BR112019012273A2

BR112019012273A2 - processo para a purificação de antibióticos lipopolipeptídicos de caldos de cultura e usos de uma resina de troca catiônica

Info

Publication number: BR112019012273A2
Application number: BR112019012273A
Authority: BR
Inventors: Roberto Tagliani Auro; Valoti Ermanno; Rossini Mauro
Original assignee: Gnosis Spa
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2019-12-03
Also published as: US20210355160A1; AU2017376192A1; CA3045214A1; MX2019007072A; EP3555114A1; IT201600127655A1; WO2018108896A1; PH12019501183A1; MA47014A

Abstract

a presente invenção refere-se a um processo para a purificação de antibióticos lipopolipeptídeos de caldos de cultura que compreende: a) remoção do micélio do caldo; b) cromatografia de troca aniônica da solução resultante do estágio a), eluindo com íons di ou trivalentes; c) concentração opcional da fração purificada resultante do estágio b); d) cromatografia de interação hidrofóbica da fração resultante do estágio b) ou c), eluindo com álcoois c1-c4; e) cromatografia de troca catiônica da fração enriquecida com lipopolipeptídeos desejada resultante do estágio d), eluindo a um ph igual ou maior do que o ponto isoelétrico do lipopolipeptídeo; f) diálise, concentração e liofilização ou secagem por atomização do lipopolipeptídeo purificado.

Description

PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS LIPOPOLIPEPTÍDICOS DE CALDOS DE CULTURA E USOS DE UMA RESINA DE TROCA CATIÔNICA

CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO [001]. A presente invenção se refere a um processo para a purificação de antibióticos lipopolipeptídeos, em partícula daptomicina e surotomicina, utilizando cromatografias de troca iônica combinadas com cromatografia de adsorção.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO [002]. Daptomicina é um antibiótico utilizado para tratar infecções resistentes a antibióticos.

[003]. Em 1978 (US4,208,403 e Re32,333), os pesquisadores da Eli Lilly desvendaram atividade antibiótica nos caldos de cultura de Streptomyces roseosporus, que produzem uma mistura de polipeptídeos chamada complexo A-21978; esta mistura foi separada em várias frações, uma das quais, chamada fração A-21978C, é particularmente interessante. A referida fração compreende vários compostos ou fatores que diferem em termos da cadeia de ácido graxo ligada ao polipeptideo; o fator CO é um fator menor, e leva a isômeros diferentes com uma cadeia decanoil (US 4,537,717).

[004]. 0 núcleo polipeptídico comum aos fatores de A-21978C foi subsequentemente obtido por biotransformação, e vários derivados foram preparados por síntese a partir daquele núcleo, incluindo o derivado de decanoil, inicialmente chamado de LY146032. Como o derivado de decanoil (obtido puro por semissíntese, mas também um dos isômeros presentes no fator A-21978C0 obtido por fermentação) apresenta a melhor relação entre toxicidade e eficácia, ele foi selecionado para estudos clínicos com o nome de daptomicina (INN).

[005]. Para produção industrial, no entanto, é mais econômico obter o antibiótico por fermentação, administrando o ácido decanóico precursor, conforme descrito na US 4,885,243. Muito embora seja tóxico para o microorganismo, o ácido decanóico permite que se obtenha uma boa quantidade de daptomicina.

[006]. A-21978C10, LY146032 e daptomicina são nomes equivalentes correspondentes ao ingrediente ativo utilizado no tratamento, muito embora o código A21978C0 indique uma mistura de isômeros que têm o mesmo núcleo polipeptídico, mas várias cadeias alquila (incluindo n-decanoil), e não corresponda ao produto

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2/18 farmacêutico.

[007]. A surotomicina (EP2379580B1) é um antibiótico lipopolipeptídico particularmente útil em infecções por Clostridium difficile. É obtida pela semissíntese da daptomicina, depois da remoção da cadeia alquila (ácido decanóico) da daptomicina e substituindo-a por uma cadeia arialquila; portanto, os dois produtos têm a mesma estrutura polipeptídica em comum, e diferem apenas em termos da cadeia lipídica.

[008]. A solução aquosa de daptomicina produzida pela fermentação de Streptomyces roseosporus, administrando ácido decanóico (EP0178152, EP1586580) ou análogos dele (US4,885,157, EP2149609), apresenta alta contaminação por impurezas, tanto correlacionadas à daptomicina (polipeptídeos) quanto não específicas (sais minerais, açúcares, proteínas, etc.). A lista das 10 principais impurezas quimicamente correlacionadas é relatada em EP01252179: aproximadamente 15 das impurezas identificadas são polipeptídeos, alguns dos quais são intermediários da biossíntese enquanto alguns derivam de biossíntese paralela ou são produtos de degradação da daptomicina: Kirsch et al, Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393 (1989).

[009]. Por outro lado, as exigências de pureza do produto farmacêutico são muito elevadas: diferente de outros antibióticos (por exemplo, teicoplaninas, onde o medicamento consiste de uma família de produtos estrutural mente semelhantes), no caso da daptomicina as substâncias correlatas não são consideradas úteis para o tratamento, mas consideradas com impurezas indesejadas; o produto comercial deve apresentar uma pureza acima de 90% como daptomicina. A US5912226 descreve algumas das principais impurezas correlacionadas à daptomicina, como a forma anidra e o isômero beta, e descreve como “forma substancialmente pura” uma preparação de daptomicina que apresenta menos de 2,5% das referidas duas impurezas combinadas.

