CN109879958A - 一种低糖基化血清白蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低糖基化血清白蛋白的制备方法。本发明提供的低糖基化血清白蛋白的制备方法包括：将血清白蛋白的编码基因导入重组酵母细胞中使血清白蛋白的编码基因得到表达，得到血清白蛋白；重组酵母细胞按照包括如下步骤的方法制备：降低受体酵母细胞中PMT1蛋白质的含量和/或活性，或抑制受体酵母细胞中PMT1蛋白质编码基因的表达，得到与受体酵母细胞相比蛋白质糖基化程度降低的重组酵母细胞。实验证明，利用本发明的重组酵母细胞的制备方法制备的重组酵母细胞表达血清白蛋白，可以降低血清白蛋白的糖基化程度，尤其是O‑糖基化以及O‑甘露糖基化。本发明所得重组酵母细胞以及低糖基化程度的血清白蛋白具有广泛的应用前景。

Description

一种低糖基化血清白蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种低糖基化血清白蛋白的制备方法。

背景技术

糖蛋白是蛋白质与糖类通过糖苷键连接的共价复合体，根据糖苷键的类型，可以将糖蛋白的糖基分为N-糖基和O-糖基两种类型。N-糖链连接在Asn-X-Thr/Ser保守序列中的Asn上(其中的X为除脯氨酸以外的任意氨基酸残基)。O-糖链的结构比N-糖链简单，连接位点比N-糖链多，常出现在丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)上。糖基化对蛋白质的正确折叠、稳定性和生物活性至关重要。在人体内，糖基化是影响蛋白质的药物动力学特性(如组织分布和在血液中的清除)的原因之一。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(也称为毕赤酵母)是近年来发展较快的外源蛋白表达宿主菌。除一般酵母所具有的特点外，毕赤酵母还具有很多优点，如毕赤酵母具有甲醇诱导启动子，可严格调控外源蛋白的表达；外源基因的表达产物既可存在于胞内，也可分泌至胞外，能高效获取外源基因的产物；表达载体能稳定遗传；可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产等，除此之外，还可进行很多典型的高等真核生物的蛋白翻译后修饰，包括对表达蛋白进行糖基化修饰，其中包括N-糖基化修饰和O-糖基化修饰。

毕赤酵母表达系统生产重组糖蛋白药物与哺乳动物细胞生产同一重组糖蛋白药物的糖基化修饰的问题存在完全不同修饰现象。酵母在表达外源蛋白时，当这个蛋白是糖蛋白，那么N-糖基化修饰会发生在其保守的N-糖基化修饰位点上(N-X-S/T)，但由于O-糖基化修饰没有保守的糖基化位点，一般认为会发生在富集丝氨酸或苏氨酸的氨基酸上，不同的蛋白是否发生O-糖基化修饰，以及发生在哪一个氨基酸上，O-糖基化修饰的程度是有所不同的。蛋白的丝氨酸或苏氨酸都可能是O-糖基化的潜在位点，但并不是每一个丝氨酸或苏氨酸都会发生O-ZZA糖基化修饰，也并非每一个含有丝氨酸或苏氨酸的蛋白会发生O-糖基化修饰，不同的蛋白在不同的表达系统中的糖基化修饰也有所不同。

如果发生O-糖基化修饰，糖链上的糖基则多是甘露糖，虽然糖链比较短，但由于其糖链数量较多，酵母表达蛋白的表面可能会有大量裸露的甘露糖。这种具有甘露糖化的糖蛋白，在人体中半衰期短、免疫原性高、易被清除。由于该缺陷，限制了毕赤酵母在大部分蛋白类药物生产方面的应用。

血清白蛋白是血浆的重要成份，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况下不易透过肾小球。血清白蛋白是一个球状的非糖基化蛋白，分子量为66kDa，目前基于重组DNA技术方法生产重组人血清白蛋白的方法比较成熟。人血清白蛋白(HSA)基因位于4号染色体，有16961碱基对，分为15个间隔区，经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码的一个具有585个氨基酸的蛋白质，没有N-糖基化修饰的保守序列Asn-X-Thr/Ser(其中的X为除脯氨酸以外的任意氨基酸残基)，即不会发生N-糖基化修饰。HSA在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程被切除。人血清白蛋白已成功地在多种宿主中表达。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备低糖基化程度的血清白蛋白。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种血清白蛋白的制备方法，所述方法包括：将血清白蛋白的编码基因导入重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达，得到血清白蛋白；

