ES2325771T3 - Procedimiento de purificacion de eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el enriquecimiento de eritropoyetina, producida mediante cultivo de células huésped eurcarióticas en un medio de cultivo, en una mezcla de proteínas, donde se efectúan los siguientes pasos a)-c) en el orden que se indica: a) una primera cromatografía de intercambio aniónico, b) una cromatografía de afinidad, una cromatografía de interacción hidrofóbica y una cromatografía en hidroxiapatita en el orden indicado, y c) una segunda cromatografía de intercambio aniónico.
Description
Procedimiento de purificación de
eritropoyetina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de fabricación de eritropoyetina recombinante que
presenta un particularmente alto grado de pureza (\geq 98%). El
procedimiento comprende al menos 5 pasos de purificación
cromatográfica, que son concretamente al menos dos cromatografías de
intercambio aniónico, al menos una cromatografía de interacción
hidrofóbica, al menos una cromatografía de afinidad y al menos una
cromatografía en hidroxiapatita. En formas de realización
preferidas, el procedimiento prescinde de toda cromatografía de
exclusión y de toda cromatografía de fase inversa. La invención se
refiere en particular a un procedimiento que comprende los
siguientes pasos de purificación cromatográfica en el orden que se
indica: I) una primera cromatografía de intercambio aniónico, II)
una cromatografía de afinidad, con respecto a la cual se trata
preferiblemente de una cromatografía de afinidad de colorante, III)
una cromatografía de interacción hidrofóbica, IV) una cromatografía
en hidroxiapatita, y V) una segunda cromatografía de intercambio
aniónico.
La eritropoyetina, llamada abreviadamente EPO,
es una glicoproteína que estimula la formación de eritrocitos en la
médula ósea. La EPO es formada principalmente en los riñones y llega
desde ahí y a través del circuito sanguíneo a su lugar de destino.
En caso de insuficiencia renal, los riñones dañados producen
demasiado poca o ninguna EPO, lo cual tiene como consecuencia que
de las células troncales de la médula ósea salen demasiado pocos
eritrocitos. Esta anemia renal puede ser tratada mediante la
administración de EPO en cantidades fisiológicas que estimulan la
formación de eritrocitos en la médula ósea. La EPO que se utiliza
para ser administrada puede ser obtenida de la orina humana o bien
puede ser producida por métodos de tecnología genética. Puesto que
la EPO está contenida en el cuerpo humano tan sólo a nivel de
pequeñas trazas, prácticamente resulta imposible el aislamiento de
EPO a partir de la fuente natural para aplicaciones terapéuticas.
Por consiguiente, los métodos de tecnología genética ofrecen la
única posibilidad rentable para producir esta sustancia en
cantidades considerables.
La producción recombinante de eritropoyetina es
posible desde la identificación del gen de la eritropoyetina humana
en el año 1984. Desde comienzos de la década de los 90 han sido
desarrollados distintos fármacos que contienen eritropoyetina
humana que fue producida por la vía de la tecnología genética en
células eucarióticas, y ante todo en células CHO (Chinese Hamster
Ovary = de ovario de hámster chino). La producción de eritropoyetina
humana recombinante está por ejemplo descrita en los documentos
EP-A-0 148 605 y
EP-A-205 564.
La producción recombinante de eritropoyetina se
hace habitualmente en células CHO huésped. Mientras que éstas eran
anteriormente cultivadas en medio de cultivo al que se había añadido
suero bovino fetal y a veces también insulina bovina, el cultivo
tiene lugar hoy en día por regla general en medio exento de suero y
de proteína. De esta manera se reducirá ya mediante el cultivo el
riesgo de contaminaciones con proteínas bovinas, virus bovinos, DNA
bovino u otras sustancias indeseadas que son originarias de los
aditivos que se usaban anteriormente. Son ofrecidos por distintos
ofertantes medios exentos de suero y de proteína que son adecuados
para el cultivo de células eucarióticas, como es p. ej. el caso del
medio MAM-PF2, que es comercializado, entre otros,
por la Bioconcept, de Allschwil, Suiza, o de los medios DMEM y
DMEM/F1.2, que son ofertados p. ej. por la Invitrogen/Gibco, de
Eggenstein, Alemania.
También han sido ya descritos en el estado de la
técnica distintos procedimientos de purificación cromatográfica
para la eritropoyetina. La EP-A-0
228 452 describe un procedimiento que sirve para la purificación de
eritropoyetina biológicamente activa a partir de un líquido y
comprende los pasos cromatográficos de cromatografía de intercambio
aniónico y cromatografía de fase inversa.