[0010]. A fabricação do ingrediente ativo deve, portanto seguir um processo de purificação elaborado para obter um produto de grau farmacêutico.

[0011]. A purificação do antibiótico dos caldos de fermentação é dificultada pelo fato de que embora as impurezas não específicas sejam fáceis de eliminar, outras impurezas consistem de substâncias muito semelhantes à daptomicina, que não podem ser facilmente separadas com as técnicas simples, baratas tradicionalmente utilizadas neste campo, como a extração com solvente e ultrafiltração. Além disso, a

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3/18 daptomicina bruta não pode ser purificada por cristalização. Muito embora a precipitação do produto puro da solução aquosa tenha sido descrita (EP1908770), esta técnica não é aplicável às soluções do produto bruto, uma vez que neste caso, a precipitação pode dar origem ao produto na forma sólida, mas sem um aumento significativo da pureza.

[0012]. A situação é ainda mais complicada pelo fato de que a estabilidade do produto em solução aquosa não é alta, e ocorre degradação espontânea prontamente mesmo em um pH neutro (e é ainda pior com pH acídico ou alcalino), com a formação de três principais compostos chamados isômero beta, daptomicina anidra e hidrólise de lactona (Kirsch et al, Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393, 1989), que são estruturalmente muito semelhantes à daptomicina e, portanto, difíceis de separar. Os primeiros produtos de degradação podem, obviamente se degradar dando origem, por sua vez, a outras impurezas.

[0013]. Os processos de fabricação da daptomicina são, portanto, baseados na purificação por cromatografia, com várias etapas em resinas de troca iônica e/ou adsorventes, até que se obtenha um produto de elevada pureza química.

[0014]. A principal etapa em todos os processos conhecidos até hoje consiste de cromatografia de fase reversa ou de interação hidrofóbica, técnicas semelhantes que podem ser realizadas em fases fixas baseadas em silica derivatizada (RP) com cadeias lipofílicas (tipicamente cadeias C8-C18 alquila ou fenila) ou em resinas adsorventes (HIC), com cadeias lipofílicas que são semelhantes ou desprovidas de grupos funcionais. Devido ao custo proibitivo da silica derivatizada, a técnica de RP só é adequada para uso em escala laboratorial, enquanto as resinas cromatográficas adsorventes são utilizadas principalmente em escala industrial, apesar de sua menor eficiência de separação. Como as resinas também são muito caras, mas facilmente sujas, gradativamente perdendo sua capacidade de separação, é geralmente preferível pré-tratar os caldos de fermentação com outra técnica, aplicando HIC a jusante.

[0015]. Como uma única etapa cromatográfica é geralmente insuficiente para atingir um grau de pureza satisfatório, a cromatografia deve ser repetida sob as mesmas condições (US RE390,071), ou uma segunda etapa de purificação deve ser realizada nas mesmas resinas, mas com pH diferente (US RE390,071, EP2398817), ou deve-se adicionar uma técnica de purificação diferente, como a cromatografia de troca

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4/18 iônica (US6,696,412). 0 produto também pode ser purificado por cromatografia de fase reversa (RP), utilizando fases reversas em silica derivatizada (US4,331,594, exemplo 4), mas a técnica não é econômica devido ao custo das fases em silica derivatizada, ao custo do equipamento (HPLC preparativa) necessária para trabalhar com pressões elevadas, e ao alto consumo de solvente.

[0016]. Ambas as técnicas requerem o uso de solventes orgânicos miscíveis em água, que devem, então, ser separados do produto. 0 uso de solvente também envolve problemas de segurança devido à sua flamabilidade, e os riscos para a saúde dos trabalhadores expostos aos vapores; os solventes também devem ser recuperados ou descartados, o que envolve óbvias desvantagens ecológicas e financeiras.

[0017]. A cromatografia de troca iônica (IEC) é baseada na ligação entre o produto e uma fase fixa carregada positivamente ou negativamente, enquanto a separação é obtida geralmente com tampões com elevada potência iônica. No caso da daptomicina, que é altamente instável com pHs alcalinos, são utilizadas resinas com funcionalização básica (uma base fraca, como a dietilaminoetila, ou uma base forte, como o amônio quaternário), e o processo é realizado com pH neutro ou fracamente ácido, carregando a solução a ser purificada com baixa potência iônica e, então, eluindo o produto com soluções de potência iônica aumentando gradativamente, tipicamente obtido aumentado as concentrações de cloreto de sódio. No caso específico da daptomicina, resinas com funcionalização de dietilaminoetila (base fraca) e uma matriz acrílica ou metacrílica com porosidade controlada, que são adequadas para uso com macromoléculas como as proteínas e ácidos nucleicos, têm sido utilizadas até agora; isto permite que o produto seja separado da resina sob condições que não são muito drásticas prevenindo, dessa forma, a degradação do produto. Em particular, resinas como Diaion FPDA13, Amberlite IRA68 ou outras resinas podem ser utilizadas.

[0018]. Em combinações com purificações por cromatografia, técnicas mais baratas como a extração em solvente orgânico (imiscível com água) também podem ser utilizadas; n-butanol ou acetato de n-butila é tipicamente utilizado (US4,331,594, W02009/144739) para extrair o produto de soluções com pH fortemente ácido (abaixo do pl de daptomicina). As fases são separadas, eliminando a fase aquosa, e a fase orgânica é, então, extraída com solução aquosa tamponada para um pH neutro, contendo o produto na forma dissociada. Este é um processo barato, que elimina

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5/18 algumas purezas não específicas, mas não garante qualquer purificação de impurezas estruturalmente correlacionadas.

