたものを用意
し、この充填カラム内にサンプル（分離・精製対象物）
に適した溶離液を連続的に通液する。しかる後溶離液流
中に各種成分の混合物よりなるサンプルを注入するとカ
ラム内ではサンプル中の各成分は移動速度が異なるので
、液体クロマトグラフィーを使用すればこの移動速度の
差を利用して各成分を成分ごとに分Ａ１１（分取）・精
製することができるのである。

尚、液体クロマトグラフィーにより分取された精製フラ
クシヨン（核酸の水溶液）は、これにアルコールを加え
ることにより核酸を沈殿させ分離する方法が一般的に行
われているが、精製フラクション中に無機塩が存在して
いるとこの無機塩も共に沈殿する。従って精製フラクシ
ョンは、上記アルコール添加に先立って無機塩を除くた
めの脱塩操作が必要である。

本発明においては、カラムの充填材にヒドロキシアパタ
イトを使用することを必須要件とするものであるが、液
体クロマトグラフィーそのものには特に限定はない、即
ち、古くから用いられているもので、ガラスカラムに充
填材を結め、このカラムに溶離液を水頭圧差またはペリ
スフリックポンプを用いるなどして、低圧で通液する簡
便な方法や、高圧ポンプと耐圧性のカラムを組み合わせ
て用いる高速液体クロマトグラフィーなど、いずれの装
置でも好適に使用可能である。もちろん、分取・精製の
迅速性および精密さの点から高速液体クロマトグラフィ
ーを用いることが特に好ましい。

また本発明では溶離液として炭酸のアンモニウム塩水溶
液を使用することを必須要件とする。

この炭酸のアンモニウム塩は揮発性塩である。即ち減圧
または／および数十゛Ｃ程度の加温によりアンモニヤと
炭酸ガスに分解する。

従って溶離液として炭酸のアンモニウム塩を使用して核
酸の分離・精製を行う際に、従来の方法の如く透析法を
採用する必要はなく、精製フラクションを減圧または／
および上記程度の温度に加温すれば炭酸のアンモニウム
塩はアンモニヤ及び炭酸ガスとして短時間に揮散除去さ
せることができるのである。

更に、炭酸のアンモニウム塩の中でも、炭酸水素アンモ
ニウムまたはカルバミン酸アンモニウムはアルコールに
対して溶解度が大きいので特に好ましい、その理由は仮
に脱塩操作が不充分であっても、アルコールを加えて核
酸を沈殿させる次の操作で、残存する炭酸水素アンモニ
ウムまたはカルバミン酸アンモンはアルコールに溶存し
沈殿することがないからである。

本発明においては、上記の通り、カラムに溶離液として
炭酸のアンモニウム塩水溶液を通液して核酸の分離・精
製を行うものであるが、この際の溶離液は最初水とし、
通液が進むに従って、漸次炭酸のアンモニウム塩の濃度
を上昇させるのが、核酸をより良好に分離出来るので好
ましい。

本発明の核酸の分離・精製方法は、プラスミドＤＮ＾、
ファージＤＮＡ　、染色体ＤＮＡ　、ＤＮＡ　、ファー
ジＲＮＡなとその分子量や、また開環状、閉環状などの
分子形状に制約されることなく、あらゆる核酸の分離・
精製に好適に適用することができるのである。

本発明では溶離液として炭酸のアンモニウム塩水溶液を
使用するものであるが、この炭酸のアンモニウム塩水溶
液は従来使用されてきたリン酸塩水溶液と比べ溶離力が
弱い、しかし、核酸に対して比較的吸着力のマイルドな
ヒドロキシアパタイトをカラムの充填材として使用して
いるので、この２つの組合せにより核酸の分離・精製に
好結果が得られるものと考えられる。

