ES2317827T3

ES2317827T3 - Metodo cronomatografico de purificacion de albumina.

Info

Publication number: ES2317827T3
Application number: ES00901252T
Authority: ES
Inventors: Hendrik Novozymes Biopharma UK Limited VAN URK; David John Novozymes Biopharma UK Limited MEAD; Philip Harvey Novozymes Biopharma UK Limited MORTON; Andrew John Novozymes Biopharma UK Limited CARTWRIGHT; Jason Novozymes Biopharma UK Limited CAMERON; David James Aventis Behring BALLANCE; Michel G. J. Aventis Behring GmbH GRANDGEORGE; Stephen Novozymes Biopharma UK Limited BEREZENKO; John Rodney Novozymes Biopharma UK Limited WOODROW; Darrell Novozymes Biopharma UK Limited SLEEP; Jean-Luc Bernard Novozymes Biopharma UK Limited VERON
Original assignee: Novozymes Biopharma UK Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1999-01-30
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2020-01-31
Also published as: AU763899B2; WO2000044772A3; ATE416254T1; EP2048234A1; KR20020008114A; SG119194A1; EP2048234B1; US20150056654A1; WO2000044772A2; KR20050061612A; HK1042521B; JP5474661B2; US20090171070A1; KR100577493B1; EP1149163A2; AU2120700A; CA2359705A1; CN1810834A; DK2048234T3; CN1339065A

Abstract

Proceso de purificación de una solución de albúmina recombinante, proceso comprendiendo: (a) exposición de una primera solución de albúmina recombinante de pH 8.0-9.5 tamponada con un tampón comprendiendo un catión bivalente en una concentración de 5-250 mM, y que posee una conductividad en la gama de 1 a 75 mS.cm-1 , a una fase de cromatografía de afinidad que es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y que utiliza una matriz de afinidad comprendiendo grupos dihidroxiborilo inmovilizados, para obtener una solución de albúmina purificada; y (b) exposición de la solución de albúmina purificada de fase (a) a una fase de concentración, una fase de diafiltración y a una fase de cromatografía de intercambio catiónico, donde la fase de diafiltración es realizada a un pH de 2.5-6.0, donde la fase de intercambio catiónico es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en condiciones tales que la albúmina glicosilada se liga al material de intercambio catiónico, y donde la solución de albúmina que sufre la cromatografía de intercambio catiónico tiene una concentración de albúmina de 10-250 g.L -1 ; (c) para producir una solución de albúmina final recombinante que posee un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina.

Description

Método cromatográfico de purificación de albúmina.

La presente invención se refiere a un proceso de purificación de la albúmina de suero humano proteica (HSA) extraída del suero o plasma, o albúmina humana recombinante (rHA) producida por transformación o transfección de un organismo no humano con una secuencia codificante de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano, incluyendo rHA producida usando animales o plantas transgénicos no humanos. En esta especificación, el término "albúmina" se refiere genéricamente a HSA y/o rHA.

Antecedentes de la invención

La albúmina es utilizada para tratar pacientes con quemaduras severas, golpes o pérdidas de sangre. También se usa para suplementar medios usados para el cultivo de células eucarióticas más grandes y como excipiente para compuestos activos farmacológicamente, de los cuales muchos necesitan ser estabilizados. Actualmente, la demanda del producto está satisfecha por la albúmina extraída de la sangre humana. Ejemplos de técnicas de extracción y de separación incluyen las que se describen en: JP 03/258 728 sobre el uso de un intercambiador catiónico; EP 428 758 sobre el uso de intercambio aniónico; y EP 452 753 sobre el uso de calentamiento, adición de sal y dia-
filtración.

La producción de rHA en microorganismos ha sido descrita en EP 570 916, EP 330 451 y EP 361 991. Unas técnicas de purificación para rHA han sido descritas en: WO 92/04367, eliminación de colorante derivado de una matriz; EP 464 590, eliminación de colorantes derivados de levadura; EP 319 067, precipitación alcalina y aplicación posterior de la rHA a una fase lipofílica; EP 570 916, centrifugado, ultrafiltración, tratamiento térmico, otra ultrafiltración, intercambio catiónico, cromatografía hidrofóbica, intercambio aniónico, y precipitación por sales está definida para proveer albúmina purificada a partir de sustancias relacionadas con un huésped, otros contaminantes y de coloración baja; WO 97/31947 y WO 96/37515, que contienen varios procesos de purificación completa.

La presente invención representa el resultado de desarrollo intensivo de los procesos descritos en WO 97/31947, WO 96/37515 y del proceso de US 5 728 553.

Resumen de la invención

Un primer aspecto de la presente invención provee un proceso de purificación de una solución de albúmina, el proceso comprendiendo (a) la exposición de una primera solución de albúmina recombinante de pH 8.0-9.5, tamponada con un tampón comprendiendo un catión bivalente en una concentración de 5-250 mM, y que posee una conductividad en la gama de 1 a 75 mS.cm^{-1}, para una fase de cromatografía por afinidad que se realiza en modo negativo con respecto a la albúmina y que utiliza una matriz de afinidad comprendiendo grupos dihidroxiborilo inmovilizados, para obtener una solución de albúmina purificada; y (b) la exposición de la solución de albúmina purificada de fase (a) a una fase de concentración, a una fase de diafiltración y a una fase de cromatografía de intercambio catiónico, donde la fase de diafiltración es realizada a un pH de 2.5-6.0, donde la fase de intercambio catiónico es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en condiciones tales que la albúmina glicosilada se enlaza con el material de intercambio catiónico, y donde la solución de albúmina que está sometida a una cromatografía por intercambio catiónico tiene una concentración de albúmina de 10-250 g.L^{-1}; (c) para producir una solución de albúmina recombinante final conteniendo un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina.

Preferiblemente, el pH de la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) es pH 8.0-9.0, y más preferiblemente pH 8.3- pH 8.6. Se prefiere que la primera solución de albúmina sea tamponada con un tampón con un pH comprendido en las gamas de pH mencionadas anteriormente.

El tampón usado en la fase (a) puede comprender un aminoácido en una concentración de 10-500 mM, preferiblemente 25-200 mM, y más preferiblemente 50-150 mM. Preferiblemente el aminoácido es glicina.

El tampón usado en la fase (a) puede comprender un catión monovalente en una concentración de 0-500 mM, preferiblemente 25-200 mM, y más preferiblemente 50-150 mM. Preferiblemente, el catión monovalente es sodio, preferiblemente en forma de NaCl. Por consiguiente, en una forma de realización preferida el tampón usado en la fase (a) comprende NaCl en una concentración de 0-500 mM, preferiblemente 25-200 mM, y más preferiblemente
50-150 mM.

Preferiblemente, el tampón usado en la fase (a) comprende un catión bivalente en una concentración de 10-100 mM. Preferiblemente, el catión bivalente es calcio, preferiblemente en forma de CaCl_{2}. Por consiguiente, en una forma de realización preferida el tampón usado en la fase (a) comprende CaCl_{2} en una concentración de 5-250 mM, preferiblemente 10-100 mM.

En una forma de realización particularmente preferida la primera solución de albúmina y/o tampón usada en la fase (a) comprende aproximadamente 100 mM de glicina, aproximadamente 100 mM de NaCl y aproximadamente 50 mM de CaCl_{2}.

Preferiblemente, la conductividad de la primera solución de albúmina y/o tampón usado en la fase (a) es 10-50 mS.cm^{-1} y más preferiblemente 18-22 mS.cm^{-1}.

De manera ventajosa, la concentración de albúmina en la primera solución de albúmina usada en la fase (a) se sitúa en la gama de 20-120 g.L^{-1}, preferiblemente 70-120 g.L^{-1}, y más preferiblemente 100\pm10 g.L^{-1}. Preferiblemente, la albúmina está cargada en menos de 0,5 volúmenes de columna, más preferiblemente en menos de 0,35 volúmenes de columna.

De manera adecuada, la matriz usada en la fase (a) comprende un ácido borónico. El término "ácido" como se utiliza en este caso incluye las sales de éste. De manera ventajosa, el ácido borónico está enlazado por medio de triazina o triazina sustituida, por ejemplo para formar monoborotriazina o diborotriazina, a un soporte tal como la agarosa. Preferiblemente, el ácido borónico es ácido aminofenilborónico.

Las publicaciones que cubren las alternativas al fenilboronato, tal como ligandos alifáticos y aromáticos sustituidos, incluyen Adamek, V. et al (1992) J. Chrom. 625, 91-99, Singhal, R.P. et al (1991) J. Chrom 543, 17-38 and Liu, X. et al (1994) 687, 61-69.

Después de la fase de cromatografía por afinidad de la fase (a), la solución de albúmina purificada es sometida a otra purificación, incluyendo la concentración, diafiltración y cromatografía de intercambio catiónico tal como se ha definido anteriormente en la fase (b). La albúmina puede ser purificada también usando una cromatografía de intercambio aniónico seguida por otra fase de diafiltración que se realiza con un pH 2.5-6.0. El orden de las fases de intercambio catiónico y aniónico pueden ser intercambiadas durante la realización de su objetivos de purificación. Desde un punto de vista operacional, un proceso mejor integrado es la cromatografía de intercambio catiónico seguida de la cromatografía de intercambio aniónico.

De manera adecuada, la solución de albúmina purificada producida según el proceso del primer aspecto de la presente invención está sometida a una o más fases de: intercambio de tampón; dilución; diálisis; ajuste de pH (preferiblemente con un pH superior a pH 2.0 o pH 4.0, y preferiblemente con un pH inferior a pH 10.0); tratamiento con un agente reductor (por ejemplo tal como se describe en EP 570 916); tratamiento de decoloración (por ejemplo con carbón); calentamiento (incluyendo esterilización); enfriamiento o preparación; formulación para una administración parenteral a un humano; o disposición en un contenedor final.

Por administración parenteral incluimos administración intravenosa, administración subcutánea y administración intramuscular. La albúmina puede funcionar como un excipiente para una proteína farmacológicamente activa, que puede ser administrada parenteralmente.

Un "contenedor final" es aquel que deja el fabricante y que es distribuido a clientes como hospitales y farmacias.

También se describe aquí el proceso de purificación de una solución de albúmina, el proceso comprendiendo una cromatografía de intercambio catiónico y una cromatografía de intercambio aniónico, donde la solución de albúmina purificada de esta manera es sometida opcionalmente a una o más fases de intercambio de tampón; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH (preferiblemente con un pH superior a pH 2.0 o pH 4.0, y preferiblemente con un pH inferior a pH 10.0); adición de agente reductor; tratamiento de decoloración (por ejemplo con carbón); calentamiento (incluyendo esterilización); enfriamiento; o preparación, pero sin purificación adicional, en particular purificación cromatográfica adicional, antes de ser dispuesta en un contenedor final.

La fase de cromatografía de intercambio catiónico puede seguir la fase de cromatografía de intercambio aniónico, o viceversa. Preferiblemente, la fase de cromatografía de intercambio catiónico es seguida por la fase de cromatografía de intercambio aniónico.

Preferiblemente, entre las fases de intercambio aniónico y catiónico, no existe ninguna fase de purificación adicional, aunque la albúmina puede ser sometida a un intercambio de tampón etc. tal y como se ha citado más arriba.

Por acondicionamiento, entendemos cualquier fase de manipulación no purificante que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para el uso final. El acondicionamiento puede incluir la adición de un estabilizador de albúmina tal como el octanoato y/u otro ácido graso, tal como un ácido graso C_{6} o C_{10}, o acetil triptofanato de sodio o mandelato. El acondicionamiento también puede incluir la adición de sales etc., y puede implicar el ajuste de la conductividad de la solución de albúmina.

La fase de intercambio catiónico de fase (b) del primer aspecto de la presente invención es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina, y las condiciones son elegidas de tal forma que la albúmina glicosilada se enlaza de manera más fuerte al material de intercambio catiónico que a la albúmina no glicosilada.

La fase de cromatografía de intercambio catiónico de fase (b) del primer y segundo aspecto de la presente invención puede usar una matriz de intercambio catiónico comercial tal como SP-Sefarosa FF, SP-Sferosil, CM-Sefarosa FF, CM- Celulosa, SE-Celulosa o S-Sferadex. Preferiblemente, la fase de intercambio catiónico usa una matriz que comprende sustituyentes de sulfopropilo inmovilizados como intercambiadores de cationes.

Preferiblemente, la solución de albúmina que sufre una cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) del primer aspecto de la invención tiene un pH de 4.5-6.0, más preferiblemente un pH de 5.0-5.6, y aún más preferiblemente un pH de 5.2-5.4.

La solución de albúmina sometida a una cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) del primer aspecto de la invención tiene una concentración de albúmina de 10-250 g.L^{-1}, preferiblemente 20-70 g.L^{-1}, y más preferiblemente 50\pm10 g.L^{-1}.

Preferiblemente, la solución de albúmina sometida a una cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) del primer aspecto de la invención comprende octanoato y/u otro ácido graso, y preferiblemente tiene una concentración fónica de octanoato de 2-15 mM, más preferiblemente 5-10 mM, e incluso más preferiblemente 6-9 mM.

Convenientemente, antes de la fase de intercambio catiónico, la solución de albúmina es sometida a uno o más de los siguientes procesos: (i) ajuste de pH (preferiblemente a un pH superior a pH 2.0 o pH 4.0, y preferiblemente a un pH inferior a pH 10.0); o (ii) acondicionamiento por adición de un estabilizador tal como el octanoato y/u otro ácido graso, tal como un ácido graso C_{6} o C_{10} o acetil triptofanato de sodio o mandelato. De forma alternativa, o adicionalmente, la solución de albúmina es sometida a una o más fases de: intercambio de tampón; dilución; diálisis; diafiltración; tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración (por ejemplo con carbón); calentamiento; enfriamiento; o acondicionamiento.

Generalmente, cualquier modificación implica adiciones, no eliminaciones. Preferiblemente, el pH de la solución de albúmina es ajustada por la adición de ácido acético. Preferiblemente, la solución de albúmina es concentrada por ultrafiltración.

Donde el método del primer aspecto de la presente invención incluye una fase de cromatografía de intercambio aniónico éste puede usar una matriz comercial de intercambio aniónico tal como Q sefarosa-FF, QMA-Sferosil, DEAE-Sferodex, Q- Hiper D, DEAE-celulosa, QAE-celulosa, o TMAE, DMAE, o DEAE Fractogel. Preferiblemente, la fase de intercambio aniónico utiliza una matriz que comprende sustituyentes de dialquilaminoalquilo inmovilizado (por ejemplo dietilaminoetilo) en forma de intercambiadores aniónicos.

En una forma de realización preferida la fase de cromatografía de intercambio aniónico del primer aspecto de la presente invención es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina.

Preferiblemente, la solución de albúmina sometida a una cromatografía de intercambio aniónico en modo negativo tiene un pH de 4.0-5.2, más preferiblemente un pH de 4.2-4.9, y aún más preferiblemente un pH de 4.5-4.7.

Preferiblemente, la solución de albúmina sometida la cromatografía de intercambio aniónico tiene una conductividad inferior a 4.0 mS.cm^{-1}, y más preferiblemente una conductividad de 1.0\pm0.5 mS.cm^{-1} y aún más preferiblemente 1.05\pm0.1 mS.cm^{-1}.

Convenientemente, antes de la fase de intercambio aniónico, la solución de albúmina es sometida a un ajuste del pH y/o a una dilución con agua. Preferiblemente, el pH de la solución de albúmina es ajustado con ácido acético.

En otra forma de realización preferida la fase de cromatografía de intercambio aniónico del primer aspecto de la presente invención es realizada en modo positivo con respecto a la albúmina.

De manera adecuada la solución de albúmina sometida en modo positivo a una cromatografía de intercambio aniónico tiene un pH de 6.0-8.0, preferiblemente un pH de 6.5-7.5, y aún más preferiblemente un pH de 6.8 a 7.2. Preferiblemente, la solución de albúmina ha sido ajustada al pH usando iones de ortofosfato.

En una forma de realización preferida la concentración de albúmina es 10-100 g.L^{-1}, más preferiblemente 25-80 g.L^{-1}, y más preferiblemente 30-60 g.L^{-1}. Preferiblemente, la conductividad de la solución de albúmina es 1.0-2.0 mS.cm^{-1}, preferiblemente 1.2 1.6 mS.cm^{-1}.