[0019]. Técnicas de filtração tangencial também são utilizadas para separar o micélio (microfiltração), concentrar e/ou dialisar as soluções, eliminar o solvente (ultra e nanofiltração, osmose reversa) ou remover pirógenos (ultrafiltração).

[0020]. Conforme descrito na US4,331,594, o produto pode ser purificado por cromatografia de fase reversa que, no entanto, não é amplamente utilizada em escala industrial devido ao custo da silica RP-18, ao custo do equipamento necessário, e ao consumo excessivo de solvente orgânico. A purificação em fases de RP-18 foi, portanto, considerada insatisfatória para aplicação industrial, e buscaram-se alternativas mais baratas para produzir o antibiótico com um custo razoável.

[0021]. 0 método descrito na US4,874,843 envolve separação por filtração da biomassa no final da fermentação da fase líquida que contém o produto, e absorção de daptomicina em resina adsorvente Diaion HP20. Depois da eluição, a daptomicina semipura é purificada por uma sucessão de etapas em Diaion HP20 e Diaion HP20ss, uma versão de melhor qualidade da mesma resina, adequada para HIC. No entanto, uma única etapa não é suficiente; o solvente deve ser removido e a solução de daptomicina deve, então, ser submetida a pelo menos mais uma etapa cromatográfica. A pureza do produto resultante não é alta, e o processo requer o uso de grandes quantidades de solvente.

[0022]. 0 método descrito na US 6,696,412, que é comercialmente viável para produzir daptomicina com um elevado grau de pureza, consiste de uma série de operações cromatográficas sucessiva compreendendo cromatografia de troca aniônica, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e uma segunda etapa de troca aniônica. A pureza declarada da daptomicina resultante ultrapassa 95%. Uma aplicação particularmente econômica do referido processo envolve a separação do micélio da solução aquosa no final da fermentação, utilizando um dispositivo especial chamado de PalISep, para obter uma solução transparente de daptomicina. A referida solução é fluída em uma resina aniônica, que retém a daptomicina, mas não retém a maioria das impurezas não específicas presentes no meio de cultura; o produto desejado é eluído da resina com uma solução de cloreto de sódio em concentrações aumentadas, para obter uma solução salina aquosa de daptomicina, com pureza aumentada. De acordo

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6/18 com os ensinamentos da patente, Mitsubishi Diaion FPDA13, uma resina acrílica com funcionalização de DEAE (dietilaminometila), é particularmente adequada. A solução resultante, então, é submetida à concentração e/ou diálise por ultrafiltração, uma etapa onde a maior parte do sal presente no tampão de eluição é eliminado no permeado, enquanto a daptomicina é concentrada no retentado; em uma variação no processo, a fase de ultrafiltração pode ser substituída por diluição simples com água.

[0023]. A solução parcialmente purificada, dessalgada, concentrada é, então, carregada em uma coluna cromatográfica preenchida com uma resina adsorvente, Diaion HP20ss, e eluída com concentrações aumentadas de um solvente orgânico miscível em água (acetonitrila, isopropanol ou substância semelhante); a pureza exigida no produto final é alcançada nesta etapa, enquanto as fases subsequentes não envolvem purificação substancial do produto, mas, na realidade, reduzindo o risco de sua pureza, devido à degradação espontânea de daptomicina. Como as soluções puras de daptomicina contêm elevados percentuais de solvente orgânico, elas são submetidas a diluição e diálise com água, por ultrafiltração, ou podem ser submetidas a cromatografia adicional em resina FPDA13, como no processo descrito acima. Outras etapas de ultrafiltração são realizadas para remover pirógenos e concentrar as soluções, que são finalmente liofilizadas para obter o produto em pó.

[0024]. Micelas, a saber, agregados de diversas moléculas de daptomicina, são formadas sob as condições descritas nesta patente devido às características particulares da daptomicina, que compreendem uma cadeia lipídica (ácido decanóico) ligado a uma estrutura polipeptídica, e este fenômeno é expressamente explorado nas etapas de ultrafiltração. A mesma patente também descreve o uso de agentes caotrópicos (por exemplo, ureia) em altas concentrações para a fase de purificação por HIC. A US8,0582,38 e a US8,129,342 apresentam mais detalhes das impurezas presentes e descrevem os métodos analíticos por HPLC utilizados para analisar o produto.

[0025]. Diversos métodos de purificação envolvem uma sucessão de diferentes etapas cromatográficas para obter um produto com pureza adequada; por exemplo, a WO 2009/144739 descreve o uso de RP-HPLC preparativa como a única etapa cromatográfica para obter daptomicina com níveis de pureza que ultrapasssam 96%. A desvantagem da referida abordagem é o alto custo da técnica de HPLC em uma

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7/18 escala preparativa, e o fato de que ela é inadequada para preparar centenas de quilos do produto.

[0026]. Outras patentes, como a W02009/144739 e a EP2398817, relatam esquemas de purificação envolvendo múltiplos estágios, com base no uso de resinas aniônicas e resinas adsorventes opcionalmente combinadas com extração em solvente orgânico; ambas descrevem o uso de cloreto de sódio ou de cloreto de potássio (ou outros haletos alcalinos ou alcalinos terrosos) como sendo particularmente vantajosos.

[0027]. Como a cromatografia de HIC realizada na resina é menos eficiente do que RP em silica, pode ser necessário introduzir novos estágios de purificação ou, mais simplesmente, repetir a cromatografia com um pH diferente, consequentemente conduzindo uma etapa com um pH neutro e um com pH ácido na mesma resina (EP2398817).

