ES2306450T3 - Procedimientos nuevos de purificacion del factor ix. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA NUEVOS METODOS DE PURIFICACION Y RECUPERACION DE PROTEINA DEL FACTOR IX, UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO ANIONICO SOBRE RESINAS DE TIPO HEPARINA Y CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRE METAL INMOVILIZADO.
Description
Procedimientos nuevos de purificación del
factor IX.
La presente invención se refiere en general a
procedimientos nuevos de purificación y recuperación de proteínas
y, más particularmente, a procedimientos nuevos para recuperar y
purificar el factor IX.
La actual aparición de la tecnología
recombinante permite la producción de altos niveles de proteínas
dentro de células huésped transformadas adecuadamente. En el caso
de proteínas secretadas, la purificación de la proteína de interés
implica el aislamiento y la purificación a partir del medio de
cultivo de la célula huésped. Habitualmente, el medio de cultivo
contiene nutrientes seleccionados (por ejemplo, vitaminas,
aminoácidos, cofactores, minerales) y suplementos/factores de
crecimiento adicionales, incluyendo insulina y posibles proteínas
exógenas adicionales. El medio condicionado contiene tanto el
producto secretado de interés como cantidades significativas de
proteínas adicionales de la célula huésped y otras sustancias (por
ejemplo ácidos nucleicos, vesículas membranosas). Aunque se expresa
a niveles elevados, el producto de interés puede representar una
minoría de todas las proteínas presentes en el medio condicionado.
No es sorprendente que, las proteínas secretadas por células
huésped transformadas pueden presentar características bastante
distintas de las del producto de interés (p.ej. carga, tamaño
molecular, composición de aminoácido). De manera similar, las
proteínas de células huésped secretadas pueden presentar
propiedades muy similares a las del producto de interés, teniendo
un peso considerable el proceso utilizado para la purificación.
Mientras se desarrolla un proceso para la purificación de una
proteína recombinante del medio condicionado, es importante que las
condiciones utilizadas estén limitadas respecto a la
desnaturalización del producto de interés (condiciones que pueden
ser utilizadas para explotar diferencias menores entre las
proteínas secretadas para obtener el gran beneficio de la
separación), dificultando de este modo la separación del producto
de interés de todas las proteínas de células huésped presentes.
Además de las proteínas secretadas por las
células huésped descritas anteriormente, el medio condicionado
también puede contener productos derivados del código genético
expresado heterológicamente para el producto de interés. Estos
productos no son deseables para la sustancia medicamentosa final y
comprenden, por ejemplo, formas de producto que carecen de
determinadas modificaciones postranslacionales tales como
glicosilación, sulfatación, gamacarboxilación u otras
modificaciones potencialmente necesarias para la actividad
biológica. Además, en el medio condicionado pueden estar presentes
formas proteolíticamente degradadas del producto de interés, que
también deberán eliminarse durante la purificación, pero que son muy
parecidas al producto de interés. Lamentablemente, la mayoría de
propuestas, tales como la cromatografía de intercambio de iones, la
cromatografía de interacción hidrofóbica y la cromatografía de
exclusión de tamaño no pueden proporcionar el grado de separación
del producto de interés necesario para su utilización en situaciones
de terapia humana a partir de estar formas indeseadas. Para
aprovechar las diferencias grandes o pequeñas entre el producto
deseado y los contaminantes (por ejemplo, pequeñas diferencias de
carga, pequeñas diferencias del tamaño molecular) con frecuencia es
necesaria la utilización de desnaturalizantes fuertes. No obstante,
tales desnaturalizantes pueden conducir a la pérdida de actividad
biológica, a la expresión de sitios neoantígenos y potencialmente
aumentar la descomposición de modificaciones postranslacionales
seleccionadas.
Además de separar el producto de interés de las
moléculas con propiedades similares (por ejemplo formas modificadas
del gen expresado), también es importante reconocer la necesidad de
separar el producto deseado de los componentes presentes en el
medio condicionado con los cuales actúa específicamente. En el caso
de que la proteína de interés esté cargada positivamente, tenderá a
enlazarse con cualesquiera moléculas cargadas negativamente
presentes dificultando en gran medida la purificación de las
proteínas por procedimientos tradicionales.
Entre la técnica anterior, son de interés
general para la presente invención los documentos siguientes: Yan,
patente US nº 4.981.952 (1 de enero de 1991) y Yan et al.
Bio/Technology 8:655 (julio 1990) que dan a conocer la utilización
de cromatografía de seudoafinidad de intercambio aniónico para la
purificación de proteínas dependientes de la vitamina K. Josic,
et al. J. Chrom. 632:1 (1993) da a conocer la utilización de
cromatografía de afinidad de heparina para separar el factor IX de
otras proteínas dependientes de la vitamina K. Suomela, Thromb.
Res. 7:101 (1975); Suomela, Eur. J. Bio. Chem. 71:145 (1976); y
Suomela, Thrombos. Haemostis. 35:211 (1976) describe la utilización
de la hidroxiapatita en la separación de diversos factores de
coagulación y variantes de factor IX en plasma (basándose en las
diferencias de carga debidas a la variación del contenido de
fracciones de carbohidrato, por ejemplo ácido siálico y galactosa).
No obstante, Reekers, et al. Haemostasis 1:2 (1972)
demostraron la incapacidad de la hidroxiapatita para separar los
factores II, VII y IX entre si y de otras proteínas plasmáticas.
Schwinn, et al. patente US nº 4.411.794 da a conocer la
purificación parcial de los factores de coagulación sanguínea
utilizando hidroxiapatita en presencia de calcio a una concentración
de 50-200 mM. Feldman, et al. Biotech. Blood
Proteins 227:63 (1993) y Roberts, et al. Vox Sang 67 (supl.