De manera adecuada, la albúmina es eluida a partir del intercambiador aniónico con un tampón comprendiendo 20-90 mM, preferiblemente 30-70 mM y más preferiblemente 35-65 mM de una sal de ácido fosfórico, por ejemplo fosfato sódico. Preferiblemente, la albúmina es eluida a partir del intercambiador aniónico con un tampón de pH 6.0-8.0, preferiblemente pH 6.5-7.5.

Es particularmente preferido que el proceso del primer aspecto de la presente invención sea precedido por una o más de las siguientes fases: fermentación; separación de albúmina de una célula huésped de producción de albúmina recombinante; sometimiento del centrado de la fermentación a una fase de manipulación no purificante que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para un uso final; cromatografía de intercambio catiónico, preferiblemente usando sustituyentes de sulfopropilo como intercambiadores catiónicos; cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente usando sustituyentes de dietilaminoalquilo como intercambiadores aniónicos o cromatografía de afinidad, preferiblemente usando una matriz de afinidad que comprende un colorante inmovilizado específico de la albúmina, preferiblemente un colorante de tipo azul Cibacron.

En una forma de realización preferida del primer aspecto de la presente invención se provee un proceso de purificación de albúmina que comprende las siguientes fases:

(a): exposición de una solución de albúmina recombinante a una fase de cromatografía de intercambio catiónico realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(b): recogida de un eluato de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(c): exposición del eluato de intercambio catiónico a una fase de cromatografía por intercambio aniónico realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(d): recogida de un eluato de intercambio aniónico conteniendo albúmina;

(e): exposición del eluato de intercambio aniónico a una fase de cromatografía por afinidad realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(f): recogida de un eluato de cromatografía de afinidad conteniendo albúmina;

(g): exposición del eluato de cromatografía de afinidad a una fase de cromatografía por afinidad realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en modo positivo con respecto a los glicoconjugados (albúmina glicosilada y/o glicoproteínas) según la fase (a) del primer aspecto de la invención;

(h): recogida del flujo de cromatografía de afinidad conteniendo albúmina;

(i): exposición del flujo de cromatografía de afinidad a fases de concentración, diafiltración y fases de cromatografía por intercambio catiónico según la fase (b) del primer aspecto de la invención para producir una albúmina recombinante que contiene un flujo de intercambio catiónico que tiene un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina;

(j): recogida del flujo de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(k): exposición del flujo de intercambio catiónico a una fase de cromatografía de intercambio aniónico realizada en modo negativo o modo positivo;

(l): recogida del flujo de intercambio aniónico conteniendo albúmina donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo negativo; o elución a partir de la matriz de intercambio aniónico de un eluato de intercambio aniónico donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo positivo;

y donde cualquiera de las fases de purificación respectivas son precedidas o seguidas opcionalmente por una o más fases de: intercambio de tampón; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH (preferiblemente con un pH superior a pH 2.0 o pH 4.0, y preferiblemente con un pH inferior a pH 10.0); tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración (por ejemplo con carbón); calentamiento (incluyendo la esterilización); enfriamiento; o una fase de manipulación de no purificación que mejora el medio ambiente o la condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para un uso final; y donde las fases (a)-(1) son seguidas por una fase de diafiltración que se realiza con un pH de 2.5-6.0.

En consecuencia, las fases de purificación pueden o no pueden estar separadas por una o más fases de: intercambio de tampones; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH; tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración; calentamiento; enfriamiento; o una fase de manipulación de no purificación que mejora el medio ambiente o la condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para un uso final (es decir acondicionamiento).

Cuando cualquier fase es realizada en modo negativo para la albúmina, los lavados pueden ser recogidos así como el flujo.

En otra forma de realización preferida del primer aspecto de la presente invención, se provee el proceso de purificación de la albúmina que comprende las fases siguientes:

(a): la exposición de una solución de albúmina recombinante a una fase de cromatografía de intercambio catiónico realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(b): recogida de un eluato de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(d): recogida de un eluato de intercambio aniónico conteniendo albúmina;

(e): exposición del eluato de intercambio aniónico a una fase de cromatografía de afinidad realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(g): exposición del eluato de cromatografía de afinidad a una fase de cromatografía por afinidad realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en modo positivo con respecto a los glicoconjugados según la fase (a) del primer aspecto de la invención;

(i): exposición del flujo de matriz de afinidad a una fase de cromatografía de intercambio aniónico realizada en modo negativo o en modo positivo con respecto a la albúmina;

(j): recogida del flujo de intercambio aniónico conteniendo albúmina donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo negativo; o elución de la matriz de intercambio aniónico de un eluato de intercambio aniónico donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo positivo;

(k): exposición de la solución de albúmina purificada por la fase de cromatografía de intercambio aniónico a una concentración, diafiltración y por fases de cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) del primer aspecto de la invención para producir un flujo de intercambio catiónico conteniendo la albúmina recombinante que posee un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina;

(l): recogida del flujo de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

y donde cualquiera de las fases de purificación respectivas son opcionalmente precedidas o seguidas de una o más fases de intercambio de tampones; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH (preferiblemente con un pH superior a un pH 2.0 o pH 4.0, y preferiblemente a un pH inferior a un pH 10.0); tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración (por ejemplo con carbón); calentamiento (incluyendo esterilización); enfriamiento; o una fase de manipulación de no purificación que mejora el medio ambiente o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para un uso final (es decir, acondicionamiento).

Por consiguiente, las fases de purificación pueden o no estar separadas por una o más fases de: intercambio de tampones; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH; tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración; calentamiento; enfriamiento; o una fase de manipulación no purificante que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para el uso final (es decir el acondicionamiento).

Preferiblemente, antes de la fase de intercambio catiónico en modo positivo de la invención, la solución de albúmina es acondicionada como se ha mencionado más arriba. Preferiblemente, el octanoato es añadido a ésta en una concentración final de aproximadamente 1-10 mM y el pH es ajustado a aproximadamente 4.0-5.0.

De manera ventajosa, la albúmina retenida en la fase de intercambio catiónico positiva es lavada con una solución con alto contenido en sal (por ejemplo de 0.5-3.0M de NaCl tamponada con un pH de 3.5 a 4.5, preferiblemente con aproximadamente un pH 4.0, de 10-100 mM, preferiblemente 20-40 mM, por ejemplo 25-30 mM de acetato sódico) antes de ser eluida.

Preferiblemente, la albúmina es eluida en la fase de intercambio catiónico usando un tampón que contiene un compuesto que posee una afinidad específica para la albúmina, especialmente un ácido, por ejemplo octanoato u otro ácido graso, por ejemplo C_{6} o C_{10}.

De manera adecuada, la albúmina es eluida a partir del intercambiador aniónico, en la primera fase de intercambio aniónico, con un tampón que contiene un nivel alto (por ejemplo de al menos 50 mM, preferiblemente 50-200 mM, por ejemplo 80-150 mM) de una sal de ácido bórico, por ejemplo tetraborato de sodio o potasio.

Preferiblemente, la fase de cromatografía y afinidad en modo positivo utiliza una resina comprendiendo un colorante específico de albúmina inmovilizada, tal como un colorante de tipo azul de Cibacron, preferiblemente inmovilizado en la resina mediante un separador tal como 1,4-diaminobutano u otro separador de C_{1-8}, preferiblemente C_{1-6}, por ejemplo C_{1-5} y más preferiblemente con una longitud C_{4}, preferiblemente con una sustitución \alpha-\omega-diamino. Preferiblemente, la matriz es la "Matriz Delta Blue" (DBA), preparada tal y como está descrito en WO 96/37515 y
WO 97/31947.

El método de la presente invención tal y como está definido por el primer aspecto provee un proceso de reducción del nivel de iones níquel en una solución de albúmina, el proceso comprendiendo la exposición de la solución de albúmina a una fase de diafiltración realizada con un pH de 2.5-6.0, y de eliminación de iones níquel. Preferiblemente, la solución de albúmina está sometida a un pH de 4.0 a 7.5, preferiblemente 4.0 a 6.0, más preferiblemente pH 4.0 a 5.5, aún más preferiblemente un pH de 4.0 a 5.0, y más preferiblemente de 4.0 a 4.5.

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Por consiguiente, el proceso del primer aspecto de la invención comprende una diafiltración contra un tampón de pH 2.5- 6.0, o contra un tampón que posee un pH comprendido en las gamas de pH mencionadas anteriormente. Como se ha descrito aquí también, la eliminación de níquel puede ser conseguida usando una cromatografía de permeación en gel con un tampón que posee un pH comprendido en las gamas de pH mencionadas anteriormente. La cromatografía de permeación en gel puede ser realizada usando Sefacril S200 HR. Preferiblemente, el tampón comprende acetato y/o iones malato. De forma alternativa, hay suficiente capacidad amortiguadora de la albúmina para ajustar el pH y realizar la diafiltración/cromatografía de permeación en gel con agua.

De forma alternativa, los iones níquel, pueden ser quelados y eliminados de la albúmina. Esto se puede conseguir usando un agente quelante tal como el ácido iminodiacético inmovilizado en sefarosa (Chelating Sepharose, Pharmacia) u otro polímero (tal como Chelex, Bio Rad Laboratories) con un pH bajo, preferiblemente pH 4.0 a 6.0, más preferiblemente pH 4.0 a 4.5. Por consiguiente, también puede ser útil incluir la cromatografía de permeación en gel descrita anteriormente y/o las fases de quelación de iones níquel en un método según el primer aspecto de la invención además de la fase de diafiltración de pH bajo.

En una forma de realización preferida del primer aspecto de la presente invención la solución de albúmina inicial es derivada de un medio de cultivo fúngico obtenido por cultivo de un hongo transformado con una secuencia de nucleótidos codificante de albúmina en un medio de fermentación, donde dicho hongo expresa la albúmina y la segrega dentro del medio. El hongo puede ser un hongo filamentoso tal como una especie de Aspergillus. Preferiblemente, el hongo es una levadura. Más preferiblemente el hongo es del género Saccharomyces (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae), el género Kluyveromices (por ejemplo Kluyveromices lactis) o el género Pichia (por ejemplo Pichia pastoris).

Preferiblemente, al menos alguna albúmina purificada según el primer aspecto de la presente invención es producida por una célula fúngica tal y como se ha definido anteriormente.

También se ha descrito aquí una solución de albúmina obtenible por un proceso según el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, la solución de albúmina comprende albúmina recombinante que muestra una o más de las siguientes propiedades:

(1): menos del 0,5 % (p/p) se enlaza a la Concanavalina A, preferiblemente menos del 0,2 % o 0,15%;

(2): un nivel de glicación inferior a 0,6 moles de hexosa/ mol de proteína, y preferiblemente menos de 0,10, 0,075 o 0,05 moles de hexosa/ mol de proteína.

Una solución de albúmina purificada preparada por un proceso de la presente invención puede ser procesada también según su utilidad prevista. Por ejemplo, puede ser ultrafiltrada a través de una membrana de ultrafiltración para obtener un retenido de ultrafiltración con una concentración de albúmina de al menos aproximadamente 10 g, preferiblemente al menos 40 g o más preferiblemente aproximadamente 80 g, de albúmina por litro, con el retenido de ultrafiltración siendo diafiltrado con respeto a al menos 5 equivalentes de retenido de agua.

También se describe aquí una secuencia de ADN, plásmido o célula que comprende una secuencia codificante de albúmina recombinante donde el extremo 3' de la secuencia codificante de albúmina recombinante comprende dos o más codones de parada de traducción dentro del marco, y preferiblemente tres codones de parada de traducción dentro del marco.

Tales células pueden ser eucarióticas o procarióticas. Las células recombinantes pueden ser bacterias (por ejemplo E. coli o Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo una levadura del género Saccharomyces (por ejemplo S. cerevisiae), del género Kluyveromyces (por ejemplo K. lactis) o del género Pichia (por ejemplo P. pastoris), hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), plantas o células vegetales, animales o células animales (que pueden ser transgénicas) o células de insecto.

Preferiblemente, al menos alguna albúmina purificada según el primer aspecto de la presente invención es producida por tal célula.

Preferiblemente, la (o al menos algo de la) albúmina recombinante purificada por el método del primer aspecto de la presente invención es producida por un proceso comprendiendo el cultivo de una célula fúngica expresando una secuencia codificante de albúmina recombinante y la obtención de la albúmina, donde la célula tiene una modificación genética en una región codificante de un gen que codifica una enzima de la proteína O-manosiltransferasa (PMT) o en una región implicada en la expresión de un gen que codifica una enzima PMT que implica que la célula tenga al menos una capacidad reducida de manosilación de la albúmina expresada de forma recombinante y donde el medio de cultivo es de al menos 1,000L y posee un pH de 6,0-6,8.

En el significado de la presente invención, la modificación genética significa preferiblemente cualquier supresión, sustitución, deleción o adición de una o más bases o de un fragmento de las secuencias de ADN de células fúngicas. Tales modificaciones genéticas pueden ser obtenidas in vitro (directamente en ADN aislado) o in situ, por ejemplo por técnicas de ingeniería genética o por exposición de las células micóticas a agentes mutagénicos. Los agentes mutagénicos incluyen por ejemplo agentes físicos tales como rayos energéticos (rayos X, rayos \gamma, UV, etc.) o agentes químicos capaces de reaccionar con diversos grupos de ADN funcionales, tales como agentes alquilantes (EMS, NQO, etc.), agentes bisalquilantes, agentes intercalantes, etc. Unas modificaciones genéticas también pueden ser obtenidas por disrupción genética, por ejemplo según el método descrito por Rotstein et al. [Meth. Enzimol. 194 (1991), 281-301]. Según este método, parte o la totalidad de un gen es sustituida, a través de una recombinación homóloga, por una versión modificada in vitro. Las modificaciones genéticas pueden ser obtenidas también por cualquier inserción mutacional en las secuencias de ADN, tales como transposones, fagos, etc.

Es conocido que ciertas modificaciones tales como mutaciones puntuales pueden ser invertidas o atenuadas por mecanismos celulares. Tales modificaciones no pueden proporcionar las formas más útiles de células micóticas modificadas de esta invención ya que sus propiedades fenotípicas ya no pueden ser muy estables. Por consiguiente, se prefiere que la(s) modificación(es) genética(s) sea(n) heredada(s) de forma estable y/o no sea(n) invertida(s) y/o no sea(n) rezumante(s). Tal(es) modificación(es) es(son) generalmente obtenida(s) por deleción o disrupción
génica.

Por un "mutante rezumante" y variantes gramaticales del mismo, incluimos mutantes que son producidos por una inactivación parcial en vez de completa de la función de tipo salvaje.

La(s) modificación(es) genética(s) soportada(s) por las células micóticas definidas anteriormente se localiza(n) en una región codificante de un gen que codifica una enzima PMT y/o en una región que influye en la expresión del gen que codifica una enzima PMT.

La capacidad reducida de las células micóticas de la invención para proteínas manosiladas produce en consecuencia la producción de enzimas inactivas debido a cambios estructurales y/o conformacionales, de la producción de enzimas con propiedades biológicas alteradas, de la ausencia de producción de dichas enzimas, o de la producción de dichas enzimas a niveles bajos.

La ruta de manosilación de la célula fúngica implica la fijación de un primer residuo de mannosilo al grupo hidróxilo de seril y/o treonil aminoácidos de proteínas o péptidos, y luego la extensión para di- y oligosacáridos O-enlazados mediante la adición posterior de residuos de manosilo. El primer residuo de manosilo es transferido a partir de la dolicol monofosfato manosa (Dol-P-Man) a la proteína en el retículo endoplásmico, y los residuos de manosilo adicionales son transferidos desde GPD-Man en el golgi.

Las células fúngicas modificadas pueden implicar modificación(es) genética(s) en al menos un gen PMT cuyo producto de expresión está implicado en la fijación de un residuo de manosilo al grupo hidróxilo de seril o treonil aminoácidos.

El producto de expresión de un gen PMT está incluido en la transferencia de un residuo de manosilo del precursor de Dol-P-Man al grupo hidróxilo de los seril o treonil aminoácidos. Los genes PMT ejemplares incluyen PMT1, PMT2, PMT3, PMT4, PMT5, PMT6 o PMT7. Preferiblemente el gen PMT es PMT1, PMT5 o PMT7.