En la EP-A-0 267
678 se describe la purificación de una eritropoyetina producida en
cultivo exento de suero, en cuyo procedimiento se efectúan
consecutivamente una diálisis, una cromatografía de intercambio
iónico, una HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta
resolución) de fase inversa y una cromatografía de filtración en
gel. El paso de la cromatografía de filtración en gel puede ser
además sustituido por una cromatografía de intercambio iónico. Se
propone asimismo efectuar antes de la (primera) cromatografía de
intercambio iónico una cromatografía de afinidad de colorante en
una columna de Azul de Trisacrilo.
En la EP-A-0 830
376 está descrito un procedimiento de purificación de eritropoyetina
en el que la EPO del supernatante del cultivo en el primer paso de
la purificación cromatográfica es sometido a una cromatografía de
afinidad de colorante. En el segundo paso se efectúa una
cromatografía en un soporte hidrofobizado, seguida por una
cromatografía en hidroxiapatita. A esto le sigue entonces una HPLC
de fase inversa, seguida por una cromatografía de intercambio
aniónico como último paso cromatográfico.
La EP-A-1 127
063 describe un procedimiento de purificación de eritropoyetina que
comprende los pasos siguientes: precipitación diferencial,
cromatografía de interacción hidrofóbica, diafiltración,
cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio
catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño. Los distintos
pasos de purificación se efectúan en la
EP-A-1 127 063 en el orden
mencionado. En una variante del procedimiento, la purificación
comprende los pasos siguientes: precipitación diferencial,
cromatografía de interacción hidrofóbica, diafiltración,
cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio
catiónico, una adicional diafiltración y una cromatografía de
exclusión por tamaño. El procedimiento prevé en todo caso en el
primer paso una precipitación, seguida por una centrifugación. Se
prevé asimismo obligatoriamente una filtración en gel al final de
la purificación cromatográfica.
La solicitud internacional
WO-A-03/045996 describe un
procedimiento de purificación de EPO que comprende una
cromatografía de intercambio aniónico seguida por una cromatografía
de fase inversa y por una adicional cromatografía de intercambio
aniónico. A la segunda cromatografía de intercambio aniónico le
sigue una cromatografía de exclusión por tamaño usando un medio
filtrante de gel.
La purificación de eritropoyetina es también
objeto de la EP-A-0 428 267. Aquí se
efectúa una cromatografía en una columna de Sefarosa Q ("Q
Sepharose"), seguida en parte por cromatografía de fase inversa y
filtración en gel.
La presente invención persigue la finalidad de
indicar un procedimiento de purificación de eritropoyetina que en
la medida de lo posible prescinda de costosos pasos de cromatografía
tanto como de la realización de pasos laboriosos que puedan hacer
que sea necesaria la utilización de reactivos indeseados. La
eritropoyetina que se obtenga con el procedimiento de purificación
según la invención debe ajustarse a los criterios de pureza
definidos por las autoridades homologadoras y en la Farmacopea
Europea, respectivamente. El contenido de proteínas originarias de
la célula huésped (proteína de la célula huésped) deberá ser en
particular de menos de 100 ppm. También el contenido de DNA de la
célula huésped deberá ser de menos de 100 pg/mg de eritropoyetina.
Finalmente, la eritropoyetina obtenida mediante la purificación
deberá en cuanto a su composición de isoformas ajustarse al patrón
que se define en la Farmacopea Europea (Ph. Eur.; 01/2002:1316).
El procedimiento deberá también en la medida de
lo posible prescindir de una cromatografía de fase inversa, como p.
ej. una RP-HPLC (RP-HPLC = HPLC de
fase inversa). En esta clase de cromatografía se usan habitualmente
reactivos tales como acetonitrilo que son a continuación difíciles
de eliminar de la proteína y podrían ser dañinos para los humanos.
Otra desventaja de la RP-HPLC es la de que a menudo
se usan costosos disolventes orgánicos que incrementan los costes
de la purificación, y además los disolventes orgánicos son
objetables en cuanto a la contaminación del medio ambiente y también
peligrosos y difíciles de manipular. Los medios que se usan en la
cromatografía de fase inversa son en conjunto a menudo
indeseados.
Es evidente que para la eritropoyetina obtenida
como producto de la purificación se establecen estrictas normas con
respecto a la pureza y al patrón de glicosilación. Estas estrictas
exigencias pueden ser satisfechas tan sólo mediante un
procedimiento de purificación que esté dirigido específicamente a la
eritropoyetina y sea el resultado de extensivos estudios y
análisis.
Estas y otras finalidades son alcanzadas
mediante el procedimiento de purificación que se indica en la
reivindicación 1. Están descritas en las reivindicaciones
dependientes formas de realización preferidas.
La invención se refiere con ello a un
procedimiento de purificación de eritropoyetina a partir de una
solución, y en particular de un supernatante de cultivo, en cuyo
procedimiento se realizan los siguientes pasos a) a c) en el orden
que se indica: en el paso a) una primera cromatografía de
intercambio aniónico, en el paso b) una cromatografía de afinidad,
una cromatografía de interacción hidrofóbica y una cromatografía en
hidroxiapatita, en el orden indicado, y en el paso c) una segunda
cromatografía de intercambio aniónico.
