KR101772090B1 - 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정효율 증진 방법 - Google Patents

다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정효율 증진 방법 Download PDF

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이영주
이상명
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Abstract

본 발명은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다발리아락톤은 정자의 운동성 및 생존능을 증가시키고 난자 내 침입을 촉진함으로써 체외수정률을 증가시키므로 수정란의 체외수정효율 증진용 배지 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다

Description

다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정효율 증진 방법{Medium composition comprising davallialactone for improving in vitro fertilization efficiency of mammal and method using the same}
본 발명은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외수정효율 증진 방법에 관한 것이다.
버섯은 오래 전부터 재배되어온 천연물로써 약제 및 식용으로 널리 이용되고 있다. 버섯은 항균, 항바이러스, 항암, 항알러지, 면역조절, 항염증, 항산화 등의 다양한 활성을 가지고 있는 것으로 이미 알려져 있으며, 예로부터 각종 질병 치료를 위한 약제로 이용되어 왔다 (Lindequist 등, 2005, eCAM 2:285-99). 장수진흙버섯은 야생에서 참나무과 나무에 서식하는 버섯으로, 최근 장수진흙버섯으로부터 추출된 다발리아락톤이 항혈소판 응집 활성 (antiplatelet-aggregation activity), 항산화 활성 (antioxidant activity), 프리 라디칼 소거활성 (free radical scavenging activity), 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide)에 의하여 유발된 염증 반응 억제활성 등을 나타낸다고 보고 된 바 있다 (Lee와 Yun, 2006, Bioorg Med Chem Lett 16(9):2376-9; Lee 등, 2006, Bioorg Med Chem Lett 16(21):5621-4; Kim 등, 2008, Eur J Pharm 584(2):361-7). 다만, 버섯을 보조적 번식 기술에 응용된 예는 아직까지 보고된 바가 없다.
일반적으로 포유동물에서 정상수정 (fertilization)이란 성숙된 난자 (oocyte)에 단일의 정자 (spermatozoa)가 침입함으로써 각각 하나의 자성전핵 (female pronucleus)과 웅성전핵 (male pronucleus)을 형성하고, 부계와 모계의 염색체가 정상적으로 배열되어 수정란 (embryo)으로 발달하는 것을 의미한다. 한편 하나 이상의 정자가 난모세포에 침입하여 비정상적인 수정란 또는 비수정란에 도달하는 것을 다정자 침입 (polyspermy)이라고 일컫는데, 특히 돼지의 체외수정 (in vitro fertilization, IVF)에서 빈번하게 이 현상이 나타나고 있으며, 아직까지 그 원인 규명이 모호한 실정이다. 일반적으로 돼지의 체내수정 (in vivo fertilization)에서 다정자 침입률은 다른 종에 비하여 30-40% (Hanly, 1961, J Reprod Fertil 2:182-94; Polge, 1978, J Reprod Fertil 54:461-70)에 이르며, 체외수정에서 다정자 침입률은 50% (Wang 등, 1991, J Reprod Fertil 93:491-96; 1994, Biol Reprod 50:510-15; 1997, J Reprod Fertil 109:247-55; Abeydeera and Day, 1997, Theriogenology 48:537-44)에 이른다. Wang 등 (1997, J Reprod Fertil 109:247-55)은 돼지의 체외수정에서 다정자 침입은 미성숙 난자 (immature oocyte)에서 발생하는 표층과립 반응 (cortical granule exocytosis)의 실패와 성숙 난자 (mature oocyte)에서 발생하는 표층과립 반응의 지연이라고 보고하였다.