De manera alternativa, la célula fúngica tiene una modificación genética al interior de una región que afecta a la expresión o producto de un gen PMT. Una región que afecta a la expresión de un gen PMT puede, por ejemplo, afectar a los niveles de transcripción de ARNm o niveles de producto de PMT.

WO 94/04687 describe la preparación de S. cerevisiae deficiente en actividad de O-manosilación. Una célula de S. cerevisiae deficitaria en actividad de O-manosilación fue preparada por ruptura génica, por inserción del gen URA3 en el sitio de restricción HindIII del PMT1 ORF. Los mutantes resultantes fueron cultivados en YEPD (aproximadamente pH 6.95) o en medios mínimos + Ade, + Leu (con un pH 4.75 aproximadamente, decreciente con un cultivo de levadura). De forma inesperada, hemos descubierto que los pH de los medios de cultivo usados en WO 94/04687 no son óptimos para el cultivo a gran escala de mutantes PMT para producir la albúmina segregada. Hemos descubierto que un medio de crecimiento de pH 6.0-6.8 es ventajoso en cuanto a la integridad de la célula huésped durante la fermentación a gran escala.

Además de las modificaciones en un gen PMT implicado en la fijación de residuos de manosilo al grupo hidróxilo de los seril o treonil aminoácidos, también se ha descrito que las células fúngicas pueden implicar modificaciones en los genes incluidos en adiciones posteriores de residuos de manosilo produciendo di- u oligosacáridos, o en la síntesis del donante de residuos de manosilo (Dol-P-Man).

WO 94/26873 describe una cepa de S. cerevisiae que se caracteriza por ser deficiente en O-manosilación de un grupo hidróxilo de al menos un residuo de serina o al menos uno de treonina en una proteína expresada por la cepa; la proteína puede ser heteróloga y codificada en un vector.

La célula fúngica modificada genéticamente puede ser elegida a partir de hongos filamentosos y levaduras. Preferiblemente, las células son levaduras, por ejemplo una levadura del género Saccharomyces (por ejemplo S. cerevisiae), el género Kluyveromyces (por ejemplo K. lactis) o el género Pichia (por ejemplo P. pastoris).

Preferiblemente, la célula fúngica modificada genéticamente que expresa la secuencia codificante de albúmina recombinante está cultivada en un medio de cultivo de al menos 5.000 L, más preferiblemente al menos 7.500 L.

Preferiblemente, la célula fúngica modificada genéticamente para la expresión de la secuencia codificante de albúmina recombinante está cultivada en un medio de cultivo que se mantiene en la gama de pH 6.2-6.7, más preferiblemente de pH 6.3-6.5. Preferiblemente, el pH del medio de cultivo es mantenido usando un controlador de pH fijado a un pH entre pH 6.3 y pH 6.5, preferiblemente un pH entre 6.35 y 6.45 y más preferiblemente aproximadamente un pH 6.4. Preferiblemente, el controlador de pH está controlado dentro de 0.20 o 0.10 unidades de pH de cualquier valor de pH dentro de cualquiera de las gamas de pH mencionadas o dentro de 0.20 o 0.10 unidades de pH de pH 6.4.

En una forma de realización alternativa, la célula fúngica modificada genéticamente es cultivada en un medio de cultivo que es mantenido en la gama de pH 5.30-pH 5.90, preferiblemente pH 5.50-pH 5.90; pH 5.40-pH 5.90 o pH 5.40-5.60. Preferiblemente, el valor de ajuste de control inferior se sitúa entre pH 5.40 y pH 5.60, preferiblemente entre pH 5.45 y pH 5.55, y preferiblemente el valor de ajuste de control inferior es aproximadamente pH 5.50.

La presente invención provee procesos para la preparación de albúmina altamente purificada. La albúmina se caracteriza por niveles de colorantes extremadamente bajos. El término "colorante" como se utiliza en este caso indica cualquier compuesto de coloración de la albúmina. Por ejemplo, un pigmento es un colorante que surge del organismo, tal como la levadura, que se utiliza para preparar albúmina recombinante, mientras que un tinte es un colorante que está producido a partir de fases cromatográficas para purificar la albúmina.

La albúmina se caracteriza también por niveles extremadamente bajos de, o por no contener esencialmente aluminio, lactato, citrato, metales, proteínas humanas sin albúmina, tales como inmunoglobulinas, activador de precalicreína, transferrina, glicoproteína de \alpha_{1}-ácido, hemoglobina y factores de coagulación sanguínea, proteínas procarióticas, fragmentos de albúmina, agregados o polímeros de albúmina, o endotoxina, bilirrubina, hemo, proteínas de levadura, proteínas animales y virus. Por esencialmente libres se hace referencia a los niveles inferiores a los niveles
detectables.

La albúmina de la invención puede ser al menos un 99,5 % monomérica y dimérica, preferiblemente esencialmente un 100% monomérica y dimérica. Hasta 0,5%, preferiblemente 0,2% de trímero es tolerable aunque unas formas más grandes de albúmina están generalmente ausentes. Se puede caracterizar también por una o más de las siguientes características. Posee un nivel de iones níquel inferior a 100 ng, en base a un gramo de albúmina; un nivel de glicación inferior a 0,6, preferiblemente inferior a 0,10, 0,075 o 0,05 moles de hexosa/mol de proteína medidos en el ensayo de productos de Amadori; un C-término intacto, es decir homogéneo; un contenido de albúmina de unión a coNA inferior al 0,5% (p/p), preferiblemente inferior al 0,2 o 0,15%; un contenido sin tiol de al menos 0,85 mol de SH/mol de proteína; y esencialmente ningún ácido graso C18 o C20. Al menos el 99%, preferiblemente al menos 99,9%, en peso de la proteína en las preparaciones de albúmina purificadas por el proceso de la invención es albúmina. Tal albúmina de gran pureza tiene menos posibilidades de causar efectos secundarios adversos.

La rHA purificada según la invención estará generalmente totalmente libre de contaminantes derivados de suero, ya que ninguno está presente en la materia prima.

Conformemente a la presente invención, la albúmina recombinante de gran pureza es obtenida a partir de una solución de albúmina impura. El proceso comprende una o más de las fases siguientes: cultivo en un medio de fermentación de un microorganismo transformado con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de albúmina humana; preferiblemente la separación del microorganismo del medio de fermentación; acondicionamiento del medio, si es necesario, para una purificación posterior; paso del medio acondicionado por tres fases sucesivas de cromatografía; ultrafiltración/diafiltración del producto; paso del producto ultrafiltrado por otra fase de cromatografía según la fase (a) del primer aspecto de la invención; ultrafiltración/diafiltración de nuevo antes de la purificación por dos fases cromatográficas adicionales según la fase (b) del primer aspecto de la invención; y ultrafiltración/diafiltración final.

La albúmina recombinante puede ser obtenida a partir de un animal transgénico no humano, tal como una cabra, oveja o ganado bovino, por ejemplo, a partir de la leche o de la sangre del animal o, en caso de pollo transgénico, de la clara de huevo.

En otra alternativa más, la albúmina recombinante puede ser obtenida a partir de una planta transgénica no humana, tal como el tabaco, la patata o un grano (maíz).

En ejemplos donde la albúmina está purificada a partir de fuentes sin plasma, unos procesos de purificación de técnica anterior producen un nivel relativamente alto de iones níquel. La albúmina es conocida por el hecho de tener sitios de unión de gran afinidad para iones cobre, níquel y zinc en el N-término de la molécula. En consecuencia, la molécula de albúmina concentra de manera eficaz iones níquel de los medios usados para el cultivo y/o la purificación. La albúmina purificada según esta invención tiene un nivel sorprendentemente bajo de iones níquel.

Antes o después de cualquiera de los procedimientos de la presente invención la solución de albúmina puede ser expuesta a un intercambio de tampones, una concentración, dilución, calentamiento (incluyendo esterilización), un enfriamiento o puede tener sales etc. añadidas a la solución de albúmina que pueden, por ejemplo, acondicionar o ajustar el pH de la solución. Opcionalmente, la albúmina puede ser tratada con un agente reductor o puede sufrir una fase de decoloración.

El producto final puede ser formulado para darle una estabilidad adicional y puede ser formulado según su utilidad prevista, por ejemplo puede ser formulado para una administración parenteral, preferiblemente administración parenteral a un humano. De manera adecuada, la albúmina es sometida a una esterilización.

Preferiblemente, el producto de albúmina de gran pureza de la invención contiene al menos 100 g, más preferiblemente 1 kg o 10 kg de albúmina, que pueden ser divididos en una pluralidad de viales.

La albúmina de la presente invención puede cumplir varias funciones además del uso terapéutico en el tratamiento de quemaduras, golpes o pérdidas de sangre. Por ejemplo, se puede usar como un excipiente de producto final (por ejemplo en formulaciones líquidas, formulaciones liofilizadas o formulaciones para la inhalación), para estabilizar otras proteínas durante la purificación, en cultivo celular, producción viral, terapia génica, medios de fertilización in vitro, y para recubrir dispositivos médicos tales como cánulas, catéteres y prótesis vasculares.

Se debe apreciar que cada aspecto de la invención pueda ser combinado con uno o más aspectos adicionales de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La invención está ilustrada también en los dibujos anexos en los que:

Las figuras 1 a 7 respectivamente muestran la construcción de los plásmidos pAYE309, pAYE440, pAYE438, pDB2241, pDB2242, pDB2243 y pDB2244; y

La figura 8 muestra una espectrometría de masas por electrospray de la fracción de rHA que se une a coNA de rHA preparada según la invención.

La figura 9 muestra el efecto del pH y del tiempo en la eliminación de níquel de rHA por Chelex^{TM}

Las figuras 10 y 11 representan dos secuencias de ADN con homología a la región PMT1 de Saccharomyces cerevisiae que codifica la proteína.

Las figuras 12 a 15 representan cuatro secuencias de ADN con homología a la región PMT7 de Saccharomyces cerevisiae que codifica la proteína.

Las figuras 16 y 17 representan dos secuencias de ADN con homología a la región PMT5 Saccharomyces cerevisiae que codifica la proteína.

Descripción detallada de formas de realización preferidas de la invención

El proceso del primer aspecto de la presente invención es utilizado para obtener albúmina de gran pureza a partir de una solución de albúmina recombinante impura de varias fuentes, particularmente es aplicable a la purificación de albúmina humana recombinante (rHA). La albúmina producida según la invención puede ser cualquier albúmina mamífera, tal como la albúmina de rata, bovina u ovina, aunque es preferiblemente albúmina humana.

El ADN que codifica la albúmina puede ser expresado en un huésped no humano adecuado para producir albúmina. De esta manera, el ADN puede ser usado según unas técnicas conocidas, modificado de forma adecuada en vista de las instrucciones aquí contenidas, para construir un vector de expresión, que se va a usar después para transformar una célula huésped no humana apropiada para la expresión y la producción de albúmina.

El ADN que codifica la albúmina puede ser unido a una amplia variedad de otras secuencias de ADN para ser introducido dentro de un huésped apropiado. El ADN compañero dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma de introducción del ADN al interior del huésped, y si el mantenimiento o integración episomales son deseados.

Generalmente, el ADN es insertado en un vector de expresión, tal como un plásmido, en una orientación apropiada y un marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede estar ligado a las secuencias de nucleótidos de control reguladoras de la transcripción y de la traducción apropiadas reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. Es adecuado incorporar más de una secuencia de ADN que codifica un codón de parada de la traducción, tal como UAA, UAG o UGA, para minimizar la ultralectura traduccional y evitar así la producción de proteínas de fusión no naturales, alargadas. Una secuencia de ADN que codifica el codón UAA de parada de la traducción es preferida. El vector es introducido después en el huésped a través de técnicas estándar, seguido de una selección de las células huéspedes transformadas. Las células huéspedes transformadas de esta manera son cultivadas después durante un tiempo suficiente y en condiciones apropiadas conocidas por los expertos en la técnica, y en vista de las conclusiones descritas aquí, para permitir la expresión de la albúmina, que puede ser recuperada después.

Muchos sistemas de expresión son conocidos, incluyendo bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Kluyveromyces lactis), hongos filamentosos (por ejemplo Aspergillus), células vegetales, células animales y células de insectos. Los microorganismos preferidos son las levaduras de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis y Pichia pastoris. Es particularmente ventajoso usar una levadura deficiente de una o más proteína(s) manosil transferasas de implicadas en la O-glicosilación de proteínas, por ejemplo por disrupción de la secuencia codificante del gen.

La secuencia de la proteína albúmina no contiene ningún sitio de glicosilación N-ligada y no ha sido determinada para ser modificada, en la naturaleza, por glicosilación O-ligada. No obstante, se ha descubierto que la rHA producida en un número de especies de levadura puede ser modificada por glicosilación O-ligada, que implica habitualmente manosa. La albúmina manosilada puede ligarse con la lectina Concanavalina A. La cantidad de albúmina manosilada producida por la levadura puede ser reducida usando una cepa de levadura deficiente de uno o más de los genes PMT (WO 94/04687).

La forma más apropiada de conseguirlo consiste en crear una levadura que tenga un defecto en su genoma de tal forma que se produzca un nivel reducido de una de las proteínas Pmt. Por ejemplo, puede haber una deleción, inserción o transposición en la secuencia codificante o las regiones reguladoras (o en otro gen de regulación de la expresión de uno de los genes PMT) de tal forma que se produzca poca cantidad o ninguna proteína Pmt. De forma alternativa, la levadura puede ser transformada para producir un agente anti-Pmt, tal como un anticuerpo anti-Pmt.

Para modificar uno de los genes PMT para producir un nivel reducido de proteína PMT, una mutagénesis dirigida u otras técnicas conocidas pueden ser empleadas para crear una mutación única o mutaciones múltiples, como reemplazos, inserciones, deleciones, y transposiciones, tal y como está descrito en Botstein y Shortie. "Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis", Science, 229: 193-210 (1985). Las mutaciones adecuadas incluyen mutaciones de terminación de cadena (claramente los codones de parada introducidos en la proximidad del extremo 3' pueden tener un efecto insuficiente sobre el producto génico para que sea provechoso; el experto en la materia podrá crear fácilmente una mutación en dichos tres cuartos 5' de la secuencia codificante), mutaciones de puntos que alteran el marco de lectura, pequeñas a grandes deleciones de la secuencia codificante, mutaciones en el promotor o terminador que afectan la expresión génica y mutaciones que desestabilizan el ARNm. Unas mutaciones específicas pueden ser introducidas por una extensión de la técnica de disrupción génica conocida como la transposición de genes (Winston, F. et al (1983) Methods Enzymol. 101, 211-228).

Generalmente, se usa un marcador seleccionable para disrumpir una secuencia de genes, pero este no debe ser el caso, particularmente si uno puede detectar el evento de disrupción fenotípicamente. En muchos ejemplos la inserción del intrón será tal que un codón de parada estará presente en un marco con la secuencia Pmt y la secuencia codificante insertada no será traducida. De forma alternativa, la secuencia insertada puede encontrarse en un marco de lectura diferente a Pmt.

El gen puede tener una o más porciones (incluyendo opcionalmente regiones reguladoras, hasta el gen completo) cortadas o invertidas, o ésta puede tener una parte insertada, con el fin de proporcionar una producción reducida de proteína de uno de los loci de PMT y/o en la producción de proteína a partir de uno de los loci de PMT que poseen un nivel de actividad reducido.

Los genes PMT de Saccharomyces cerevisiae codifican una familia de siete (PMT1-PMT7) proteínas O-manosiltransferasas de especificidad variada. Estas proteínas son conocidas también como dolicol fosfato-D-manosa: proteinotransferasas, dolicil-fosfato-D-manosa: proteína O-D-manosiltransferasas o fosfomanosa transferasas (Gentzsch y Tanner, EMBO 15, 5752-5757, 1996, y las referencias incluidas ahí). Esta familia de enzimas de membrana integral cataliza la transferencia de manosa, en forma de dolicil fosfato manosa, sobre el grupo hidróxilo de serina o treonina al interior de la cadena polipeptídica, descrita por la reacción siguiente:

1000

La prueba disponible sugiere que la síntesis de dolichil fosfato manosa y la transferencia posterior de manosa a la proteína ocurre en el retículo endoplásmico.