1): 69 (1994) da a conocer la reducción de la infectividad viral
utilizando acidificación y sefarosa quelante cargada con cobre,
dando como resultado bajos rendimientos de factor IX procedente de
plasma humano.
Habitualmente los investigadores han utilizado
combinaciones de técnicas de cromatografía tradicionales para
purificar los productos deseados. Muchas veces, tales técnicas no
son suficientes para la purificación de un producto hasta el nivel
de pureza y consistencia deseado para productos terapéuticos
humanos. Los investigadores han intentado superar esta dificultad
utilizando la cromatografía de afinidad, en la que la proteína de
interés se encuentra unida a un ligante inmovilizado con el cual
interactúa de forma específica. Después del lavado adecuado, el
producto deseado puede ser eluido por disrupción de la interacción
ligante-proteína, frecuentemente con el resultado
de un eluato significativamente más puro. No obstante, en el caso de
separación de un producto deseado de formas modificadas presentes
en el medio condicionado, las técnicas de cromatografía de afinidad
de etapa única pueden resultar insuficientes y deben utilizarse
conjuntamente con otras resinas de afinidad y/o técnicas de
separación tradicionales. Aunque las etapas de cromatografía de
afinidad de alta resolución (por ejemplo la purificación por
inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal
inmovilizado)pueden no proporcionar una separación
suficiente del producto deseado de otros componentes debido a los
lugares de interacción comunes (por ejemplo cuando un epítopo que
se encuentra presente en el producto de interés también está
presente en una forma proteolíticamente degradada del
producto).
Por consiguiente, en la técnica de purificación
de proteínas sigue existiendo la necesidad de procedimientos que
superen de manera eficaz dichas dificultades.
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La presente invención presenta procedimientos
para la purificación del factor IX en una solución que comprenden
las etapas de aplicación de dicha solución a una resina de
intercambio aniónico, lavado de dicha resina de intercambio
aniónico mediante un primer lavado, y elución de dicha resina de
intercambio aniónico con un primer eluyente para formar un primer
eluato, caracterizado porque dicho primer eluyente presenta una
conductividad inferior a dicha conductividad del primer lavado.
En otro aspecto, la invención comprende la
aplicación de dicho eluato a una resina similar a la heparina (por
ejemplo aglomerante negativamente cargado), la elución de dicha
resina similar a la heparina con un segundo eluyente para formar un
segundo eluato, la aplicación de dicho segundo eluato a una resina
hidroxiapatita y la elución de dicha resina hidroxiapatita con un
tercer eluyente para formar un tercer eluato.
Según los procedimientos de la invención, el
factor IX puede ser tanto un derivado plasmático, expresado por
células en cultivo, como producido de forma recombinante en la forma
conocida por los expertos en la materia. Preferentemente, el primer
lavado comprende una solución que presenta una conductividad
inferior a la requerida para eluir el factor IX de la columna y es,
generalmente, superior o igual a la conductividad de la solución de
carga el primer tampón eluyente; esta conductividad es suficiente
para eliminar una proporción sustancial de las proteínas
contaminantes que, de lo contrario, estarían presentes en el primer
eluato. Un primer lavado adecuado comprende una solución salina tal
como cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, fosfato
sódico o fosfato potásico y, opcionalmente, puede contener un agente
tampón adecuado. Los intervalos de concentración adecuados son los
que resultan efectivos para eliminar contaminantes sin eluir el
factor IX y comprenden, por ejemplo, sal entre 25 mM y 200 mM y
preferentemente cloruro sódico 200 mM. El primer eluyente comprende
un catión divalente tal como calcio, magnesio, estroncio, cinc,
cobalto y níquel; los intervalos de concentración son los que
resultan efectivos para la elución del factor IX, incluyendo, por
ejemplo, una solución que contiene un agente de tamponación a un pH
de aproximadamente 8,0, por ejemplo Tris, en un intervalo de 5 a 100
mM, preferentemente aproximadamente 50 mM, una sal como por ejemplo
NaCl en un intervalo de 30 a 250 mM, preferentemente 100 mM
y cloruro cálcico en el intervalo de 5 a 20 mM, preferentemente
aproximadamente 10 mM.
La resinas de intercambio aniónico adecuadas
comprenden las resinas que presentan un grupo cargado positivamente,
por ejemplo dietilaminoetano (DEAE), polietilenimina (PEI) y
aminoetano cuaternario (QAE) y comprenden
Q-Sepharose Fast Flow,
DEAE-Sepharose Fast Flow, POROS-Q,
Fractogel-TMAE, Fractogel-DMAE y
QAE-
Toyopearl, siendo la resina preferida Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia).
Toyopearl, siendo la resina preferida Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia).
El segundo eluyente puede ser una sal adecuada
en tampón, por ejemplo Tris con cloruro sódico y cloruro potásico,
con TRIS 50 mM, NaCl 0,50 M, pH 8,0. La heparina o resinas similares
a la heparina adecuadas comprenden las resinas que presentan un
grupo cargado negativamente tales como heparina, ésteres sulfatados
de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo y carboximetilo y
comprenden Matrex Cellufine Sulfate, Heparin Sepharose, Heparina
Toyopearl, Carboxy Sulfon, Fractogel EMD-SO_{3}, y
Fractogel EMD COO, siendo la preferida Matrex Cellufine
Sulfate.