更に付言するならば、本発明ではカラムの充填材として
ヒドロキシアパタイトを使用しているので、分離前の核
酸のサンプルをリン酸塩などの無機塩水溶液で溶解させ
たものであっても脱塩を行う必要はなく、そのままカラ
ムに通液して核酸の分離・精製を行うことができるとい
う大きな利点がある。これは次の理由によるものと考え
られる即ち（１）ヒドロキシアパタイトを充填材として
使用した場合は、他の充填材と異なり無機塩の混入がカ
ラム内における核酸の溶出に妨害を及ぼさない、（２）
ヒドロキシアパタイトには無機塩類が保持されることな
く、サンプル中に混入している無機塩はボイドボリュー
ム付近で溶出される。従って精製フラクシッンには無機
塩の混入はない。

（実施例〕 以下本発明を実施例に基づき更に具体的に説明する。

実施例１ 子牛胸腺ＤＮ＾（米国シグマ社、　Ｎｏ　Ｄ−１５０１
，ＴＶｐｅ−■）を、１０ｗＭリン酸カリウム緩衝液で
０．４５■／ｄの濃度に溶解した。更にこの溶液とこの
溶液を加熱・急冷して熱変性させたものの等型温合物、
即ち２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＤＮＡの等型温合物を調整し
、以下の実験の試料に供した。

即ち、カラムとしてヒドロキシアパタイト充填カラム（
内径７，６φ、長さ１００ｍｎ＋）および溶離液として
炭酸水素アンモニウム水溶液を使用し、高速液体クロマ
トグラフィー（以下ＨＰＬＣ装置と略記する）を用いて
核酸の分離・着装実験を行った。

その結果は第１図に示すように、１本鎖ＤＮＡおよび２
本ｔｌ　Ｄ　Ｎ　Ａがそれぞれ完全に分離されていた。

尚、上記実験に使用した機器および操作条件の詳細は以
下に示す通りであった。

カラム：　ＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ＾−７６１０＋　Ｐ−
４００１（三井東圧化学■製） ）ＩＰＬＣ装置：■島津製作所製　ＬＣ−６Ａ型検出器
　：　ＵＶ　２６０ｒｖ　Ｏ，６４＾ＵＦＳ溶離液　：
炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ７，８）０〜０．１
５ｈｉｎ、　　５００　ｍＭｏ、１〜５　ｍｉｎ、　１
０００　ｍＭ５〜１５　　ｌｌ１ｉｎ、　１５００　ｍ
Ｍステップグラジェント 流速　　：　１．Ｏｄ／■ｉｎ。

温度　　：室温 チャートスピード：　　５ｍｍ／ｌ１ｉｎ。

試料　　＝２０Ｏｔｔｌ 上記クロマトグラフィー操作で得られた１本鎖ＤＮＡお
よび２本１１ＤＮＡのそれぞれのフラクシッンを分取し
、それぞれ圧力１００ｍｍＨｇ　ａｂｓ、　＋　　温度
４０°Ｃの条件下で１０分間減圧処理して炭酸水素アン
モニウムを揮発させた９次に減圧処理したこのＤＮＡ水
溶液にエタノールを加え、高純度の１本鎖および２本鎖
の各ＤＮＡを沈殿として回収した。

尚、炭酸水素アンモニウムを溶離液として用いる場合に
は、上記の減圧操作を省略して、分取したフラクシテン
に直接エタノールを加え核酸を沈殿させても差し支えな
いことを本発明者等は確認している。

実施例２ プラスミドｆｌＮＡを増殖させた大腸菌を集菌し、これ
をアルカリ−３ＤＳ法により溶菌および除クンバク処理
し、プラスミドＤＮＡ（ｐｕｃ　１９）、　ＲＮ＾、ク
ロモシームＤＮＡを主として含む試料を調整しこれを試
料とした。

上記試料について、実施例１と同様にヒドロキシアパタ
イト充填カラム、炭酸水素アンモニウムの組合わせによ
り、ＨＰＬＣ装置を用いて核酸の分離実験を行った。

その結果は第２図に示すように、プラスミドＤＮＡがＲ
ＮＡ等の夾雑物ときれいに分離されており、また、閉環
状プラスミドＤＮＡと開環状プラスミドＤＮＡもそれぞ
れに分離されていた。