El procedimiento de purificación según la
invención hace con ello uso de al menos cuatro distintos métodos de
separación cromatográfica, que son concretamente (I) el del
intercambio iónico sobre la base de la interacción competitiva de
iones cargados, (II) el de la interacción hidrofóbica, que se
distingue por el hecho de que las regiones superficiales apolares
de una proteína a altas concentraciones salinas son adsorbidas en
los ligandos débilmente hidrofóbicos de una fase estacionaria, (III)
el de la afinidad, que se basa en la adsorción específica y
reversible de una molécula en una contraparte de fijación individual
fijada a una matriz, y (IV) el de la cromatografía en
hidroxiapatita, que se basa en el uso de cristales de hidroxiapatita
inorgánicos.
Estos principios cromatográficos mencionados son
también correspondientemente diferenciados en los círculos
profesionales (véase p. ej., Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas
(Hrsg.), Heidelberg, Berlín, Spektrum Akad. Verlag 1998). Hay que
destacar a pesar de ello que en cuanto a la cromatografía de
afinidad que se prevé obligatoriamente en el paso b) no se trata de
una cromatografía en hidroxiapatita. Antes bien comprende el paso
b) tanto una cromatografía de afinidad como una cromatografía en
hidroxiapatita.
En una forma de realización preferida, el
procedimiento de purificación de EPO comprende una primera
cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de
afinidad, una cromatografía de interacción hidrofóbica, una
cromatografía en hidroxiapatita y una segunda cromatografía de
intercambio aniónico, en el orden mencionado.
En cuanto a la cromatografía de afinidad, se
trata preferiblemente de una cromatografía de afinidad de
colorante.
La segunda cromatografía de intercambio aniónico
tiene lugar en una forma de realización preferida realizándose un
paso de lavado ácido con el que mediante una clara disminución del
pH las isoformas básicas de la eritropoyetina son eluidas y son con
ello separadas del producto final. La expresión "paso de lavado
ácido" significa que el valor pH del tampón de lavado está
claramente situado dentro de la gama de valores ácida,
preferiblemente entre 2,0 y 5,5, con especial preferencia entre 3,0
y 4,5, y con suma preferencia alrededor de 4,0. Resulta adecuado
como tampón ante todo un tampón de acetato sódico. Este paso de
cromatografía es según ello particularmente importante con vistas
al patrón de glicosilación de la EPO que constituye el producto
final.
El cultivo de las células huésped productoras de
eritropoyetina se efectúa en un medio de cultivo que está exento de
proteína y exento de componentes animales.
En formas de realización preferidas en ningún
estadio de la purificación de EPO tiene lugar una cromatografía de
fase inversa. También se evita en la medida de lo posible una
filtración en gel.
Se ha descubierto que la eritropoyetina obtenida
con el procedimiento según la invención presenta un contenido de
proteína de célula huésped de < 100 ppm y un contenido de DNA de
célula huésped de < 100 pg/mg. Particularmente el insuficiente
empobrecimiento en proteína de célula huésped es un problema
frecuente en los procedimientos de purificación del estado de la
técnica. El procedimiento según la invención ofrece aquí
particulares ventajas, puesto que se logra un fiable empobrecimiento
de hasta menos de 100 ppm.
La eritropoyetina obtenida con el procedimiento
según la invención tiene una pureza de al menos un 95%,
preferiblemente de al menos un 98%, y con particular preferencia de
al menos un 99%, siendo la pureza determinada mediante
RP-HPLC analítica. La RP-HPLC que
aquí se efectúa sirve sin embargo tan sólo a efectos analíticos, ya
que dentro del marco de la purificación no se efectúa en la medida
de lo posible RP-HPLC alguna.
La actividad de la proteína deberá ser de al
menos 100.000 UI/mg (UI/mg = unidades internacionales/mg),
preferiblemente de al menos 110.000 UI/mg, y con particular
preferencia, de al menos 120.000 UI/mg (véase también la Farmacopea
Europea 01/2002:1316).
La invención describe también preparaciones
farmacéuticas que contienen la eritropoyetina purificada según la
invención. Las preparaciones de EPO se hacen habitualmente en forma
líquida y son en tal forma administradas mediante inyección
intravenosa o subcutánea. Son sustancias auxiliares adecuadas para
ser usadas en preparaciones líquidas de EPO p. ej. tampones tales
como tampón de fosfato, sales como por ejemplo cloruro sódico,
estabilizadores para EPO, como p. ej. aminoácidos, azúcares y
alcoholes de azúcar, así como agentes superficiactivos, como p. ej.
polisorbato 20/80. Están descritos ejemplos de formulaciones de
preparaciones de este tipo en los documentos
EP-A-0 306 824,
EP-A-0 607 156 y
EP-A-0 909 564; véanse también los
productos comerciales NeoRecormon® y Erypo® en la LISTA ROJA
2004.
