KR102027561B1

KR102027561B1 - 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외수정용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법

Info

Publication number: KR102027561B1
Application number: KR1020180044729A
Authority: KR
Inventors: 이영주; 이상명; 이귀재
Original assignee: 전북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2019-10-01

Abstract

본 발명은 실라짓(Shilajit) 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 포유동물 난·정자의 체외수정용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법에 관한 것으로, 본 발명의 체외수정용 배지 조성물은 포유동물의 번식 장애 극복, 보조적 번식 기술 등에 활용될 수 있다.

Description

실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외수정용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법{Medium composition for in vitro fertilization comprising shilajit or its extract as effective component and method of in vitro fertilization using the same}

본 발명은 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외수정용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법에 관한 것이다.

실라짓(shilajit)은 짙은 갈색의 삼출물로, 히말라야 산맥의 암석층에서 주로 발견되며, 암석층의 다양한 미네랄이 지속적인 직사광선에 의하여 과열되면서 유화되어 식물의 레진이나 검처럼 삼출되어 생성된다. 실라짓은 민간요법에서 신장 기능 회복, 면역 체계 강화, 관절염, 고혈압 등 다양한 질환의 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 이전의 연구들에 의하면 실라짓은 항당뇨, 항스트레스, 기억력 향상, 불안증 해소, 알러지 반응 약화, 항염증, 항에이즈 등의 다양한 질환에도 효과가 있는 것으로 보고되었다. 실라짓에는 풀빅산(fulvic acid), 디벤조-알파-피론(dibenzo-α-pyrones), 디벤조-알파-피론 색소단백질(dibenzo-α-pyrone chromoprotein) 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.

포유동물에서 정상적인 수정(fertilization)이란 성숙된 난자(ovum)에 단일의 정자(spermatozoa)가 침입함으로써 각각 하나의 자성전핵(female pronucleus)과 웅성전핵(male pronucleus)을 형성하고, 부계와 모계의 염색체가 정상적으로 배열되어 수정란(embryo)으로 발달하는 것을 의미한다.

포유동물의 체외수정(in vitro fertilization)은 가축 등의 증식 및 개량에 있어서 매우 유용한 기술이다. 동물산업의 증진과 인간의 불임(infertility) 또는 난임(subfertility)의 치료를 위해 체외수정과 같은 다양한 보조적 번식 기술 방법(assisted reproductive technology)이 이행되고 있으나, 아직 그 효율성이 높지 않다. 포유동물의 체외수정률을 증대시킬 수 있는 체외수정 조건을 확립하고자 산소의 농도, 난구세포의 유무, 난자의 크기 차이에 따른 배 발달률 등과 관련된 다양한 연구들이 수행되었으나, 정자 및 난자의 체외수정 환경을 최적화시켜 체외수정률을 증대시키는 미지의 발달인자들이 완전히 밝혀지지 않았다. 따라서 보다 개선된 체외수정 조건을 확립하여 체외수정률을 향상시킴으로써 포유동물의 보조적 번식기술에 응용될 수 있는 방법이 필요한 실정이다.

한편, 한국공개특허 제2011-0039689호에는 락트산(lactate), 피루브산(pyruvate), 시트르산(citrate) 및 글루코스(glucose)가 첨가된 무혈청 배지를 이용한 '수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법'이 기재되어 있고, 한국공개특허 제2017-0072236호에는 '실라짓의 사용에 의한 근육 형성과 복구의 증진, 및 콜라겐 및 관련 단백질과 관련된 장애의 치료'가 개시되어 있으나, 본 발명의 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외수정용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 실라짓 추출물이 첨가된 배지에서 배양된 정자가 실라짓 추출물이 처리되지 않은 배지에서 배양된 정자보다 운동성 및 세포 내 칼슘이온의 농도가 증가하고, 세포 내 활성산소종(Reactive Oxygen Species)의 발생이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 실라짓 추출물이 포함된 체외수정용 배지에서 난자와 정자를 배양했을 때 난자에 결합한 정자의 수와 총 수정률이 증가하는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 실라짓(Shilajit) 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 포유동물 난·정자의 체외수정용 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 체외수정용 배지 조성물에 포유동물의 정자와 난자를 첨가하여 수정시키는 단계를 포함하는 포유동물 난·정자의 체외수정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 체외 성숙된 난자와 정자를 본 발명의 체외수정용 배지 조성물에 첨가하여 체외수정시키는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 수정된 체외수정란을 배양 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 정자 운동성 증진용 조성물을 포유동물로부터 분리된 정자에 처리하는 단계를 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 실라짓 또는 이의 추출물을 포함하는 체외수정용 배지 조성물은 정자의 운동성을 향상시켜 수정률을 증가시킬 수 있으므로, 포유동물의 보조적 번식기술에 활용되어 포유동물의 체외수정란 생산 증가 및 수정란 이식효율을 증대시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 실라짓 추출물의 처리에 따른 돼지 정자의 운동성을 측정한 결과이다. A; 운동성 정자(motile sperm), B; 전진운동성 정자(progressive sperm), C; 과잉운동성 정자(hyperactive sperm).
도 2는 실라짓 추출물의 처리에 따른 정자 세포 내 활성산소종(ROS) 발생량(A) 및 정자세포 내 칼슘이온(Ca²+) 농도(B)를 측정한 결과이다.
도 3은 실라짓 추출물의 처리에 따른 돼지 난자세포에 대한 정자의 결합수를 측정한 결과이다.
도 4는 실라짓 추출물의 처리에 따른 체외수정란의 수정률을 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실라짓(Shilajit) 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 포유동물 난·정자의 체외수정용 배지 조성물을 제공한다.