所述重组酵母细胞按照包括如下步骤的重组酵母细胞的制备方法制备：

降低受体酵母细胞中PMT1蛋白质的含量和/或活性，或抑制所述受体酵母细胞中所述PMT1蛋白质编码基因的表达，得到与所述受体酵母细胞相比蛋白质糖基化程度降低的重组酵母细胞。

上述方法中，所述PMT1蛋白质可为如下B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

B2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述PMT1蛋白质的编码基因为b1)、b2)或b3)：

b1)序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PMT1蛋白质的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PMT1蛋白质的DNA分子。

上述B2)中的PMT1蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的PMT1蛋白质。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述方法中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述方法中，所述受体酵母细胞可为毕赤酵母。

在本发明的一个实施例中，所述受体酵母细胞为毕赤酵母JC308。

上述方法中，所述糖基化可为O-糖基化。

上述方法中，所述O-糖基化具体可为O-甘露糖基化。

上述方法中，所述血清白蛋白可为人血清白蛋白。

所述血清白蛋白具体可为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

上述A2)中的血清白蛋白，为与序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的血清白蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的所述血清白蛋白的编码基因可通过将序列3的第10-1839位或序列3的第82-1839位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列3的第82-1839位所示的DNA分子编码序列4所示的血清白蛋白。

所述血清白蛋白的编码基因可为a1)、a2)、a3)或a4)：

a1)序列表中序列3的第10-1839位的DNA分子；

a2)序列表中序列3的第82-1839位所示的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述血清白蛋白的DNA分子；

a4)在严格条件下与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述血清白蛋白的DNA分子。

上述方法中，所述将血清白蛋白的编码基因导入重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达包括：将含有所述血清白蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达。

所述重组表达载体为含有所述血清白蛋白的编码基因表达盒的重组载体。所述重组表达载体具体可按照如下方法制备：用NspV和BamHI酶切序列表中序列3所示的DNA片段，得到HSA基因酶切产物；将pHIL-D2载体用限制性内切酶ClaI和SalI酶切成3段，回收带有复制区、AOX启动子、AP抗性基因等的4kb片段，自身连接后命名为pD3载体；将所述pD3载体用NspV和EcoRI切，电泳回收线性化载体，连接该线性化载体与所述HSA基因酶切产物得到重组载体，将序列正确的重组载体记为pD3HSA。将所述pD3HSA用ClaI酶切，去磷酸化，电泳回收线性化的约5.8kb片段，即线性化pD3HSA；pHIL-D2载体用ClaI和PstI双切回收带有HIS4和3’AOX序列的约4.2kb的片段，连接该片段与所述线性化pD3HSA，序列正确的重组载体即为所述重组表达载体。

利用所述重组酵母细胞的制备方法制备的重组酵母细胞，也属于本发明的保护范围。

实验证明，利用本发明的重组酵母细胞的制备方法制备的重组酵母细胞表达血清白蛋白，可以降低血清白蛋白的糖基化程度，尤其是O-糖基化以及O-甘露糖基化。本发明所得重组酵母细胞以及低糖基化程度的血清白蛋白具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2。

图2为JC308(Δpmt1)鉴定引物设计示意图。其中，ORF为PMT1的ORF。

图3为PCR鉴定pmt1插入失活菌。泳道1：JC308(对照)；泳道2-3：JC308(Δpmt1)；M：DNA分子量标准，单位为kb。

图4为pD2HSA载体结构示意图。

图5为转入HSA基因的JC308(Δpmt1)突变型菌株和野生型菌株的表达上清进行SDS-PAGE结果。泳道1：商业化人血清白蛋白；泳道2：JC308(Δpmt1)突变型菌株表达的HSA；泳道3：野生型菌株表达的HSA；M：分子量标准Marker，自上而下分别97、66、43、31kDa。

图6为JC308(Δpmt1)突变型菌株和野生型菌株表达HSA的Western blotting分析。泳道1：商业化人血清白蛋白；泳道2：JC308(Δpmt1)突变型菌株表达的HSA；泳道3：野生型菌株表达的HSA。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实验中所使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品；pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞如未特殊明确指明，均为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

实施例1、PMT1基因插入失活的重组毕赤酵母菌株的构建

一、灭活PMT1基因的重组载体的构建

以质粒pPIC9(invitrogen公司)为模板，通过PCR方法获取终止子AOXTT序列。所用PCR钓取终止子引物AOXTT-5和AOXTT-3(见表1)。将得到的PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(鼎国生物技术有限公司，北京)，得到AOX1TT终止子片段。