[0028]. 0 uso de uma resina catiônica na purificação da daptomicina é descrita em CN101899094, onde a purificação é realizada por meio de etapas repetidas com membranas de ultrafiltração e nanofiltração com diferentes cortes, devido à formação de micelas. A solução contendo o produto é, então, acidificada e carregada, a uma taxa de fluxo particularmente baixa (0,3 volumes por hora), em uma resina sulfônica em forma de ácido. A solução é eluída com um gradiente de HCI variando de 0,01 N a 0,05 N, para obter um produto com 90% de pureza, que é, então, concentrado por nanofiltração e evaporação sob vácuo, e finalmente cristalizado. No entanto, não existem indicações do rendimento, e as condições operacionais, com um pH extremamente ácido por um longo período de tempo, são incompatíveis com a estabilidade da daptomicina (conforme relatado em Kirsch et al, Pharmaceutical Research 6, 5, 387-393, 1989) e polipeptídeos em geral. Além disso, o uso de soluções de HCI fortemente ácidas leva à corrosão das peças de aço do equipamento e, consequentemente, à presença de impurezas feitas de íons de ferro, cromo e níquel, que são obviamente indesejáveis em um produto farmacêutico injetável.

[0029]. Em toda a literatura conhecida até o momento, a daptomicina é eluída a partir de uma resina de troca iônica com elevadas concentrações de cloreto de sódio, que é considerado particularmente adequado para esse propósito, conforme descrito na US6696412 e na EP2398817, que reivindica especificamente o uso de íons monovalentes. A presença de cloreto de sódio parece ser particularmente importante

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8/18 nos processos com base na formação de micelas, auxiliado pela presença de sal e de determinadas condições de pH, conforme relatado na US8129342 (coluna 21).

[0030]. A daptomicina também é conhecida por apresentar propriedades quelantes; em particular seu mecanismo de ação como antibiótico está correlacionado com a formação de uma ligação com íons de cálcio (Shapiro et al, Antimicr Ag Chemother 47, 8 2538-44, 2003), mas sua capacidade de quelação também pode ser explorada no processo de purificação, por exemplo, extraindo-se o complexo antibióticoCA na fase orgânica conforme descrito na EP1355920B1 (exemplo 14, referindo-se à mistura antibiótica A-21978C). Consequentemente, isto não é um processo cromatográfico, mas um método alternativo para extrair o produto em solvente; o grau de purificação obtido é muito baixo, e somente impurezas não específicas são eliminadas, não as impurezas mais semelhantes à daptomicina (que são mais difíceis de separar).

[0031]. Além disso, a cristalização do produto puro (EP1908770) não envolve a formação de complexos com Ca++ ou outros íons bivalentes. Na prática, em todos os processos de purificação do produto conhecimento até o momento, fora a extração em solvente mencionada acima, a presença de íons bivalentes nas soluções de daptomicina tende a ser evitada.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA PRESENTE INVENÇÃO [0032]. A presente invenção descreve um processo para a purificação de antibióticos lipopolipeptídicos, em particular a daptomicina ou surotomicina, caracterizada por técnicas de cromatografia de troca iônica do eluente com base em tampões de íons bivalentes ou trivalentes, também em altas concentrações, obtendo um bom grau de purificação. Uma resina catiônica também é utilizada, na qual o produto é carregado e eluído sob condições de pH diferentes daquelas conhecidas até o momento. Em uma variação do processo descrito, a cromatografia de troca catiônica pode ser convenientemente utilizada para remover o solvente de soluções antibióticas lipopolipeptídicas. Em uma variação adicional, ela pode ser utilizada para a descoloração de soluções antibióticas lipopolipeptídicas resultantes de caldos de fermentação.

[0033]. 0 processo de acordo com A presente invenção compreende:

a) remoção do micélio do caldo de cultura (por microfiltração, centrifugação

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9/18 ou por outro processo);

b) cromatografia de troca aniônica da solução resultante do estágio a), eluindo com íons di ou trivalentes;

c) concentração opcional da fração purificada resultante do estágio b, em particular, por nanofiltração;

d) cromatografia de interação hidrofóbica da fração resultante do estágio b) ou c), eluindo com alcoóis C1-C4;

e) cromatografia de troca catiônica da fração enriquecida com lipopolipeptídeos desejada resultante do estágio d) eluindo com soluções salinas, opcionalmente com um pH maior do que o ponto isoelétrico do lipopolipeptídeo;

f) diálise, concentração e liofilização ou secagem por atomização do lipopolipeptídeo purificado.

[0034]. 0 estágio b) é preferivelmente eluído com sulfato de magnésio, sulfato de alumínio ou um citrato de diamina linear ou cíclico, mais preferivelmente com sulfato de magnésio.

[0035]. A resina de troca aniônica é preferivelmente uma resina funcionalizada com grupos básicos fracos.

[0036]. A eluição da cromatografia de interação hidrofóbica do estágio d) é preferivelmente realizada com isopropanol.

[0037]. A cromatografia de troca catiônica do estágio e) é realizada com uma resina funcionalizada com grupos ácidos fortes, eluindo em um pH variando entre 3 e 7.