상기 실라짓은 히말라야 산맥의 단단한 바위 틈에서 배출되는 자연적인 삼출물로, 액상 또는 흑갈색의 고체상 형태를 가진다.

본 발명의 배지 조성물에 있어서, 상기 실라짓은 바람직하게는 분말 또는 과립 형태의 고형의 실라짓일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 실라짓 추출물은 실라짓의 물, 알코올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 또는 이의 혼합 용매 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "체외수정"이란 난자와 정자가 체내에서 수정하는 상태와 구분되는 방법으로, 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내 자궁의 환경과 유사한 조건으로 수정·배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하며, 본 발명의 배지 조성물은 이러한 체외수정에 최적화된 배지 조성물이다.

본 발명의 체외수정용 배지 조성물은 실라짓 또는 이의 추출물을 통상적인 포유동물 체외수정에 이용되는 기본 배지에 첨가시켜 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "기본 배지"는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 포유동물 초기 배아세포 배양용 배지를 의미하며, 당업자들에게 잘 알려진 통상의 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다.

상기 무기염류는 염화나트륨(NaCl), 염화칼륨(KCl) 및 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 탄소원은 글루코오스, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate) 및 젖산 칼슘(calcium lactate) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 아미노산은 필수아미노산인 발린(valine), 류신(leucine), 아이소루신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 트레오닌(threonine), 라이신(lysine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine); 준필수아미노산인 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 시스테인(cysteine), 아르지닌(arginine), 티로신(tyrosine), 프롤린(proline); 및 비필수아미노산인 알라닌(alanine), 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid) 및 아스파라긴(asparagine) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 보조인자는 아연(Zn), 구리(Cu), 망간(Mn), 셀렌(Se), 코발트(Co), 몰리브덴(Mo), 바나듐(V), 요오드(I), 브롬(Br), 불소(F), 니켈(Ni), 규소(Si), 주석(Su), 크롬(Cr), 붕소(B), 완충액 및 항생제 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 기본 배지로는 포유동물 세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, mTBM(modified Tris-buffered medium; Abeydeera LR. et al., Theriogenology, 48(4):537-544, 1997), PZM-3(Pocrine zygote medium-3; Yoshioka et al., biology of reproduction, 66(1):112-119, 2002), NCSU-23(North Carolina State University medium; Petters and Wells, J. Reprod. Fert., Suppl. 48:61-73., 1993), CR1-aa(Rosenkrans, CF Jr. et al., Biol. Reprod., 49(3):459-462, 1993), TCM(tissue culture medium of medium 199; Yue, C. et al., Development, 121:2645-2654, 1995), CZB(Chatot-Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L. et al., J. Reprod. Fert., 86:679-688, 1989) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 상업화된 배지를 그대로 사용하거나 일부 변형하여 사용할 수 있다.