La eritropoyetina purificada según la invención
es preferentemente eritropoyetina humana recombinante producida en
células eucarióticas. La eritropoyetina recombinante es
preferiblemente producida en células de mamífero, y con especial
preferencia en células CHO, como se describe p. ej. en la
EP-A-0 205 564 y en la
EP-A-0 148 605. La fermentación se
efectúa según protocolos tradicionales en medios de cultivo de los
que están a la venta en el mercado.
Dentro del marco de la presente invención se
entiende por "eritropoyetina" toda proteína que esté en
condiciones de estimular la formación de eritrocitos en la médula
ósea y según el análisis que se describe en la Farmacopea Europea
(Ph. Eur.; 01/2002:1316) pueda ser claramente identificada como
eritropoyetina (Determinación de la actividad en ratones
policitémicos o normocitémicos). En cuanto a la eritropoyetina,
puede tratarse de la eritropoyetina humana de tipo salvaje o de una
variante de la misma con una o varias sustituciones, deleciones o
adiciones de aminoácidos. En cuanto a la eritropoyetina contenida en
la preparación según la invención, puede asimismo tratarse de un
conjugado en el que la proteína esté p. ej. en forma conjugada con
polímeros, como p. ej. polialquilenglicoles, como sería el caso de
la llamada eritropoyetina polietilenglicolada.
Se entiende aquí por "purificación de
eritropoyetina" o "enriquecimiento de eritropoyetina" que la
proteína eritropoyetina es obtenida en forma muy pura a partir de
una mezcla, o sea que se enriquece la eritropoyetina contenida en
la mezcla hasta que prácticamente no están ya contenidas en la
mezcla otras proteínas aparte de la eritropoyetina.
El experto en la materia está familiarizado con
los principios cromatográficos de los que se hace uso en el
procedimiento según la invención, estando dichos principios en todo
caso descritos en los manuales o protocolos corrientes de los
ofertantes de matrices de cromatografía. Adecuadas matrices e
informaciones de fondo así como instrucciones para la realización
de las distintas cromatografías se encuentran p. ej. en el catálogo
de productos y en las informaciones de productos de Amersham
Biosciences (véase también www.amershambiosciences.com) o
bien también en el catálogo de productos de Bio-Rad
(véase también www.bio-rad.com).
Las cromatografías de intercambio aniónico
pueden realizarse con membranas o resinas de intercambio aniónico
convencionales de las que están a la venta en el mercado. Las
típicas resinas de intercambio aniónico que pueden ser usadas
comprenden grupos funcionales tales como dietilaminoetilo (DEAE),
siendo aquí dignos de mención los productos llamados
DEAE-Sepharose (Amersham Biosciences), Macroprep
DEAE (Bio-Rad) y Fractogel EMD DEAE (Merck);
aminoetilo cuaternario (QAE), siendo aquí digno de ser mencionado el
producto llamado Toyopearl QAE (Toyo Biosep); amonio cuaternario,
siendo aquí dignos de ser mencionados los productos llamados
Q-Sepharose XL (Amersham Biosciences),
Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences), Resource Q
(Amersham Biosciences), Source 30 Q (Amersham Biosciences), Macro
Prep High Q (Bio-Rad) y Toyopearl Super Q (Toyo
Biosep); dimetilaminoetilo (DMAE), siendo aquí digno de ser
mencionado el producto llamado Fractogel EMD DMAE (Merck); y
trimetilaminoetilo (TMAE), siendo aquí digno de ser mencionado el
producto llamado Fractogel EMD TMAE (Merck); y el adsorbedor de
membrana (MA) Sartobind Q100 (Sartorius).
\newpage
Son preferidos intecambiadores de aniones
resinas con ligandos amonio cuaternario o terciario. Así se usan p.
ej. en una forma de realización preferida del procedimiento según la
invención en la primera y en la segunda cromatografía de
intercambio aniónico respectivamente Q Sepharose XL o Source 30 Q
(siendo ambos productos suministrados por la Amersham Biosciences).
Con particular preferencia se usa en la primera cromatografía de
intercambio aniónico Q Sepharose XL y en la segunda cromatografía de
intercambio aniónico Source 30 Q.