El tercer eluyente puede ser una sal, por
ejemplo fosfato y sulfato, preferentemente fosfato potásico 0,5 M,
NaCl 0,2 M, pH 7,2. Las resinas de hidroxiapatita adecuada
comprenden una resina cualquiera que contenga fosfato cálcico, por
ejemplo hidroxiapatita cerámica, Biogel HT y otras, preferentemente
HA cerámica. La resina de afinidad por ión metálico inmovilizado
puede ser, por ejemplo, Fractogel EMD Chelate, Chelating Sepharose,
Matrex Cellufine Chelate y POROS 20MC, prefiriéndose actualmente
Fractogel EMD Chelate. El cuarto eluyente es una solución tampón
que contiene un quelante tal como imidazol, EDTA, EGTA, glicina,
histidina y Tris, preferentemente fosfato potásico 20 mM, imidazol
15 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,1.
La presente invención también dispone
composiciones de factor IX producidas por procedimientos según la
invención. El factor IX así producido presenta una actividad
específica en el intervalo de 240-400 U/mg y
opcionalmente se sitúa alrededor de 240 U/mg.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "factor IX" comprende, sin carácter limitativo,
factor IX aislado del plasma, estirpes de célula transformadas y
factor IX producido de forma recombinante aislado del medio de
cultivo de la célula huésped.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "resina de intercambio aniónico" comprende, sin
carácter limitativo, resinas que presentan una fracción cargada
positivamente (a pH neutro), tales como dietilaminoetano (DEAE),
polietilenimina (PEI) y aminoetano cuaternario (QAE) y comprende,
por ejemplo Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia),
DEAE- Sepharose Fast Flow, DEAE-Toyopearl,
QAE-Toyopearl, POROS Q,
Fractogel-DMAE, Fractogel EMD-TMAE,
Matrex Cellufines DEAE y similares.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "primer lavado" comprende, sin carácter limitativo,
una solución que presenta una conductividad inferior a la requerida
para eluir el factor IX de la columna de intercambio aniónico y
cuya conductividad es generalmente superior o igual a la
conductividad de la solución de carga y a la conductividad del
primer eluyente; esta conductividad es suficiente para eliminar una
proporción sustancial de las proteínas contaminantes que, de lo
contrario, estaría presentes en el eluato. Como apreciarán
fácilmente los expertos en la materia, el primer lavado puede estar
constituido por cualquier solución salina y comprende, por ejemplo,
cloruro sódico, cloruro potásico, sulfato sódico, fosfato sódico o
fosfato potásico y puede tamponarse adecuadamente. Habitualmente la
concentración oscila de baja (sal 25 mM) a alta (sal 200 mM),
prefiriéndose actualmente cloruro sódico 200 mM.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "primer eluyente" comprende, sin carácter
limitativo: soluciones compuestas por un agente tampón (por ejemplo
Tris) a una concentración de aproximadamente 0,05 M, sal (por
ejemplo NaCl) a una concentración que no es suficiente para la
elución desde la resina en ausencia del catión divalente (por
ejemplo aproximadamente 0,10 M - 0,20 M) y el catión divalente (por
ejemplo CaCl_{2}) a concentraciones bajas de aproximadamente 0,01
M, a pH 8,0. La selección de la composición tampón es compatible
con la presencia del catión divalente. Preferentemente, el "primer
eluyente" presenta una conductividad inferior a la del "primer
lavado".
En el sentido utilizado en la presente memoria,
las expresiones "heparina" y "similar a la heparina" se
utilizan de forma intercambiable y comprenden, sin carácter
limitativo, resinas que contienen una fracción cargada
negativamente inmovilizada, como heparina, ésteres de celulosa
sulfatados, sulfilpropilo (SP), carboxilo y carboximetilo y
comprenden Fractogel-EMD-SO_{3},
Carboxy Sulfon, Fractogel-EMD-COO,
Heparin-Sepharose y Matex Cellufine Sulfate.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "segundo eluyente" comprende, sin carácter
limitativo: soluciones compuestas por un agente tampón (por ejemplo
Tris) a una concentración de aproximadamente 0,05 M y sal (por
ejemplo NaCl, KCl, Na_{2}SO_{4}) a una concentración suficiente
para romper la interacción del factor IX con el soporte de resina
cargado negativamente (por ejemplo 0,50 M) a aproximadamente pH 8.0.
En la forma utilizada en este proceso, el segundo eluyente debe ser
compatible con la siguiente etapa del proceso, es decir,
hidroxiapatita.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
el término "columna de hidroxiapatita" comprende, sin carácter
limitativo: soportes de gel de fosfato cálcico, incluyendo, por
ejemplo, BioGel-HT y hidroxiapatita cerámica.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
la expresión "tercer eluyente" (y "segundo tampón de
fosfato") comprende, sin carácter limitativo: soluciones
compuestas de un agente tampón (por ejemplo fosfato o sulfato) a
concentraciones suficientes para romper la interacción del factor IX
con la resina (por ejemplo aproximadamente 0,20 M o superior) y sal
(por ejemplo NaCl, KCl) presente a concentraciones suficientes para
minimizar las interacciones entre cargas del factor IX con la
resina de hidroxiapatita, a un pH aproximadamente neutro (pH 7,2);
la expresión "primer tampón de fosfato" comprende, sin carácter
limitativo, soluciones compuestas por un agente tampón (por ejemplo
fosfato o sulfato) a concentraciones suficientes para eliminar las
formas inactivas del factor IX de la resina de hidroxiapatita.
En el sentido utilizado en la presente memoria,
la expresión "resina de afinidad por ión metálico inmovilizado"
(IMAC) comprende, sin carácter limitativo: resinas que contienen
una fracción funcional inmovilizada (por ejemplo ácido
iminodiacético) capaz de fijar y coordinar cationes multivalentes,
incluyendo Chelating-Sepharose,
Fractogel-EMD-Chelate, POROS 20MC y
Matrex Cellufine Chelate. El ión metálico fijado puede seleccionarse
entre diversas opciones posibles, incluyendo, sin carácter
limitativo, cobre, níquel, cadmio, cobalto, hierro, cinc o
estroncio.