尚、上記分離実験に用いた機器および操作条件の詳細は
以下の通りであった。

カラム：　ＩＩＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ＾−７６１０＋Ｐ−
４００１（三井東圧化学■製） ＨＰＬＣ装Ｗ１．：日本分光工業■製 ＴＲＩ−ＲＯＴＡＲＶｌ型 検出器　：　ＵＶ　２６Ｏｎ＋＊　０．６４ＡＵＰＳ溶
離液　：炭酸水素アンモニウム水溶液（ｐＨ７，８）０
〜１０　ｗｉｎ、　　９００　ｍＭ １０〜１５　ｓｉｎ、１０００　ｍＭ １５〜２０　ｗｉｎ、１１００　　ｍＭ２Ｏ〜２５１１
ｉｎ、　　１５００　＋ｍＭステップグラジェント 流速　　：　１．Ｏｍ／＋ｉｎ。

温度　　：室温 チャートスピード：　　５ｍｍ／＋ｉｎ。

試料　　：ｚｏｏｔＩｘ 上記クロマトグラフィー操作にて得られた閉環状プラス
ミドＤＮＡの精製フラクションを分取し、これにエタノ
ールを加え、閉環状プラスミドＤＮＡの精製品を沈殿と
して得た。

尚、上記閉環状プラスミドＤＮＡの精製品は、制限酵素
（Ｈｉｎｄ　ＩＩ）により１ケ所で切断されることが確
認された。従って、本発明技術により精製したプラスミ
ドＤＮＡは、形質転換にも用いることが出来る。

比較例１ 実施例１で用いたものと同じ１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮ
Ａの等型温合物を試料として用いて、ヒドロキシアパタ
イト充填カラムと溶離液としてリン酸カリウム緩衝液の
組合せにより、ＨＰＬＣ装置により核酸の分離・精製実
験を行った。その結果を第３図に示した。

尚、上記実験に用いた機器および操作条件の詳細は以下
の通りであった。

カラム：　ＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ　Ａ−７６１０＋Ｐ−
４００１（三井東圧化学■製） ＨＰＬＣ装置：■島津製作所製　ＬＣ−６Ａ型検出器　
：　ＵＶ　２６０ｎ＋ｇ　０．３２ＡＵＦＳ溶離液　ニ
リン酸カルシウムウム緩衝液（ｐＨ６，８）〜Ｏｍｔｎ
、　１００　ｍＭ Ｏ〜５　ｓｉｎ、　２００　ｍＭ ５〜１５　ｌｌ１ｉｎ、　３００　ｓＭステップグラジ
ェント 流速　　：　１．ＯＩｄｌ／＋＊ｉｎ。

温度　　：室温 チャートスピード：　　５ｎｎ／＋ｓｉｎ。

試料　　：２００μ！ 上記クロマトグラフィー操作にて、１本鎖ＤＮＡ、２本
ｔｉＯＮへのそれぞれのフラクションを分取した。この
分取液を脱塩透析してリン酸分を除去した後、エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈殿させて回収した。

尚、脱塩透析操作は以下の如くであり、脱塩に長時間を
要した。

即ち０．２Ｍ　ＮａＣ１、ＴＥ温溶液１ｍＭトリス−塩
酸緩衝液　０．１　　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液、ｐＨ８，０
）に対して２時間の透析を２回さらに１日の透析を２回
行った比較例２ 実施例２で調整し、液体クロマトグラフィーの試料に供
したものと同じ試料を使用し、塩化セシウム平衡密度勾
配遠心法（超遠心法）により核酸の分離・精製を行った
。操作方法は以下の通りである。

即ち、遠心管の中に常法に従い試料、塩化セシウム、エ
チジムブロマイド等を注入し、これを回転数４０．００
Ｏｒｐｍ　、温度１８°Ｃで４０時間にわたり超遠心機
（米国Ｂｅｃｌｖａｎ社製）にかけ、各成分ごとに層分
離させた０次に、この超遠心によって分離したバンドよ
り閉環状プラスミドＤＮＡに相当する部分を取り出し、
これをイソプロピルアルコール飽和水飽和塩化セシウム
溶液にて抽出を３回繰り返し、エチジムブロマイドを除
去した。これを更にＴＥ温溶液対して透析を２回（各２
時間）行い、得られた溶液にエタノールを加えて閉環状
プラスミドＤＮＡを沈殿として回収した。