La cromatografía de afinidad puede efectuarse
asimismo con resinas convencionales de las que están a la venta en
el mercado. Son aquí dignos de ser mencionados por ejemplo los
productos llamados Dye-Sepharose,
Heparin-Sepharose, columnas HiTrap Blue HP (Cibacron
Blue F3G-A) y Blue Sepharose (Cibacron Blue
F3G-A), las resinas de afinidad con ligandos
peptídicos, las resinas de afinidad con anticuerpos, las resinas de
afinidad con lectina, la cromatografía de afinidad en DNA
inmovilizado o en nucleótidos inmovilizados y en medios de
adsorción específicos de grupo, como p. ej. en gelatina acoplada a
agarosa.
Preferiblemente se trata de una cromatografía de
afinidad de colorante, en particular usando Blue Sepharose (como p.
ej. Blue Sepharose 6 Fast Flow de Amersham Biosciences). Pero
también son adecuadas otras matrices de afinidad de colorante, como
es p. ej. el caso del producto DyeMatrex de la firma Millipore.
También la cromatografía de interacción
hidrofóbica puede ser efectuada con matrices habituales. Son
adecuadas matrices tales como las de butil-, fenil-, propil- u
octil-Sefarosa (Amersham Biosciences), metilo o
t-butilo Macro-Prep
(Bio-Rad) y Fractogel EMD con ligandos propilo o
fenilo (Merck). Preferiblemente se trata de
Butil-Sefarosa (como p. ej. el producto llamado
Butyl Sepharose 4 Fast Flow, de Amersham Biosciences).
Para la cromatografía en hidroxiapatita pueden
usarse materiales de hidroxiapatita habituales. En cuanto a la
hidroxiapatita, se trata de una forma de fosfato cálcico.
Preferiblemente se usa hidroxiapatita cerámica CHT
(Bio-Rad), y con particular preferencia se usa
hidroxiapatita cerámica CHT Tipo I (Bio-Rad).
El patrón de isoformas del producto final de
EPO, o sea obtenido mediante el procedimiento según la invención y
determinado tras la segunda cromatografía de intercambio aniónico,
es equiparable al del patrón de BRP-EPO (véase la
Farmacopea Europea 01/2002:1316).
Los ejemplos siguientes están destinados a
aclarar la invención sin limitarla.
Se produce EPO en células CHO. La fermentación
se efectúa según protocolos estándar como los que están descritos
en la literatura científica y de patentes para células eucarióticas,
y en particular para células CHO. El cultivo se efectúa en medio de
cultivo que está exento de proteína y exento de componentes animales
(como p. ej. el MAM-PF2, suministrado por la
Bioconcept, de Allschwil, Suiza, según las recomendaciones del
ofertante). La recolección tiene lugar tras una fase de producción
que dura como máximo siete días. Las células se separan mediante un
filtro en profundidad y mediante posterior filtración con un tamaño
de poro de 0,2 \mum. Como alternativa, las células pueden ser
separadas mediante centrifugación. El filtrado exento de células es
a continuación concentrado mediante ultrafiltración con un factor de
aproximadamente 10 y es sometido a diafiltración contra tampón de
fosfato. La diafiltración sirve para la reducción de la
conductividad hasta un valor inferior a los 5 mS/cm, para preparar
la solución de proteína para el primer paso cromatográfico, que es
el llamado paso de captura.
Como paso de "captura" se efectúa una
cromatografía de intercambio iónico (IEX) en Q Sepharose XL. En
este primer paso de purificación se concentra la sustancia activa
eritropoyetina. Este paso sirve además para poner a la sustancia
activa en una forma más estable para el almacenamiento.
El lavado se efectúa con fosfato sódico 20 mM,
pH 7,5, y la elución se efectúa con cloruro sódico 0,3M a pH 7,5. A
continuación de la cromatografía de intercambio aniónico puede
efectuarse una filtración con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
En el paso siguiente se efectúa una
cromatografía de afinidad en Blue Sepharose 6 FF (adquirida a la
Amersham Bisociences). Tras la sustitución del tampón en la columna
y tras un adicional paso de lavado se efectúa la elución en cloruro
sódico 1M. El eluido es mezclado con tampón salino e isopropanol
para la posterior cromatografía de interacción hidrofóbica.
El eluido mezclado con tampón salino e
isopropanol es en el paso siguiente aplicado a una columna de
cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC; Butyl Sepharose 4 FF,
adquirida a la Amersham Biosciences). Tras un paso de lavado
(cloruro sódico 2M en isopropanol al 10%) se efectúa la elución de
la sustancia activa con cloruro sódico 0,75M en isopropanol al 23%
(volumétrico).
El eluido de la cromatografía de interacción
hidrofóbica es a continuación sometido a una cromatografía en
hidroxiapatita (hidroxiapatita cerámica CHT-I,
adquirida a la Bio-Rad). Dicho eluido puede ser
previamente diluido. La dilución se efectúa preferiblemente
introduciendo el eluido de la columna de HIC directamente en tampón
Tris (Tris 20 mM/HCl, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,9). La concentración
final de isopropanol es tras la dilución preferiblemente de poco
más o menos un 9%. Esta solución es luego aplicada directamente a la
columna de hidroxiapatita.
