CN112368368B - 辅助生殖医疗用培养基 - Google Patents

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Abstract

本申请提供以使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基为特征的辅助生殖医疗方法、该培养基、以及用于在该培养基中使用的制剂。

Description

辅助生殖医疗用培养基
技术领域
本申请涉及辅助生殖医疗用培养基及使用了其的辅助生殖医疗方法等。
背景技术
近年来，受到不孕症烦恼的夫妇的数量逐年增加，部分原因是考虑怀孕的年龄在增高。在不孕症的治疗中，根据其病情进行辅助受精的治疗。通常，如定时法→诱导排卵法→人工授精→体外受精/显微授精这样，治疗方法逐渐增强。
体外受精是在体外使卵子与精子受精的方法。在卵子及精子的前培养、授精(insemination)、以及胚胎培养时使用的培养基中通常包含无机盐、能量源、蛋白质/高分子化合物、抗生素，作为蛋白质/高分子化合物，广泛使用了白蛋白。已知白蛋白可将血浆等纯化而得到，但得到的白蛋白容易形成聚合物，是不稳定的，对于其稳定化，添加脂肪酸是有效的(非专利文献1等)。在脂肪酸中，通常使用辛酸作为白蛋白的稳定剂(非专利文献2等)。
显微授精是在显微镜下将精子注入卵子直至受精的方法。与体外受精相比，显微授精尽管提高了受精率，但被指出怀疑欠缺仅通过精子和卵子各自的能力进行受精的通常受精过程、物理性损伤、胚胎形成率降低、表观遗传学(epigenetics)疾病的增加等的问题。为了避免显微授精，要求提高其它的辅助生殖医疗的受精率。
另外，为了获得良好的不孕治疗结果，在上述的任意受精方法中，要求提高受精率。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Biochim.Biophys.Acta(2004)1702(1):9-17.
非专利文献2：美国药典Albumin Human项
发明内容
发明要解决的课题
本申请的课题在于提供提高辅助生殖医疗的受精率的方法及其方式。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，使用从添加有辛酸的白蛋白中去除辛酸后的白蛋白制备培养液，通过使用该培养液，可提高体外受精的受精率，从而完成了本申请发明。另外，本发明人等发现，与使用添加有辛酸的白蛋白的情况相比，通过在去除了辛酸的白蛋白中添加作为稳定剂的各种脂肪酸(非辛酸)而使用，可提高体外受精的受精率，从而完成了本申请发明。另外，本发明人等发现，通过离子交换树脂对添加有辛酸的白蛋白进行纯化，可特异性地去除辛酸，从而完成了本申请发明。
本申请提供下述发明。
[1]一种含有辛酸含量低的白蛋白的制剂，其用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用。
[2]根据[1]所述的制剂，其中，该辅助生殖医疗包含人工授精、体外受精、或显微授精。
[3]根据[2]所述的制剂，其中，该辅助生殖医疗包含体外受精。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制剂，其进一步含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制剂，其中，该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐选自月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、它们的盐、以及它们的混合物。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制剂，其中，相对于每1g白蛋白，该辛酸含量低的白蛋白包含游离形态的辛酸50μmol以下。
[7]一种辅助生殖医疗的培养基用试剂盒，其包含：
用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的制剂、以及
将该制剂用于辅助生殖医疗所使用的培养基的说明。
[8]一种含有辛酸含量低的白蛋白的培养基，其用于在辅助生殖医疗中使用。
[9]根据[8]所述的培养基，其中，该辅助生殖医疗包含人工授精、体外受精、或显微授精。
[10]根据[9]所述的培养基，其中，该辅助生殖医疗包含体外受精。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的培养基，其进一步含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。
[12]根据[8]～[11]中任一项所述的培养基，其中，该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐选自月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、它们的盐、以及它们的混合物。