포유동물의 수정란을 체외에서 수정하는 것은 가축 등의 포유동물 증식 및 개량에 있어서 매우 유용한 기술이다. 특히 최근에는 동물 형질전환기술 및 복제동물 생산 기술의 유용성이 전 세계적으로 인정되면서 포유동물의 필수적인 과정이 되었으며, 상기 체외조작은 체외배양을 전제로 하여 이루어지는 과정이기에, 보다 간편하고 안정적인 체외배양기법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
특히, 포유동물의 체외수정률을 증대시킬 수 있는 체외수정 조건을 확립하고자 다양한 연구들이 진행되어 왔으며, 많은 연구자들이 산소의 농도, 난구세포의 유무, 난자의 크기 차이에 따른 배 발달률 조사를 수행하였으나 많은 연구들에도 불구하고, 정자 및 난자의 체외수정 환경을 최적화시켜 체외수정률을 증대시키는 미지의 발달 인자들이 완전하게 밝혀지지 않은 상태이다. 그러므로, 보다 개선된 체외수정 조건을 확립하여 체외수정률이 향상된 수정란을 생산하는 방법이 필요한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 체외수정률을 향상시키기 위해 연구 노력한 결과, 버섯에서 유래된 성분인 다발리아락톤이 포함된 체외수정효율 증진용 배지를 개발하고, 이를 포유동물의 체외수정에 이용할 경우, 정자의 운동성 및 생존능이 증가됨으로써 포유동물의 체외수정률을 향상시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 및 정자운동성 증진용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용한 포유동물의 체외수정효율 및 정자 운동성 향상 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 정자운동성 증진용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 포유동물의 정자 및 난자를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 포유동물로부터 분리된 정자에 처리하는 단계를 포함하는 포유동물의 정자 운동성 향상 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다발리아락톤은 정자의 운동성 및 생존능을 증가시키고 난자 내 침입을 촉진함으로써 체외 수정률을 증가시키므로 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 다발리아락톤의 1H-NMR 스펙트럼(a) 및 13C-NMR 스펙트럼(b) 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 다발리아락톤이 포함된 배지에서 배양된 돼지 정자의 운동성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 다발리아락톤이 포함된 배지에서 배양된 돼지 정자의 생존능 및 사멸된 정자를 확인하기 위해SYBR14G 형광강도(a) 및 PI 형광강도(b)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 다발리아락톤이 포함된 배지에서 체외수정된 돼지 난자의 수정률을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 다발리아락톤을 유효성분으로 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016054052917-pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 “다발리아락톤(davallialactone)”은 통상적인 추출 및 분획 방법에 의해 얻을 수 있고, 또는 유기 합성적인 방법으로 합성하거나 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 장수진흙버섯(Phellinus baumii)으로부터 다발리아락톤을 추출하였다.
구체적으로는, 먼저 음건, 세절한 장수진흙버섯 자실체를 실온에서 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 후, 추출액을 감압 건조 및 용매를 제거하여 조추출물을 수득한다. 이때, 탄소수 1 내지 4의 알코올은 1 내지 100%(v/v)의 메탄올 또는 1 내지 100%(v/v)의 에탄올일 수 있으며, 1 내지 100%(v/v)의 메탄올이 더욱 바람직하다. 용매가 제거된 조추출물을 증류수에 현탁하고 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(n-butanol)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상으로 분배 추출하고 용매층을 회수하여 폴리페놀이 함유된 추출물을 수득하고, 이로부터 다발리아락톤을 분리한다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 다발리아락톤은 체외수정에서 동등한 작용을 나타내는 한, 화합물뿐만 아니라, 이의 염 또는 이의 유도체가 사용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물을 적용시킬 수 있는 포유동물은 인간 또는 가축을 모두 포함하는 것으로, 예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 당나귀 및 토끼나 질환모델로 널리 쓰이는 마우스, 랫트, 마모트 및 실험용 토끼 등을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "체외수정"이란 정자와 난자가 체내에서 수정되는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator)에서 체내 자궁의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하며, 본 발명의 배지 조성물은 이러한 체외수정에 최적화된 배지 조성물이다.
상기 배지 조성물은 다발리아락톤을 통상적인 포유동물의 체외수정에 이용되는 기본 배지에 첨가시켜 이용할 수 있다. 본 발명에서 "기본 배지"는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민(BSA) 및 보조인자로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 포유동물 초기 배아세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다.