Tras lavado con tampón de fosfato potásico 10 mM
se efectúa la elución de eritropoyetina. El valor pH del eluido se
ajusta a pH 7,4 con HCl.
Para el posterior y preferiblemente último paso
cromatográfico se carga la solución con contenido de EPO en una
matriz de intercambio iónico (Source 30 Q, adquirida a la Amersham
Biosciences). Este paso de cromatografía comprende un paso de
lavado ácido con acetato sódico (pH 4,0), para empobrecer las
isoformas básicas de la sustancia activa. Tras un ajuste del valor
pH mediante un adicional paso de lavado a pH 7,4 se efectúa la
elución de eritropoyetina con cloruro sódico 200 mM.
A continuación puede efectuarse de nuevo una
filtración con un tamaño de poro de 0,2 \mum dentro del marco de
la filtración viral. La solución de sustancia activa recibe el
nombre de producto a granel y puede ser sometida a congelación
ultrarrápida con nitrógeno líquido y puede ser luego almacenada a
-80ºC.
Con la eritropoyetina obtenida y con habituales
sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables puede hacerse
una preparación líquida.
El equilibrado de la matriz de Q Sepharose XL
(0,6 l \pm 0,05 l) se efectúa con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5
(hasta que detrás de la columna el valor pH sea de 7,5 \pm 0,3 y
la conductividad sea < 5 mS/cm). Luego se efectúa la aplicación
de la muestra. A continuación se lava la columna con el tampón de
equilibrado, o sea con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5. Para la
posterior elución se usa fosfato sódico 20 mM, NaCl 300 mM, pH
7,5.
Dentro del marco del paso de captura se
prescinde por regla general de un paso de lavado ácido.
La pureza de la eritropoyetina eluida es >
65%, medida con RP-HPLC.
A continuación del paso de captura puede
efectuarse una filtración con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
Preferiblemente, el eluido se bombea directamente durante la elución
con cloruro sódico a través de un filtro de 0,2 \mum.
El equilibrado de la columna se efectúa con
fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,1M, pH 7,5. A continuación es aplicada
a la columna la muestra obtenida del paso de captura, pudiendo ser
la misma previamente diluida con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5, en
preparación para la cromatografía de afinidad.
A continuación se efectúa un lavado con
HCl-Tris 20 mM, NaCl 0,1M, pH 7,5. El segundo paso
de lavado se efectúa con Tris 20 mM/HCl, NaCl_{2} 5 mM, NaCl
0,1M, pH 7,5. La elución se efectúa con Tris 100 mM/HCl, CaCl_{2}
5 mM, NaCl 1M, pH 7,5.
La cromatografía de afinidad en sefarosa sirve,
entre otras cosas, para el empobrecimiento en proteína de célula
huésped. El contenido de proteína de célula huésped se determina
habitualmente mediante ELISA (ELISA = inmunoanálisis ligado a
enzimas). Esta y otras estrategias para el análisis para la
determinación del contenido de proteína de célula huésped pueden
estudiarse p. ej. en Hoffman K. (2000) Biopharm, Vol. 13, Nº 6, pp.
38-45.
El rendimiento de la producción de
eritropoyetina, medido con RP-HPLC, es después de la
cromatografía de afinidad en Blue Sepharose de al menos un 65%, y
preferiblemente de al menos un 70%. La pureza, medida asimismo con
RP-HPLC, es de al menos un 90%, y preferiblemente de
al menos un 95%.
La cromatografía de interacción hidrofóbica se
efectúa con Butyl Sepharose 4 FF como matriz. Esta matriz es
físicamente estable y permite altas velocidades de flujo.
La concentración salina (NaCl 2M) que es
necesaria para la fijación de EPO se ajusta mezclando el eluido de
la Blue Sepharose 6 FF con tampón que contiene NaCl 4M. La muestra
es adicionalmente ajustada a un 10% de isopropanol (en
volumen).
La conductividad de la muestra prevista para la
carga de la columna de HIC debería en la medida de lo posible estar
situada entre 95 y 110 mS/cm. La conductividad del tampón de
equilibrado debería estar asimismo situada dentro de esta gama de
valores.
Se equilibra la columna de HIC con Tris 20
mM/HCl, NaCl 2M, isopropanol al 10%, pH 7,5. Tras la aplicación de
la muestra se efectúa el lavado con el tampón de equilibrado. La
elución se efectúa con el siguiente tampón de elución: Tris 20
mM/HCl, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,75 m, isopropanol al 23%
(volumétrico), pH 6,9. El volumen de elución es de 1 volumen de
columna.