[13]根据[8]～[12]中任一项所述的培养基，其中，相对于每1g白蛋白，该辛酸含量低的白蛋白包含游离形态的辛酸50μmol以下。
[14]一种辅助生殖医疗的培养基用试剂盒，其包含：
用于在辅助生殖医疗中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基、以及将该培养基用于辅助生殖医疗的说明。
[15]一种辅助生殖医疗方法，该方法包括：
使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基。
[16]一种体外受精方法，该方法包括：
使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基。
[17]一种该制剂的制造方法，该方法包括：
在辛酸含量低的白蛋白及碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐的存在下，制造用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用的制剂。
[18]一种该培养基的制造方法，该方法包括：
在辛酸含量低的白蛋白及碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐的存在下，制造用于辅助生殖医疗的培养基。
[19]一种用于在辅助生殖医疗中使用的辛酸含量低的白蛋白的稳定化方法，该方法包括：
添加碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。
[20]一种从蛋白质中去除辛酸的方法，该方法包括：
使用离子交换处理。
[21]根据[20]所述的方法，其中，该蛋白质为白蛋白。
发明的效果
根据本发明，通过使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基，提高辅助生殖医疗的受精率。
附图说明
图1为去除辛酸、并再添加的HAS的体外受精率。与*、***比较例相比有显著差异(*p＜0.05、***p＜0.001、卡方检验(Chi-Squared Test)、用Holm法调整p值)。
图2为去除辛酸、并再添加的rHA的体外受精率。与*、***比较例相比有显著差异。(***p＜0.001、卡方检验、用Holm法调整p值)
图3为37℃加热条件下的各种白蛋白的稳定性。
图4为添加了各种游离脂肪酸的白蛋白的受精率。与***比较例相比有显著差异(***p＜0.001、卡方检验、用Holm法调整p值)。
图5为带有棕榈酸的白蛋白向培养基中的添加浓度和受精率。与***比较例相比有显著差异(***p＜0.001、卡方检验、用Holm法调整p值)。
图6为向白蛋白添加的棕榈酸的浓度和受精率。与***比较例相比有显著差异(***p＜0.001、卡方检验、用Holm法调整p值)。
具体实施方式
在一个方式中，本申请提供一种含有辛酸含量低的白蛋白的制剂，其用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用。本申请的制剂例如可以用作培养基制造的原料、或用作适合添加于辅助生殖医疗的基础培养基等使用的补充剂。
在其它的方式中，本申请提供一种含有辛酸含量低的白蛋白的培养基，其用于在辅助生殖医疗中使用。
在其它的方式中，本申请提供一种辅助生殖医疗方法，该方法包括：使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基。
在本申请中，“培养基”只要是可以应用于配子/胚胎等的培养基即可，其使用目的没有特别限定。例如，本申请中的培养基可以用于对配子/胚胎等进行培养、用于对配子/胚胎等进行清洗、用于对配子/胚胎等进行悬浮、以及用于对配子/胚胎等进行保存。
在本申请中，辅助生殖医疗是指包括人工操作配子使其受精(人为受精)直至妊娠的操作的治疗方法。在本申请的辅助生殖医疗中，不一定需要进行人为受精，用于准备人为受精而进行的操作(例如，采集卵子、卵子的冷冻保存)也包含于辅助生殖医疗。作为人为受精的例子，可以列举：人工授精、体外受精、显微授精。
在本申请中，辅助生殖医疗的对象没有特别限定，优选为哺乳动物(人及人以外的哺乳类(例如，牛、马、猪、犬、猫、小鼠、大鼠、兔、猴))，进一步优选为人。在人以外的哺乳动物为对象的情况下，辅助生殖医疗可以包括以提高该哺乳动物的生产、改良品种等工业目的而进行的处理。此外，使用人、人以外的哺乳类的配子的受精相关试验研究也包含于辅助生殖医疗。
在本申请中，人工授精是指将采集到的精子人工注入女性生殖器的操作。采集到的精子通常在注入前进行清洗及悬浮，本申请的培养基也可以作为用于这样的清洗及悬浮的溶液来使用。