La expresión "cuarto eluyente" (también
denominado "desplazador") comprende, sin carácter limitativo,
cualquier compuesto que desplace el factor IX fijado del soporte de
resina IMAC, mientras minimiza el desplazamiento del ión metálico
inmovilizado del soporte de resina, y comprende, aunque sin carácter
limitativo, componentes tales como glicina, histidina, tris,
imidazol, EDTA, EGTA y similares. Como apreciarán fácilmente los
expertos en la materia, las concentraciones adecuadas de
desplazador variarán según la afinidad de fijación y pueden
determinarse mediante la evaluación experimental de las condiciones.
Habitualmente, las concentraciones oscilan de baja (por ejemplo
desplazador 5-15 mM) a alta (por ejemplo,
desplazador 100-200 mM).
\newpage
La referencia a la actividad específica del
factor IX de "U/mg" comprende, sin carácter limitativo: la
actividad biológica determinada en el ensayo de coagulación in
vitro (APTT) utilizando plasma concentrado o factor IX
purificado, aislado, como estándar. La concentración de proteína
puede determinarse mediante uno cualquiera de los diversos
procedimientos validados adecuados incluyendo SEC,
RP-HPLC, ensayos basados en color (por ejemplo
Bradford, Lowry) o absorbancia a 280 nm. La actividad del factor IX
se determina según el procedimiento de Pittman, D., et al.,
Blood 79:389-397 (1992) utilizando plasma deficiente
en factor IX.
La figura 1 proporciona una vista general del
proceso. Aunque el orden de las etapas expuesto es el de la forma
de realización actualmente preferida, los expertos en la materia
apreciarán que dicho orden puede reconfigurarse en caso deseado y
pueden omitirse etapas.
Según la presente invención, primero se eliminan
las células del medio condicionado, por ejemplo por microfiltrado
(MF) utilizando membranas de filtración de flujo tangencial con un
tamaño de poro de aproximadamente 0,6 \mum. Opcionalmente, se
prepara medio condicionado libre de células para purificación por
filtrado a través de un filtro de 0,45 \mum de profundidad. En
caso deseado, a continuación el medio condicionado libre de células
puede concentrarse por ultrafiltrado, seguido de diafiltrado en un
tampón adecuado para carga en la primera etapa de cromatografía.
Alternativamente, el medio condicionado libre de células puede
cargarse directamente en la primera columna de cromatografía
equilibrada en un tampón apropiado.
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La etapa inicial del proceso, UF/DF#1, comporta
la concentración del medio condicionado libre de células que
contiene factor IX por medio de ultrafiltración seguida de
diafiltración. Aunque no es necesaria para la fijación de factor IX
a la primera columna de cromatografía, esta etapa resulta efectiva
para la eliminación de los componentes del medio de cultivo de bajo
peso molecular. Tales componentes pueden fijarse a la columna de
cromatografía inicial, reduciendo la capacidad de la columna para el
factor IX. La UF/DF#1 se utiliza para intercambiar el factor IX en
una solución tampón adecuada para el procesamiento siguiente.
En la primera etapa de cromatografía,
intercambio aniónico en Q-Sepharose Fast Flow (FF)
(Pharmacia), se captura y purifica el factor IX de los componentes
de célula huésped presentes en el volumen de concentrado de UF/DF#1.
La columna de Q-Sepharose FF adsorbe la proteína
factor IX y las proteínas contaminantes de la célula huésped con
puntos isoeléctricos superiores al pH funcional se eliminan del
flujo de proceso fluyendo a través de la columna. La columna en la
cual se adsorbe el factor IX se lava a continuación, antes de la
elución para eliminar los contaminantes débilmente ligados y
ajustar la conductividad del tampón como preparación para la
elución.
Habitualmente, las proteínas fijadas se eluyen
de la Q-Sepharose FF incrementando el potencial
iónico del tampón. El proceso de purificación del factor IX, no
obstante, utiliza esta resina en un modo de intercambio aniónico
sudoafindad en el cual el factor IX activo es eluido mediante la
adición de, por ejemplo, cloruro cálcico al tampón. Este catión
divalente da como resultado la elución de formas activas del factor
IX de la resina. Algunas formas menos activas del factor IX también
pueden ser eluídas de la columna de Q-Sepharose FF
con este tampón de elución. Las formas inactivas seleccionadas del
factor IX y otras proteínas contaminantes de la célula huésped
permanecen fijadas a la columna. La etapa de
Q-Sepharose FF consigue un incremento significativo
de la pureza del factor IX.
En la segunda etapa de cromatografía, el volumen
de elución de Q-Sepharose FF se carga directamente,
sin dilución, en la columna de Matrex Cellufine Sulfate. El factor
IX se adsorbe en la columna, mientras que otras proteínas
contaminantes (por ejemplo PACE solubles y otras proteínas de célula
huésped presentes en el eluato de Q-Sepharose FF)
se eliminan del flujo de proceso fluyendo a través de la columna. La
columna se lava con un tampón de bajo potencial iónico para
eliminar todas las proteínas no fijadas. El factor IX se eluye
incrementando el potencial iónico del tampón mediante sal (por
ejemplo cloruro sódico).