Es evidente que las enzimas de esta familia poseen diferentes especificidades de sustrato (proteína) (Gentzsch and Tanner (1997) Glycobiology 7, 481-486). Cinco de siete proteínas de prueba eran sustratos para Pmt1p y Pmt2p, los productos de los genes PMT1 y PMT2 respectivamente, tal como mostrados por su baja glicosilación en cepas de Saccharomyces cerevisiae de mutantes pmt1 o pmt2. Aparentemente, otras dos proteínas de prueba no fueron afectadas por mutaciones PMT1 o bien PMT2, pero fueron infraglicosiladas en una cepa mutante pmt4.

La enzima de la proteína O-manosiltransferasa Pmt1p de 92 kD ha sido purificada con respecto a su homogeneidad a partir de membranas solubilizadas de Saccharomyces cerevisiae (Strahl-Bolsinger y Tanner (1991) Eur. J. Biochem. 196, 185-190). El gen que codifica para la Pmt1p (PMT1) ha sido clonado y secuenciado. El gen está localizado en el cromosoma IV y codifica un polipéptido único con una secuencia primaria de 817 aminoácidos (Strahl-Bolsinger et al (1993) P.N.A.S. USA 90, 8164- 8168). La información de secuencia de PMT1 (y otros genes PMT) puede ser usada para la identificación de genes que codifican manosiltransferasas relacionadas en Saccharomyces cerevisiae.

Las secuencias mostradas en las Figuras 10 y 11 son homólogas a la región PMT1 de Saccharomyces cerevisiae codificante de proteínas, las secuencias mostradas en las Figuras 12 a 15 son homólogas a la región PMT7 de Saccharomyces cerevisiae codificante de proteínas y las secuencias mostradas en las Figuras 16 a 17 son homólogas a la región PMT5 de Saccharomyces cerevisiae codificante de proteínas. Los expertos en la materia apreciarán el hecho de que cualquiera de estas secuencias pueda ser usada para identificar (o disrumpir) un gen de la manosiltransferasa de Saccharomyces cerevisiae. Se apreciará el hecho de que unos fragmentos de las secuencias representadas en las Figuras 10 a 17 pueden ser usados de manera similar, como secuencias homólogas a las secuencias representadas en las Figuras 10 a 17 y a sus fragmentos. Técnicas para generar secuencias homólogas son conocidas en la técnica.

Se debe apreciar el hecho de que por una secuencia homóloga, incluimos secuencias que poseen una homología de al menos el 70%, 80%, 90%, 95%, o 98% con una secuencia mostrada en cualquiera de las figuras 10 a 17, o con un fragmento de una secuencia mostrada en cualquiera de las figuras 10 a 17.

El porcentaje de homología puede ser determinado, por ejemplo, mediante la comparación de la información de secuencia usando el programa de ordenador GAP, versión 6.0 descrita por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponibles en University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Neddleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), y revisado por Smith y Waterman (Adv. Appl. Matemáticas 2.482. 1981). Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (conteniendo un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) de nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Bribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986 tal y como se describe por Schwarts y Daihoff, eds, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp 353-358, 1979; (2) una penalización de 3.0 para cada espacio y una penalización de 0.10 adicional para cada símbolo en cada espacio; y (3) ninguna penalización para espacios terminales.

Si se usa otra levadura aparte de la S. cerevisiae, la disrupción de uno o más de los genes equivalentes a los genes PMT de S. cerevisiae es también provechosa, por ejemplo en Pichia pastoris o Kluyveromyces lactis. La secuencia de PMT1 (o de cualquier otro gen PMT) aislada de S. cerevisiae puede ser usada para la identificación o disrupción de genes que codifican actividades enzimáticas similares en otras especies fúngicas. La clonación del homólogo PMT1 de otra Kluyveromyces lactis está descrita en WO 94/04687.

Si se usa otra levadura aparte de la S. cerevisiae, las secuencias representadas en las Figuras 10 a 17 también pueden ser usadas para identificar (o disrumpir) un gen equivalente a un gen PMT de S. cerevisiae. Expertos en la técnica apreciarán el hecho de que unos fragmentos de las secuencias representadas en las Figuras 10 a 17 puedan ser usados de forma similar, como unas secuencias que son homólogas a las secuencias representadas en las Figuras 10 a 17 y fragmentos de éstas.

Métodos para llevar a cabo unas interrupciones de genes están descritas en la bibliografía, un ejemplo de éstos está descrito por Boehm et al. (Boehm, T., Pirie-Shepherd, S., Trinh, L., Shiloach, J. and Folkman, J. 1999) Yeast 15 563-572) que describen el uso del gen SUC2 de Saccharomyces cerevisiae como un marcador flanqueado por el ADN de Pichia pastoris específico para el gen diana. En el ejemplo de disrupción de Pichia pastoris la secuencia de ADN SUC2 puede ser insertada en una posición al interior de cualquiera de las secuencias de ADN representadas en las Figuras 10 a 17.

La levadura tendrá de manera ventajosa una deleción de los genes HSP150 y/o YAP3 como se muestra respectivamente en WO 95/33833 y WO 95/23857.

En una forma de realización preferida la levadura es transformada con un plásmido de expresión en base al plásmido de 21 \mum de Saccharomyces cerevisiae. Durante la transformación de la levadura, el plásmido contiene secuencias de replicación y de selección bacteriana, que son cortadas después de la transformación, por una forma de recombinación interna según las conclusiones de EP 286 424. El plásmido también contiene un casete de expresión comprendiendo: un promotor de levadura (por ejemplo el promotor PRB1 de Saccharomyces cerevisiae), tal como se indica en EP 431 880; una secuencia que codifica un líder de secreción que, por ejemplo, comprende la mayor parte del líder de secreción de HSA natural, más una pequeña porción del líder de secreción de factor \alpha-unión de S. Cerevisiae tal como se enseña en WO 90/01063; la secuencia codificante de HSA, obtenible por métodos conocidos para aislar el ADNc correspondiente a genes humanos, y también descrita en, por ejemplo, EP 73 646 y EP 286 424; y un terminador de la transcripción, preferiblemente el terminador de ADH1 de Saccharomyces, tal y como se enseña en EP 60 057. Preferiblemente, el vector incorpora al menos dos codones de parada de translación.

La selección de varios elementos del plásmido descrito anteriormente no está prevista para estar relacionada directamente con la pureza del producto de albúmina obtenido, aunque los elementos pueden contribuir a un rendimiento mejorado del producto. Una forma de realización preferida del proceso de fermentación y de purificación está descrita en el ejemplo 1.

Ejemplo 1

La estrategia de clonación para la construcción del microorganismo productor de la albúmina fue tal y como está descrito en EP 431 880 excepto que el extremo 3' de las secuencias de codificación de albúmina y su empalme con la secuencia de terminación de la transcripción ADH1 fueron alterados de tal forma que la secuencia codificante de ADH fue eliminada y de que estaban presentes dos codones de parada de traducción consecutivos en el marco, seguidos por un tercer codón de parada hacia abajo, tal y como se indica a continuación:

1001

Esto se consiguió por modificación del terminador de ADH1 del plásmido pAYE309, descrito en EP 431 880, por mutagénesis por PCR usando dos oligonucleótidos monocatenarios, JMADH1 y JMADH2 con las secuencias:

1

Las condiciones de PCR fueron 25 ciclos a 94ºC durante 60 segundos, 37ºC durante 120 segundos y 72ºC durante 180 segundos. El producto de PCR de 0,48 kb fue digerido con ambos HindIII y BamHI y ligado dentro del plásmido pBST+, descrito en WO 97/24445, digerido de forma similar con HindIII y BamHI, para crear un plásmido pAYE440 (Fig. 2). El terminador ADH1 fue modificado también por mutagénesis por PCR usando dos oligonucleótidos monocatenarios, AT19R y el cebador -40 universal con las secuencias:

3

Las condiciones de PCR fueron 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 40 segundos y 72ºC durante 50 segundos y luego un ciclo de 72ºC durante 10 minutos, usando el terminador ADH1 en pAYE440 en forma de molde (Fig. 2). La máquina usada fue un sistema de PCR de Perkin Elmer GeneAmp 9600. Un producto del tamaño correcto, de aproximadamente 0,33 kb, fue obtenido y digerido con los dos HindIII y BamHI. El plásmido pAYE309, descrito en EP 431 880, fue digerido con NotI y HindIII y el fragmento de ADN de 0,84 kb conteniendo el fragmento del promotor PRB1 y parte de la secuencia líder HSA/MF\alpha-1 (WO 90/01063) empleada para la secreción directa de HSA madura, fue ligada en pBST+ digerido con NotI y HindIII, descrito en WO 97/24445, para generar el plásmido pAYE438 (Fig. 3). El plásmido receptor pAYE438 fue digerido con HindIII y BamHI y el terminador ADH1 modificado fue clonado con éxito en este vector para generar el plásmido pDB2241 (Fig. 4). Este plásmido contiene el esqueleto pBST+ (WO 97/24445), el promotor PRB1 y el terminador ADH1 modificado.

Para facilitar la introducción de dos codones de parada de traducción al final de la región codificante de HSA y crear el sitio HindIII requerido, el extremo 3' de la región codificante de HSA fue alterado.

El enlazador oligonucleótido bicatenario, AT21/AT22 fue ligado en pDB2241 cortado AfIIIIHindIII y comprendía un sitio AfIII en su extremo 5', una región de relleno y después el Bsu36I para la secuencia HindIII del ADN codificante de HSA, pero con la adición de un codón de parada de traducción TAA extra. Unos clones con el enlace insertado fueron controlados por secuenciación del ADN y el plásmido correcto designado como pDB2242 (Fig. 5).

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Para crear el casete de expresión de rHA final el fragmento AfIII/Bsu36I de pAYE309 (Fig. 1) fue ligado dentro de pDB2242 digerido por AfIII/Bsu36I, formando el plásmido pDB2243 (Fig. 6). Finalmente, el vector de desintegración de expresión de rHA fue formado por ligación del casete de expresión NotI a partir de pDB2243 en pSAC35 cortado NotI (Sleep et al, 1991, Bio/Technology 9, 183-187 y EP 431 880) para generar el plásmido pDB2244 (Fig. 7) en el que la dirección de transcripción de rHA está en la misma orientación que la del gen LEU2.

El plásmido pDB2244 está por lo tanto derivado del vector de desintegración pSAC3 (Chinery y Hinchliffe (1989) Current Genetics 16, 21-25) y comprende la totalidad del plásmido de 21 \mum, el gen LEU2 para complementar las mutaciones huésped de leu2, el casete de expresión donde el promotor PRB1 dirige la expresión de la secuencia de HSA y del plásmido bacteriano pUC9. Éste es cortado del plásmido por el sistema recombinasa FLP de 2 \mum de S. cerevisiae para que ningún ADN bacteriano esté presente en el organismo usado para la producción de rHA (Chinery y Hinchliffe, op cit.).

El vector de expresión utiliza el promotor PRB1 de S. cerevisiae y terminador de transcripción ADH1 para controlar la expresión y la secuencia líder HSA/MF\alpha-1 (WO 90/01063) para una secreción directa de HSA madura.

El plásmido pDB2244 fue introducido en una cepa de Saccharomyces cerevisiae que era leu2, yap3, hsp150, pmt1 [cirº] por el método descrito por Hinnen et al, (1978) P.N.A.S. 75, 1929. La mutación pmt1 puede ser realizada según el método de WO 94/04687. Unos transformantes fueron seleccionados en una base nitrogenada de levadura de medio mínimo tamponado (0,15% (p/v) sin aminoácidos ni sulfato de amonio (Difco), 0,5% (p/v) de sulfato de amonio, 0,1M de ácido cítrico/Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O pH6.5, 2 % (p/v) de sacarosa)) sin contenido de leucina. Durante el crecimiento de los transformantes durante 72 horas a 30ºC, a 200 rpm en frascos de 50 ml conteniendo 10 ml de complejo (YEP, 1% (p/v) de extracto de levadura, 2 % (p/v) de bactopeptona y 2% (p/v) de sacarosa), o medio líquido de medio mínimo tamponado, la rHA puede ser detectada en el sobrenadante del cultivo sin células por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y/o por inmunoelectroforesis en cohete en gel.

Un cultivo de células maestras de materia prima en un medio mínimo tamponado es utilizado para preparar las reservas en funcionamiento (banco de células de trabajo) de levadura de proceso adecuada para la preparación de cultivos en frasco de agitación congelando partes alícuotas del cultivo en presencia del 20% (p/v) de trehalosa.

La fermentación fue esencialmente la misma que la que se describe en WO 96/37515 y US 5 728 553, excepto en las diferencias siguientes:

Fermentación de semillas

Después de añadir el medio para la producción de rHA al contenedor fermentador de semillas, se fija la temperatura operativa a 30ºC, así como la velocidad del agitador mínima, fijada para conseguir la homogeneidad y evitar gradientes de nutrientes tales como el oxígeno o carbono. El pH inicial es ajustado con una solución de amonio (densidad relativa 0,901) usando un controlador de pH fijado a 6.40; controlado a 6.40\pm0.10.

De forma alternativa, el pH es mantenido en la gama de 5.50 a 5.90, con el punto fijado de control inferior siendo 5.50. El pH inicial puede ser ajustado con amonio (por ejemplo gravedad especifica de amonio acuoso a 0.880). Este pH de fermentación inferior produce un perfil de espectrometría de masas mejorado de la rHA.

Es preferible que el pH inicial sea próximo al máximo de los rangos mencionados anteriormente para facilitar la observación de un metabolismo prematuro, ya que un descenso del pH es el primer signo de crecimiento detectable por instrumentos en línea.

Particularmente para cepas con una deficiencia en uno o más de los genes PMT, se ha descubierto que es ventajoso que la fermentación sea realizada con un pH más elevado que el que se requiere normalmente. De esta manera, en vez de controlar el pH en aproximadamente 5.5, es ventajoso tener un punto de control fijado entre pH 6.20 y pH 6.70, preferiblemente entre pH 6.3 y 6.5. Con un pH tan elevado, la calidad del centrado es mejorada de manera significante debido a la Tisis celular reducida. La Tisis celular produce residuos celulares que quedan en la suspensión después de una fase de centrifugado de la fermentación que es suficiente únicamente para eliminar células enteras del sobrenadante. Se ha demostrado en la Tabla 1, donde se muestra una reducción importante del contenido en peso húmedo de un sobrenadante del cultivo cuando la levadura está cultivada en la gama de pH de 6.3 a 6.5 en comparación con un pH 5.5.

TABLA 1 Relación entre calidad de centrado y pH de fermentación en el contenedor del fermentador de semillas

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Los valores en paréntesis indican una desviación estándar y el número de muestras.

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2M de H_{2}SO_{4} se usan también como un agente corrector del pH. La sacarosa a 20 g.L^{-1}, vitaminas de lote MW10, y Breox FMT30 antiespumante a 0,04 g.L^{-1} son añadidos al contenedor.

El aire filtrado estéril es introducido en el contenedor a 0,5 v/v/m (es decir 0,5 litros de aire no comprimido por litro de medio por minuto), el medio es inoculado a >10 mg en peso seco de célula desde el cultivo en frasco de agitación axénico y un sistema controlador de supervisión por ordenador es iniciado. La fase en lotes prevista es de 62 \pm 10 h a partir de una concentración de inóculo de 12 mg.L^{-1}. El alimentador MW10 debe ser conectado antes del final de la fase por lotes (volumen idéntico al volumen de lote).

Las características del algoritmo de control de fermentación incluyen: el final de la fase por lote que está señalada por un aumento (DOT) de la tensión de oxígeno disuelto de > 15 % durante 30 minutos; el alimentador siendo iniciado en 0,05 ml por litro de medio en lote; el índice de alimentación de sustrato siendo determinado según la fórmula,
SF = SF _{o}e^{\mu k}, donde SF es el índice de alimentación de sustrato (ML.min^{-1}); SF_{0} es un índice de alimentación de sustrato (mL.min^{-1}), \mu es el índice de crecimiento específico (por ejemplo 0.06 h^{-1}), y \kappa es un contador variable comenzado en 0 e incrementado por 0,0167 cada 1 minuto cuando se juntan todas las condiciones; y el índice de alimentación de sustrato (a través de una manipulación de k) siendo reducido en respuesta a DOT < 15 % y/o a un cociente respiratorio (RQ) \geq 1.2.