在本申请中，体外受精是指在体外向卵子授精而使其受精的操作。本申请的培养基可以作为该授精时的培养基来使用。通常，受精卵随后被培养并在分裂至一定程度后，将得到的胚胎移植至子宫内、或进行冷冻保存。本申请的培养基可以作为向子宫内移植时的胚胎/受精卵等的保持液而使用、或者作为胚胎/受精卵等的冷冻保存液而使用。通常，授精时从采集到的精子中选择活动性高的精子使用。本申请的培养基可以用于采集到的精子的清洗、选择等。通常在包含体外受精的辅助生殖医疗中，采集到的卵子及精子在授精前分别进行前培养。本申请的培养基可以在这样的前培养中使用。
在本申请中，显微授精是在显微镜下将精子注入卵子直至受精的方法。受精后与体外受精同样地进行一定期间培养，将胚胎/受精卵等移植至子宫内、或进行冷冻保存。本申请的培养基也可以在这样的操作中使用。通常，在显微授精中，与体外受精同样地进行精子的选择及前培养、卵子的前培养等。本申请的培养基也可以在这样的显微授精前后所附带的操作中使用。
在辅助生殖医疗中，除了人为受精(人工授精、体外受精、显微授精等)以外，或者为了准备人为受精，可以根据患者的病情、症状而适当组合来进行卵子/精子的冷冻保存、胚胎的体外培养、胚胎/胚泡移植、孵化辅助法、胚胎的冷冻保存、卵子的体外培养等操作。本申请的培养基也可以在这样的人为受精前后所附带的操作中使用。
在本申请中，卵子与精子是否受精可参照该技术领域中通常的基准来确定。例如，可以将能够观察到第二极体及雌雄原核(雌雄前核)的情况判断为受精。
在一个实施方式中，本申请的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基可在辅助生殖医疗中受精前和/或受精时使用。
由于适合受精的培养基与适合胚胎形成的培养基通常是不同的，因此通常在受精后更换培养基。本申请的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基可以在受精前的前培养等、受精时、以及受精后的胚胎形成时使用，优选在受精前及受精时使用。
作为一个方式，本申请提供一种体外受精方法，该方法包括：使用含有辛酸含量低的白蛋白的培养基。本申请的体外受精例如可以在不孕治疗中或受精相关的实验等中进行。
在本申请中，辛酸含量低的白蛋白是指不含有对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响的程度的辛酸的白蛋白。为了提高受精率，辛酸含量低的白蛋白中可包含的辛酸的量优选较少。
辛酸含量低的白蛋白中包含的辛酸的量只要不对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响即可，没有特别限定，例如，1g白蛋白中包含的辛酸的量以游离形式计为50μmol以下、优选为45μmol以下、更优选为40μmol以下、进一步优选为30μmol以下、更进一步优选为20μmol以下、更进一步优选为15μmol以下、进一步优选为10μmol以下。另外，作为辛酸含量低的白蛋白的例子，可以举出相对于1g白蛋白包含0.01～50μmol、更优选为0.01～45μmol、进一步优选为0.01～40μmol、进一步更优选为0.01～30μmol、更进一步优选为0.1～20μmol、进一步优选为1～15μmol、更优选为2～10μmol的辛酸(以游离形式计)的白蛋白。或者，1g白蛋白中包含的辛酸(以游离形式计)的优选范围可以通过选自0.01μmol、0.1μmol、1μmol、2μmol及5μmol的下限值；以及选自50μmol、45μmol、40μmol、30μmol、20μmol、15μmol及10μmol的上限值的组合来表示。
白蛋白的量的测定方法没有特别限定，可以通过该技术领域中通常使用的方法来测定。例如，作为蛋白质量，白蛋白的量例如可以通过考马斯亮蓝(Bradford)法来测定。
测定辛酸(以游离形式计)的方法没有特别限定，可以通过该技术领域中通常使用的方法来测定。例如，可以提取(例如通过Bligh-Dyer提取)含白蛋白液体，将得到的脂质级分(优选在三甲基甲硅烷基化后)供于气相色谱质量分析仪进行测定。
将测定白蛋白中包含的辛酸(以游离形式计)的方法示例于以下。
(1)向白蛋白中加入溶剂(例如水)(例如，以蛋白质浓度(例如基于考马斯亮蓝法)计为5w/v％)，适当调整为例如pH7～8(优选为pH7.4)。
(2)提取(例如Bligh-Dyer提取)得到的含白蛋白液体，将得到的脂质级分(例如在三甲基甲硅烷基化后)供于气相色谱质量分析仪，测定游离辛酸量。
本申请的辛酸含量低的白蛋白可以是天然来源(例如，蛋清白蛋白、猪源白蛋白、牛源白蛋白、人源白蛋白)的白蛋白，也可以是牛型、猪型、或人型等的基因重组体的白蛋白。在用于人(包含卵子、精子、胚胎等)的情况下，优选可以使用人血清白蛋白(HSA)，从预防感染症的观点考虑，进一步优选可以使用重组人白蛋白(rHSA)。
在本申请中，白蛋白的制造方法没有特别限定，可以通过通常方法来制造。例如，白蛋白可以通过由血浆进行纯化来制造，或者通过使用基因重组技术用酵母等产生并进行纯化来制造。作为该纯化方法，可以列举例如：低温乙醇分级法、热处理法、以及色谱纯化法。
纯化后(特别是利用低温乙醇分级法及热处理法进行纯化后)的白蛋白容易聚合而不稳定，因此可以添加辛酸(游离形式或盐形式)。在以不对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响的程度添加辛酸的情况下，可以通过去除辛酸而得到本申请的辛酸含量低的白蛋白。