Durante la tercera etapa de cromatografía,
cromatografía de columna de Ceramic-HA, se obtiene
la eliminación adicional de formas de factor IX inactivas. El pH
del volumen de elución de Matrex Cellufine Sulfate se ajusta a
aproximadamente 7,5 y a continuación se carga directamente en la
columna de Ceramic-HA. El factor IX es adsorbido
por la columna. La columna de Ceramic-HA se lava con
tampón para eliminar los contaminantes débilmente ligados, y a
continuación se lava con fosfato potásico 50 mM, NaCl 0,185 M (pH
7,2) para eliminar los contaminantes más fuertemente ligados,
incluyendo formas inactivas del factor IX. El factor IX activo
fijado se eluye en etapas utilizando una solución que contiene una
concentración más elevada de fosfato potásico (por ejemplo 200 mM o
superior, pH 7,2) que el eluyente.
La cuarta etapa de cromatografía, cromatografía
Fractogel EMD-Chelate-Cu(II),
elimina bajos niveles de proteína contaminantes de célula huésped
todavía presentes en el flujo de producto. El volumen de elución de
Ceramic-HA se carga directamente en la columna de
Fractogel EMD-Chelate-Cu(II).
El factor IX y diversas proteínas contaminantes se adsorben en la
columna. Se eluye de la columna el factor IX activo purificado
mediante concentraciones bajas de imidazol (por ejemplo
aproximadamente 15 mM) en el tampón, y las proteínas contaminantes
de célula huésped residuales se eliminan del flujo de producto
permaneciendo fijadas a la columna.
Finalmente el volumen de elución del Fractogel
EMD-Chelate-Cu(II) se
concentra mediante ultrafiltración, seguida de diafiltración
(UF/DF#2) en un tampón idéntico a un tampón de formulación salvo que
no contiene polisorbato 80. Un tampón de formulación adecuado
comprende histidina, glicina, sacarosa y
polisorbato-80, opcionalmente en una concentración
de 10 mM, 260 mM, 1% y 0,005%, respectivamente. Una vez completada
la diafiltración, el factor IX se concentra para alcanzar la
concentración objetivo. El volumen de producto se elimina del
aparato de UF/DF 2 y se formula por adición de polisorbato 80 a una
concentración objetivo del 0,005%. A continuación, la sustancia
medicamentosa factor IX se filtra (0,2 \mum), se muestre, se
etiqueta y se almacena congelada a -80ºC. La última etapa del
proceso, UF/DF#2 es efectiva para concentrar y diafiltrar la
sustancia medicamentosa factor IX purificada sin desnaturalización
ni pérdida significativas de la proteína. El análisis
SDS-PAGE (reducido y no reducido) es un
procedimiento utilizado para evaluar el rendimiento global del
proceso. Cada etapa produce un rendimiento superior al 80% hasta el
100% y el rendimiento global medio de factor IX es de alrededor del
51%. El rendimiento global del proceso se determina a partir de la
actividad de coagulación contabilizada en el proceso de
purificación y la actividad de coagulación total en la sustancia
medicamentosa factor IX (excluyendo el material eliminado como
muestras de proceso y retenciones).
Los ejemplos siguientes ilustran la práctica de
la invención. Estos ejemplos se proporcionan exclusivamente a
título ilustrativo.
El ejemplo 1 describe la concentración de
proteína por ultrafiltración/diafiltración. El ejemplo 2 describe
la purificación del factor IX por cromatografía de intercambio
aniónico seudoafinidad en Q-Sepharose Fast Flow. El
ejemplo 3 describe la purificación del factor IX por cromatografía
en Matrex Cellufine Sulfate. El ejemplo 4 describe la purificación
de proteína con cromatografía de hydroxyapatite. El ejemplo 5
describe la purificación de proteína por cromatografía de afinidad
por ión metálico inmovilizado. Y el ejemplo 6 describe la
concentración y formulación de proteína por
ultrafiltración/diafiltración.
Opcionalmente puede realizarse la
ultrafiltración/diafiltración (UF/DF#1) para concentrar y
tamponar-intercambiar el medio condicionado libre
de células utilizando filtración con membrana de flujo tangencial.
La membrana utilizada en el dispositivo de flujo tangencial sirve
de filtro permeable selectivo que separa sustancias basándose en el
peso molecular. Los componentes de la solución de peso molecular
alto, por ejemplo el factor IX, quedan retenidos por la membrana y
los componentes de peso molecular bajo, por ejemplo las sales
inorgánicas y los componentes del tampón, pasan libremente a través
de la estructura de membrana porosa y se eliminan en el
permeado.
Cuando el tampón es arrastrado del dispositivo
de flujo tangencial al retentado, a una velocidad superior a la
velocidad de adición de tampón de sustitución, la solución de
proteína se concentra. Cuando se añade tampón de sustitución al
retentado del flujo tangencial a una velocidad aproximadamente igual
a la velocidad con la que el tampón es arrastrado a través de la
membrana, el tampón inicial se diluye continuamente (diafiltración
de la proteína). Bajo estas condiciones, los compuestos de bajo peso
molecular se intercambian fácilmente y la concentración de proteína
se mantiene constante. La adición de cinco volúmenes de retentado de
tampón da como resultado una sustitución teórica de \geq 99% del
tampón inicial.
Antes del uso, el sistema UF/DF#1 se equilibra
con TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. El medio condicionado libre de
células se concentra aproximadamente 20 veces respecto al volumen
del medio condicionado libre de células inicial. A continuación, el
medio condicionado libre de células se diafiltra en el tampón. La
diafiltración queda completada cuando por lo menos cinco volúmenes
de retentado del tampón han pasado a través de la membrana, dando
como resultado una eliminación teórica de \geq 99% de sales y
otros componentes de bajo peso molecular presentes en el medio
condicionado libre de células.