[0038]. A presente invenção também se refere ao uso de uma resina de troca catiônica para remover solventes orgânicos miscíveis em água das soluções aquosas de daptomicina ou surotomicina e para descolorir as soluções de daptomicina ou surotomicina em água ou em uma mistura de água e solventes orgânicos miscíveis em água.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO [0039]. Utilizando o processo de acordo com A presente invenção, íons bivalentes ou trivalentes, que podem ser íons metálicos como Mg, Zn e Al ou bases orgânicas bivalentes, lineares como a etilenodiamina, dimetiletilenodiamina e base semelhantes, ou base cíclicas como o imidazol, piperazina e bases semelhantes, podem ser utilizadas com sucesso na cromatografia de troca iônica para a purificação de

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10/18 daptomicina. 0 sal pode ser formado com um contraíon monovalente, bivalente ou trivalente inorgânico ou orgânico, como acetatos, formatos, tartaratos, citratos, sulfatos, cloretos, fosfatos e polifosfatos de bases orgânicas bivalentes ou de íons bivalentes de elementos metálicos ou metaloides.

[0040]. Quando sistema de íons bivalentes é selecionado, deve-se considerar a solubilidade do sal em água, se ele é capaz de tamponar o pH da solução, e se ele é confiável para produzir reações de redução da oxidação na presença de oxigênio dissolvido. Diferentes sistemas salinos também podem ser utilizados em vários estágios do processo; em particular, ao condicionar a resina antes do uso e regenerá-la depois do uso, sistemas de tampão e sistemas salinos diferem daqueles selecionados como eluente no estágio cromatográfico podem ser utilizados.

[0041]. 0 sistema salino preferido utilizado como eluente é o sulfato de magnésio, empregado em concentrações que variam de zero a 1 M, e, em particular de zero a 600 mM, com uma concentração menor no início da cromatografia que é, então, aumentada gradativa mente até que o valor mais alto indicado seja alcançado, com um perfil incrementai que pode ser do tipo etapa (descontínuo) ou do tipo gradiente (contínuo). Preferivelmente, o sulfato de magnésio pode ser combinado com um sistema tampão utilizado com baixa concentração, mas ainda capaz de controlar o pH, mantendo-o no valor desejado. Um exemplo de um sistema tampão é o acetato de magnésio e o ácido acético.

[0042]. 0 mesmo tipo de cromatografia em resinas de troca aniônica pode ser obtido utilizando tampões baseados em íons não metálicos bivalentes, como as diaminas lineares ou cíclicas, também, salificadas com uma contraparte ácida monovalente, bivalente ou trivalente.

[0043]. De acordo com A presente invenção, o uso de íons bivalentes como eluentes para cromatografia de troca iônica na purificação de daptomicina oferece as vantagens descritas abaixo. 0 procedimento é particularmente útil para obter boa separação de algumas impurezas correlacionadas que são difíceis de separar em processos de cromatografia de interação hidrofóbica conhecidos, eliminando simultaneamente algumas impurezas derivadas da fermentação. Em particular, a técnica é diretamente aplicável a caldos de fermentação, preferivelmente depois da separação do micélio por centrifugação ou microfiltração, um bom grau de pureza já

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11/18 sendo obtido depois da primeira etapa cromatográfica.

[0044]. Várias soluções aquosas podem utilizadas para este propósito, compreendendo a) um sistema de tampão, que poder de qualquer tipo, orgânico ou inorgânico, desde que possa ser um tampão com um pH variando de 2 a 7, e b) um sal bivalente, que é utilizado em concentrações crescentes e tem a tarefa de fazer com que a daptomicina e as impurezas relacionadas seletivamente se separem da resina, que são divididas em diferentes frações. Uma variação no processo descrita aqui envolve o uso do mesmo sal para controlar tanto o pH quanto a potência iônica, por exemplo, utilizando-o com uma baixa concentração apenas para controle do pH e, então, aumentando a concentração para obter a eluição do produto.

[0045]. Vários tipos de resinas de troca iônica podem ser utilizados para este propósito com base em polímeros naturais como dextrano e agarose, e em polímeros sintéticos como polimetacrilatos e poliestirenos; bases fracas como dietilaminas e bases fortes como íons de amônio quaternários podem ambas ser utilizadas como grupos funcionais. Resinas polimetacrílicas com uma função de dietilaminoetila, como a resina Diaion FPDA13, são particularmente adequadas para este propósito, devido ao seu baixo custo e à ausência de interações não específicas; as referidas resinas se ligam à daptomicina na faixa de pH onde o produto é mais estável e, então, libera-a com bons rendimentos.

[0046]. Diferente do cálcio, alguns íons bivalentes nãointerferem com o processo de ligação às resinas, de forma que as frações obtidas por purificação com resina aniônicas podem ser utilizadas diretamente na cromatografia de HIC, sem a necessidade de etapas de diálise a concentração.

[0047]. Um segundo campo de aplicação de cromatografia na resina de troca iônica utilizando íons bivalentes é a dessolvatação de soluções de daptomicina, como as frações obtidas por cromatografia de HIC. Conforme já declarado, a cromatografia de HIC utiliza quantidades crescentes de solventes orgânicos miscíveis em água para eluir o produto adsorvido na resina; acetonitrila, isopropanol, etanol o outros solventes semelhantes podem ser utilizados, em concentrações variáveis.

[0048]. A presente invenção é ilustrada mais detalhadamente nos exemplos abaixo.

[0049]. Pureza aqui significa a relação percentual entre a área de pico de

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12/18 daptomicina e a soma total das áreas de pico de daptomicina e das impurezas, determinadas por análise por HPLC com um detector UV a 214 nm, conforme descrito na US8129342 (coluna 22). Onde indicado, os teores de impureza individual se referem à relação entre a área de pico da substância indicada e o total das áreas, determinado por HPLC conforme acima.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 [0050]. Uma cultura de Streptomyces roseosporus é desenvolvida em fermentação aeróbica submersa conforme descrito na patente EP0178152B1, administrando ácido decanóico durante os estágios finais da fermentação e tomando as precauções necessárias para prevenir seu acúmulo, conforme descrito na patente US4,208,403.