在一个实施方式中，作为本申请中使用的辛酸含量低的白蛋白，可以使用利用低温乙醇分级法(例如Cohn的Fraction V)或热处理法、优选利用低温乙醇分级法进行纯化、且从添加了辛酸(游离形式或盐形式)的白蛋白中去除了辛酸的白蛋白。
商业上可获得的白蛋白的例子可以举出下述的例子，可以适当去除辛酸作为本申请的辛酸含量低的白蛋白来使用。
重组人白蛋白：CellPrime rAlbumin AF-s(Merck)
人血浆来源白蛋白：Human Serum Albumin Solution(Irvine Scientific)、HUMAN SERUM ALBUMIN(InVitroCare)
去除辛酸的方法没有特别限定，可以使用脂肪酸的去除所通常使用的方法(例如，使用活性炭的方法)。或者，通过利用使用了下述记载的离子交换处理的辛酸去除方法来去除人工添加的辛酸，可以得到本申请的辛酸含量低的白蛋白。
作为一个方式，本申请提供使用离子交换处理从蛋白质(例如白蛋白)中特异性去除辛酸的方法。例如，从生物体采集或通过发酵而得到的生物体来源的蛋白质在纯化后有时也残留脂肪酸，本申请的方法可以用于从生物体来源的蛋白质中去除辛酸。本申请的方法可以用于从人工添加了辛酸(游离形式或盐形式)的蛋白质中去除辛酸。
本申请的辛酸去除方法所使用的离子交换处理的方法没有特别限定，优选进行阳离子交换处理及阴离子交换处理这两者。
阳离子交换处理可以是弱酸性阳离子交换处理(例如，使用羧酸基作为交换基团)，也可以是强酸性阳离子交换处理(例如，使用磺酸基作为交换基团)，优选为强酸性阳离子交换处理(例如，使用磺酸基作为交换基团)。交换基团的离子形式没有特别限定，可以列举例如：氢、钠盐、钾盐等，优选使用氢。阳离子交换处理例如可以使用阳离子交换树脂(例如，弱酸性阳离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂)按照通常的方法来进行。
阴离子交换处理可以是弱碱性阴离子交换处理(例如，使用伯氨基～叔氨基作为交换基团)，也可以是强碱性阴离子交换处理(例如，使用季铵作为交换基团)，优选为强碱性阴离子交换处理。作为季铵的例子，可以列举：三甲基铵基及二甲基乙醇铵基，优选使用三甲基铵基。交换基团的离子形式没有特别限定，可以列举例如：氯化物、氢氧化物、乙酸盐、甲酸盐，优选使用氢氧化物。阴离子交换处理例如可以使用阴离子交换树脂(例如，弱碱性阴离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂)按照通常的方法来进行。
离子交换树脂的母体没有特别限定，可以使用通常作为离子交换树脂的母体而使用的物质(例如，苯乙烯二乙烯基苯)。
作为优选的离子交换树脂，从操作性的观点考虑，优选使用包含阳离子交换树脂和阴离子交换树脂这两者的混合床树脂(例如，AG 501-X8(D)(BIO-RAD)、以及AG 501-X8(BIO-RAD))。
本申请的辛酸去除方法例如可以通过将离子交换树脂与可含有辛酸的蛋白质(白蛋白)在适当的溶剂(例如水)中混合(优选为低温(例如1～10℃、优选为2～6度)/遮光下、例如1～48小时、优选为3～36小时、进一步优选为5～30小时)来进行。
得到的含蛋白质液体可以直接、或者适当进行pH调整、稳定剂添加等该技术领域已知的蛋白质稳定化技术而作为含有低含辛酸蛋白质的制剂来使用。
或者，可以通过冷冻干燥、超滤等将得到的含蛋白质液体浓缩。另外，也可以通过过滤进行病毒/细菌等的去除。在该情况下，可以适当实施该技术领域中已知的蛋白质的其它稳定化技术。
本申请的辛酸含量低的白蛋白可以是未人工添加辛酸的白蛋白。例如，辛酸含量低的白蛋白可以举出利用低温乙醇分级法(例如Cohn的Fraction V)或热处理法、优选利用低温乙醇分级法进行了纯化、且未人工添加辛酸的白蛋白。利用这些纯化法进行了纯化的白蛋白会不稳定，因此优选实施适当的稳定化技术来使用。
白蛋白是与各种物质结合的能力高的蛋白质，例如，血清来源的白蛋白与血清中包含的各种物质结合在一起。因此，即使不人工添加辛酸，白蛋白也有时担载生物体来源的辛酸，只要是不对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响的量就可以含有。在含有可以对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响的量的情况下，可以通过使用本申请的离子交换处理的辛酸去除方法或使用活性炭的方法等现有方法来去除辛酸，实施适当的稳定化技术来使用。
在本申请中，培养基中包含的辛酸含量低的白蛋白的量没有特别限定，可以根据辅助生殖医疗中该培养基的使用目的而在通常使用的范围内适当选择。例如，培养基中包含的辛酸含量低的白蛋白的浓度可以为0.001～5w/v％，优选为0.01～3w/v％，更优选为0.05～2w/v％，进一步优选为0.1～1w/v％。或者，培养基中包含的辛酸含量低的白蛋白的量的优选范围可以通过选自0.001w/v％、0.01w/v％、0.05w/v％及0.1w/v％的下限值；以及选自5w/v％、3w/v％、2w/v％及1w/v％的上限值的组合来表示。