La alimentación es detenida cuando el pH < 6.2 o la temperatura <29.0ºC o >31.0ºC. Esto puede ser realizado también automáticamente a través del algoritmo de control. El SF es reducido cuando el promedio RQ > 1.13 durante un periodo de 2 h, o cuando existe una evidencia de acumulación de etanol o de acetato.

La agitación es incrementada para mantener DOT > 20% de saturación de aire. Un vez iniciada la alimentación, la concentración de Breox FMT30 es incrementada a 0.3 g.L^{-1} (calculado en un volumen final). La duración de fase de alimentación prevista es de 65 \pm 17 h, dependiendo de las limitaciones de transferencia del contenedor.

El flujo de aire es incrementado a través de la fermentación para mantener los valores de la velocidad de consumo de oxígeno (OUR) y el índice de evolución del dióxido de carbono (CER), en niveles suficientes para proporcionar un análisis del gas preciso. El índice del flujo de aire de la fermentación es nominalmente 1 v/v/m. Unas verificaciones diarias son realizadas para determinar la pureza del cultivo y CDW. Unas muestras apropiadas son retenidas. Al final de la alimentación, el cultivo es transferido a un recipiente de producción.

Fermentación de producción

El fermentador de producción es inoculado a 0,25-1,00 g.cdw.L^{-1}. El pH inicial es ajustado con una solución de amonio (SG 0.901) usando un controlador de pH fijado a pH 6.40; controlado a 6.40 \pm0.10.

De forma alternativa, el pH es mantenido en la gama de 5.50 a 5.90, con el valor ajustado de control inferior siendo de 5.50. El pH inicial puede ser ajustado con amonio (por ejemplo gravedad relativa de amonio acuoso 0.880). Este pH de fermentación inferior produce un perfil de espectrometría de masa mejorada de la rHA.

Preferiblemente, el pH inicial es próximo al máximo de los rangos mencionados para facilitar la observación del metabolismo prematuro, ya que un descenso del pH es el primer signo de crecimiento detectable por los instrumentos en línea.

Particularmente para cepas con una deficiencia en uno o más de los genes PMT, se ha descubierto que es ventajoso que la fermentación sea realizada con un pH más elevado que el que se requiere normalmente. Así, en vez de controlar el pH a aproximadamente 5.5, es ventajoso tener un punto de control fijado entre pH 6.20 y pH 6.70 preferiblemente entre pH 6.3 y 6.5. Con este pH más elevado, la calidad del concentrado es mejorada en gran medida debido a una tisis celular reducida. La tisis celular produce residuos celulares restantes en suspensión después de una fase de centrifugado de la fermentación que es suficiente únicamente para eliminar células enteras del sobrenadante. Esto está demostrado en la Tabla 2, donde se expone una reducción significante del contenido en peso húmedo de un sobrenadante de cultivo cuando la levadura está cultivada con un pH 6.5 en comparación con un pH 5.5.

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TABLA 2 Relación entre calidad de centrado y pH de fermentación en un contenedor de producción

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2M de H_{2}SO_{4} se usan también como un agente corrector de pH. La sacarosa a 20 g.L^{-1}, vitaminas de lote MW10, y antiespumante Breox FMT30 en 0.04 g.L^{-1} son añadidos al contenedor.

El índice de alimentación de sustrato inicial es determinado según la fórmula:

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donde SF_{0} es el índice de alimentación de sustrato inicial, ii, es el índice de crecimiento específico (por ejemplo 0.06 h^{-1}), Vote es el volumen de lote (L), Y_{X/S} es el rendimiento de célula (g.L^{-1}), [sacarosa] es la concentración de sacarosa (g.L^{-1}) y [CDW] es la concentración en peso seco de células (g.L^{-1}). El índice de alimentación de sustrato es determinado según la fórmula, SF SF _{o}e^{\mu k}, donde SF es el índice de alimentación de sustrato (mL.min^{-1}); SF_{0} es el índice de alimentación de sustrato inicial (mL.min^{-1}), \mu es el indice de crecimiento específico (h^{-1}) (por ejemplo 0.06 h^{-1}), y k es un contador variable iniciado a 0 e incrementado por 0.0167 cada 1 minuto cuando se reúnen todas las condiciones. Varias condiciones son revisadas constantemente durante la fermentación, y usadas para ajustar la SF a través de la manipulación de k; la SF es reducida en respuesta a DOT <15% y/o al cociente respiratorio (RQ) \geq 1.2. El alimento es detenido si el pH <6.2 o si la temperatura <29.0ºC o >31.0ºC. Esto puede ser realizado también automáticamente a través del algoritmo de control. El SF es reducido si el promedio RQ >1.13 durante un periodo de 2 h o si aparece una evidencia de acumulación de etanol o de acetato.

La agitación incrementó para mantener DOT \geq 20% de saturación de aire, y se mantuvo al máximo una vez conseguida con el fin de facilitar la mezcla. Cuando empieza la alimentación y que el cultivo está bajo limitación de carbono, la concentración de Breox FMT30 es incrementada a 0.2-0.32g.L^{-1} (calculado en el volumen final). La duración de la fase de alimentación prevista depende de las limitaciones de transferencia del contenedor, normalmente de 90-120 h en la escala de 8,000 L.

El flujo de aire es aumentado progresivamente a través de la fermentación para mantener los valores del índice de consumo de oxígeno (OUR) y el índice de evolución de dióxido de carbono (CER), en niveles suficientes para proporcionar un análisis preciso de gas. El contenedor es sobrepresionado según se necesite para mejorar la OTR. El índice de flujo del aire de la fermentación es nominalmente 1 v/v/m. Unos controles diarios pueden ser realizados para determinar la pureza del cultivo y CDW, y unas muestras apropiadas son retenidas.

El cultivo es mantenido para un tratamiento descendente al final de la alimentación.

Mantenimiento del cultivo de producción

El cultivo de producción puede ser mantenido bajo las condiciones apropiadas para permitir el tratamiento por lotes del cultivo. El tiempo de mantenimiento debería ser mantenido en un mínimo, pero puede extenderse hasta 48 horas o más en caso de necesidad (por ejemplo hasta 5 días). Se apreciará el hecho de que, en condiciones de tratamiento por lotes, las limitaciones del tiempo de mantenimiento tal como se expresan aquí se aplican a la porción final del cultivo que debe ser procesada.

El centrado de la fermentación, o una solución de albúmina impura de cualquiera de las otras fuentes (tal como el plasma), es preparado, o acondicionado, para una cromatografía en una matriz de intercambio catiónico durante la protección de la rHA a partir de una polimerización y de la actividad proteasa. Preferiblemente, el octanoato de sodio es añadido (solución de cromatografía 14 (CS14) - Tabla 3) en una concentración final de 1-10 mM, por ejemplo de aproximadamente 5 mM. El pH es ajustado con ácido acético de pH4.3-4.8, preferiblemente 4.50 \pm 0.1 (más preferiblemente \pm 0.05) y la conductividad es controlada para ser <5.5 mScm^{-1}.

Cromatografía

Todas las operaciones puede llevarse a cabo a temperatura ambiente (20 \pm 5ºC). Las cargas de albúmina (g/L) para las columnas de cromatografía son determinadas a partir de títulos de albúmina (g/L) sea por SDS-PAGE (en la primera fase) o GP-HPLC (para todas las otras columnas). El progreso de cada fase es seguido para medir la absorbencia de UV en línea, por ejemplo a 254 o 280 nm.

En una forma de realización particularmente preferida de la presente invención el proceso de purificación comprende las fases siguientes: cromatografía por intercambio catiónico (SP-FF); cromatografía por intercambio aniónico (DE-FF); cromatografía por afinidad (DBA); ultrafiltración y diafiltración; una segunda fase de cromatografía por afinidad (PBA); ultrafiltración y diafiltración; una segunda fase de cromatografía por intercambio catiónico (SP-FF2); y una segunda fase de cromatografía por intercambio aniónico (DE-FF2). Preferiblemente, estos procesos de purificación son seguidos por una ultrafiltración/diafiltración final seguida por una fase de formulación, y/o la disposición de la solución dentro de un contenedor final.

La secuencia de fases cromatográficas tal y como se describe aquí es nueva e inventiva en varios aspectos. El uso de una matriz de aminofenilboronato (PBA) con un tampón mejorado, tal y como está descrito en este caso, y de un pequeño volumen de carga ha sido expuesto para proporcionar un claro de antígeno de levadura incrementado, medido por ELISA (aproximadamente 4-20 pliegues). Se descubrió que el tampón usado con la matriz de aminofenilboronato era de forma inesperada particularmente ventajoso, y representa el resultado de ensayos intensivos de una plétora de tampones de un amplio rango de constituyentes y propiedades. El tampón proporciona una distancia significativamente incrementada de los antígenos de levadura, cuando se compara con el tampón usado en la fase de cromatografía de PBA de WO 96/37515.

Durante la carga de la matriz de aminofenilboronato con una solución de albúmina altamente concentrada, por ejemplo 100\pm10 g.L^{-1}, se pueden conseguir medios que mejoran la resolución de la rHA y de los antígenos de levadura debido al volumen de carga más pequeño.

WO 96/37515 y WO 97/31947 incluyen una fase de permeación en gel S200 después de una primera fase de cromatografía de afinidad. La fase de filtración en gel purificó la albúmina con respecto a los antígenos de levadura, pigmento y albúmina dimerizada. Hemos descubierto que esa fase ya no es necesaria debido a las mejoras que hemos hecho a
la fase de afinidad de aminofenilboronato y a la introducción de fases adicionales de intercambio catiónico y aniónico.

Después de la fase de afinidad del aminofenilboronato es preferible que la albúmina sea concentrada y diafiltrada para una fase de intercambio catiónico en modo negativo. Hemos descubierto que la combinación de esta fase de diafiltración y la fase de intercambio catiónico reduce esencialmente la concentración relativa de iones níquel. En particular, la exposición de rHA a un pH bajo es eficaz para la reducción de los niveles de iones níquel. En consecuencia, la albúmina purificada según la presente invención tiene un contenido de iones níquel sorprendentemente bajo (de menos de 100 ng/g de albúmina).

La fase de intercambio catiónico en modo negativo, tal y como está descrita en este caso, se utiliza para eliminar un material de unión a Concanavalina A (cbm) que es una pequeña cantidad de rHA modificada, prevista para ser glicosilada. Se ha descubierto que la fase de intercambio catiónico en modo negativo reduce el contenido de cbm producido por el mutante de pmt1 recombinante de Saccharomyces cerevisiae aproximadamente de 1.3 veces. Un efecto superior es conseguido con rHA derivada de mutantes sin pmt1 (claro de 2-3 veces).

En comparación con otras levaduras comerciales, la Saccharomyces cerevisiae produce un nivel relativamente bajo de rHA modificada. Por consiguiente, la fase de intercambio catiónico en modo negativo y el uso de células con una deficiencia en uno o más de los genes PMT pueden tener una importancia aún superior si la rHA es producida por un huésped recombinante distinto de Saccharomyces cerevisiae.

Las soluciones de cromatografía usadas durante la purificación de albúmina están detalladas en la Tabla 3. Debido a la producción de albúmina a gran escala, y al coste relativamente bajo del producto, estas sales de tampón son las más adecuadas para el proceso ya que éstas están disponibles en forma muy pura a escala industrial y de bajo coste en comparación con otros tampones usados comúnmente tales como Tris, HEPES o MOPS. Unos tampones alternativos podrían ser usados en vez de aquellos que se usan en la Tabla 3, por ejemplo tampones de un pK_{a} similar (por ejemplo malato para el acetato), pero en la mayoría de los ejemplos el coste y disponibilidad a gran escala excluyen su uso. Unas formas de sales alternativas pueden ser usadas siempre que sean solubles, disponibles a escala industrial y de bajo coste.

Las soluciones de tampón pueden ser preparadas en las concentraciones descritas más abajo, o unas soluciones de reserva concentradas pueden ser preparadas y mezcladas o diluidas en línea para un uso inmediato.

Cromatografía de intercambio catiónico

La albúmina es concentrada y purificada con respecto al menos a proteínas de levadura (si la albúmina es rHA de una fermentación de levadura) y a otros antígenos, contaminantes de bajo peso molecular y compuestos pigmentados por cromatografía de intercambio catiónico. En el método se usa una matriz de intercambio catiónico comercial tal como SP-sefarosa FF, SP-sferosil, CM-sefarosa FF, CM-celulosa, SE-celulosa o S-Sferodex. Preferiblemente, la matriz es SP-sefarosa FF (Pharmacia) que, en caso de ser usada en una columna de flujo axial, puede estar a una altura de lecho de 5 a 25 cm, preferiblemente de 10 a 15 cm, por ejemplo a 12,5 cm. Si una columna radial de tipo flujo es usada, una longitud de recorrido de flujo de lecho adecuada es de 11,0 \pm 1,0 cm. una carga de columna de 10 a 50 g de albúmina/L, preferiblemente de 40 \pm 10 g de albúmina/L, de matriz es adecuada. La matriz es equilibrada con un tampón para eliminar la solución de almacenamiento de álcali; preferiblemente el tampón debería ser suficientemente fuerte para reducir el pH a aproximadamente un pH 6.0. Un tampón tal como CS01 es usado para eliminar la solución de almacenamiento CS07 de la columna; no obstante, cualquier tampón con un pH<6.0 puede ser usado. El equilibrado es considerado completo cuando el pH del efluente de columna es aproximadamente un pH 6.0.

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TABLA 3 Soluciones de cromatografía para la purificación de albúmina

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El centrado de una fermentación está preparado, o acondicionado, para una cromatografía en una matriz de intercambio catiónico durante la protección de la rHA de polimerización y la actividad proteasa. No obstante si la cepa de levadura no es deficitaria de las proteasas que degradan la rHA al pH requerido para purificar la rHA, entonces el sobrenadante del cultivo debería ser pasteurizado, por ejemplo por un tratamiento térmico de 50-70ºC durante 30 minutos hasta 5 horas, tal y como está detallado en WO 94/03636. Normalmente, 1-10 mM de octanoato de sodio es suficiente para proteger la rHA de una desnaturalización en caliente y 30 segundos hasta 10 minutos a temperaturas de 60-80ºC adecuadas para inactivar las proteasas en un procedimiento por lotes o de flujo continuo. La pasteurización también puede ser deseable si se usa HSA.

El centrado acondicionado es cargado después sobre la columna a un nivel de flujo de por ejemplo, 0,07-0,75 volúmenes/minuto de lecho, preferiblemente 0,3-0,6 volúmenes/minuto de lecho, en este ejemplo 0,5 volúmenes/minuto de lecho, y la columna es lavada después con una o más soluciones para eliminar contaminantes residuales. La columna es lavada primero con, por ejemplo, ocho volúmenes de 10-100 mM, preferiblemente 30-70 mM, por ejemplo 50 mM de acetato, pH 3.9-4.1, 0.6-0.8 mS.cm^{-1} (CS02). La columna es lavada después con cuatro volúmenes de un tampón de alto contenido de sal conteniendo 1-3M de NaCl, preferiblemente 2M de NaCl, en tampón de acetato sódico (por ejemplo 10-50 mM de acetato sódico, preferiblemente aproximadamente 27 mM, pH 3.5-4.5, preferiblemente pH 4.0 (CS03) y luego con diez volúmenes de CS01. La albúmina es eluida con, y recogida en un tampón de acetato/octanoato (por ejemplo 40-120, preferiblemente 60-100, por ejemplo 85 mM de acetato, y 2-50 mM, preferiblemente, 2-20 mM, por ejemplo 5 mM de octanoato, como en CS04). La recogida de albúmina comienza cuando la señal UV aumenta de 0,6 A_{254}/cm, y la recogida continúa hasta que la señal de UV cae debajo de 0,36 A_{254}/cm. La columna es después limpiada usando 0,25-3,0M de NaCl y 0,05-2% de detergente (CS05) y luego 0,1-1,0M de NaOH (CS06), posteriormente almacenado en (10-50 mM) NaOH diluido (CS07). En este ejemplo, el nivel de flujo para el equilibrado, carga y fases de lavado es de 0,5 volúmenes de lecho por minuto. Para la elución de la albúmina, un índice de flujo de 0,04-0,6 por lecho en vol/min, preferiblemente 0,15-0,35, en este ejemplo se usa 0,25 por lecho en vol/min.