本发明所用的载体pYES2(invitrogen公司)具有酵母的URA3筛选标记，可用于后续筛选工作。为了防止载体上的URA3基因的启动子对载体上其他基因的影响，本发明在URA3基因末端添加AOX1TT终止子。具体构建方法为：将上述获得的AOX1TT终止子片段回收后用MluI酶切，得到酶切片段；将该酶切片段与用同样用Mlu1处理过的载体pYES2连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Trans5α(北京全式金生物技术有限公司，目录号CD201)扩增，将序列正确的克隆命名为Trans5α-pYES2-URA3-AOX1TT，提取质粒，得到URA3基因末端添加AOX1TT终止子的重组载体，记为pYES2-URA3-AOX1TT。

为了使构建的载体能够定点整合到毕赤酵母PMT1基因中，本发明利用PCR钓取PMT1基因中ORF区(序列表中序列1，编码序列表中序列2所示的PMT1蛋白质)的一个片段作为同源重组片段。为了确保失活载体整合到PMT1基因上能够引起PMT1基因的失活，本研究在引物两端加上不同组合的终止密码子，在钓取的PMT1基因片段3^′末端加上CYCTT终止子。以毕赤酵母JC308(Invitrogen公司)基因组为模板，用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取毕赤酵母JC308的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，利用引物PMT1-IN-5和PMT1-IN-3进行PCR扩增钓取PMT1基因片段，钓取的PMT1基因片段两端加入具有不同组合的终止密码子，命名为PMT1-IN，该片段含有序列表中序列1的第61-902位。PCR钓取PMT1基因片段反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s。共进行25个循环，最后72℃延伸10min。回收PCR产物即为钓取的PMT1基因片段。

以含有CYCTT终止子的质粒pYES2为模板，利用引物CYC1TT-5和CYC1TT-3进行PCR扩增钓取CYC1TT终止子片段，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min。共进行25个循环，最后72℃延伸10min。回收PCR产物，即为CYC1TT终止子片段。

再以回收的PCR产物CYC1TT终止子片段和PMT1-IN片段(钓取的PMT1基因片段)为模板，利用引物PMT1-IN-5和CYC1TT-3进行PCR扩增，连接PMT1-IN和CYC1TT片段，构建PMT1-IN-CYC1TT融合片段。PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.4min。共进行25个循环，最后72℃延伸10min。回收PCR产物，即为PMT1-IN和CYC1TT终止子的连接片段——PMT1-IN-CYC1TT融合片段。回收后的产物用Nsi1酶切后磷酸化，然后与pYES2-URA3-AOX1TT经Nsi1和Stu1酶切得到的载体骨架连接，得到的序列正确的重组载体为PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2(如图1)。

在钓取的PMT1基因片段的前端和末端各装上不同组合的终止密码子，并且在末端的终止密码子之后又装了CYC1TT终止子，即保证如果基因组整合正确PMT1基因便不会表达。PYES2-URA3载体上含有毕赤酵母的URA3基因，为防止URA3基因启动子对PMT1基因的启动，在URA3基因后插入AOX1TT终止子。根据设计的引物，获得CYC1TT终止子(272bp)片段和PMT1(907bp)片段，与理论大小一致。PMT1-IN片段与CYC1TT融合片段大小是1135bp，通过以上PCR鉴定和测序等证明载体PMT1-in-pYES2构建成功。

二、PMT1基因灭活菌株的构建

制备酵母JC308感受态细胞，制备方法为：

挑取JC308单菌落接种于2mL YPD+U培养基(该培养基为向YPD培养基中添加尿嘧啶得到的尿嘧啶浓度为100μg/mL的培养基)中，在25℃摇床以170r/min培养48h；然后取500μL培养物，接种于100mL YPD+U培养基中，25℃下以170r/min培养24h，OD₆₀₀到达1.0；然后在4℃以6000r/min离心6min，用15mL的冷无菌水重悬菌体；相同条件下再次离心，用15mL的冷无菌水重悬菌体；4℃下以6000r/min离心6min，用15mL冷的1mol/L山梨醇重悬菌体；相同条件下再次离心；倒掉上清，用1mL冷的1mol/L山梨醇重悬菌体，体积约1.5mL，即酵母JC308感受态细胞，置于冰上备用。

PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2的电击转化：将PMT1插入失活载体PMT1-IN-pYES2利用EcoRV酶切线性化后回收，终产物溶于20μL ddH₂O，即为线性化质粒；将85μL的JC308感受态细胞与线性化质粒混合于电转杯中，冰上放置5min，按毕赤酵母电转化手册上的条件进行电转化(2kV)，电击后立即加入700μL的1M的山梨醇，转移至1.5mL离心管中，25℃下放置1h，涂布于MD+RH平板(该平板为向MD培养基中添加组氨酸和精氨酸得到的组氨酸和精氨酸浓度分别为100μg/mL和100μg/mL的固体培养基)，置于25℃下培养，待平板上长出的克隆提取基因组DNA，利用PMT1基因组外围引物(图2)PMT1-ORF-OUT-5和PMT1-ORF-OUT-3做PCR鉴定，基因组鉴定正确的克隆命名为JC308(Δpmt1)。

利用插入失活载体插入整合的方式整合到毕赤酵母染色体中，由于载体中含有PMT1基因同源片段，理论上载体的整合属于定点整合，即插入在PMT1基因上，可以通过设计的特定引物进行鉴定和筛选。利用毕赤酵母的URA3筛选标记，通过压力筛选，鉴定MD+RH平板上长出的克隆。通过PMT1基因外围引物PMT1-ORF-OUT-5和PMT1-ORF-OUT-3做PCR鉴定。如果PMT1-IN-pYES2载体正确整合到PMT1基因中，利用上面的引物可以得到8.6kb大小的片段；对照(即酵母JC308)为3kb大小的片段；由图3可知，PMT1-IN-pYES2载体正确整合到PMT1基因中(图3)，命名为JC308(Δpmt1)。由于插入载体上设计了不同的终止密码子和终止子，因此，基因整合正确，PMT1基因便不会表达。

表1、引物信息

实施例2、人血清白蛋白(HSA)在JC308(Δpmt1)菌中的表达

1)pD2HSA载体的构建

为了将HSA从毕赤酵母分泌表达，本发明选择pHIL-D2质粒(Invitrogen公司)作为载体构建了能含有HSA编码基因并能表达HSA的重组载体——pD2HSA载体(图4)，首先合成引物：

HSA1:5’-GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT-3’

HSA2:5’-tgaGAATTCTTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCA-3’

利用HSA1和HSA2从人胎肝cDNA文库中PCR扩增出HSA全长基因(HSA全长基因序列为序列表中序列3的第10-1839位)，该基因带有HSA自身的信号肽和原肽，以促进融合蛋白的分泌和正确折叠，在5’端加入了NspV酶切位点，并使其起始密码子前的序列与pHIL-D2载体AOX 1启动子的Kozak序列一致。PCR条件为：100μl反应体系中，加入1μl人肝胎cDNA文库，20μmol/L的HSA1和HSA2引物各3μl，2mmol/L的dNTPs 10μl，10X反应缓冲液10μl，TaqplusIDNA聚合酶5U。PCR条件为94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，再72℃延伸10分钟。用DNA片段回收试剂盒回收纯化获得约1.8KD的HSA cDNA目标带,用NspV和BamHI酶切得到HSA基因酶切产物。(实验中的TaqplusI DNA聚合酶、10X反应缓冲液、内切酶、连接酶、试剂盒等为上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司产品)。

为了使HSA的起始区重构载体的Kozak序列，以提高融合蛋白的表达水平，需要在pHIL-D2载体AOX启动子下游的NspV位点与EcoRI位点间插入HSA基因，但该载体上在3’AOX上还有一个NspV位点，为了方便操作，首先将pHIL-D2载体用限制性内切酶ClaI和SalI酶切成3段，回收带有复制区、AOX启动子、AP抗性基因等的4kb片段，自身连接后命名为pD3载体。将pD3载体用NspV和EcoRI切，电泳回收线性化载体，将该线性化载体与HSA基因酶切产物用T4连接酶催化连接，转化DH5a，涂于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆pD3HSA。抽提质粒，将得到的序列正确的重组质粒记为pD3HSA，将pD3HSA用ClaI酶切，去磷酸化，电泳回收线性化的约5.8kb片段，即线性化pD3HSA。pHIL-D2空载体用ClaI和PstI双切回收带有HIS4和3’AOX序列的约4.2kb的片段，将该片段与线性化pD3HSA利用T4连接酶催化连接，连接产物转化DH5a后，涂于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，提取质粒，将序列鉴定正确的重组质粒命名为pD2HSA(图4)。HSA的氨基酸序列见序列表中序列4。