在本申请的一个实施方式中，本申请的用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的制剂、以及本申请的用于在辅助生殖医疗中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基可以分别进一步含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。与使用添加有辛酸的白蛋白的情况相比，通过含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐，可以在改善辅助生殖医疗的效果(例如受精率)的同时，使白蛋白稳定化(例如防止形成聚合物)。在该制剂或培养基的制造中，为了进行高效的白蛋白的稳定化，优选将辛酸含量低的白蛋白与该脂肪酸或其盐充分混合，优选在与其它的任意成分混合之前将辛酸含量低的白蛋白与该脂肪酸或其盐混合。
在一个方式中，本申请提供一种用于在辅助生殖医疗中使用的辛酸含量低的白蛋白的稳定化方法，该方法包括：添加碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。与使用添加有辛酸的白蛋白的情况相比，通过使用该方法，可以在提高辅助生殖医疗的效果(例如受精率)的同时，使白蛋白稳定化(例如防止形成聚合物)。在该方法中，进行辅助生殖医疗时，可以形成包含该脂肪酸或其盐和辛酸含量低的白蛋白的混合物。即，该脂肪酸或其盐与辛酸含量低的白蛋白可以在辅助生殖医疗之前进行混合，该脂肪酸与辛酸含量低的白蛋白也可以在辅助生殖医疗时进行混合。白蛋白优选在早期进行稳定化，优选在制造辛酸含量低的白蛋白后快速添加该脂肪酸或其盐。
与使用添加有辛酸的白蛋白的情况相比，该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐只要可以改善辅助生殖医疗的效果(例如受精率)、使白蛋白稳定化(例如防止形成聚合物)即可，没有特别限定。该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐可以是单一的脂肪酸和/或其盐，也可以是多种脂肪酸和/或其盐的混合物。作为该脂肪酸或其盐的优选例子，可以列举：月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、它们的盐、以及它们的混合物，更优选该混合物中至少包含棕榈酸或其盐。作为进一步优选的例子，可以列举：月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、它们的盐、以及它们的混合物。作为特别优选的例子，可以举出棕榈酸及其盐。
该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸的盐优选为生理学上可接受的盐，例如为钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐及钡盐等碱土金属盐；精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸盐；铵盐、三环己基铵盐等铵盐；单乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、单异丙醇胺盐、二异丙醇胺盐及三异丙醇胺盐等各种链烷醇胺盐。
作为本发明的更优选的该脂肪酸的盐的例子，可以列举：碱金属盐、碱土金属盐、以及其混合物。
与使用添加有辛酸的白蛋白的情况相比，本申请中使用的该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐的量只要是能够改善辅助生殖医疗的效果(例如受精率)、使白蛋白稳定化(例如防止形成聚合物)的量即可，没有特别限定。例如，相对于1g白蛋白，以游离形式计包含该脂肪酸或其盐10～100μmol、优选包含20～80μmol、进一步优选包含30～50μmol。或者，相对于1g白蛋白的该脂肪酸或其盐的量的优选范围以游离形式计为5μmol～100μmol的范围，例如可以通过选自5μmol、10μmol、20μmol及30μmol的下限值；以及选自100μmol、90μmol、80μmol、70μmol、60μmol及50μmol的上限值的组合来表示。