본 발명의 체외수정용 배지 조성물은 실라짓 또는 이의 추출물을 5~55 ㎍/㎖ 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 10~50 ㎍/㎖ 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 배지 조성물은 구체적으로, 정제된 실라짓을 PBS(phosphate-buffered saline) 용액과 혼합하여 10분간 볼텍싱하고 0.45 ㎛ 공극 크기의 주사기 필터로 여과한 실라짓 추출물을 유효성분으로 사용하였으며, 상기 실라짓 추출물은 정자의 운동성을 증진시키고, 정자의 수정능 획득(capacitation) 및 첨체반응(acrosome reaction)에 중요한 세포 내 칼슘이온의 농도를 증가시키며, 세포 내 활성산소종의 발생을 감소시키는 효과가 있다.

본 발명의 체외수정용 배지 조성물에 있어서, 상기 포유동물은 인간을 제외한 동물, 예를 들어, 돼지, 소, 양, 말 같은 가축, 애완 동물 그리고 쥐, 백서, 기니피그 등과 같은 실험 동물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 돼지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 체외수정용 배지 조성물에 포유동물의 정자와 난자를 첨가하여 수정시키는 단계를 포함하는 포유동물 난·정자의 체외수정 방법을 제공한다.

본 발명의 체외수정 방법은 정자의 운동성을 증가시키는 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외수정용 배지 조성물을 사용함으로써, 포유동물 난·정자의 체외수정률을 증대시킬 수 있다.

본 발명의 체외수정 방법을 적용시킬 수 있는 포유동물의 난자와 정자는 인간을 제외한 동물의 난자와 정자, 예를 들어, 돼지, 소, 양, 말 같은 가축, 애완 동물 그리고 쥐, 백서, 기니피그 등과 같은 실험 동물의 난자와 정자일 수 있고, 바람직하게는 돼지의 난자와 정자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 체외에서 수정할 수 있는 난자와 정자라면, 특별히 그 종류에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

(a) 인간을 제외한 포유동물로부터 난포란을 채취하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계의 체외 성숙된 난자와 정자를 본 발명의 체외수정용 배지 조성물에 첨가하여 체외수정시키는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계에서 수정된 체외수정란을 배양 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 포유동물 체외수정란의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 정자의 운동성을 증진시키고, 정자의 수정능 획득(capacitation) 및 첨체반응에 중요한 세포 내 칼슘이온의 농도를 증가시키며, 세포 내 활성산소종의 발생을 감소시키는 실라짓 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하고 있어, 상기 조성물을 정자 세포를 포함하고 있는 배지에 첨가하면 정자의 운동성이 증가될 수 있다.

본 발명의 실라짓 추출물이 첨가된 배지에서 정자를 배양한 후 정자의 운동성(sperm motility, %)을 관찰한 결과, 실라짓 추출물의 무처리구에 비해 실라짓 추출물 처리구에서 유의적으로 높은 정자 운동성이 나타나는 것을 확인하였다.

본 발명의 정자 운동성 증진용 조성물은 실라짓 또는 이의 추출물을 5~55 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 10~50 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 정자 운동성 증진용 조성물을 포유동물로부터 분리된 정자에 처리하는 단계를 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 실라짓 추출물의 제조

정제된 실라짓(Gorkha Ayurved Co. PVT. LTD., Kathmandu, Nepal)을 PBS(phosphate-buffered saline) 용액과 혼합하여 10분간 볼텍싱(vortexing)하고 0.45 ㎛ 공극 크기의 주사기 필터(syringe filter)로 여과하여 사용하였다.

제조예 2. 실라짓 추출물이 처리된 돼지의 체외수정용 배지 제조

체외수정(in vitro fertilization)을 위한 배지는 0.2% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 mTBM(modified Tris-buffered medium; NaCl 113.1 mM, KCl 3 mM, CaCl₂·2H₂O 7.5 mM, Tris 20.0 mM, glucose 11.0 mM, sodium pyruvic acid 5.0 mM, caffeine 3.4 mM)에 10, 20, 50 또는 100 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 추출물을 각각 첨가하여 제조하였다.