상기 무기염류는 NaCl, KCl 및 NaHCO3 등을 포함하고, 탄소원은 글루코즈, 나트륨 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 포함하고, 아미노산은 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산을 포함하며, 보조인자는 기타 미량원소 및 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지는 또한 항생제를 포함할 수 있으며, 상기 기본 배지는 바람직하게는 포유동물세포 체외수정용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어, NCSU-23 (North Carolina State University medium; Petters and Wells, J. Reprod. Fert., Suppl. 48:61-73., 1993), CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr., et al., Biol. Reprod., 49(3);459-462, 1993), TCM(tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al., Development, 121:2645-2654, 1995), CZB (Chatot -Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L., et al., J. Reprod. Fert., 86:679-688, 1989) 등을 그대로 사용할 수 있으며, 돼지의 경우 NCSU-23, 소의 경우 CR1-aa를 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 배지 조성물은 다발리아락톤을 0.1 내지 100 μM 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.5 내지 10 μM의 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 μM미만의 농도로 포함할 수 있다. 상기 농도 범위 내에서 다발리아락톤은 세포독성 없이 더욱 우수한 체외수정증진 효율을 가진다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 포유동물의 정자 및 난자를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 돼지로부터 미성숙 난자를 회수하여 체외 성숙시키고 본 발명의 배지 조성물에서 정자와 난자를 배양함으로써 체외 수정을 실시하였다. 이때 돼지의 경우, 회수한 난자를 성숙 배양시킨 후, 제1 극체가 돌출되어 있는 중기 II (metaphase II) 난자만을 선별하였으며, 돼지의 정자를 0.1% 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol, PVA)이 포함된 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 펠릿 (pellet)만을 채취하여 상기 배지로 부유시킨 뒤, 난자가 있는 배지에 첨가하였다. 정자-난자 체외수정 공배양을 38.5℃ 5% CO2로 조정된 배양기에서 실시한 결과, 다발리아락톤을 포함하는 본 발명의 배지 조성물을 이용한 군에서 정상수정률 및 다정자침입률이 유의적으로 높게 나타남을 확인함으로써, 본 발명에 따른 다발리아락톤의 체외수정효율 증진 효과를 확인하였다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 다발리아락톤은 정자의 난자 내 침입을 촉진함으로써 체외수정률을 증가시키므로 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 다발리아락톤을 첨가한 배지에서 정자를 배양한 후 정자의 운동성(sperm motility, %)을 관찰한 결과, 다발리아락톤을 포함하는 본 발명의 배지 조성물을 이용한 군에서 유의적으로 높은 정자 운동성이 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 다발리아락톤이 우수한 정자운동성 증진 효능을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 다발리아락톤이 첨가된 배지에서 배양된 정자의 생존능(viability)을 SYBR14 (살아있는 정자 탐지) 또는 프로피디움 아이오다이(propidium iodide, PI; 죽어있는 정자 탐지)를 이용한 형광염색을 통하여 분석한 결과, 다발리아락톤을 포함하는 본 발명의 배지 조성물을 이용한 군에서 유의적으로 높은 정자의 생존능 및 낮은 정자 사멸 정도를 나타내는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 다발리아락톤이 우수한 정자 생존능 증진 효능을 가지고 있음을 확인하였다.
상기한 바와 같이 본 발명의 다발리아락톤은 정자의 운동성 및 생존능을 증가시키므로 정자 운동성 증진용 배지 조성물로의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에 대한 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 포유동물로부터 분리된 정자에 처리하는 단계를 포함하는 포유동물의 정자 운동성 향상 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 다발리아락톤의 추출
음건, 세절한 장수진흙버섯 자실체 3 kg을 메탄올에 1일 동안 침지하여 실온에서 추출한 후 감압 건조하여 용매를 제거하여 조추출물을 수득하였다. 용매가 제거된 조추출물을 증류수에 현탁하고, 동량의 헥산을 첨가하여 분배 추출한 후, 물층에 다시 에틸아세테이트를 첨가하여 분배 추출하고 용매층을 회수하여 폴리페놀이 함유된 추출물을 수득하였다. 농축한 폴리페놀 추출물을 헥산-에틸 아세테이트(50:1 ~1:1, v/v), 클로로포름-메탄올 (2:1)의 용매계를 사용하여 실리카겔 후레쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 메탄올의 용매로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그 후 50 ~ 90%의 용매를 이용하여 고체상 추출을 실시한 후 다시 70%의 메탄올을 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다.
그 결과, 분자량 464의 황색 분말인 다발리아락톤(C25H20O9)이 확인되었다.
다발리아락톤의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼 결과를 도 1에 나타내었으며, 그 구체적인 화학구조는 하기와 같다.
[화학식 1]
Figure 112016054052917-pat00002
실시예 2. 다발리아락톤이 포함된 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물의 제조
체외수정효율 증진용 수정배지는 포유동물의 체외수정에 일반적으로 사용되는 배지 조성물인 변형된 트리스 배지(modified Tris-buffered medium, mTBM; 113.1 mM NaCl, 3 mM KCl, 7.5 mM CaCl2·2H2O, 20.0 mM 트리스(Tris), 11.0 mM 글루코스(glucose), 5.0 mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvic acid), 3.4 mM 카페인(caffeine), 0.2% 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA 포함 Abeydeera 등, 1997, Theriogenology 48:537-44))를 기초로 제조하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 다발리아락톤을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시킨 후, 상기 제조된 mTBM에 0.5 내지 2 μM 농도로 첨가하였다.