[0051]. 40 litros de uma suspensão contendo aproximadamente 2,5 gramas de daptomicina por grama de caldo de fermentação são obtidas e purificadas nas etapas a seguir:

a) Todo o caldo é submetido à microfiltração utilizando membranas à base de dióxido de titânio com porosidade adequada (0,2 pm). Um filtrado quase transparente é obtido, e levado até os estágios de filtração subsequentes; o micélio no retentado é ressuspenso em água e microfiltrado novamente, e o segundo filtrado é combinado com o primeiro para melhorar a recuperação do produto. Finalmente, uma solução aquosa escura é obtida, com uma concentração de daptomicina de aproximadamente 1,5 g/l, correspondendo a um rendimento de processo de mais de 90%. A solução é parcialmente concentrada por nanofiltração, eliminando o permeado (que é desprovido de produto) e retendo o retentado; para reduzir o tempo de processamento e limitar a degradação do produto, a nanofiltração é conduzida em baixa temperatura, e iniciada simultaneamente com a microfiltração. Uma solução concentrada marrom avermelhada de daptomicina bruta é obtida, com uma pureza de aproximadamente 50-55% na área da HPLC (determinada conforme descrito acima), que é chamada de caldo microfiltrado;

b) 0 caldo microfiltrado é carregado, corrigido para pH=6, e carregado em uma coluna de resina aniônica Diaion FPDA13, pré-balanceada com 50 mM de solução tampão de acetato de magnésio com pH 6. A daptomicina se liga totalmente à resina, enquanto uma solução transparente, colorida, é eliminada no efluente. A resina é

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13/18 lavada com água desmineralizada, então, com uma solução tampão de 50 mM de acetato de magnésio com pH=6; o efluente obtido da coluna contém principalmente impurezas, e é eliminado. 0 produto é eluído da resina com uma solução de 50 mM de acetato de magnésio e sulfato de magnésio variando de zero a 50 mM com pH 6, dividindo o efluente em várias frações, seguido por análise com HPLC de cada fração conforme descrito acima. As frações com pureza adequada são combinadas, então, concentradas por nanofiltração, utilizando membranas poliméricas com um corte de aproximadamente 500 Da; não se observa formação de micela;

b) A solução de daptomicina é carregada em uma coluna de resina Diaion HP20ss, pré-condicionada em 50 mM de tampão acetato de amônio com pH de aproximadamente 6,3, e preenchida sob pressão em um recipiente de leito fixo. A solução que deixa a coluna durante o carregamento é descartada, e um volume de água desmineralizada igual ao volume de resina é carregado, descartando a solução que deixa a coluna. 0 produto é eluído com 50 mM de solução tampão de acetato de amônio pH 6 com quantidades crescentes de isopropanol, aumentando a concentração de solvente em uma progressão linear gradativa de 5% a 40% (por volume); a solução resultante é fracionada em porções equivalentes à metade do volume de resina. As frações são analisadas por HPLC e combinadas ou descartadas com base nos dados de pureza de daptomicina em % de área pelo método indicado acima;

d) A solução de daptomicina purificada é diluída com um volume igual de água desmineralizada, então, carregada em uma coluna de resina Relisorb SP400 (Resindion) pré-condicionada para pH 3 com ácido fórmico diluído. A resina é lavada com uma solução de ácido fórmico a 0,1% diluída em água para injeção (WFI), utilizando dois volumes de solução por volume de resina; neste estágio, a perda de produto no efluente é quase nada. A daptomicina é eluída da resina com uma solução aquosa de 100 mM de acetato de amônio a pH 5, então, concentrada por nanofiltração até que o volume seja reduzido a 1/5 do volume inicial. 0 concentrado é dialisado com WFI, adicionando-o continuamente no retentado em quantidades iguais ao fluxo de permeado.

[0052]. A solução de daptomicina resultante é concentrada adicionalmente até que uma concentração de 130 g/l seja alcançada e, então, liofilizada. Obtém-se daptomicina em pó com pureza de 96% e um teor residual de magnésio inferior a 10

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14/18 ppm.

EXEMPLO 2 [0053]. A fermentação e a microfiltração de S. roseosporus são realizadas conforme descrito no exemplo 1:

a) 0 caldo microfiltrado 1 é corrigido para pH=6 e carregado em uma coluna de resina aniônica Diaion FPDA13, pré-balanceada com uma solução tampão de 50 mM de acetato de magnésio com pH 6; a daptomicina se liga totalmente à resina, enquanto uma solução transparente, colorida, é eliminada no efluente. A resina é lavada com água desmineralizada, então, com uma solução tampão de 50 mM de acetato de magnésio com pH=6; o efluente obtido da coluna contém principalmente impurezas, e é eliminado. 0 produto é eluído da resina com uma solução de 50 mM de acetato de magnésio e sulfato de alumínio variando de zero a 300 mM com pH 6, dividindo o efluente em várias frações. Então, a análise de HPLC de cada fração é realizada conforme descrito acima; as frações com pureza adequada são combinadas e concentradas por nanofiltração, sem observar formação de micela.