제조예 3. 체외수정을 위한 돼지의 체외성숙 난포란 및 정자 제조

도축장에서 도살된 미경산돈의 난소를 적출하고, 상기 적출된 난소를 0.9% 생리식염수에 담아 실험실로 운반하였다. 난포액(follicular fluids)과 난구세포(cumulus cell)가 부착된 미성숙 난자는 18게이지 바늘이 장착된 10 ㎖ 주사기를 이용하여 직경 2-6 mm 난포로부터 흡입하여 채취하였다. 상기 채취된 난포액에서 난구세포가 균일하게 부착되어 있고 세포질이 건강한 미성숙 난자만을 선별하여 0.01% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)이 포함된 TL-HEPES(Tyrode lactate-Hepes) 배지로 세척한 후, 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone, FSH), 황체형성호르몬(Luteinizing hormone, LH) 및 표피증식인자(epidermal growth factor, EGF)가 첨가된 TCM(tissue culture medium)-199에서 44시간 동안 체외성숙(in vitro maturation; IVM)을 유도하였다. 상기 체외성숙된 난자에 0.1% 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 처리하여 난자를 싸고 있는 난구세포를 제거한 후 세포질이 건강하고 제1극체(1st polar body)가 돌출되어 있는 중기(metaphase Ⅱ)의 난자만을 선별하였다.

또한, 하기 실시예 1의 돼지 액상정액을 0.01% 폴리비닐 알코올이 함유된 PBS 용액으로 3회 세척하고 액상정액의 펠렛을 수득하였으며, 상기 펠렛을 mTBM 배지에 부유시킨 후 실험에 사용하였다.

실시예 1. 실라짓 추출물의 처리에 따른 돼지 정자의 운동성 분석

실라짓 추출물이 돼지의 정자 운동성(sperm motility)에 미치는 영향을 확인하기 위해, 양돈장에서 채취된 돼지정액의 운동성(>85% 활력)과 농도(sperm concentration)를 확인한 후 돼지 액상정액 보존액 BTS(beltsville thawing solution; 증류수 100 ㎖에 glucose 3.7 g, sodium citrate 0.6 g, sodium bicarbonate 0.125 g, EDTA 0.125 g, potassium chloride 0.075 g, penicillin G 0.06 g, streptomycin 0.1 g 포함)에 1x10⁸ 정자(spermatozoa)수/㎖의 농도로 정액을 희석하여 액상정액(liquid semen)을 제조한 다음 17℃ 저장고에서 5일 동안 보관하여 실험에 사용하였다. 이후 액상정액에 실라짓 추출물을 농도별(10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도)로 처리하고, 37.5℃에서 30분 동안 배양한 후 CASA(computer-assisted sperm analysis; Microptic, 스페인) 프로그램으로 정자의 운동성을 관찰하였으며, 대조구는 실라짓 추출물이 처리되지 않은 액상정액 내 정자를 사용하였다.

그 결과, 운동성 정자(% motile sperm)는 대조구(91.9%)에 비해 실라짓 추출물 처리구(91.7~94.5%)에서 약간 증가하였으나, 유의한 차이가 없었으며(도 1A), 전진운동성 정자(% progressive sperm)도 대조구(79.6%)에 비해 실라짓 처리구(80.4~83.2%)에서 약간 증가하였으나, 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 1B). 반면, 과잉운동성 정자(% hyperactive sperm)는 대조구에 비해 10 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 추출물 처리구(0.95%)에서 현저하게 증가하였으나, 실라짓 추출물의 농도가 증가함에 따라 과잉운동성 정자의 비율이 감소하는 것을 확인하였다(도 1C).

실시예 2. 실라짓 추출물의 처리에 따른 돼지 정자의 활성산소종 발생량 및 정자 내 칼슘이온 농도 분석

돼지 정자에서 발생한 활성산소종(ROS)는 정자의 지질과산화(peroxidation), DNA 손상 또는 수정방해 등을 유발할 수 있고, 정자 내 칼슘이온(Ca²⁺)은 정자의 수정능 획득(capacitation), 첨체반응(acrosome reaction), 과활성(hyperactivation) 유발과 관계가 있다.

실라짓 추출물이 정자의 활성산소종 발생에 미치는 영향을 확인하기 위해, 상기 돼지의 액상정액에 실라짓 추출물을 농도별(10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도)로 처리하고 37.5℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양된 정자에 1 μM carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-Dichlorofluorescein Diacetate; Invitrogen, 미국)를 첨가하여 37.5℃에서 30분 동안 배양하고, PBS로 2회 반복 세척한 후 485 nm의 여기(excitation) 파장대와 520 nm의 방출(emission) 파장대에서 형광강도를 측정하였다. 또한, 정자 내 칼슘이온의 농도를 측정하기 위해, 상기 배양된 정자를 5 nM fluo-3/AM(Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 염색한 후 PBS로 2회 반복 세척하고, 상기와 같은 파장대에서 형광강도를 측정하였다.