2)人血清白蛋白(HSA)在JC308(Δpmt1)菌中的表达

用上述获得的PMT1基因灭活的菌株JC308(Δpmt1)和野生型菌株JC308制备电转感受态，将带有上述表达载体pD2HSA以SacI线性化后分别电转入这两种菌的感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有尿嘧啶和精氨酸的MD培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，葡萄糖2g/100ml，琼脂1.5g/100ml，精氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml)上，待长出转化子后将其接种到2mlYPD培养基中，25℃培养2天后，以5％的接种量接种到BMGY培养基(YNB 1.34g/100ml，生物素4×10^-5g/100ml，酵母提取物1g/100ml，蛋白胨2g/100ml，甘油1ml/100ml)中，48小时后加入0.5ml/100ml甲醇进行诱导表达，每12个小时补加一次甲醇，诱导72小时后离心取上清。

SDS-PAGE检测表达产物：取转入HSA基因的JC308(Δpmt1)突变型菌株和野生型菌株的表达上清进行SDS-PAGE，蛋白质的SDS-PAGE电泳方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)。电泳图见图5。由电泳结果可知，突变型菌株和野生型菌株表达均能表达HSA，分子量约为66KD，利用商业化人血清白蛋白作为对照。

Western blot检测表达HSA的甘露糖化：取转入HSA基因的JC308(Δpmt1)突变型菌株和野生型菌株的JC308的表达上清进行Western blot检测，利用商业化人血清白蛋白作为对照。抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的凝集素ConA(Concanavalin A，Sigma,货号L6397，ConA是一种典型的对于甘露糖型的糖链有高亲和性的植物凝集素)，Western blot的操作方法为本领域所共知的(如F.奥斯伯等，《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，1998)。用ECL试剂盒(Amersham Biosciences，北京)方法显色，显色照片见图6。ECL显色结果表明了：(1)无论是突变型菌株还是野生型菌株，表达的HSA均发生了甘露糖化的修饰，但因为HSA为非糖蛋白，即HSA的氨基酸序列中并没有N-糖基化位点，即不能发生N-糖基化修饰，本实施例证实了HSA在酵母中表达时会发生另一种糖基化修饰现象，即O-糖基化修饰；(2)突变型菌株JC308(Δpmt1)表达的HSA的O-甘露糖基化修饰程度明显低于野生型菌株JC308表达的HSA，即PMT1基因的灭活明显降低了酵母表达的人血清白蛋白的O-甘露糖基化修饰程度。

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种低糖基化血清白蛋白的制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2370

<212> DNA

<213> 酵母(saccharomyce)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2370)