Se ha comprobado que dentro del marco del
proceso de purificación que aquí se expone en detalle una
concentración de isopropanol de un 23% (volumétrico) en el tampón de
elución conduce a una óptima elución de EPO con pérdidas al mismo
tiempo minimizadas.
Para impedir una precipitación de la EPO debido
a una prolongada actuación del isopropanol (al 23% volumétrico),
durante la elución el eluido es introducido directamente en tampón
Tris. La concentración de isopropanol del eluido diluido es
finalmente de un 9% (volumétrico).
El rendimiento de la producción de
eritropoyetina tras este paso de cromatografía es de al menos un
65%, preferiblemente de al menos un 70%, y con particular
preferencia, de al menos un 80%. La pureza es de al menos un 92%, y
preferiblemente de al menos un 95%.
El eluido de la cromatografía en Butyl Sepharose
4 FF puede ser cargado sin adicional acondicionamiento en la
columna de hidroxiapatita (HAP). De las condiciones de elución de la
cromatografía de interacción hidrofóbica resulta debido a ello para
el equilibrado de la columna un tampón de equilibrado de Tris con
contenido de isopropanol. Tras la carga de la columna se procede a
eliminar el isopropanol mediante un paso de lavado.
Los tampones que se usan para el paso de
cromatografía en hidroxiapatita son los siguientes:
Tampón de equilibrado: Tris 20 mM/HCl,
NaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,25M, isopropanol al 9%, pH 6,9.
El primer paso de lavado se efectúa con el
tampón de equilibrado, y el segundo paso de lavado se efectúa con:
Tris 10 mM/HCl, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,8. El tampón de elución es el
siguiente:
Tris 10 mM/HCl, CaCl_{2} 0,5 mM,
K_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 6,8.
El rendimiento del paso de cromatografía en
hidroxiapatita es de al menos un 65%, y preferiblemente de al menos
un 70%. La pureza de la EPO obtenida es de al menos un 97%, y
preferiblemente de al menos un 98%.
La cromatografía mediante hidroxiapatita sirve
en conjunto para eliminar el isopropanol del paso de cromatografía
de interacción hidrofóbica. La elución de la EPO de la columna de
hidroxiapatita puede hacerse preferiblemente mediante una elución
escalonada (fosfato potásico de 0 a 10 mM). Pero también puede
usarse un gradiente lineal (p. ej. fosfato potásico de 0 a 40
mM).
A continuación de la cromatografía en
hidroxiapatita se efectúa en una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención una filtración viral. Esta
filtración viral puede ser por ejemplo efectuada con un filtro
Planova 15N del Grupo Asahi Kasei. La membrana de filtración posee
un tamaño de poro de 15 nm y asegura también el empobrecimiento en
poliovirus y parvovirus.
Como último paso de purificación se efectúa una
cromatografía de intercambio iónico mediante Source 30 Q. El paso
está ante todo caracterizado por un paso de lavado ácido con el que
las isoformas básicas de la eritropoyetina son eluidas mediante un
descenso del pH y son con ello separadas del producto final. Este
paso de cromatografía es según ello particularmente importante con
vistas al patrón de glicosilación de la EPO que constituye el
producto final.
Como sistema tampón para el segundo paso de
intercambio iónico para la purificación de eritropoyetina se usa un
tampón de fosfato. Tras la carga de la muestra y un primer paso de
lavado se efectúa un paso de lavado "ácido". Bajo estas
condiciones son eluidas las isoformas básicas de la
eritropoyetina.
El equilibrado y el primer paso de lavado se
efectúan con fosfato sódico 10 mM, pH 7,4. El paso de lavado ácido
se efectúa con un tampón de lavado con un contenido de acetato
sódico de 20 mM y un valor pH de 4,0. El volumen de lavado del paso
de lavado ácido es de 2 volúmenes de columna.
A continuación se efectúa por regla general aun
otro lavado con un tampón de fosfato, con lo cual el valor pH es
incrementado hasta 7,4. La elución se efectúa con un gradiente
escalonado de NaCl 0 a 0,2M. Pero también es adecuado un gradiente
lineal, p. ej. de NaCl 0 a 0,5M.
El tampón de elución tiene la composición
siguiente: fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,2M, pH 7,4. La elución se
efectúa con 1,5 volúmenes de columna.
El rendimiento es el de al menos un 65%,
preferiblemente de al menos un 70%, y con particular preferencia,
de al menos un 75%. La pureza es de al menos un 98%, y
preferiblemente de al menos un 99%.
La EPO que es obtenida finalmente como producto
tiene una actividad biológica de \geq 100.000 UI/mg en el
bioensayo, un contenido de DNA de < 100 pg/mg de proteína, una
pureza de la EPO de \geq 98%, un contenido de proteína de célula
huésped (HCP, host cell protein = proteína de célula huésped) de
< 100 ppm y un patrón de isoformas (en la ZCE) (ZCE =
electroforesis capilar zonal) que satisface las exigencias de la
Farmacopea Europea.