本申请的用于在辅助生殖医疗所使用的培养基中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的制剂的形状没有特别限定，例如，可以是与适当的溶剂(例如，水、缓冲液)等混合而成的液体(适当制备为优选的pH(例如pH7～8))、经冷冻干燥等的固体。只要不对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响，本申请的制剂中可以包含公知的添加物作为培养基构成成分。可以列举例如：无机盐(NaCl、KCl、MgSO4、KH2PO4、CaCl2、NaHCO3等)、糖类(例如葡萄糖等)、有机酸(例如山萮酸、乳酸等)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺等)、维生素类(例如抗坏血酸等)、抗生素(例如庆大霉素等)等，但并不限定于此。另外，也可以适当包含一直以来可用于辅助生殖医疗中的培养等的其它添加物。只要不对受精、产品的稳定性等造成不良影响，优选在各自公知的浓度范围内包含添加物。
用于在本申请的辅助生殖医疗中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基中，除辛酸含量低的白蛋白以外，优选不含有可供给辛酸的成分。该培养基中可包含的辛酸的量只要不对辅助生殖医疗(例如受精)造成不良影响即可，没有特别限定，例如，每1000g培养基中包含的辛酸的量以游离形式计为2500μmol以下、优选为2200μmol以下、更优选为2000μmol以下、进一步优选为1800μmol以下、更进一步优选为1500μmol以下、更进一步优选为1400μmol以下、进一步优选为1300μmol以下。另外，作为1000g培养基中包含的辛酸(以游离形式计)量的例子，可以列举：0.01～2500μmol、优选为0.1～2200μmol、进一步优选为0.5～2000μmol、进一步更优选为1～1800μmol、更进一步优选为2～1500μmol、进一步优选为3～1400μmol、更优选为5～1300μmol。或者，1000g培养基中包含的辛酸(以游离形式计)的量的优选范围可以通过选自0.01μmol、0.1μmol、0.5μmol、1μmol、2μmol、3μmol、4μmol及5μmol的下限值；以及选自2500μmol、2000μmol、1800μmol、1500μmol、1400μmol、1300μmol、1200μmol、1100μmol及1000μmol的上限值的组合来表示。
本申请的用于在辅助生殖医疗中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基的形状没有特别限定，可以根据辅助生殖医疗中的培养基的使用目的而适当选择固体培养基(琼脂培养基等)、液体培养基等、粉末培养基(例如溶于水中制成液体培养基来使用)等，可以使用通常方法来制造。本申请培养基与上述的本申请的制剂同样，只要不对受精造成不良影响，就可以在公知的浓度范围包含公知的添加物作为培养基构成成分。例如，本申请的用于在辅助生殖医疗中使用的含有辛酸含量低的白蛋白的培养基可以通过在已知作为辅助生殖医疗用途的已知培养基(例如，HTF培养基、KSOMAA培养基、HFF99培养基、HiGROW IVF培养基)中添加辛酸含量低的白蛋白来制造。
在本申请的其它方式中，提供一种试剂盒，其包含：本申请的制剂或培养基、以及它们在辅助生殖医疗中使用的说明。该说明的形态没有特别限定，可以是使用说明书，也可以记载有用于在网上阅读该说明内容的访问信息(URL、二维码(QR Code)等)。
实施例
以下，列举实施例及试验例对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。
试验例1.基于离子交换处理的辛酸去除
1.1辛酸去除处理
将预先用超纯水清洗的离子交换树脂(AG 501-X8(D),BIO-RAD)与人血清白蛋白(HSA,Irvine Scientific)或10％基因重组人白蛋白(rHA,Merck)混合后，使用旋转器(RT50,TAITEC)在4℃遮光下平稳地搅拌24小时。回收处理后的白蛋白溶液，通过考马斯亮蓝法对蛋白质浓度进行定量，用超纯水和2mol/L NaOH制备为5w/v％(pH7.4)。
1.2游离脂肪酸测定
对处理前的HSA(比较例1)和rHA(比较例2)、处理后的HSA(实施例1)和rHA(实施例2)分别进行Bligh-Dyer提取，将得到的脂质级分在三甲基甲硅烷基化后供于气相色谱质量分析仪(7890A GC&5975C GC/MSD,Agilent)，测定了游离脂肪酸浓度。将得到的结果示于表1。
表1.离子交换处理前后的5w/v％白蛋白溶液中的游离脂肪酸浓度(μmol/L)
如表1所示，通过进行离子交换处理，可以从白蛋白溶液中包含的游离脂肪酸中特异性地去除辛酸。
试验例2.辛酸的受精抑制能力
2.1培养基的制备
制备上述表1所示的4种白蛋白溶液、以及在实施例1中添加4,000μmol/L辛酸钠而得到的白蛋白溶液(实施例1+4000辛酸)、或者在实施例2中添加2,000μmol/L、4,000μmol/L辛酸钠而得到的白蛋白溶液(实施例2+2000辛酸、实施例2+4000辛酸)，添加于HTF培养基中，使其为0.5w/v％。使矿物油在这些培养基200μL上形成多层，在37℃、6v/v％CO2的条件下平衡过夜后用于精子的前培养和体外受精。
2.2精子的回收