<400> 1

atgtgccaga tatttctccc gcaaaacgta acacgttgtt ctgtttccct tttgacaatg 60

agtaaaacaa gtcctcaaga ggtgccagaa aacactactg agcttaaaat ctcaaaagga 120

gagctccgtc cttttattgt gacctctcca tctcctcaat tgagcaagtc tcgttctgtg 180

acttcaacca aggagaagct gatattggct agtttgttca tatttgcaat ggtcatcagg 240

ttccacaacg tcgcccaccc tgacagcgtt gtgtttgatg aagttcactt tggggggttt 300

gccagaaagt acattttggg aacctttttc atggatgttc atccgccatt ggccaagcta 360

ttatttgctg gtgttggcag tcttggtgga tacgatggag agtttgagtt caagaaaatt 420

ggtgacgaat tcccagagaa tgttccttat gtgctcatga gatatcttcc ctctggtatg 480

ggagttggaa catgtattat gttgtatttg actctgagag cttctggttg tcaaccaata 540

gtctgtgctc tgacaaccgc tcttttgatc attgagaatg ctaatgttac aatctccaga 600

ttcattttgc tggattcgcc aatgctgttt tttattgctt caacagttta ctctttcaag 660

aaatttcaaa ttcaggaacc gtttaccttc caatggtaca agacccttat tgctactggt 720

gtttctttag ggttagcagc ttccagtaaa tgggttggtt tgttcaccgt tgcctggatt 780

ggattgataa caatttggga cttatggttc atcattggtg atttgactgt ttctgtaaag 840

aaaattttcg gccattttat caccagagct gtagctttct tagtcgtccc cactctgatc 900

tacctcactt tctttgccat ccatttgcaa gtcttaacca aggaaggtga tggtggtgct 960

ttcatgtctt ccgtcttcag atcgacctta gaaggtaatg ctgttccaaa acagtcgctg 1020

gccaacgttg gtttgggctc tttagtcact atccgtcatt tgaacaccag aggtggttac 1080

ttacactctc acaatcatct ttacgagggt ggttctggtc aacagcaggt caccttgtac 1140

ccacacattg attctaataa tcaatggatt gtacaggatt acaacgcgac tgaggagcca 1200

actgaatttg ttccattgaa agacggtgtc aaaatcagat taaaccacaa attgacttcc 1260

cgaagattgc actctcataa cctcagacct cctgtgactg aacaagattg gcaaaatgag 1320

gtatctgctt atggacatga gggctttggc ggtgatgcca atgatgactt tgttgtggag 1380

attgccaagg atctttcaac tactgaagaa gctaaggaaa acgttagggc cattcaaact 1440

gtttttagat tgagacatgc gatgactggt tgttacttgt tctcccacga agtcaagctt 1500

cccaagtggg catatgagca acaagaggtt acttgtgcta ctcaaggtat caaaccacta 1560

tcttactggt acgttgagac caacgaaaac ccattcttgg ataaagaggt tgatgaaata 1620

gttagctatc ctgttccgac tttctttcaa aaggttgccg agctacacgc cagaatgtgg 1680

aagatcaaca agggcttaac tgatcatcat gtctatgaat ccagtccaga ttcttggccc 1740

ttcctgctca gaggtataag ctactggtca aaaaatcact cacaaattta tttcataggt 1800

aatgctgtca cttggtggac agtcaccgca agtattgctt tgttctctgt ctttttggtt 1860

ttctctattc tgagatggca aagaggtttt gggttcagcg ttgacccaac tgtgttcaac 1920

ttcaatgttc aaatgcttca ttacatccta ggatgggtac tgcattactt gccatctttc 1980

cttatggccc gtcagctatt tttgcaccac tatctaccat cattgtactt tggtatattg 2040

gctctcggac atgtgtttga gattattcac tcttatgtct tcaaaaacaa acaggttgtg 2100

tcttactcca tattcgttct cttttttgcc gttgcgcttt ctttcttcca aagatattct 2160

ccattgatct atgcaggacg atggaccaag gaccaatgca acgaatccaa gatactcaag 2220

tgggactttg actgtaacac cttccccagt cacacatctc agtatgaaat atgggcatcc 2280

cctgtacaaa cttccactcc taaagaagga acccactcag aatctaccgt cggagaacct 2340

gacgttgaga agctgggaga gacagtctaa 2370

<210> 2

<211> 789

<212> PRT

<213> 酵母(saccharomyce)