Una vez completada la diafiltración, en caso
necesario, se concentra el retentado. A continuación el equipo se
lava abundantemente con tampón suficiente para recuperar el producto
factor IX residual del depósito y las conducciones. Seguidamente,
el volumen de líquido se bombea al exterior del recipiente UF/DF y
se filtra a través de un filtro de 0,2 \mum autoclaveado al
interior de un recipiente limpio. El volumen de UF/DF#1 se almacena
a una temperatura comprendida entre 2 y 8ºC hasta posterior
procesado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Q-Sepharose Fast Flow (FF)
(Pharmacia) es una resina de intercambio aniónico fuerte compuesta
por una matriz de agarosa de enlace cruzado que se deriva de forma
covalente con un grupo amina cuaternario a través de un short
linker. Las proteínas acídicas (por ejemplo el factor IX) y otras
sustancias poliiónicas con una carga negativa neta en el pH
operativo se fijan a la Q-Sepharose FF a través de
interacciones entre cargas. Habitualmente, los componentes fijados
se eluyen diferencialmente de la Q-Sepharose FF por
ruptura de dichas interacciones con cargas con soluciones de
conductividad incrementada. No obstante, el proceso de purificación
del factor IX utiliza la resina Q-Sepharose FF en
un modo de seudoafinidad. El factor IX se eluye de la columna
utilizando una solución que contiene cloruro cálcico de baja
concentración (10 mM). La inclusión de iones calcio en el tampón de
elución genera un cambio conformacional en el factor IX que da como
resultado la elución de la resina.
La Q-Sepharose FF se utiliza
para capturar el factor IX del retentado de UF/DF#1; para eliminar
contaminantes no cargados y básicos del flujo de proceso (en la
fracción no fijada durante la carga de la columna); para separar el
factor IX de las proteínas acídicas (que se fijan a la resina pero
no son eluidas por adición de cloruro de calcio al tampón),
incluyendo formas inactivas del factor IX; y para liberar un flujo
de proceso de factor IX concentrado a la siguiente etapa de
cromatografía del proceso de purificación, Matrex Cellufine
Sulfate.
Opcionalmente, todas las operaciones de
cromatografía de esta etapa se realizan a entre 2 y 8ºC. La columna
de Q-Sepharose FF se carga primero con TRIS 50 mM,
NaCl 2 M, pH 8,0 y a continuación se equilibra con TRIS 50 mM, NaCl
150 mM, pH 8,0. El rententato de UF/DF#1 se carga en la columna de
Q-Sepharose FF y se lava la columna con TRIS 50 mM,
NaCl 200 mM, pH 8,0. Este primer lavado garantiza que toda la carga
ha pasado a través de la columna y que se han lavado del sistema
las impurezas de la carga no adsorbidas y los contaminantes
débilmente ligados a la resina. A continuación la columna se lava
con TRIS mM 50, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 8,0 para reducir
la conductividad como preparación para la elución.
El factor IX se eluye de la columna con TRIS 50
mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 8,0 y el producto eluido se
recoge como máximo único. El eluato de Q-Sepharose
FF se muestrea y almacena a entre 2 y 8ºC, hasta ser sometido a
posterior procesamiento. Opcionalmente, la columna puede ser
regenerada y reutilizada.
La Matrex Cellufine Sulfate está formada por
perlas de celulosa esferoidales derivadas con ésteres de sulfato.
Puede utilizarse como un análogo de heparina inmovilizada para
purificación por afinidad de proteínas que contienen dominios de
unión de heparina. Asimismo, puede utilizarse para cromatografía de
intercambio catiónico debido a sus funciones de sulfato cargado
negativamente. Las proteínas básicas, otras sustancias poliiónicas
con una carga netamente positiva en el pH operativo y las proteínas
de unión de heparina a la resina se eluyen con soluciones de
potencial iónico creciente. La resina Matrex Cellufine Sulfate se
utiliza en el proceso de purificación del factor IX para eliminar
las proteínas de célula huésped distintas del factor IX del volumen
de elución de Q-Sepharose FF y, opcionalmente, para
proporcionar condiciones tampón adecuadas para cargar la columna de
hidroxiapatita.
Opcionalmente, todas las operaciones de
cromatografía para esta etapa se realizan a entre 2 y 8ºC. Como
preparación para la etapa de carga, la columna de Matrex Cellufine
Sulfate se equilibra con TRIS 50 mM, pH 8,0. El volumen de elución
de Q-Sepharose FF se carga directamente en la
columna de Matrex Cellufine Sulfate, se lava la columna con TRIS 50
mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 8,0 para garantizar que toda
la carga ha pasado a través de la columna y que las impurezas
débilmente ligadas han sido eliminadas del sistema. A continuación,
la columna puede lavarse para eliminar los iones de calcio antes de
la elución.
Una vez completadas las etapas de lavado, la
columna Matrex Cellufine Sulfate se eluye con TRIS 50 mM, NaCl 500
mM, pH 8,0 y el eluato se recoge como un volumen único de elución
absorbente de UV. El volumen de elución de Matrex Cellufine Sulfate
se muestra y se almacena a entre 2 y 8ºC hasta posterior
procesamiento. Opcionalmente, la columna puede ser regenerada y
reutilizada.
La hidroxiapatita cerámica
(Ceramic-HA) es una forma sintética del fosfato
cálcico consistente en partículas macroporasa esferoidales con
elevada resistencia mecánica. La Ceramic-HA separa
proteínas con un amplio rango de cargas y puntos isoeléctricos, en
gran parte basándose en las interacciones entre cargas. El factor IX
es una proteína acídica que se une con la
Ceramic-HA a un pH aproximadamente neutro.