실시예 3. 다발리아락톤이 포함된 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물을 이용한 포유동물 수정란의 체외수정 방법
3-1. 돼지의 체외성숙 난자 배양
도축장에서 도살된 미경산돈의 난소들을 적출하고 0.9% 생리식염수에 담아 실험실로 운반하였다. 난포액(follicular fluids)과 난구세포(cumulus cell)가 부착된 미성숙 난자를 10 ml 주사기에 18게이지 바늘을 장착하여 2-6 mm 직경의 난포로부터 흡입하여 채취하였으며, 채취된 난포액에서 난구세포가 균일하게 부착되어있고 세포질이 건강한 미성숙 난자만을 골라 0.01% 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA)이 포함된 타이로이드 락테이트-HEPES-PVA 배지(Tyrode lactacte-HEPES-PVA medium)로 세척한 후 FSH, LH, EGF가 첨가된 조직 배양 배지(tissue culture medium, TCM) 199에서 44시간 동안 성숙배양 하였다(in vitro maturation; IVM). IVM 후 0.1% 히알루오니다아제(hyaluronidase)를 이용하여 난자를 싸고 있는 난구세포를 제거하고, 세포질이 건강하고 제1 극체(1st polar body)가 돌출되어 있는 중기 II (metaphase II) 난자만을 선별하여 상기 실시예 2에서 제조한 체외수정효율 증진용 배지에 첨가하였다.
3-2. 돼지의 정자-난자 체외 수정 실시
돼지의 정자를 0.1% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)이 포함된 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 3회 세척한 후 펠릿(pellet)만을 채취하여 상기 배양 배지로 부유시킨 뒤, 난자가 있는 배지에 1 μl(최종농도 1x105 spermatozoa/ml) 첨가하였다. 정자-난자 체외수정 공배양은 38.5℃ 5% CO2로 조정된 배양기에서 2시간 동안 실시하였다. 체외수정 후, 수정란을 돼지 접합 배지-3(porcine zygote medium-3, PZM-3)에 옮겨 20시간 동안 배양하였다.
실험예 1. 다발리아락톤이 포함된 배지 조성물에서 배양된 포유동물 정자의 운동성 측정
다발리아락톤이 정자 운동성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 0.5 μM, 1 μM, 2 μM 및 5 μM의 다발리아락톤을 첨가한 체외수정효율 증진용 배지에서 정자를 10분, 60분간 각각 배양한 후 정자의 운동성(sperm motility, %)을 관찰하였다. 대조군으로는 다발리아락톤을 첨가하지 않고 DMSO를 첨가한 배지에서 정자를 배양하였다. 상기 운동성을 검정한 결과를 도 2에 나타내었다. 각 컬럼들의 상단에 표시한 서로 다른 알파벳 문자 (a-b)는 평균 간에 0.05 % 수준에서 유의성이 인정되는 것을 의미한다(이하 도면에 표시된 유의성 평가는 같다).
도 2에 나타낸 바와 같이, 다발리아락톤의 첨가 10분 뒤 운동성 관찰 결과, 1 μM 농도로 첨가된 배지에서 배양된 정자가 가장 높은 정자 운동성(91.7%)을 나타냄을 확인하였다. 또한, 정자 배양 1시간 뒤 운동성 관찰결과 0.5 및 1 μM 다발리아락톤을 처리한 군에서 다른 처리군과 비교하여 유의적으로 높은 운동성을 나타내었다(p<0.05).
이를 통해, 다발리아락톤이 효과적으로 정자 운동성을 증가시킴을 확인하였다.
실험예 2. 다발리아락톤이 포함된 배지 조성물에서 배양된 포유동물 정자의 생존능 측정
상기 실험예 1과 같이 다양한 농도의 다발리아락톤이 첨가된 배지에서 1시간 동안 배양된 정자의 생존능 (viability) 측정을 위하여 정자를 100 nM SYBR14 (살아있는 정자 탐지) 또는 5 nM 프로피디움 아이오다이(propidium iodide, PI; 죽어있는 정자 탐지)로 각각 형광염색하고 형광강도 (fluorescence intensity)를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 0.5 μM 다발리아락톤을 처리한 군에서 가장 높은 형광강도를 나타내어 높은 정자 생존능을 나타내었고, 5 μM 다발리아락톤 처리시 정자 생존능은 유의적으로 낮게 나타남을(p<0.05) 확인하였다. 따라서 5 μM 이상 농도의 다발리아락톤은 세포독성을 가지며, 이는 실험예 1에서 정자 운동성에 부정적 영향을 주는 원인으로 작용함을 확인하였다.