<400> 2

Met Cys Gln Ile Phe Leu Pro Gln Asn Val Thr Arg Cys Ser Val Ser

1 5 10 15

Leu Leu Thr Met Ser Lys Thr Ser Pro Gln Glu Val Pro Glu Asn Thr

20 25 30

Thr Glu Leu Lys Ile Ser Lys Gly Glu Leu Arg Pro Phe Ile Val Thr

35 40 45

Ser Pro Ser Pro Gln Leu Ser Lys Ser Arg Ser Val Thr Ser Thr Lys

50 55 60

Glu Lys Leu Ile Leu Ala Ser Leu Phe Ile Phe Ala Met Val Ile Arg

65 70 75 80

Phe His Asn Val Ala His Pro Asp Ser Val Val Phe Asp Glu Val His

85 90 95

Phe Gly Gly Phe Ala Arg Lys Tyr Ile Leu Gly Thr Phe Phe Met Asp

100 105 110

Val His Pro Pro Leu Ala Lys Leu Leu Phe Ala Gly Val Gly Ser Leu

115 120 125

Gly Gly Tyr Asp Gly Glu Phe Glu Phe Lys Lys Ile Gly Asp Glu Phe

130 135 140

Pro Glu Asn Val Pro Tyr Val Leu Met Arg Tyr Leu Pro Ser Gly Met

145 150 155 160

Gly Val Gly Thr Cys Ile Met Leu Tyr Leu Thr Leu Arg Ala Ser Gly

165 170 175

Cys Gln Pro Ile Val Cys Ala Leu Thr Thr Ala Leu Leu Ile Ile Glu

180 185 190

Asn Ala Asn Val Thr Ile Ser Arg Phe Ile Leu Leu Asp Ser Pro Met

195 200 205

Leu Phe Phe Ile Ala Ser Thr Val Tyr Ser Phe Lys Lys Phe Gln Ile

210 215 220

Gln Glu Pro Phe Thr Phe Gln Trp Tyr Lys Thr Leu Ile Ala Thr Gly

225 230 235 240

Val Ser Leu Gly Leu Ala Ala Ser Ser Lys Trp Val Gly Leu Phe Thr

245 250 255

Val Ala Trp Ile Gly Leu Ile Thr Ile Trp Asp Leu Trp Phe Ile Ile

260 265 270

Gly Asp Leu Thr Val Ser Val Lys Lys Ile Phe Gly His Phe Ile Thr

275 280 285

Arg Ala Val Ala Phe Leu Val Val Pro Thr Leu Ile Tyr Leu Thr Phe

290 295 300

Phe Ala Ile His Leu Gln Val Leu Thr Lys Glu Gly Asp Gly Gly Ala

305 310 315 320

Phe Met Ser Ser Val Phe Arg Ser Thr Leu Glu Gly Asn Ala Val Pro

325 330 335

Lys Gln Ser Leu Ala Asn Val Gly Leu Gly Ser Leu Val Thr Ile Arg

340 345 350

His Leu Asn Thr Arg Gly Gly Tyr Leu His Ser His Asn His Leu Tyr

355 360 365

Glu Gly Gly Ser Gly Gln Gln Gln Val Thr Leu Tyr Pro His Ile Asp

370 375 380

Ser Asn Asn Gln Trp Ile Val Gln Asp Tyr Asn Ala Thr Glu Glu Pro

385 390 395 400

Thr Glu Phe Val Pro Leu Lys Asp Gly Val Lys Ile Arg Leu Asn His

405 410 415

Lys Leu Thr Ser Arg Arg Leu His Ser His Asn Leu Arg Pro Pro Val

420 425 430

Thr Glu Gln Asp Trp Gln Asn Glu Val Ser Ala Tyr Gly His Glu Gly

435 440 445

Phe Gly Gly Asp Ala Asn Asp Asp Phe Val Val Glu Ile Ala Lys Asp

450 455 460

Leu Ser Thr Thr Glu Glu Ala Lys Glu Asn Val Arg Ala Ile Gln Thr

465 470 475 480

Val Phe Arg Leu Arg His Ala Met Thr Gly Cys Tyr Leu Phe Ser His

485 490 495

Glu Val Lys Leu Pro Lys Trp Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Val Thr Cys

500 505 510

Ala Thr Gln Gly Ile Lys Pro Leu Ser Tyr Trp Tyr Val Glu Thr Asn

515 520 525

Glu Asn Pro Phe Leu Asp Lys Glu Val Asp Glu Ile Val Ser Tyr Pro

530 535 540

Val Pro Thr Phe Phe Gln Lys Val Ala Glu Leu His Ala Arg Met Trp

545 550 555 560

Lys Ile Asn Lys Gly Leu Thr Asp His His Val Tyr Glu Ser Ser Pro

565 570 575

Asp Ser Trp Pro Phe Leu Leu Arg Gly Ile Ser Tyr Trp Ser Lys Asn

580 585 590

His Ser Gln Ile Tyr Phe Ile Gly Asn Ala Val Thr Trp Trp Thr Val

595 600 605

Thr Ala Ser Ile Ala Leu Phe Ser Val Phe Leu Val Phe Ser Ile Leu

610 615 620

Arg Trp Gln Arg Gly Phe Gly Phe Ser Val Asp Pro Thr Val Phe Asn

625 630 635 640

Phe Asn Val Gln Met Leu His Tyr Ile Leu Gly Trp Val Leu His Tyr

645 650 655

Leu Pro Ser Phe Leu Met Ala Arg Gln Leu Phe Leu His His Tyr Leu

660 665 670

Pro Ser Leu Tyr Phe Gly Ile Leu Ala Leu Gly His Val Phe Glu Ile

675 680 685

Ile His Ser Tyr Val Phe Lys Asn Lys Gln Val Val Ser Tyr Ser Ile

690 695 700

Phe Val Leu Phe Phe Ala Val Ala Leu Ser Phe Phe Gln Arg Tyr Ser

705 710 715 720

Pro Leu Ile Tyr Ala Gly Arg Trp Thr Lys Asp Gln Cys Asn Glu Ser

725 730 735

Lys Ile Leu Lys Trp Asp Phe Asp Cys Asn Thr Phe Pro Ser His Thr

740 745 750

Ser Gln Tyr Glu Ile Trp Ala Ser Pro Val Gln Thr Ser Thr Pro Lys

755 760 765

Glu Gly Thr His Ser Glu Ser Thr Val Gly Glu Pro Asp Val Glu Lys

770 775 780

Leu Gly Glu Thr Val

785

<210> 3

<211> 1845

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

ttcgaaacca tgaagtgggt aacctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat 60