Cromatografía de intercambio aniónico

El eluato del intercambiador catiónico es después diluido hasta menos de 10 mS.cm^{-1}, preferiblemente menos de 5 mS.cm^{-1}, especialmente menos de 2.5 mS.cm^{-1} y cargado después en una resina de intercambio aniónico tal como QMA-sferosil, DEAE-Sferodex, Q-hiper D, DEAE-celulosa, QAE-celulosa, o TMAE, DMAE, o DEAE Fractogel. Preferiblemente, la matriz es la matriz de intercambio aniónico comercial DEAE (Pharmacia) de sefarosa-FF, de longitud de trayectoria de flujo de lecho de 11,0\pm 1,0 cm, preequilibrado con el tampón de elución de cationes (CS04) y equilibrado después con tres volúmenes de columna de CS01. La albúmina es cargada sobre la matriz a 30\pm10 g de albúmina monomérica por litro de matriz y posteriormente la matriz es lavada con un tampón de tetraborato diluido, por ejemplo de 15-25 mM de tetraborato de potasio o tetraborato de sodio (CS08), que tiene como efecto aumentar el pH hasta aproximadamente 9.2, y la albúmina es posteriormente eluida con un tampón de tetraborato más concentrado (por ejemplo 80-150 mM de tetraborato de potasio, preferiblemente 110 mM de tetraborato de potasio (CS09)). La matriz es limpiada con sal/detergente (CS05) y después con NaOH (CS06) antes del almacenamiento en NaOH diluido (CS07). El eluato de la matriz de intercambio aniónico es después cargado sobre una matriz de afinidad.

Cromatografía de afinidad

Esta fase adicional purifica la rHA con respecto al fragmento de albúmina de N-terminal de 45 kDa, antígenos de levadura y pigmento. La matriz de afinidad puede comprender cualquier colorante de tipo azul de Cibacron que enlaza la albúmina, por ejemplo azul reactivo 2, azul Procion HB, azul sefarosa, azul Trisacril y otros compuestos de tipo antraquinona. Preferiblemente, la matriz es la matriz "Delta Blue" (DBA), preparada tal y como se describe en
WO 96/37515.

El método usa DBA en una longitud de trayectoria de flujo de lecho de 11,0\pm1,0 cm. La DBA es equilibrada en un tampón de acetato amónico (100-300 mM, preferiblemente 200-275 mM, por ejemplo 250 mM como en CS10) y la albúmina aplicada en 7,0-14,0 g/L, preferiblemente 8,0-12,0 g/L, en este ejemplo 10,0\pm 1,0 g/L. El equilibrado, carga y fases de lavado son realizadas con índices de flujo de 0,05-0,30 en un vol/min de lecho de preferiblemente 0,15-0,27, en este ejemplo en un lecho de 0.25 vol/min. Todas las otras fases son realizadas en un lecho de 0,20 vol/min. Cuando la carga está completa, la columna es lavada para eliminar contaminantes con 1-5 volúmenes de tampón de acetato amónico 10-30 mS cm^{-1}, preferiblemente 15-25 MS cm^{-1}, por ejemplo CS10, preferiblemente 5 volúmenes de columna. La albúmina es eluida con una sal concentrada y una solución de fosfato (1,0-3,OM de NaCl, por ejemplo 1,5-2,5M de NaCl o 2,0M de NaCl, y 5-100 mM, por ejemplo 50 mM de fosfato, como en CS11. La columna es después limpiada usando CS06 y almacenada en CS07.

El eluato de la columna de DBA es después concentrada y diafiltrada en la preparación para la purificación usando una cromatografía de agarosa de boronato de fenilo (PBA). La ultrafiltración de DBA puede ser realizada con cualquier membrana de ultrafiltración usada en una concentración de proteína con un corte de peso molecular nominal de 30.000 o menos, preferiblemente una membrana de tipo polietersulfona (por ejemplo de serie Filtron Omega) de corte en peso molecular nominal de 10.000. El eluato de DBA es concentrado y diafiltrado luego a \approx100 g rHA.L^{-1} contra al menos 5 volúmenes de agua seguidos de al menos 5 volúmenes de CS20. Al final de la diafiltración, el retenido puede estar concentrado también si se requiere y el equipamiento lavado con CS20 para aumentar la recuperación de fase. La concentración del retenido final debería estar en la gama de 20-120 g rHA.L^{-1}, preferiblemente 70-120 g.L^{-1}, o como en este ejemplo 100\pm 10 g rHA.L^{-1}. Después del uso, las membranas son tratadas por eliminación de la proteína residual con agua, limpiadas con CS06 y almacenadas en CS07.

PBA es una fase de afinidad para eliminar glicoconjugados, tales como glicoproteínas, glicolípidos y poli, oligo y monosacáridos, y utiliza ácido aminofenilborónico inmovilizado en forma de ligando. El ácido aminofenilborónico es acoplado de forma covalente a través de un separador a una matriz insoluble tal como poliacrilamida, agarosa, polímeros celulósicos u orgánicos. La patente estadounidense Nº 4 562 251 (incorporada aquí como referencia) describe métodos adecuados para la realización de diborotriazina o agarosa de monoborotriazina: (1) la triazina es O-enlazada con la agarosa en primer lugar y enlazada después con ácido 3-aminofenilboronico (APBA) en una segunda reacción. (2) La triazina reacciona en primer lugar con APBA para producir mono o bien diborotriazina. Estas son después O-enlazadas a través de la clorina libre sobre la triazina para la agarosa activada ONa para producir agarosa mono o bien disubstituida.

Una patente anterior, 4,269,605, contempla una variedad de métodos de activación, incluyendo la activación de epiclorohidrina de agarosa, preferida en la presente. Unas matrices comercialmente disponibles incluyen aminofenilboronato en perlas con acrílico de Amicon PBA30 y Sigma.

Se ha descubierto que es particularmente ventajoso usar un tampón conteniendo glicina (10-500 mM, por ejemplo 25-200 mM, preferiblemente 50-150 mM, en este ejemplo 100 mM), NaCl (0-500 mM, por ejemplo 25-200 mM, preferiblemente 50-150 mM, en este ejemplo 100 mM) y CaCl_{2} (5-250 mM, preferiblemente 10-100 mM, en este ejemplo 50 mM), pH8.0-9.5, preferiblemente, pH 8.0-9.0, en este ejemplo pH 8.5 (CS20).

La columna de PBA usa una longitud de trayectoria de flujo de 11,0\pm1,0 cm y está preequilibrada con el tampón tal y como se ha descrito anteriormente, por ejemplo CS20. La columna es cargada con menos de 1 volumen de columna, preferiblemente menos de 0,5 volúmenes de columna, en este ejemplo \leq0,35 volúmenes de columna. La PBA es realizada como una fase negativa y por consiguiente la albúmina es recogida en el flujo y lavada desde la columna. Todas las fases cromatográficas pueden ser realizadas en índices de flujo de lecho de 0,005-0,3 vol./min. Preferiblemente el equilibrado y limpieza de la columna son realizados en un índice de flujo más alto, por ejemplo un lecho de 0,19 vol./min, comparado con la carga y recogida de la solución de albúmina, que se realiza preferiblemente en un índice de flujo de lecho de 0,01-0,05, preferiblemente 0,025 vol./min. La columna es posteriormente limpiada con sal (CS03), tampón de borato (CS09), NaOH (CS06) y después almacenada en NaOH diluido (CS07).

Después de la cromatografía de PBA la solución de albúmina es concentrada y diafiltrada para prepararse para una fase de intercambio catiónico en modo negativo. La combinación de esta fase de diafiltración y la cromatografía de intercambio catiónico en modo negativo reduce esencialmente la concentración relativa de iones níquel.

La ultrafiltración de PBA puede ser realizada con cualquier membrana de ultrafiltración usada en una concentración de proteínas con un corte de peso molecular nominal de 30.000 o menos, preferiblemente una membrana de tipo polietersulfona (por ejemplo de serie Filtron Omega) de corte de peso molecular nominal de 10.000. El flujo de PBA recogido es ajustado a un pH de 5.3\pm0.5 con CS21, concentrado y diafiltrado después en \approx100 g rHA.L^{-1} contra al menos 7 volúmenes de CS19. Para fines de diafiltración, el equipamiento es lavado con CS19 y se añade más CS19 según lo requerido para proporcionar una concentración retenida de 50\pm10 g rHA.L^{-1}. Finalmente, se añade octanoato de sodio para proporcionar una concentración final de aproximadamente 2-15 preferiblemente 5-10, más preferiblemente 6-9, y en este ejemplo 6 mM, por ejemplo CS14 son añadidos en 3 mL.L^{-1}. Después del uso, las membranas son tratadas por eliminación de la proteína residual con agua, limpieza con CS06 y almacenamiento en CS07.

La solución de albúmina es sometida después a una segunda fase de intercambio catiónico usando por ejemplo, sefarosa SP-FF (Pharmacia), esta vez en el modo negativo, es decir que la albúmina pasa a través de la matriz, en vez de ser retenida. Las condiciones son tales que la albúmina manosilada se une a la matriz. El tampón es preferiblemente un tampón de acetato sódico (5-110 mM de acetato, preferiblemente 10-50 mM, en este ejemplo 30 mM), pH 5.2-5.4, CS19). Otros tampones que pueden tamponar en el rango apropiado pueden ser usados, tales como un tampón de fosfato-citrato. De manera adecuada, el tampón tiene una conductividad de aproximadamente 2 mS.cm^{-1}. La columna tiene una longitud de trayectoria de flujo de 11,0\pm1,0 cm, con la albúmina cargada a 10-250 g.L^{-1} preferiblemente 20-70 g.L^{-1} y en este ejemplo de matriz 50\pm15 g o 50\pm10 g.L^{-1}. Como se trata de una fase negativa, la albúmina es recogida en el flujo y lavada.

Después de esta fase de intercambio catiónico, la albúmina es sometida a una cromatografía de intercambio aniónico en modo negativo. Esta fase elimina antígenos de levadura medidos por ELISA y Western blot. El flujo recogido y lavado a partir de la segunda fase de intercambio catiónico es ajustado a pH4.60\pm0.10 con CS21, diluido a 1.05\pm0.1 mS.cm^{-1} con agua y la rHA purificada usando las condiciones siguientes. La fase usa una matriz de intercambio aniónico tal como la sefarosa DE-FF (Pharmacia) en una longitud de recorrido de flujo de 11,0\pm1,0 cm y la albúmina es cargada a 50-250 g.L^{-1}, preferiblemente una matriz de 150\pm50 g.L 1. Como se trata de una fase negativa, la albúmina es recogida en el flujo y lavada. El pH del flujo y de lavado es ajustado después a 7.0\pm0.1 con CS22.

De forma alternativa, tal y como está descrito en el Ejemplo 9, el ajuste de pH puede tener lugar en el contenedor de alimentación UF final en vez de ser realizado en el flujo continuo de DEAE y lavado.

Mientras que el ejemplo 1 ha sido ilustrado en referencia a un mutante pmt1, se debe apreciar que el proceso de purificación de la presente invención puede ser aplicado de la misma manera a células huéspedes que no son mutantes en este locus, o que, en efecto no son mutantes en cualquier otro locus de pmt.

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Ejemplo 2

Dos ensayos fueron usados para investigar la calidad del centrado. Cuanto más pobre es la calidad de centrado peor es la "robustez" de las células de levadura.

Los dos ensayos fueron:

1. Determinación de la absorbencia de centrado a 600 nm (A_{600}).

2. Determinación del peso húmedo de partículas en el centrado (WW).

En los dos ensayos, cuanto más alto es el valor más pobre es la calidad del centrado.

Se comparó la calidad del centrado de las tres cepas diferentes de levadura en dos condiciones de pH diferentes cultivadas en fermentación en flujo discontinuo.

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TABLA 4 Valores A600 y WW para tres cepas diferentes productoras de rHA en una fermentación en flujo discontinuo cultivadas en dos valores de pH diferentes

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En la primera columna están indicadas las deleciones de genes específicos. Los valores entre paréntesis representan una desviación típica y el número de muestras.

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A partir de la tabla anterior se puede concluir que con un pH 5.5, las cepas con deleciones de genes múltiples producen un concentrado inferior, mientras que a pH 6.4 o 6.5, se evita el efecto deletéreo de estas deleciones de genes adicionales.

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Ejemplo 3

Este ejemplo fue realizado de la misma manera descrita en el ejemplo 1, pero se utilizaba una cepa que no es un mutante de pmt1. Esta cepa fue cultivada también con dos valores de control de pH diferentes, y el contenido en peso húmedo del centrado fue determinado tal y como está descrito en el ejemplo 1. El beneficio de un crecimiento en el valor de control de un pH elevado está observado también para esta cepa de levadura; demostrado en la Tabla 5, donde se muestra una reducción importante del contenido en peso húmedo de un sobrenadante de cultivo cuando la levadura está cultivada en la gama de pH 6.3 a 6.5 comparado con el pH 5.5.

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TABLA 5 Relación entre la calidad de centrado y el pH de fermentación para una cepa sin pmt1

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Los valores en paréntesis representan la desviación estándar y el número de muestras.

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De esta manera, en vez de controlar el pH a aproximadamente 5.5, es ventajoso tener un valor de control fijado entre pH 6.20 y pH 6.70 preferiblemente entre pH 6.3 y 6.5. Con un pH tan alto, la calidad del centrado es mejorada de manera significante debido a la Tisis celular reducida.

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Ejemplo 4

Este ejemplo fue realizado de una manera similar a la que está descrita en el Ejemplo 1, con las diferencias siguientes. La cepa GS115 (Invitrogen) de levadura Pichia pastoris fue cultivada usando las mismas condiciones y medio que los que se han descrito anteriormente, pero usando un controlador de pH fijado a 5.90; controlado a 5.90+0.20, un índice de crecimiento específico de 0.10 h^{-1} con glucosa como fuente de carbono. La duración de la fase discontinua fue de 28 h, y la duración de la fase de alimentación de 42 h. La albúmina humana recombinante fue añadida una vez iniciada la fase de alimentación, proporcionando una concentración final de 3.8 g de cultivo de rHA.L^{-1} al final de la fermentación. La rHA usada para reforzar el cultivo de Pichia ha sido purificada pero no según el proceso de purificación de la invención.

La rHA del medio de cultivo en flujo discontinuo de Pichia fue purificada después según el proceso de purificación descrito en el ejemplo 1.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe el análisis de rHA purificada de los medios de cultivo de Pichia tal y como está descrito en el Ejemplo 4.

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Datos del inmunoensayo

Los inmunoensayos fueron realizados en: (i) la rHA purificada de los medios de cultivo de Pichia; (ii) la rHA usada para reforzar los medios de cultivo; y (iii) en la albúmina producida por Saccharomyces cerevisiae purificada según la presente invención.

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Resumen de Western blot

Número de lotes de anticuerpos Ig9601

Tipo de gel: 4-12 % de GELES NOVEX SDSNR

Tipo de leche: {}\hskip0,8cm UHT

Tiempo de exposición: 20 segundos

El Ig9601 fue desarrollado contra una cepa de Saccharomyces cerevisiae sin producción de albúmina y en consecuencia puede ser utilizada para detectar antígenos de levadura.

La técnica de Western blot mostró que el perfil del antígeno de la levadura de la albúmina derivado del medio de cultivo de Pichia contenía menos bandas y menos intensas que el material usado para reforzar la fermentación de Pichia. El perfil del antígeno de levadura de albúmina derivado de Pichia fue muy similar al perfil derivado de Saccharomyces.

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Resumen de ELISA blot

Las impurezas de antígeno de levadura en la albúmina purificada del medio de cultivo de Pichia y para la albúmina usada para reforzar el medio de Pichia fueron cuantificadas por ELISA usando Ig9601.

El contenido de antígeno de levadura de la albúmina purificada desde el medio de cultivo de Pichia fue inferior al límite detectable del ensayo (aproximadamente 0.004 \mug.g^{-1}), y el contenido de antígeno para la albúmina usada para el medio de Pichia era 0.62 \mug.g^{-1}.