Todas las cromatografías en columna son por lo
demás efectuadas según las recomendaciones y los protocolos de los
ofertantes de las matrices y de las columnas (p. ej. con respecto a
las velocidades de flujo, a los volúmenes de columna que se usan
para el lavado y para la elución, a los diámetros y a las alturas de
lecho de las columnas, etc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias que cita el
solicitante se aporta solamente en calidad de información para el
lector y no forma parte del documento de patente europea. A pesar de
que se ha procedido con gran esmero al compilar las referencias, no
puede excluirse la posibilidad de que se hayan producido errores u
omisiones, y la OEP se exime de toda responsabilidad a este
respecto.
- \bullet EP 0148605 A [0003] [0027]
- \bullet WO 03045996 A [0009]
- \bullet EP 205564 A [0003]
- \bullet EP 0428267 A [0010]
- \bullet EP 0228452 A [0005]
- \bullet EP 0306824 A [0026]
- \bullet EP 0267678 A [0006]
- \bullet EP 0607156 A [0026]
- \bullet EP 0830376 A [0007]
- \bullet EP 0909564 A [0026]
- \bullet EP 1127063 A [0008] [0008]
- \bullet EP 0205564 A [0027]
\bullet Bioanalytik. Spektrum Akad. Verlag,
1998 [0017]
\bulletHOFFMAN K. Biopharm,
2000, vol. 13 (6), 38-45 [0055]
Claims (18)
1. Procedimiento para el enriquecimiento de
eritropoyetina, producida mediante cultivo de células huésped
eurcarióticas en un medio de cultivo, en una mezcla de proteínas,
donde se efectúan los siguientes pasos a)-c) en el
orden que se indica:
- a)
- una primera cromatografía de intercambio aniónico,
- b)
- una cromatografía de afinidad, una cromatografía de interacción hidrofóbica y una cromatografía en hidroxiapatita en el orden indicado, y
- c)
- una segunda cromatografía de intercambio aniónico.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde la cromatografía de afinidad está configurada como
cromatografía de afinidad de colorante.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la segunda cromatografía de
intercambio aniónico comprende un paso de lavado ácido.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, que comprende además al menos un paso
de filtración.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
donde tiene lugar una filtración después del último paso de
purificación cromatográfica del paso b).
6. Procedimiento según la reivindicación 4 o 5,
donde tiene lugar una filtración después de la segunda cromatografía
de intercambio aniónico.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la mezcla de proteínas es un
filtrado exento de células huésped del medio de cultivo, que es
sometido a una diafiltración antes de la primera cromatografía de
intercambio aniónico.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
donde el filtrado exento de células huésped es sometido a una
ultrafiltración antes de la diafiltración.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el medio de cultivo está exento
de proteínas y exento de componentes animales.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el procedimiento no comprende
cromatografía de fase inversa alguna.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el procedimiento no comprende
filtración en gel alguna.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el procedimiento no comprende
precipitación de proteína alguna.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde el procedimiento además no
comprende adicionales pasos de purificación cromatográfica.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la eritropoyetina enriquecida
presenta después de la segunda cromatografía de intercambio
aniónico un contenido de proteína de célula huésped de < 100
ppm.
15. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la eritropoyetina enriquecida
presenta después de la segunda cromatografía de intercambio
aniónico un contenido de DNA de célula huésped de < 100
pg/mg.
16. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la eritropoyetina enriquecida
presenta
después de la segunda cromatografía de intercambio aniónico una pureza de \geq 98%, determinada mediante
RP-HPLC.
después de la segunda cromatografía de intercambio aniónico una pureza de \geq 98%, determinada mediante
RP-HPLC.
17. Procedimiento según una de las
reivindicaciones precedentes, donde la eritropoyetina enriquecida
presenta después de la segunda cromatografía de intercambio
aniónico una actividad de \geq 100.000 UI/mg.
\newpage
18. Procedimiento para la producción de una
preparación líquida de eritropoyetina, que comprende los pasos
siguientes:
- I)
- enriquecimiento de la eritropoyetina, producida mediante cultivo de células huésped eucarióticas en un medio de cultivo, en una mezcla de proteínas, donde se efectúan los siguientes pasos a)-c) en el orden que se indica:
- a)
- una primera cromatografía de intercambio aniónico,
- b)
- una cromatografía de afinidad, una cromatografía de interacción hidrofóbica y una cromatografía en hidroxiapatita en el orden indicado, y
- c)
- una segunda cromatografía de intercambio aniónico, y
- II)
- realización de una preparación líquida con la eritropoyetina enriquecida en el paso I) y con sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tales como tampones, sales y estabilizadores.
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