tccaggggtg tgtttcgtcg agatgcacac aagagtgagg ttgctcatcg gtttaaagat 120

ttgggagaag aaaatttcaa agccttggtg ttgattgcct ttgctcagta tcttcagcag 180

tgtccatttg aagatcatgt aaaattagtg aatgaagtaa ctgaatttgc aaaaacatgt 240

gttgctgatg agtcagctga aaattgtgac aaatcacttc ataccctttt tggagacaaa 300

ttatgcacag ttgcaactct tcgtgaaacc tatggtgaaa tggctgactg ctgtgcaaaa 360

caagaacctg agagaaatga atgcttcttg caacacaaag atgacaaccc aaacctcccc 420

cgattggtga gaccagaggt tgatgtgatg tgcactgctt ttcatgacaa tgaagagaca 480

tttttgaaaa aatacttata tgaaattgcc agaagacatc cttactttta tgccccggaa 540

ctccttttct ttgctaaaag gtataaagct gcttttacag aatgttgcca agctgctgat 600

aaagctgcct gcctgttgcc aaagctcgat gaacttcggg atgaagggaa ggcttcgtct 660

gccaaacaga gactcaagtg tgccagtctc caaaaatttg gagaaagagc tttcaaagca 720

tgggcagtag ctcgcctgag ccagagattt cccaaagctg agtttgcaga agtttccaag 780

ttagtgacag atcttaccaa agtccacacg gaatgctgcc atggagatct gcttgaatgt 840

gctgatgaca gggcggacct tgccaagtat atctgtgaaa atcaagattc gatctccagt 900

aaactgaagg aatgctgtga aaaacctctg ttggaaaaat cccactgcat tgccgaagtg 960

gaaaatgatg agatgcctgc tgacttgcct tcattagctg ctgattttgt tgaaagtaag 1020

gatgtttgca aaaactatgc tgaggcaaag gatgtcttcc tgggcatgtt tttgtatgaa 1080

tatgcaagaa ggcatcctga ttactctgtc gtgctgctgc tgagacttgc caagacatat 1140

gaaaccactc tagagaagtg ctgtgccgct gcagatcctc atgaatgcta tgccaaagtg 1200

ttcgatgaat ttaaacctct tgtggaagag cctcagaatt taatcaaaca aaattgtgag 1260

ctttttgagc agcttggaga gtacaaattc cagaatgcgc tattagttcg ttacaccaag 1320

aaagtacccc aagtgtcaac tccaactctt gtagaggtct caagaaacct aggaaaagtg 1380

ggcagcaaat gttgtaaaca tcctgaagca aaaagaatgc cctgtgcaga agactatcta 1440

tccgtggtcc tgaaccagtt atgtgtgttg catgagaaaa cgccagtaag tgacagagtc 1500

accaaatgct gcacagaatc cttggtgaac aggcgaccat gcttttcagc tctggaagtc 1560

gatgaaacat acgttcccaa agagtttaat gctgaaacat tcaccttcca tgcagatata 1620

tgcacacttt ctgagaagga gagacaaatc aagaaacaaa ctgcacttgt tgagcttgtg 1680

aaacacaagc ccaaggcaac aaaagagcaa ctgaaagctg ttatggatga tttcgcagct 1740

tttgtagaga agtgctgcaa ggctgacgat aaggagacct gctttgccga ggagggtaaa 1800

aaacttgttg ctgcaagtca agctgcctta ggcctttaag aattc 1845

<210> 4

<211> 585

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

Claims (10)

1.血清白蛋白的制备方法，包括：将血清白蛋白的编码基因导入重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达，得到血清白蛋白；

所述重组酵母细胞按照包括如下步骤的重组酵母细胞的制备方法制备：

降低受体酵母细胞中PMT1蛋白质的含量和/或活性，或抑制所述受体酵母细胞中所述PMT1蛋白质编码基因的表达，得到与所述受体酵母细胞相比蛋白质糖基化程度降低的重组酵母细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PMT1蛋白质为如下B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

B2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

所述PMT1蛋白质的编码基因为b1)、b2)或b3)：

b1)序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PMT1蛋白质的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PMT1蛋白质的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述受体酵母细胞为毕赤酵母。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述糖基化为O-糖基化。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述O-糖基化为O-甘露糖基化。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白为人血清白蛋白。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列4的蛋白质；

A2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白的编码基因为a1)、a2)、a3)或a4)：

a1)序列表中序列3的第10-1839位的DNA分子；

a2)序列表中序列3的第82-1839位所示的DNA分子；

a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述血清白蛋白的DNA分子；

a4)在严格条件下与a1)或a2)或a3)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述血清白蛋白的DNA分子。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：将血清白蛋白的编码基因导入重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达包括：将含有所述血清白蛋白的编码基因的重组表达载体导入所述重组酵母细胞中使所述血清白蛋白的编码基因得到表达。

10.利用权利要求1-5中任一所述重组酵母细胞的制备方法制备的重组酵母细胞。