Material de unión a Con A

El ensayo de Con A descrito en el ejemplo 9 fue realizado en albúmina purificada del medio de cultivo de Pichia y para la albúmina usada para reforzar el medio de Pichia. El contenido de material de unión a Con A para éste último fue de 0,22% (p/p) y para éste fue 0.57% (p/p).

El nivel de material de unión a Con A en la albúmina purificada del medio de cultivo de Pichia es similar al de la albúmina purificada de Saccharomyces cerevisiae según la invención (ver tabla 6), cuando ésta no es producida a partir de un mutante de pmt1.

Los análisis de pureza confirman que el proceso de la invención puede ser usado con éxito para purificar la albúmina a partir de otra levadura distinta de la Saccharomyces cerevisiae (por ejemplo Pichia) y que se puede obtener la albúmina de pureza similar a aquella purificada a partir de la Saccharomyces cerevisiae.

Ejemplo 6

En el ejemplo 1 una fase de cromatografía por intercambio aniónico en modo negativo (DE-FF2) siguió a la segunda fase de cromatografía por intercambio catiónico (SP-FF2). En un proceso de purificación alternativo la segunda fase de cromatografía por intercambio catiónico puede estar seguida por una fase de cromatografía por intercambio aniónico en modo positivo.

A partir del eluato SP-FF2 con un pH 5.3 aproximadamente, el pH necesita ser incrementado a pH 7. Existen dos medios detallados a continuación, el ajuste de pH y la diafiltración. Éstos últimos proporcionan un producto de mejor calidad.

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DE-FF2 (A)

El flujo continuo y lavados de SP-FF2 fueron ajustados en su pH hasta un pH 7.0 con 0,5 M de hidrógeno ortofosfato de disodio. Este material fue cargado sobre un DEAE en condiciones positivas estándar para proporcionar una carga matricial de 40 g de matriz rHA.L^{-1}, el pH y la conductividad de carga fueron 7.0 y 1.29 mS.cm^{-1} respectivamente.

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DE-FF2(B)

El flujo continuo y lavados de SP-FF2 fueron diafiltrados contra 10 volúmenes de 10 mM de fosfato sódico de pH 7.0, concentrados y diluidos con un tampón a 50 g.L^{-1} y cargado sobre un DEAE en condiciones positivas estándar. El pH y conductividad de la carga fue de 7.0 y 1.43 mS.cm^{-1} respectivamente.

La albúmina de DE-FF2A / DE-FF2B es eluida de manera adecuada por un tampón de fosfato sódico de 45-55 mM (pH7.0).

La cinética de eliminación de níquel a partir de rHA por tratamiento con un pH bajo fue investigada (véase figura 9). Los resultados mostraban que entre un pH 4 y 4.5 el índice y extensión de la eliminación de níquel eran independientes del pH, pero que con un pH 5 el índice de eliminación se reducía ligeramente. Tanto el índice como la extensión de eliminación de níquel disminuyeron con en aumento del pH a través de la gama de 5-6.5 con una pequeña o ninguna eliminación superior a un pH 6.5.

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Ejemplo 8

La purificación de albúmina de suero humano a partir de una muestra de pasta de plasma pobre en crío (Centeon Pharma Gmbh) fue conseguida usando el proceso de purificación detallado en el Ejemplo 1.

Las recuperaciones de HSA en cada fase de cromatografía fueron comparables esencialmente a la recuperación de rHA anticipada en la misma fase, con la excepción de la columna de PBA. Aquí, las recuperaciones eran muy inferiores a las que estaban previstas que podían ser debidas a la eliminación de la albúmina glicada.

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Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la concentración, diafiltración y formulación de la rHA altamente purificada en un producto adecuado, en este ejemplo 20%(p/v) de albúmina. Este procedimiento es realizado en dos fases, es decir por ultrafiltración final (UF) y formulación.

La UF final reduce la concentración de níquel por diafiltración en un pH bajo y presenta la rHA en un entorno acuoso definido, usando agua de calidad apropiada.

La UF final empieza con una transferencia de flujo continuo y lavado de DEAE en el recipiente de alimentación de la UF final. Como está descrito más abajo, la albúmina es posteriormente concentrada, diafiltrada y ajustada a un pH hasta un pH 7.0 y concentrada de nuevo.

Si se realiza DE-FF2 en modo positivo, el eluato de DE-FF2 puede ser usado en vez de, o además del flujo y del lavado de DEAE.

Después de la transferencia del flujo y lavado de DE-FF2 (o eluato si se realiza DE-FF2 en modo positivo), la corriente de proceso conteniendo rHA sometida consecutivamente a una concentración primaria, diafiltración y fases de concentración secundarias en un sistema de ultrafiltración dispuesto con membranas celulósicas con un límite de corte de peso molecular nominal de 10.000. La fase de concentración inicial aumenta la concentración de rHA hasta aproximadamente 100 g.L^{-1} y es seguida inmediatamente por la fase de diafiltración continua donde la rHA es diafiltrada contra al menos 5, preferiblemente al menos 7 equivalentes en volumen de retenido de agua-para-inyección, preferiblemente 50 mM de solución salina para eliminar el amonio. Después de la diafiltración el pH es ajustado a 7.0 y la fase de concentración secundaria aumenta también la concentración de rHA a 275-325 g.L^{-1}. Al final de la UF el retenido es transferido al recipiente de formulación del producto en masa.

En vez de un ajuste de pH realizado en el flujo continuo y lavado de DEAE, el ajuste de pH puede ocurrir en el contenedor de alimentación de la UF final, preferiblemente entre el proceso de diafiltración y la fase de concentración secundaria. Preferiblemente, el retenido de diafiltración es ajustado hasta un pH 7\pm0.1 con EX04. Si el pH excede 7.1 pero permanece \leq pH 8.5 entonces el pH puede ser reducido con EX05.

La fase de formulación produce rHA en un entorno químico apropiado y en una concentración apropiada adecuada para la filtración y relleno estéril de productos a granel. El retenido de UF final transferido es analizado para determinar concentraciones de albúmina, sodio y octanoato. Estas cantidades son tomadas en cuenta y cualquier cantidad adicional necesaria de cloruro sódico de reserva y de soluciones de excipiente de octanoato de sodio y de agua de calidad apropiada añadida para conseguir la especificación de la formulación en masa. La concentración de albúmina final puede ser de 150- 250 g.L^{-1} o 235-265 g.L^{-1}, con una concentración de sodio de 130-160 mM. Cualquier otra concentración de albúmina realizable puede ser realizada, no obstante, por ejemplo, con una concentración mínima de al menos 4% (p/v), preferiblemente 4-25 % (p/v). La formulación es completada después de la adición de excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales y apropiados, tales como el polisorbato 80 o aquellos especificados en la farmacopea estadounidense para la albúmina humana, y la dilución de agua.

Una concentración final de 0,08 moles de octanoato de sodio por gramo de albúmina puede ser deseable. El producto es estéril y no pirogénico. Puede estar presente hasta un 1% de albúmina dimérica pero ningún polímero o agregados mayores son detectables.

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Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra el análisis realizado para establecer la pureza de albúmina purificada según la presente invención. Aunque se haya declarado lo contrario, todos los ensayos son realizados en albúmina purificada según el Ejemplo 1 y formulada según el Ejemplo 9.

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Glicación de rHA

Un microensayo para la proteína glicada ha mostrado que la rHA purificada según la invención no es modificada esencialmente por glicosilación no enzimática (glicación). El microensayo mide la forma de producto de Amadori estable (AP) de proteína glicada, por oxidación de los grupos hidróxilo C-1 de AP con peryodato. El formaldehído liberado por oxidación de peryodato es cuantificado por conversión en un cromóforo, diacetildihidrolutidina (DDL), por reacción con acetilacetona en amonio. LA DDL es detectada después colorimétricamente. Las muestras fueron evaluadas después de la desalación usando una columna Pharmacia PD-10 (G25 Sephadex) y la albúmina en las muestras fue recuantificada después por el método de Bradford y 10 mg de albúmina fueron evaluados. Un control positivo de fructosa fue incluido, y las absorbencias fueron leídas en un espectrofotómetro de Shimadzu UV 2101 a 412 nm. Para cada mol de hexosa un mol de producto de Amadori fue formado.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Análisis de C-término

Un aspecto importante del control de calidad de proteínas recombinantes es la conformación y estabilidad de la estructura primaria predeterminada. El análisis del péptido tríptico C-terminal en la HSA disponible comercialmente y rHA purificada según la invención por secuenciación de N-terminal y la espectometría de masas FAB indicó la presencia de un péptido truncado, carente de la leucina C-terminal en HSA. El péptido tríptico C-terminal Des-Leu fue detectado en la HSA comercial a aproximadamente 5-10% (no cuantitativa), pero no pudo ser detectado en la rHA de la invención, incluso después de 6 meses a 30ºC. El péptido Des-Leu no pudo ser detectado en la HSA en 12 semanas a 30ºC, y el valor máximo para el péptido C-terminal de longitud total fue muy disminuido comparado con las otras muestras, indicando que quizás éste había sufrido otra degradación C-terminal.

Estos resultados indican que la rHA, purificada según la invención, tiene un carboxi-término estable y de longitud total, mientras que la HSA disponible anteriormente de fuentes comerciales resulta heterogénea en comparación.

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Contenido de iones níquel de rHA preparada según la invención Instrumento de medida

Horno Perkin Elmer, SIMAA 6000: CTT (tubo de temperatura constante) usando una detección a 232 nm, 2470ºC.

Calibración

El método se basa en una calibración de tres puntos (soluciones estándar de 18/30/60 \mug/L de Perkin Elmer). Después de la calibración, un blanco de agua purificada es medido. El control estándar es medido después del blanco y al final de cada serie de prueba (20 \mug/L de Ni estándar, estándar certificado de Perkin Elmer).

Preparación de muestra

Cada ensayo es el resultado de una determinación por duplicado que es también válida para la calibración y el estándar de control. Dependiendo de la concentración de Ni prevista, la muestra es diluida en una proporción adecuada para trabajar con una concentración de Ni que se encuentra en el rango de calibración. Unas muestras con una concentración de proteína del 10% o más deben ser diluidas al menos a 1:5 en cualquier caso. La dilución se realiza con agua purificada.

La solución de aclarado para el capilar de muestra: 2L de agua purificada mezclada con 0,5 ml de Tritón X100. Cada serie de prueba incluye una prueba de idoneidad del sistema.

Requisitos

1.: El coeficiente de correlación de la calibración es de al menos 0,99000. Si no lo es, la calibración debe ser repetida una vez. Si la calibración no cumple con el requisito una segunda vez, se debe efectuar un análisis de error.

2.: La masa característica medida con el 30 \mug/L-Standard no puede exceder el valor teórico de 20 pg/0.0044A-s de más del 20 por ciento.

: Masa característica m_{0}

: Esta cantidad del analito en picogramos (pg) que contribuye a una absorción del 1 por ciento. Una absorción del 1 por ciento corresponde a 0.0044 A-s ( amperio por segundos).

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3.: La concentración medida del estándar de control tiene que situarse en el rango de confianza (criterio 2s/3s).

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Cálculo

El instrumento de medida calcula el resultado según el término siguiente:

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A: absorción

pendiente: pendiente de la curva de calibración (regresión lineal)

V: dilución

No se usa modificador.

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Análisis de ácidos grasos de cadena media y larga

Los perfiles de ácidos grasos de la albúmina según la invención y de HSA disponible comercialmente fueron analizados por extracción de solvente acídico y cromatografía gaseosa de los ácidos grasos libres usando un estándar interno C17:0. No se han detectado ácidos grasos anormales en la albúmina de la invención por este método aunque los perfiles para la rHA y HSA mostraban diferencias importantes. Según estaba previsto, las dos mostraban grandes cantidades de estabilizador añadido, octanoato (C8:0). Por otra parte, la HSA comercial se caracterizaba principalmente por C16:0, C16:1, C18:0, C18:1 y C18:2 mientras que la albúmina de la invención contenía principalmente C10:0 y C12:0 y ocasionalmente C14:0. Experimentos sucesivos mostraron que los niveles de C10:0 y C12:0 en el producto final de rHA estaban correlacionados con los niveles de estos contaminantes en el octanoato usado para dichas fases del proceso de purificación.

Preferiblemente, el nivel total de ácidos grasos C18 no excede el 1,0% (mol/mol) del nivel de octanoato, y preferiblemente no excede el 0,5% de este nivel. Además, en la albúmina de la invención, el nivel de C18:2, C18:3 y de ácidos grasos C20 es generalmente no detectable. En la HSA comercial, habitualmente, 0,4 moles de ácidos grasos C18 por mol de albúmina pueden estar presentes. En el producto de la invención, no están presentes habitualmente ácidos grasos C20 no detectables y sólo aproximadamente 0,02 moles de ácidos grasos C18 por mol de albúmina.

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SDS reductor de la electroforesis en gel de poliacrilamida

Este ensayo fue realizado tal y como está descrito en WO 96/37515. El ensayo mostraba que la rHA de la invención consiste en una única cadena de polipéptido, la cual, cuando está tratada con un agente reductor (\beta-mercaptoetanol) migra como una única banda (monómero) en SDS reductor de la electroforesis de poliacrilamida (PAGE) que indicaba que la proporción de albúmina presente en la forma de un monómero era de al menos el 99,9%.

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Cromatografía en fase líquida de alta presión de permeación en gel

25x1 de una solución de albúmina a 10 mg/ml purificada según la invención que ha sido formulada al 25% p/v fue inyectada en una columna TSK3000SWXL en una HPLC de Shimadzu LC6A y demostró comprender menos del 0,1% de albúmina polimérica. Este resultado indica que la formulación tal y como está descrita en este caso no tiene efecto perjudicial sobre el contenido de polímero/agregado de la albúmina purificada.

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Dos Electroforesis en Gel dimensionales

2 \mug de rHA de albúmina preparada mediante el proceso de la invención fue sometido a una electroforesis bidimensional usando un sistema investigador Millipore. La separación en la primera dimensión fue un gel de isoelectroenfoque a pH 3-10 y fue seguida por un 10% de gel de poliacrilamida/SDS en la segunda dimensión. Con la coloración del gel con azul Coomassie, sólo se distinguía una mancha, indicando la presencia de una especie de proteína únicamente.

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Ensayo de albúmina manosilada / Con A

La concanavalina A (Con A) se enlaza con moléculas que contienen \alpha-D-manopiranosilo, \alpha-D-glucopiranosilo y residuos relacionados estéricamente. En el ensayo de Con A, la cromatografía de afinidad de Con A Sepharose (Pharmacia, Cat. Nº. 17-0440-01) de albúmina humana recombinante (rHA) y/o albúmina de suero humano (HSA) se usó para determinar el contenido de albúmina manosilada.

La albúmina humana recombinante (rHA) es diluida al 5% (p/v) de rHA con 145 mM de cloruro sódico, después en 1:1 con un tampón de dilución de Con A (200 mM de acetato sódico, 85 mM de cloruro sódico, 2 mM de cloruro de magnesio, 2 mM de cloruro de manganeso, 2 mM de cloruro de calcio de pH 5.5). 100 mg de rHA son cargados después en una columna equilibrada con 2 mL de Con A Sepharose, que es lavada posteriormente (5 X 4 mL) con un tampón de equilibrado con Con A (100 mM de acetato sódico, 100 mM de cloruro sódico, 1 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de cloruro de manganeso, 1 mM de cloruro de calcio de pH 5.5). La columna es eluida con 6 mL de tampón de elución de Con A (100 mM de acetato sódico, 100 mM de cloruro sódico, 0.5M de metil- \alpha-D-manopiranosida de pH 5.5).

La albúmina monomérica en la carga de Con A (diluida a aproximadamente 0,1 mg.mL^{-1}) y el eluato (testado puro) son cuantificados por GP.HPLC usando una curva estándar de rHA a 0-0.2 mg.mL^{-1} y el monámero de albúmina de unión a Con A recuperado en el eluato es expresado en forma de porcentaje de carga.

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TABLA 6 Claro de rHA de unión a Con A a través del proceso. Los lotes 1-4 son derivados de un mutante de pmt1, mientras que el lote 5 es un derivado de una cepa no mutante

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(FT & W = flujo continuo & lavados)

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La rHA de unión a coNA fue analizada también por espectrometría de masas con electrospray (Fig. 8). Esto indicó que, además de una reducción en la cantidad de rHA de unión a Con A, la extensión de modificación de la rHA de unión a coNA era reducida.