Habitualmente, las proteínas acídicas se eluyen de la
Ceramic-HA mediante la adición de fosfato a la
solución tampón. La concentración de fosfato requerida para la
elución varía dependiendo de las propiedades de la molécula de
interés, permitiendo la elución diferencial de las proteínas
fijadas. La Ceramic-HA se utiliza en el proceso de
purificación del factor IX para eliminar el factor IX activo y
otros contaminantes del volumen de elución de Matrex Cellufine
Sulfate y para intercambiar el tampón eluato a uno compatible con la
etapa de cromatografía final. Al ser la etapa final de
cromatografía una cromatografía de afinidad por ión metálico
inmovilizado, los tampones utilizados para la elución de la
Ceramic-HA se seleccionan para que sean compatibles
con la IMAC. De este modo se evita una diafiltración en proceso u
otros procedimientos de intercambio de tampón. Los tampones tales
como el TRIS, la glicina y la histidina no son compatibles con la
IMAC debido a la ruptura de la interacción de los ligandos de ión
metálico inmovilizado. La elución de la columna de
Ceramic-HA con tampones de fosfato evita tales
complicaciones.
Como preparación de la carga, la columna de
Ceramic-HA se equilibra con TRIS 50 mM, NaCl 500 mM,
pH 7,5. El volumen de elución de Matrex Cellufine Sulfate se valora
hasta pH 7,5 con HCl diluido y se carga directamente en la columna
de Ceramic-HA. Una vez completada la carga, la
columna se lava con tampón (NaCl 0,5 M, TRIS 50 mM, pH 7,5) para
garantizar que toda la carga ha pasado a través de la columna y que
se han eliminado de la misma los contaminantes débilmente ligados.
A continuación, la columna se lava con K_{2}HPO_{4} 50 mM, NaCl
185 mM, pH 7,2 para eliminar las formas inactivas del factor IX del
flujo de proceso.
Una vez completadas las etapas de lavado, se
eluye el factor IX con K_{2}HPO_{4} 500 mM, NaCl
200 mM, pH 7,2 y el factor IX se recoge como volumen de elución
único absorbente de UV. El volumen eluido se muestrea y se almacena
a entre 2 y 8ºC hasta ser sometido a posterior procesamiento.
Opcionalmente la columna puede regenerarse y ser reutilizada.
La
Fracttogel-EMD-Chelate está formada
por un polímero metacrilato derivado con grupos funcionales
iminodiacéticos a los cuales pueden fijase iones metálicos en
estado de transición. Como preparación para la utilización en el
proceso de purificación, la resina se carga con iones cobre
utilizando una solución de sulfato de cobre. Las proteínas capaces
de interactuar con los iones cobre inmovilizados son retenidas en la
columna y los contaminantes no interactivos pasan a través de la
misma en la fracción no ligada. Las proteínas fijadas se eluyen de
la resina utilizando soluciones que contienen imidazol. En el
proceso de purificación de proteínas puede utilizarse una etapa de
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
para eliminar del flujo de proceso contaminantes no ligados al ión
metálico inmovilizado o que requieren para su elución
concentraciones de imidazol superiores a las requeridas por el
factor IX. El término IMAC (cromatografía por afinidad por ión
metálico inmovilizado) también se utiliza para designar esta etapa
de cromatografía.
Como preparación para la carga, la columna de
Fracttogel-EMD-Chelate sin cargar
(sin ión metálico inmovilizado) se lava con ácido acético 100 mM,
NaCl 500 mM, pH 4,0 y seguidamente se carga con CuSO_{4} 200 mM,
NaCl 500 mM. Los iones de cobre débilmente ligados se eliminan
lavando la resina cargada con ácido acético 100 mM, NaCl 500 mM, pH
4,0 y después con imidazol 200 mM, NaCl 500 mM, pH 7,1. A
continuación, la resina
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
se equilibra en K_{2}HPO_{4} 200 mM, NaCl 200 mM, pH 7,1
(equilibrado V). El volumen de elución de Ceramic-HA
se carga directamente en la columna de
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
equilibrada.
Una vez completada la carga, la columna se lava
con tampón de equilibrado para garantizar que toda la carga ha
pasado a través de la columna. El factor IX fijado a la resina se
eluye utilizando K_{2}HPO_{4} 20 mM, imidazol 15 mM , NaCl 100
mM, pH 7,1. El eluato de
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
se recoge en un único volumen absorbente de UV. Una vez recogido,
el volumen de elución se diluye con 20 ml de EDTA 500 mM, pH 8,0
por litro de eluato de columna. El volumen de elución diluido se
almacena a temperatura ambiente hasta que debe ser sometido a
procesamiento posterior.
Para transferir el factor IX a un tampón a
elección, se utiliza una combinación de
ultrafiltración/diafiltración. La UF/DF de flujo tangencial es un
procedimiento de separación no cromatográfico que puede utilizarse
para concentrar e intercambiar a tampón sustancias en solución. Se
conduce un flujo de alimentación paralelamente a la superficie de
una membrana selectivamente permeable y se aplica presión en el lado
del retentado de salida de la membrana para efectuar el transporte
de agua y solutos en la superficie de la membrana basándose en su
permeabilidad relativa. En estas circunstancias, los componentes del
flujo de alimentación de bajo peso molecular pasan libremente a
través de los poros de la membrana a la fracción de permeado y las
sustancias de peso molecular elevado (por ejemplo factor IX) son
retenidas por la membrana y constituyen la fracción de retentado.
De este modo, el agua y las sales tampón pueden eliminarse del
volumen de elución de
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
y el factor IX puede concentrarse a la concentración objetivo.