그 결과, 활성산소종에 대한 형광강도는 대조구에 비해 실라짓 추출물 처리구에서 감소하였으며, 특히 50 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 처리구에서 유의적으로 낮은 형광강도를 나타내었다(도 2A). 이를 통해, 실라짓 추출물은 정자의 배양과정에서 발생하는 활성산소종의 발생을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 정자 내 칼슘이온에 대한 형광강도는 대조구에 비해 실라짓 추출물 처리구에서 증가하였으며, 특히 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 추출물 처리구에서 유의적으로 형광강도가 높게 나타나는 것으로 보아, 실라짓 추출물이 정자 내 칼슘이온의 농도를 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 2B).

실시예 3. 돼지 난자에 결합한 정자의 수 측정

상기 제조예 3에서 선별된 난자 10개와, mTBM 배지에서 희석된 정자를 1x10⁵ 정자수/㎖ 농도로 실라짓이 농도별로 처리된 체외수정용 배지에 각각 주입하고, 38.5℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 30분 동안 공배양(co-incubation; IVF)한 후 수거하여 2% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정시키고 2.5 mg/㎖의 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색하여, 형광현미경으로 난자의 투명대(zona pellucida, ZP)에 부착된 정자의 수를 관찰하였다.

그 결과, 난자의 투명대에 부착된 정자의 수는 실라짓 추출물의 무처리 대조구(27.4개) 보다 실라짓 추출물 처리구(31.5~39.6개)에서 증가하였으며, 특히 20 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 추출물 처리구에서 난자 투명대에 결합된 정자의 수가 유의적으로 가장 높았으나, 100 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 처리구에서는 다소 감소한 것으로 확인되었다(도 3). 이를 통해, 본 발명의 실라짓 추출물이 첨가된 체외수정용 배지에서 정자와 난자를 배양할 경우 정자의 침입률을 증가시킬 수 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 4. 돼지 정자와 난자의 수정률 분석

상기 제조예 3에서 선별된 난자와, mTBM 배지에서 희석된 정자 1 ㎕(최종농도 0.5×10⁵ 정자수/㎖)를 실라짓이 농도별로 처리된 체외수정용 배지에 각각 주입하고, 38.5℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 3시간 동안 공배양(co-incubation; IVF)하여 체외수정을 유도한 후, 상기 유도된 체외수정란을 PZM-3(porcine zygote medium-3)에 옮겨 16~20시간 동안 배양하였으며, 배양이 끝난 후 체외수정란을 2% 포름알데히드로 고정시키고 2.5 mg/㎖의 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하여 수정률을 분석하였다.

그 결과, 총 수정률은 대조구(61.9%)에 비해 실라짓 농도별 처리구(81.5~87.6%)에서 증가하였으며, 특히 10 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 처리구(87.6%)에서 유의적으로 가장 높음을 확인하였다. 다만, 50 또는 100 ㎍/㎖ 농도의 실라짓 처리구에서는 수정률이 다소 감소하여 각각 70.6%와 65.6%의 수정률을 나타내었다(도 4).

상기 결과를 통해, 체외수정 시 배지에 실라짓을 처리하면 정자의 운동성을 증진시켜 난자에 대한 정자의 침입을 용이하게 하여 수정률을 높일 수 있음을 유추할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 실라짓 또는 이의 추출물은 포유동물의 체외수정 및 인공수정액, 동결정액 희석액 등을 제조하는데 사용할 수 있다.

Claims

10~50 ㎍/㎖의 실라짓(Shilajit) 추출물을 유효성분으로 포함하는 돼지 난·정자의 체외수정용 배지 조성물.

제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 무기염류, 탄소원, 아미노산 및 소 혈청 알부민 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 난·정자의 체외수정용 배지 조성물.

삭제

제1항 또는 제2항의 체외수정용 배지 조성물에 돼지의 정자와 난자를 첨가하여 수정시키는 단계를 포함하는 돼지 난·정자의 체외수정 방법.

(a) 돼지로부터 난포란을 채취하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 채취된 난포란에서 미성숙 난자를 회수하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 회수된 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계;
(d) 상기 (c) 단계의 체외 성숙된 난자와 정자를 제1항 또는 제2항의 체외수정용 배지 조성물에 첨가하여 체외수정시키는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 수정된 체외수정란을 배양 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 돼지 체외수정란의 대량 생산 방법.

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