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Análisis de color

La absorbencia de una solución de 5% (p/v) del producto final en una cubeta de 1 cm fue medida a 350 nm, 403 nm y 500 nm y calculada en términos de absorbencias por gramo de albúmina/litro por longitud de recorrido en cm (es decir ABS.L.g^{-1}.cm^{-1}). La albúmina de la invención presenta los valores siguientes:

Longitud de onda	Absorbencia principal (n=4 lotes)
(nm)	(L.g^{-1}.cm^{-1})

350	5.75 x 10^{-3}

403	1.7 X 10^{-3}

500	0.4 X 10^{-3}

Generalmente, la albúmina de la invención no excede absorbencias respectivas de 8.0 X 10^{-3}, 3.0 X 10^{-3} y 0.75 X 10^{-3} en dichas tres longitudes de onda.

Ensayos de varias preparaciones de HSA comercialmente disponibles revelaban absorbencias más altas en estas longitudes de onda (véase tabla 7).

TABLA 7 Absorbencia (L.g^{-1}.cm^{-1}) de preparaciones de HSA de la técnica anterior

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Endotoxina

Una solución de fármaco es testada usando lisado de amebocito Limulus por medición turbidimétrica cinética a 340 nm, a una temperatura de 36,5 - 37,5ºC usando un sistema de detección de endotoxina automático (por ejemplo LAL 5000E). Una curva estándar es construida a partir de concentraciones conocidas de una preparación de endotoxina estándar, controles negativos y solución de material de prueba reforzada con una cantidad conocida de endotoxina estándar también están incluidos en el ensayo. El cambio de turbidez de la mezcla reactiva es medido en el tiempo y en una regresión log-log. Cualquier endotoxina en el fármaco es cuantificada con respecto a la curva estándar y la recuperación del refuerzo de endotoxina está confirmada. No se detectó ninguna endotoxina.

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Tiol libre

Un reactivo de Ellman, 5,5'-Ditiobis-(2-Nitrobenzoato) (DTNB) es un medio específico de detección de grupos sin sulfidrilo tal como cys-SH (Cys-residuo 34 en el caso de rHA). La reacción libera el ión 5 tio-2-nitrobenzoato TNB^{2-} que tiene una absorción máxima a 412 nm. Gracias a la medida del aumento de absorbencia a 412 nm y división por el coeficiente de extinción molar del ión TNB^{2-} a 412 nm, el contenido de rHA libre de sulfidrilo puede ser calculado.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información deflector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

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Documentos de patente citados en la descripción

- JP 3258728 A [0002]

- EP 428758 A [0002]

- EP 452753 A [0002]

- EP 570916 A [0003] [0003] [0016]

- EP 330451 A [0003]

- EP 361991 A [0003]

- WO 9204367 A [0003]

- EP 464590 A [0003]

- EP 319067 A [0003]

- WO 9731947 A [0003] [0004] [0049] [0151]

- WO 9637515 A [0003] [0004] [0049] [0125] [0149] [0151] [0161] [0222]

- US 5728553 A [0004] [0125]

- WO 9404687 A [0070] [0070] [0096] [0108] [0123]

- WO 9426873 A [0072]

- WO 9533833 A [0111]

- WO 9523857 A [0111]

- EP 286424 A [0112] [0112]

- EP 431880 A [0112] [0114] [0115] [0117] [0120]

- WO 9001063 A [0112] [0117] [0122]

- EP 73646 A [0112]

- EP 60057 A [0112]

- WO 9724445 A [0116] [0117] [0117]

- WO 9403636 A [0158]

- US 4562251 A [0164]

- US 4269605 A [0165]

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Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

- ADAMEK, V. et al. J. Chrom, 1992, vol. 625, 91-99 [0014]

- SINGHAL, R.P. et al. J. Chrom, 1991, vol. 543, 17-38 [0014]

- ROTHSTEIN et al. Meth. Enzymol., 1991, vol. 194, 281-301 [0061]

- BOTSTEIN SHORTLE Strategies and Applications of In Vitro Mutagenesis Science, 1985, vol. 229, 193-210 [0098]

- WINSTON, F. et al. Methods Enzymol., 1983, vol. 101, 211-228 [0098]

- GENTZSCH TANNER EMBO, 1996, vol. 15, 5752-5757 [0101]

- GENTZSCH TANNER Glycobiology, 1997, vol. 7, 481-486 [0103]

- STRAHL-BOLSINGER TANNER Eur. J. Biochem., 1991, vol. 196, 185-190 [0104]

- STRAHL-BOLSINGER et al. P.N.A.S. USA, 1993, vol. 90, 8164-8168 [0104]

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- BRIBSKOV BURGESS Nucl. Acids Res., 1986, vol. 14, 6745- [0107]

- Atlas of Protein Sequence and Structure National Biomedical Research Foundation 1979. 353-358 [0107]

- BOEHM, T. PIRIE-SHEPHERD, S. TRINH, L. SHILOACH, J. FOLKMAN, J. Yeast, 1999, vol. 15, 563-572 [0110]

- SLEEP et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 183-187 [0120]

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- HINNEN et al. P.N.A.S., 1978, vol. 75, 1929 [0123]

Claims

1. Proceso de purificación de una solución de albúmina recombinante, proceso comprendiendo:

(a): exposición de una primera solución de albúmina recombinante de pH 8.0-9.5 tamponada con un tampón comprendiendo un catión bivalente en una concentración de 5-250 mM, y que posee una conductividad en la gama de 1 a 75 mS.cm^{-1}, a una fase de cromatografía de afinidad que es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y que utiliza una matriz de afinidad comprendiendo grupos dihidroxiborilo inmovilizados, para obtener una solución de albúmina purificada; y

(b): exposición de la solución de albúmina purificada de fase (a) a una fase de concentración, una fase de diafiltración y a una fase de cromatografía de intercambio catiónico, donde la fase de diafiltración es realizada a un pH de 2.5-6.0, donde la fase de intercambio catiónico es realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en condiciones tales que la albúmina glicosilada se liga al material de intercambio catiónico, y donde la solución de albúmina que sufre la cromatografía de intercambio catiónico tiene una concentración de albúmina de 10-250 g.L^{-1};

(c): para producir una solución de albúmina final recombinante que posee un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina.

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2. Proceso según la reivindicación 1 donde la fase de diafiltración es realizada a un pH de 4.0-6.0, preferiblemente 5.3\pm0.5.

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2 donde la solución de albúmina recombinante es obtenida a partir de un medio de cultivo fúngico obtenido mediante el cultivo de un hongo transformado con una secuencia de nucleótidos que codifica la albúmina en un medio de fermentación, por lo que dicho hongo expresa la albúmina y la segrega en el medio.

4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la fase de intercambio catiónico utiliza una matriz que comprende sustituyentes de sulfopropilo inmovilizados como intercambiadores de cationes.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la solución de albúmina que está sometida a una cromatografía de intercambio catiónico tiene un pH de 4.5-6.0, más preferiblemente un pH de 5.0-5.6, y aún más preferiblemente un pH de 5.2-5.4.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la solución de albúmina que está sometida a una cromatografía de intercambio catiónico tiene una concentración de albúmina de 20-70 g.L^{-1}, y preferiblemente 50\pm10 g.L^{-1}.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la solución de albúmina que está sometida a una cromatografía de intercambio catiónico realizada en modo negativo con respecto a la albúmina comprende octanoato y/u otro ácido graso, y preferiblemente tiene una concentración iónica de octanoato de 2-15 mM, más preferiblemente de 5-10 mM, e incluso más preferiblemente de 6-9 mM.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde antes de la fase de intercambio catiónico, la solución de albúmina está sometida a uno o más de los siguientes procesos: (i) ajuste de pH; o (ii) acondicionamiento por adición de octanoato y/o de otro ácido graso.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el pH de la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 es pH 8.0-9.0, preferiblemente pH8.3-pH8.6.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 está tamponada con un tampón que comprende un catión bivalente en una concentración de 10-100 mM.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el catión bivalente en el tampón de la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 es calcio, preferiblemente en forma de CaCl_{2}.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 está tamponada con un tampón que comprende glicina en una concentración de 10-500 mM, preferiblemente de 25-200 mM, y más preferiblemente de 50-150 mM; NaCl en una concentración de 0-500 mM, preferiblemente de 25-200 mM, y más preferiblemente de 50-150 mM; y CaCl_{2} en una concentración de 5-250 mM, preferiblemente de 10-100 mM.

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13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 está tamponada con un tampón que comprende aproximadamente 100 mM de glicina, aproximadamente 100 mM de NaCl y aproximadamente 50 mM de CaCl_{2}.

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 está tamponada con un tampón que tiene una conductividad de 10-50 mS.cm^{-1}, preferiblemente 18-22 mS.cm^{-1}.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera solución de albúmina tratada en la fase (a) según la reivindicación 1 comprende albúmina en una concentración de al menos 70 g.L_{1}.

16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la albúmina está cargada en la fase (a) según la reivindicación 1 en menos de 0,5 volúmenes de columna, más preferiblemente en menos de 0,35 volúmenes de columna.

17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la matriz usada en la fase (a) según la reivindicación 1 comprende ácido borónico inmovilizado, preferiblemente ácido aminofenilborónico.

18. Proceso según la reivindicación 1 comprendiendo también una fase de intercambio aniónico, utilizando preferiblemente una matriz que comprende sustituyentes de dialquilaminoalquilo inmovilizados como intercambiadores aniónicos, seguida por otra fase de diafiltración que es realizada a un pH de 2.5-6.0.

19. Proceso según la reivindicación 18 donde la fase de intercambio aniónico se realiza en modo negativo con respecto a la albúmina.

20. Proceso según la reivindicación 18 donde la fase de intercambio aniónico se realiza en modo positivo con respecto a la albúmina.

21. Proceso según la reivindicación 19 o 20 donde, antes de la fase de intercambio aniónico, la solución de albúmina está sometida a una o más fases de: intercambio de tampón; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH; tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración; calentamiento; enfriamiento o a una fase de manipulación sin purificación que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para su uso final.

22. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es precedida por una o más de las siguientes fases: fermentación; separación de albúmina de una célula huésped de producción de albúmina recombinante; exposición de un centrado de fermentación en una fase de manipulación sin purificación que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para el uso final; cromatografía de intercambio catiónico, preferiblemente usando sustituyentes de sulfopropilo como intercambiadores catiónicos; cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente usando sustituyentes de dietilaminoalquilo como intercambiadores aniónicos; o cromatografía de afinidad, preferiblemente usando una matriz de afinidad que comprende un colorante específico de albúmina inmovilizado, preferiblemente un colorante de tipo Cibacron azul.

23. Proceso de purificación de una solución de albúmina recombinante, proceso comprendiendo las fases de:

(b): recogida de un eluato de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(c): exposición del eluato de intercambio catiónico a una fase de cromatografía de intercambio aniónico realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(d): recogida de un eluato de intercambio aniónico conteniendo albúmina;

(g): exposición del eluato de cromatografía de afinidad a una fase de cromatografía de afinidad realizada en modo negativo con respecto a la albúmina y en modo positivo con respecto a los glicoconjugados según la fase (a) de la reivindicación 1;

(h): recogida del flujo de cromatografía de afinidad conteniendo albúmina a través de;

(i): exposición del flujo de cromatografía de afinidad a través de fases de concentración, diafiltración y de cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) de la reivindicación 1 para producir un flujo intercambiador catiónico conteniendo albúmina recombinante que posee un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina;

(j): recogida del flujo de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(k): exposición del flujo de intercambio catiónico a través de una fase de cromatografía de intercambio aniónico realizada en modo negativo o modo positivo;

(l): recogida del flujo de intercambio aniónico conteniendo albúmina a través del cual la fase de intercambio aniónico es realizada en modo negativo; o elución desde la matriz de intercambio aniónico de un eluato de intercambio aniónico donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo positivo;

y donde cualquiera de las fases de purificación respectiva es opcionalmente precedida o seguida por una o más fases de: intercambio de tampón; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH; tratamiento con un agente reductor; tratamiento de decoloración; calentamiento; enfriamiento o por una fase de manipulación sin purificación que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para el uso final; y donde las fases (a)-(I) son seguidas por una fase de diafiltración que se realiza a un pH de 2.5-6.0.

24. Proceso de purificación de una solución de albúmina recombinante, proceso comprendiendo las etapas de:

(a): exposición de una solución de albúmina recombinante en una fase de cromatografía de intercambio catiónico realizada en modo positivo con respecto a la albúmina;

(b): recogida de un eluato de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

(d): recogida de un eluato de intercambio aniónico conteniendo albúmina;

(g): exposición del eluato de cromatografía de afinidad a una fase de cromatografía de afinidad en modo negativo con respecto a la albúmina y en modo positivo con respecto a los glicoconjugados según la fase (a) de la reivindicación 1;

(i): exposición del flujo continuo de matriz de afinidad a través de una fase de cromatografía de intercambio aniónico realizada en modo negativo o positivo con respecto a la albúmina;

(j): recogida del flujo continuo de intercambio aniónico conteniendo albúmina a través del cual la fase de intercambio aniónico es realizada en modo negativo; o elución a partir de la matriz de intercambio aniónico de un eluato de intercambio aniónico donde la fase de intercambio aniónico es realizada en modo positivo;

(k): exposición de la solución de albúmina purificada por la fase de cromatografía de intercambio aniónico a una concentración, diafiltración y a fases de cromatografía de intercambio catiónico según la fase (b) de la reivindicación 1 para producir un flujo continuo de intercambio catiónico conteniendo albúmina recombinante que posee un contenido de iones níquel inferior a 100 ng por gramo de albúmina;

(l): recogida del flujo continuo de intercambio catiónico conteniendo albúmina;

y donde cualquiera de las fases de purificación respectivas son opcionalmente precedidas o seguidas por una o más fases de: intercambio de tampón; concentración; dilución; diálisis; diafiltración; ajuste de pH; adición de agente reductor; tratamiento de decoloración; calentamiento; enfriamiento o una fase de manipulación de no purificación que mejora el entorno o condición de la albúmina para la siguiente fase del proceso o para el uso final.

25. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la albúmina recombinante es producida por un proceso comprendiendo el cultivo de una célula fúngica de expresión de una secuencia codificante de albúmina recombinante y la obtención de la albúmina, donde la célula tiene una modificación genética en una región codificante de un gen de codificación de una enzima de proteína O-manosiltransferasa (PMT) o en una región implicada en la expresión de un gen de codificación de una enzima de PMT que provoca que la célula tenga al menos una capacidad reducida de manosilación de la albumina expresada en forma recombinante y donde el medio de cultivo es de al menos 1.000L y de pH 5,3-6,8.

26. Proceso según la reivindicación 25 donde dicha(s) modificación(es) comprende(n) cualquier supresión, sustitución, deleción, adición, ruptura y/o inserción mutacional.

27. Proceso según la reivindicación 26 donde dicha(s) modificación(es) son heredadas de manera estable y/o no son revertidas y/o son no rezumantes.

28. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 26 o 27 donde el gen de codificación de una enzima de PMT codifica PMT1.

29. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 donde la célula fúngica es cultivada en un medio de cultivo de al menos 5.000L, preferiblemente de al menos 7.500L.

30. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29 donde la célula fúngica es cultivada a un pH 6.2-6.7, preferiblemente pH 6.3-6.5.

31. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la solución de albúmina inicial es derivada de un medio de cultivo de levadura obtenido por cultivo de la levadura transformada con una secuencia de nucleótidos de codificación de albúmina en un medio de fermentación, por lo que dicha levadura expresa la albúmina y la segrega dentro del medio.

32. Proceso según la reivindicación 31 donde la levadura es del género Saccharomyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae.

33. Proceso según la reivindicación 31 donde la levadura es del género Pichia o Kluyveromyces.

34. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33 donde la albúmina es codificada por una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante de albúmina recombinante donde el extremo 3' de la secuencia codificante de albúmina recombinante comprende dos o más codones de parada de traducción en marco, y preferiblemente tres codones de parada de traducción en marco.

35. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde al menos una cantidad de albúmina es producida por un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 o por una célula comprendiendo una secuencia de ADN según la reivindicación 34.

36. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el producto de albúmina es formulado para una administración parenteral a un humano, esterilizado o colocado dentro de un contenedor final.