b) A solução parcialmente purificada é carregada em uma coluna de resina Purolite PCG1200M, pré-condicionada em 50 mM de tampão acetato de amônio com pH de aproximadamente 6,3, e preenchida sob pressão em um recipiente de leito fixo. A solução que deixa a coluna durante o carregamento é descartada, e um volume de água desmineralizada igual ao volume de resina é carregado, descartando a solução que deixa a coluna. 0 produto é eluído com 50 mM de solução tampão de acetato de amônio pH 6 com quantidades crescentes de etanol, aumentando a concentração de solvente em uma progressão linear gradativa de 10% a 60% (por volume); a solução resultante é fracionada em porções equivalentes à metade do volume de resina. As frações são analisadas por HPLC e combinadas ou descartadas com base nos dados de pureza de daptomicina em % de área pelo método indicado acima. Uma solução aquosa contendo etanol é obtida, onde a daptomicina está presente com uma pureza de aproximadamente 96%;

c) A solução de daptomicina purificada é diluída com um volume igual de água desmineralizada, então, carregada em uma coluna de resina Relisorb SP400 (Resindion) pré-condicionada para pH 3 com ácido fórmico diluído. A resina é lavada com uma solução de ácido fórmico a 0,1% diluída em água para injeção (WFI),

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15/18 utilizando dois volumes de solução por volume de resina; neste estágio, a perda de produto no efluente é quase nada. A daptomicina é eluída da resina com uma solução aquosa de 500 mM de sulfato de magnésio a pH 3, então, concentrada por nanofiltração, dialisada e liofilizada conforme descrito no exemplo 1.

[0054]. Obtém-se daptomicina em pó com uma pureza acima de 95%.

EXEMPLO 3

a) 0 caldo microfiltrado obtido conforme descrito no exemplo 1 é corrigido para pH 6,0-6,5 com ácido acético e carregado em uma coluna de resina aniônica Diaion FPDA13, pré-balanceada com 50 mM de solução tampão de acetato de piperazina com pH 6; a daptomicina se liga totalmente à resina, enquanto uma solução transparente, colorida, é eliminada no efluente. A resina é lavada com água desmineralizada e, então, com 50 mM de solução tampão de acetato de piperazina com pH 6; o efluente obtido da coluna contém principalmente impurezas, e é eliminado; 0 produto é eluído da resina com uma solução de citrato de piperazina variando de 50 mM a 200 mM a pH 6, dividindo o efluente em várias frações, seguidas por análise por HPLC de cada fração conforme descrito acima; as frações com pureza adequada são combinadas e concentradas por nanofiltração, sem que se observe a formação de micelas;

b) A solução do produto concentrado é acidificada para pH 3,8 e, então, submetida a extração líquido/líquido, adicionando um volume igual de n-butanol; a daptomicina é extraída novamente da solução de butanol comum pequeno volume (1/2 do volume do solvente) de tampão aquoso a pH 6,3. A solução é destilada sob vácuo para reduzir a quantidade residual de solvente;

c) A solução é carregada na resina HP20ss conforme descrito no exemplo 1, parágrafo c), mas utilizando soluções com uma concentração crescente de isopropanol. As frações com pureza excedendo 95% na áreas da HPLC são selecionadas e combinadas;

d) A solução de daptomicina purificada é diluída com um volume igual de água desmineralizada, então, carregada em uma coluna de resina Relisorb SP400 (Resindion) pré-condicionada para pH 3 com ácido fórmico diluído. A resina é lavada com uma solução de ácido fórmico a 0,1% diluída em água para injeção (WFI), utilizando dois volumes de solução por volume de resina; neste estágio, a perda de

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16/18 produto no efluente é quase nada. A daptomicina é eluída da resina com uma solução aquosa de 500 mM de cloreto de sódio em etanol a 20% com pH 3, então, concentrada por nanofiltração, dialisada e liofilizada conforme descrito no exemplo 1.

EXEMPLO 4

a) 0 caldo microfiltrado obtido conforme descrito no exemplo 1 é corrigido para pH 6,0-6,5 e carregado em uma coluna de resina aniônica Diaion FPDA13, prébalanceada com 50 mM de solução tampão de acetato de etilenodiamina com pH 6; a daptomicina se liga totalmente à resina, enquanto uma solução transparente, colorida, é eliminada no efluente. A resina é lavada com água desmineralizada e, então, com 50 mM de solução tampão de acetato de etilenodiamina com pH 6; o efluente obtido da coluna contém principalmente impurezas, e é eliminado. 0 produto é eluído da resina com 50 mM de solução de a 300 mM de acetato de etilenodiamina com pH 6, dividindo o efluente em várias frações, seguidas por análise por HPLC de cada fração conforme descrito acima; as frações com pureza adequada são combinadas;

b) A solução de daptomicina resultante é ajustada para pH 3 com ácido clorídrico, então, purificada adicionalmente com resina Purolite PCG1200M. 0 produto é eluído com 50 mM de solução tampão de acetato de amônio pH 6 com quantidades crescentes de isopropanol, aumentando a concentração de solvente em uma progressão linear gradativa de zero a 40% (por volume). As frações são analisadas por HPLC e combinadas com base na pureza;

c) A solução de daptomicina pura é dessolvatada, corrigindo para pH 3 e capturando o produto na resina Relite SP400. 0 produto resultante é eluído com uma solução de acetato de sódio com pH 6, obtendo um rendimento quantitativo. Então, a solução é dialisada com água por nanofiltração em membranas de polissulfona com um corte de 500 Da, concentrada a 100 g/l e liofilizada.