将C57BL/6N系雄性小鼠(日本SLC)处死后，切下附睾尾部。将该附睾尾部中央的附睾管切开而得到精子块，将该精子块采集到矿物油中制备的含有0.1w/v％聚乙烯醇(PVA)的HTF培养基200μL中。将采集到的精子块在37℃、6v/v％CO2的条件下培养10分钟，使精子均匀地分散。
2.3精子的前培养
向2.1中制备的培养基中导入2.2中回收的精子，使其为2×106匹/mL，在37℃、6v/v％CO2的条件下进行1小时前培养，直至体外受精。
2.4卵子的回收
向C57BL/6N系雌性小鼠(日本SLC)以7.5国际单位在腹腔内给药PMSG(孕马血清促性腺激素、ASKA Pharmaceutical公司、SEROTROPIN(商标))，在48小时后以7.5国际单位在腹腔内给药hCG(人绒毛膜促性腺激素、ASKA Pharmaceutical公司、GONATROPIN(商标))。在给药hCG 15小时后，将该小鼠处死，立即切下输卵管。从输卵管壶腹中将卵子-卵丘细胞集合体回收至2.1中制备的培养基。将回收到的卵子-卵丘细胞集合体在37℃、6v/v％CO2的条件下培养至体外受精。
2.5体外受精
向加入有2.4中准备的卵子-卵丘细胞集合体的培养基中添加2.3中准备的精子，使其为100个/μL。在37℃、6v/v％CO2的条件下授精6小时，然后，将可观察到第二极体及雌雄原核的卵子判定为受精卵，代入以下的式中计算出受精率。
受精率(％)＝受精卵/正常形态的卵子数×100
将得到的结果示于图1、图2。
如图1、2所示，通过离子交换处理去除辛酸时，受精率提高，再次添加4,000μmol/L的辛酸时，受精率再次降低。另一方面，2,000μmol/L的辛酸没有对受精率造成不良影响。该结果表明，从可以获得受精率提高作用的观点考虑，进行了离子交换处理的实施例1、2的白蛋白比比较例1、2的白蛋白更加优异，该效果与辛酸相关。
试验例3.去除辛酸后的白蛋白的稳定化
去除辛酸后的白蛋白对于提高体外受精率是有效的，但另一方面，其不稳定且容易因加热而聚合。因此，在实施例2中加入除辛酸以外的脂肪酸，对于在加热条件下可以抑制聚合物化的浓度进行了探讨。
3.1向白蛋白添加游离脂肪酸
用乙醇将棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸制备为1mg/mL，取棕榈酸19.2μL、硬脂酸21.3μL、油酸21.2μL、亚油酸21.0μL加入容器，吹入氮气，使其干燥成固体。向其中加入实施例2的白蛋白100μL，并在37℃下搅拌2小时，由此制作了添加有总浓度3000μmol/L的4种混合游离脂肪酸(FFA MIX)的白蛋白。用0.2μm的针头过滤器进行过滤灭菌，在4℃遮光下保存至使用时。利用相同的方法将表2所示的浓度的FFA MIX添加于实施例2的白蛋白，供于试验。
表2.实施例2中添加的游离脂肪酸的种类和浓度
3.2白蛋白的稳定性评价
将表2的(1)～(8)在37℃下保管7天，在稀释至0.5w/v％后，将9μL与非变性聚丙烯酸酰胺凝胶电泳(Native PAGE)用样品缓冲液3μL混合，对7.5w/v％凝胶每次上样10μL，进行了Native PAGE。用考马斯亮蓝对蛋白质染色，评价了有无白蛋白的聚合。将结果示于图3。
如图3所示，向白蛋白加入游离脂肪酸时，可以在宽广的浓度范围抑制聚合物化。
试验例4.添加有各种游离脂肪酸的白蛋白的受精率
将2000μmol/L的各种游离脂肪酸通过与试验例3相同的方法添加于实施例2的5w/v％白蛋白(表3)，在HTF培养基中添加0.5w/v％白蛋白后，在与试验例2中记载的体外受精实验相同的条件下进行了探讨。将得到的结果示于图4。
表3.用于探讨的游离脂肪酸和其浓度
脂肪酸名称 碳原子数:双键数
比较例2 辛酸 8:0
实施例2 － －
实施例3 月桂酸 12:0
实施例4 肉豆蔻酸 14:0
实施例5 十五烷酸 15:0
实施例6 棕榈酸 16:0
实施例7 棕榈油酸 16:1
实施例8 十七烷酸 17:0
实施例9 硬脂酸 18:0
实施例10 油酸 18:1
实施例11 亚油酸 18:2
实施例12 FFA MIX 16:0、18:0、18:1、18:2
在使用了如图4那样添加有月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸的白蛋白、以及分别添加有将棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸这4种混合而成的游离脂肪酸的白蛋白的情况下，从可以获得受精率提高作用的观点考虑，比比较例2的辛酸含有白蛋白更优异。
试验例5.添加有棕榈酸的白蛋白向培养基中的添加浓度
将试验例4中受精率最高的实施例6的添加有棕榈酸的白蛋白以0.5w/v％(10倍稀释、实施例6)、0.25w/v％(20倍稀释、实施例13)、0.125w/v％(40倍稀释、实施例14)、0.0625w/v％(80倍稀释、实施例15)、0.03125w/v％(160倍稀释、实施例16)添加于HTF培养基，在与试验例2中记载的体外受精实验相同的条件下进行了探讨。将与以0.5w/v％向HTF培养基中添加比较例2的白蛋白的情况进行比较的结果示于图5。需要说明的是，0.5w/v％(10倍稀释、实施例6)的结果如图4所示。