Opcionalmente, un componente de cartucho
arrollado en espiral del sistema de flujo tangencial se equilibra
primero con histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa 1%, pH 6,8. El
volumen de elución de
Fracttogel-EMD-Chelate-Cu(II)
(previamente diluido con EDTA 500 mM) se transfiere, a
continuación, al recipiente de presión de acero inoxidable del
retentado del aparto de flujo tangencial, como preparación para la
concentración de proteína.
Una vez completada la transferencia, la solución
de retentado se bombea de forma continua desde el recipiente de
presión, a través del cartucho arrollado en espiral, y de vuelta de
nuevo al recipiente de presión bajo una presión transmembrana
netamente positiva.
Cuando se ha alcanzado el volumen de retentado
deseado, el retentado se diafiltra en un tampón a elección. Durante
esta operación, el tampón de diafiltración se bombea al interior del
recipiente de presión a la misma velocidad con la que permeado
fluye del sistema, manteniéndose así un volumen de retentado
constante.
Una vez completada la etapa de diafiltración, la
fracción de retentado se concentra al volumen deseado mediante
ultrafiltración. La fracción del flujo salida del recipiente de
presión de retentado se detiene y la fracción de retentado del
cartucho arrollado en espiral fluye al interior del recipiente de
presión de retentado con un volumen deseado del tampón de elección.
El producto factor IX diafiltrado, concentrado se recupera del
recipiente de presión por bombeo a botellas taradas.
El volumen de producto factor IX se diluye con
histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa 1%, polisorbato 80 1%, pH
6,8 a una concentración final de polisorbato 80 0,005%.
Seguidamente, el producto se mezcla perfectamente y se filtra a
través de un filtro de 0,2 \mum (previamente equilibrado en
histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa 1%, polisorbato 80
0,005%, pH 6,8 en botellas de Teflon despirogenadas. A continuación
la proteína se muestrea, etiqueta, congela rápidamente en nitrógeno
líquido y almacena a -80ºC.
Aunque el presente procedimiento de la invención
se ejemplifica mediante la purificación del factor IX producido de
forma recombinante a partir de células huésped transformadas, el
procedimiento también resulta adecuado para la purificación del
factor IX que se genera naturalmente en el interior de una célula y
puede utilizarse para purificar proteínas de solución o de plasma,
homogenados celulares, sobrenadantes de cultivo celular o
subfracciones celulares aisladas.
Claims (20)
1. Procedimiento para la purificación del factor
IX en una solución, que comprende las etapas siguientes:
la aplicación de dicha solución a una resina de
intercambio aniónico,
el lavado de dicha resina de intercambio
aniónico con un primer lavado, y
la elución de dicha resina de intercambio
aniónico con un primer eluyente para formar un primer eluato,
caracterizado porque dicho primer
eluyente presenta una conductividad inferior a la conductividad de
dicho primer lavado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende asimismo:
la aplicación de dicho eluato a una resina
similar a la heparina,
la elución de dicha resina similar a la heparina
con un segundo eluyente para formar un segundo eluato,
la aplicación de dicho segundo eluato a una
resina de hidroxiapatita, y
la elución de dicha resina de hidroxiapatita con
un tercer eluyente para formar un tercer eluato.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la conductividad de dicho primer lavado es superior o
igual a la conductividad de la solución.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicho primer lavado comprende una solución seleccionada de
entre el grupo constituido por cloruro sódico, cloruro potásico,
sulfato sódico, fosfato sódico o fosfato potásico.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho primer lavado es cloruro sódico 200 mM.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que además comprende asimismo las etapas
siguientes:
la aplicación de dicho tercer eluato a una
resina de afinidad por ión metálico inmovilizado, y
la elución de dicha resina de afinidad por ión
metálico inmovilizado con un cuarto eluyente para formar un cuarto
eluato.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho primer eluyente comprende un
catión divalente seleccionado de entre el grupo constituido por
calcio, magnesio, manganeso, estroncio, cinc, cobalto y níquel.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que dicho primer eluyente es calcio 10 mM.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha resina de intercambio
aniónico presenta un grupo cargado positivamente que es un elemento
seleccionado de entre el grupo constituido por dietilamina (DEAE),
polietilenimina (PEI) y aminoetano cuaternario (QAE).
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 9, en el que dicha resina similar a la heparina
presenta un grupo cargado negativamente que es un elemento
seleccionado de entre el grupo constituido por heparina, ésteres
sulfatados de celulosa, sulfilpropilo (SP), carboxilo y
carboximetilo.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que dicho segundo eluyente es un
elemento seleccionado de entre el grupo constituido por cloruro
sódico y cloruro potásico.
12. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que dicho segundo eluyente es Tris 50 mM, NaCl 0,50 M, pH
8,0.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho tercer eluyente es un
elemento seleccionado de entre el grupo constituido por fosfato y
sulfato.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que dicho tercer eluyente es fosfato potásico 0,5 M, NaCl 0,2 M,
pH 7,2.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, en el que dicha resina de hidroxiapatita
es un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por
hidroxiapatita cerámica y BioGel-HT.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que dicha resina de hidroxiapatita es hidroxiapatita
cerámica.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 16, en el que dicho cuarto eluyente es un
desplazador.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que dicho desplazador es un elemento seleccionado de entre el
grupo constituido por imidazol, EDTA, EGTA, glicina, histidina y
TRIS.
19. Factor IX que se puede obtener mediante un
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que
presenta una actividad específica de 240 a 400 U/mg.
20. Factor IX según la reivindicación 19, en el
que dicha actividad específica es de 240 U/mg.
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