EXEMPLO 5

a) A fermentação e microfiltração são realizadas conforme descrito no exemplo 1, com a diferença de que o caldo microfiltrado é carregado diretamente na resina FPDA13 pré-condicionado com tampão acetato com pH 6. Água desmineralizada igual a dois volumes de resina é carregada, então, aluída com um tampão acetato de amônio contendo sulfato de amônio em quantidades crescentes de 50 mM a 500 mM, com pH 6;

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17/18

b) A solução resultante é carregada diretamente (na mesma concentração) em uma coluna de resina Purolite PCG1200M, pré-condicionada com ácido fórmico com pH 3 e preenchida sob pressão em um recipiente de leito fixo. A solução que deixa a coluna durante o carregamento é descartada, e um volume de água desmineralizada igual ao volume de resina é carregado, descartando a solução que deixa a coluna. 0 produto é eluído com uma solução contendo quantidades crescentes de isopropanol com a adição de ácido fórmico com pH 3, aumentando a concentração de solvente em uma progressão linear gradativa de 50% (por volume); a solução resultante é fracionada em porções equivalentes à metade do volume de resina. As frações são analisadas por HPLC e combinadas com base nos dados de pureza de daptomicina;

c) A solução de daptomicina pura é dessolvatada com Relite SP400, carregando com pH 3 e eluindo com tampão acetato de amônio com pH 7. 0 rendimento obtido é quantitativo.

EXEMPLO 6

a) A solução microfiltrada obtida no exemplo 1 é carregada em uma coluna contendo resina catiônica Amberlite 1200H pré-balanceada com 50 mM de tampão acetato de sódio com pH 6; uma solução amarela contendo aproximadamente a mesma concentração de daptomicina deixa a coluna. A resina é eluída adicionalmente com o mesmo tampão, utilizando uma quantidade por volume igual a duas vezes o volume de resina; as soluções eluídas são concentradas por ultrafiltração sem observar a formação de micelas. Uma solução branqueada com a obtenção de um rendimento de 95% de daptomicina;

b) A solução é concentrada por nanofiltração, então, acidificada para pH 3 com HCI e extraída com um volume igual de n-butanol; depois da separação, a fase aquosa é descartada. A fase orgânica é extraída com 50 mM de solução tampão de acetato de amônio, adicionando amônia para corrigir o pH para 6;

c) A solução resultante é purificada por cromatografia em resina Relite Diaion HP20, eluindo com um gradiente linear de etanol de zero a 60%, com pH 6. As frações com uma pureza excedendo 85% são selecionadas, e dessolvatadas conforme descrito no exemplo 5, ponto c). A solução é dialisada e concentrada por nanofiltração em membranas de 500 Da.

EXEMPLO 7

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18/18 [0055]. A purificação do caldo microfiltrado prossegue conforme descrito no exemplo 1, até o ponto c), com a diferença de que a dessolvatação é realizada com resina aniônica. A solução aquosa de daptomicina originária da cromatografia de HIC, contendo isopropanol, é carregada em uma coluna de resina FPDA13 pré-condicionada para pH 6 com tampão acetato de magnésio.

[0056]. A resina é lavada com água, utilizada em quantidades iguais a duas vezes o volume de resina. 0 produto é eluído com uma solução de 500 mM de sulfato de magnésio e 50 mM de acetato de magnésio com pH 6.

[0057]. A solução resultante é concentrada com um nanofiltro e dialisada com água; a solução é corrigida com HCI para pH 3 e, finalmente, concentrada adicionalmente para 130 g/l. A solução é congelada e liofilizada sob alto vácuo, para obter um pó amarelo pálido consistindo de daptomicina com 96% de pureza contendo menos de 10 ppm de magnésio.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS LIPOPOLIPEPTÍDICOS DE CALDOS DE CULTURA caracterizado pelo fato de que compreende:

a) remoção do micélio do caldo;

b) cromatografia de troca aniônica da solução da etapa a) eluindo com íons di ou trivalentes;

c) concentração opcional da fração purificada da etapa b);

d) cromatografia de interação hidrofóbica da fração da etapa b) ou c) eluindo com alcoóis C1-C4;

e) cromatografia de troca catiônica da fração enriquecida com lipopolipeptídeos desejada da etapa d) eluindo com pH igual ou maior do que o ponto isoelétrico do lipopolipeptídeo;

f) diálise, concentração e liofilização ou secagem por atomização do lipopolipeptídeo purificado.
2. PROCESSO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipopolipeptídeo seja daptomicina ou surotomicina.
3. PROCESSO de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a eluição da etapa b) é realizada com sulfato de magnésio, ou sulfato de alumínio ou um citrato de diamina linear ou cíclico.
4. PROCESSO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a eluição da etapa b) é realizada com sulfato de magnésio.
5. PROCESSO de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada utilizando uma resina funcionalizada com grupos básicos fracos.
6. PROCESSO de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a eluição de cromatografia de interação hidrofóbica da etapa d) e realizada com isopropanol.
7. PROCESSO de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca catiônica da etapa e) é realizada utilizando uma resina funcionalizada com grupos ácidos fortes.
8. PROCESSO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a resina é eluída com pH variando de 3 a 7.

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9. USO DE UMA RESINA DE TROCA CATIÔNICA caracterizado pelo fato de que é para remover solventes orgânicos miscíveis em água de soluções aquosas de daptomicina ou surotomicina.
10. USO DE UMA RESINA DE TROCA CATIÔNICA caracterizado pelo fato de que é descolorir daptomicina ou surotomicina em água ou soluções de solventes orgânicos miscíveis em água.