또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 사멸된 정자 정도를 나타내는 PI의 형광강도는 0.5 μM 다발리아락톤을 처리한 정자에서 유의적으로 낮게 나타남을 확인하였다 (p<0.05).
실험예 3. 다발리아락톤이 포함된 체외수정효율 증진용 배지 조성물 이용시 체외수정률 측정
상기 실험예 1과 같이 다양한 농도의 다발리아락톤이 포함된 체외수정효율 증진용 배지를 이용하여 체외수정(in vitro fertilization; IVF)을 실시하기 위하여, 도축장에서 도살된 미경산돈의 난소들을 적출하고 0.9% 생리식염수에 담아 실험실로 운반하였다. 난포액(follicular fluids)과 난구세포(cumulus cell)가 부착된 미성숙 난자를 10 ml 주사기에 18게이지 바늘을 장착하여 2-6 mm 직경의 난포로부터 흡입하여 채취하였다. 채취된 난포액에서 난구세포가 균일하게 부착되어있고 세포질이 건강한 미성숙 난자만을 골라 0.01% 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol, PVA)이 포함된 타이로이드 락테이트-HEPES-PVA 배지(Tyrode lactacte-HEPES-PVA medium)로 세척한 후 FSH, LH, EGF가 첨가된 조직 배양 배지(tissue culture medium, TCM) 199에서 44시간 동안 성숙배양 하였다(in vitro maturation; IVM). IVM 후 0.1% 히알루오니다아제(hyaluronidase)를 이용하여 난자를 싸고 있는 난구세포를 제거하고, 세포질이 건강하고 제1 극체(1st polar body)가 돌출되어 있는 중기 II(metaphase II) 난자만을 선별하여 체외수정효율 증진용 배지에 넣었다. 정자는 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PVA) 용액으로 3회 세척한 후 펠릿(pellet)만을 채취하여 체외수정효율 증진용 배지로 부유시킨 뒤, 난자가 있는 배지에 1 μl(최종농도 1x105 spermatozoa/ml) 첨가하였다. 정자-난자 체외수정 공배양은 38.5℃ 5% CO2로 조정된 배양기에서 2시간 동안 실시하였다. 체외수정 후, 수정란은 돼지 접합 배지-3(porcine zygote medium-3, PZM-3)에 옮겨 20시간 동안 배양한 후, 2% 포름알데히드로 고정하고 2.5 mg/ml 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 염색한 후 형광현미경하에서 수정률을 조사하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 자성과 웅성 전핵이 각각 1개씩 보일 경우 정상 수정 (monospermic oocyte), 웅성 전핵이 1개 이상 관찰될 시 다정자침입 (polyspermic oocyte)으로 판정하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 수정배지에 1 μM 다발리아락톤을 첨가한 군에서 높은 정상수정률(% monospermic oocyte)을 나타내었다(65.1%, p<0.05). 다정자 침입률은 0.5 또는 1 μM 다발리아락톤을 처리한 군에서 유의적으로 증가하였으며(12.3-17.8%, p<0.05), 세포독성이 나타난 5 μM 다발리아락톤 또는 DMSO 처리 군에서는 다정자침입이 관찰되지 않았다. 종합적으로, 1 μM 다발리아락톤을 처리한 군에서 총 수정률 (mono+polyspermic oocyte)이 유의적으로 높게 나타남을 확인하였다.
상기 실험 결과를 통하여, 다발리아락톤이 포함된 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물은 포유동물 정자의 운동성 및 생존능을 향상시킴으로써 정자의 난자 내 침입을 도와 체외수정률을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 0.5 내지 1μM의 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물은 무기염류, 탄소원, 아미노산, 및 소 혈청 알부민으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 체외수정효율 증진용 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다발리아락톤은 장수진흙버섯에서 추출한 것을 특징으로 하는 체외수정효율 증진용 배지 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배지 조성물에서 포유동물의 정자 및 난자를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물의 체외수정효율 증진 방법.
  5. 1μM의 다발리아락톤을 포함하는 포유동물의 정자 운동성 증진용 배지 조성물.
  6. 제5항의 배지 조성물을 포유동물로부터 분리된 정자에 처리하는 단계를 포함하는 포유동물의 정자 운동성 향상 방법.
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WO2021220012A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Spermatech As 5-(1h-indol-3-yl)-oxazole, -oxadiazole and -furan derivatives as enhancers of sperm motility

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JP2005213147A (ja) 2004-01-27 2005-08-11 Ryoko Kumai 哺乳動物の精子の活性化剤及び活性化方法

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