（発明の効果） 以上詳細に説明した通り、本発明は液体クロマトグラフ
ィーを用いての核酸の分離・精製方法であるが、本発明
ではカラム充填材としてヒドロキシアパタイトを、溶離
液として炭酸のアンモニウム塩水溶液を使用するという
ものである。

本発明の方法に従えば、核酸の精製フラクション中には
核酸と共に炭酸のアンモニウム塩が溶解して存在するが
、この炭酸のアンモニウム塩は減圧または／および数十
゛Ｃ程度の加熱によってアンモニヤと炭酸ガスに分解す
るので、これにより簡単にまた短時間で連敗除去するこ
とができる。

従来の方法は溶離液としてリン酸や食塩などのような不
揮発性塩の水溶液を使用しているので、脱塩に数十時間
にわたる長時間でかつ煩雑な透析法を採用せざるを得な
かったのに対し、本発明の方法は核酸の分離・精製に要
する時間が格段に短縮されるのである。

また、本発明の方法による核酸の分離・精製能力は、従
来の方法、即ち溶離液としてリン酸塩水溶液などを用い
た場合のそれと比較して、全（退色のないものであるこ
とは実施例１と比較例１より明らかである０本発明では
、核酸の精製フラクション中に含まれている炭酸アンモ
ニウム塩を減圧または／および加温することによって、
アンモニアガスと炭酸ガスに分解してこれを揮散除去す
るものであるが、この揮散操作を行っても、物理的に不
安定な核酸に何らの損傷を与えることはない、このこと
は実施例２で示したように、本発明の方法を用いて得ら
れた閉環状プラスミドＯＮ＾は、制限酵素によって１ケ
所のみ切断されたとし１う事実からも明らかである。

以上詳細に述べた如く、本発明の方法を用いて核酸を分
離・精製した場合、従来技術による分離・精製方法、即
ち超遠心法および溶離液として不揮発性塩を使用した液
体クロマトグラフィー法のいずれかの場合と比較しても
非常に単時間に精製・分離を完了することができる。し
かも精製・分離後の核酸の純度も従来技術により精製さ
れたものと同等またはそれ以上であり、また、物理的に
不安定な核酸を損傷する心配もない、従って本発明は遺
伝子工学などのバイオテクノロジーの進歩に多大の貢献
をするものと確信するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図はそれぞれ実施例１、実施例
２及び比較例１で行った核酸の分離状況を示すクロマト
グラフ図である。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 図面 第１図 時　間（分） 第２図 １１、−ａ′ｔ′（ＲＮＡ） 時　間（分） 第３図 時　間（分） 手続争甫正書（自発） 昭和６３年１２月１４日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２９３２６７号 ２、発明の名称 核酸の分離・精製方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号４、補正に
より増加する発明の数　　零５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （す明細書第２頁第１５行目に「かつ生化学分野お（２
）明細書第１３頁第１行目、第１５頁第４行目及び第１
６頁第１５行目に「ステップグラジェント」とあるのを
ｒ段階的溶出」と訂正する。 （３）明細書第１３頁第８行目に「圧力１００ｍｍＨｇ
　ａｂｓ。 、」とあるのを「圧力１００　Ｔｏｒｒ、　Ｊと訂正す
る。 （４）明細書第１６頁第１１行目に「リン酸カルシウム
緩衝液（ｐＨ６，８）　Ｊとあるのを「リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ６，８）　Ｊと訂正する。 （５）明細書第１７頁第２行目に「リン酸分」とあるの
を「リン酸塩」と訂正する。 （６）明細書第１７頁第７行目に’０．２Ｍ　ＮａＣ１
、Ｊととあるのを削除する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）カラム充填材としてヒドロキシアパタイトを使用
   し、かつ溶離液として炭酸のアンモニウム塩水溶液を使
   用することを特徴とする液体クロマトグラフィーによる
   核酸の分離・精製方法。