如图4及图5所示，与比较例2的白蛋白相比，在离子交换处理后添加有2000μmol/L棕榈酸的实施例6的白蛋白在全部的培养基中浓度(0.03125w/v％～0.5w/v％(10倍～160倍稀释))下带来了受精率提高作用。
试验例6.向白蛋白添加棕榈酸的添加浓度
将实施例6的加倍量(4000μmol/L)的棕榈酸添加于实施例2，以0.5w/v％(10倍稀释、实施例17)、0.25w/v％(20倍稀释、实施例18)、0.125w/v％(40倍稀释、实施例19)添加于HTF培养基后，在与试验例2中记载的体外受精实验相同的条件下进行了探讨。将与以0.5w/v％向HTF培养基中添加比较例2的白蛋白的情况进行比较的结果示于图6。
如图6所示，与比较例2的白蛋白相比，在离子交换处理后添加有4000μmol/L棕榈酸的实施例17的白蛋白在全部培养基中浓度(0.125w/v％～0.5w/v％(10倍～40倍稀释))下带来了受精率提高作用。
工业实用性
使用本申请的制剂或培养基，可以提高受精率。

Claims (17)

1.一种含有含辛酸白蛋白的制剂，其用于在人为受精所使用的培养基中使用，
相对于每1g白蛋白，所述含辛酸白蛋白包含游离形态的辛酸0.01～50μmol。
2.根据权利要求1所示的制剂，其中，该人为受精包含人工授精、体外受精、或显微授精。
3.根据权利要求2所示的制剂，其中，该人为受精包含体外受精。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制剂，其进一步含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。
5.根据权利要求4所述的制剂，其中，该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐选自月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、它们的盐、以及它们的混合物。
6.一种用于人为受精的培养基用试剂盒，其包含：
用于在人为受精所使用的培养基中使用的含有含辛酸白蛋白的制剂、以及
将该制剂用于人为受精所使用的培养基的说明，
相对于每1g白蛋白，所述含辛酸白蛋白包含游离形态的辛酸0.01～50μmol。
7.一种含有含辛酸白蛋白的培养基，其用于人为受精，
每1000g该培养基中包含的辛酸的量以游离形式计为2500μmol以下。
8.根据权利要求7所述的培养基，其中，该人为受精包含人工授精、体外受精、或显微授精。
9.根据权利要求8所述的培养基，其中，该人为受精包含体外受精。
10.根据权利要求7～9中任一项所述的培养基，其进一步含有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐。
11.根据权利要求10所述的培养基，其中，该碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐选自月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、棕榈油酸、十七烷酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、它们的盐、以及它们的混合物。
12.一种用于人为受精的培养基用试剂盒，其包含：
用于人为受精的含有含辛酸白蛋白的培养基、以及
将该培养基用于人为受精的说明，
每1000g该培养基中包含的辛酸的量以游离形式计为2500μmol以下。
13.一种人为受精方法，该方法不用于治疗目的，所述方法包括：
使用权利要求7～12中任一项所述的培养基。
14.一种体外受精方法，该方法不用于治疗目的，所述方法包括：
使用权利要求7～12中任一项所述的培养基。
15.一种该制剂的制造方法，该方法包括：
在含辛酸白蛋白及碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐的存在下，制造用于在人为受精所使用的培养基中使用的制剂，
相对于每1g白蛋白，所述含辛酸白蛋白包含游离形态的辛酸0.01～50μmol。
16.一种该培养基的制造方法，该方法包括：
在含辛酸白蛋白及碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐的存在下，制造用于人为受精的培养基，
每1000g该培养基中包含的辛酸的量以游离形式计为2500μmol以下。
17.一种用于人为受精的含辛酸白蛋白的稳定化方法，该方法包括：
添加碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪酸、或者其盐，
相对于每1g白蛋白，所述含辛酸白蛋白包含游离形态的辛酸0.01～50μmol。
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